XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SẢN PHẨM TRÀ TỪ CÂY BẠC HÀ CHÂU Á

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SẢN PHẨM TRÀ TỪ CÂY BẠC HÀ CHÂU Á Mentha a

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SẢN PHẨM TRÀ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SẢN PHẨM TRÀ

TỪ CÂY BẠC HÀ CHÂU Á

(Mentha arvensis Linn)

ThS LÊ HỒNG THỦY TIÊN

Tháng 1/2014

LỜI CẢM ƠN

Hoàn thành được đề tài nghiên cứu này em đã nhận được sự hỗ trợ và chỉ bảo tận tình từ quý thầy cô, những tri thức mà có thể không tìm được trong sách báo Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, quý thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học, quý thầy

cô Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm

TP Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Trần Thị Lệ Minh và ThS Lê Hồng Thủy Tiên, những người đã bên cạnh truyền đạt cho em những tri thức quý báu, giúp

đỡ em trong những vấn đề khó khăn nhất

Em rất biết ơn thầy Lê Đình Đôn, với những lời nhận xét của thầy đã cho em nhận ra những điểm sai và những điểm cần hướng đến trong quá trình thực hiện đề tài

Để có được như ngày hôm nay, em xin chân thành cảm ơn

Cô Tôn Bảo Linh đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn và cảm thông cho tập thể các bạn lớp DH10SH trong suốt quá trình thực hiện đề tài

KS Nguyễn Minh Quang, KS Phan Hữu Tín, chị và các bạn nhóm Nghiên cứu Nấm ăn và Nấm dược liệu đã luôn tận tình giúp đỡ, động viên em thực hiện đề tài này

Con xin chân thành cảm ơn ba mẹ những người đã sinh thành, dạy dỗ và luôn đứng phía sau ủng hộ con Em xin gửi lời cảm ơn đến chị gái, người không những hỗ trợ em về kinh nghiệm, còn là người luôn tạo điều kiện tốt cho em trong suốt quá trình học tập ở giảng đường đại học

Tháng 12 năm 2013

Lê Thị Cúc Hương

TÓM TẮT

Đề tài “Xây dựng quy trình tạo sản phẩm trà từ cây Bạc hà Châu Á (Mentha arvensis L.) được thực hiện nhằm đa dạng sản phẩm trà từ Bạc hà và tạo sản phẩm trà

đạt chất lượng về cảm quan và vi sinh

Hai giống Bạc hà Châu Á (Mentha arvensis L.)và Châu Âu (Mentha piperita)

được trồng trong vườm ươm Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh trong điều kiện được kiểm soát về việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, phân bón một cách chặt chẽ Sau khi thu hoạch và chọn lọc, lá Bạc hà được phối trộn cùng các thành phần khác để tạo sản phẩm trà túi lọc Tinh dầu được chiết xuất từ thân lá cây Bạc hà Châu Á được trộn với bột trà xanh để tạo sản phẩm dạng bột Trà được sấy ở 3 mức nhiệt độ xác định để giảm ẩm độ sản phẩm và hạn chế vi sinh vật có hại Tiến hành kiểm tra độ ẩm và các chỉ tiêu an toàn vi sinh cho sản phẩm trà Các sản phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn được đánh giá các chỉ tiêu cảm quan thông qua phiếu điều tra để chọn sản phẩm có mùi vị, hương thơm được ưu chuộng Trà khi sấy ở 65oC trong vòng 1 giờ đạt độ ẩm dưới 9% đối với trà túi lọc và dưới 1% đối với trà bột hương Bạc hà ; các chỉ tiêu vi sinh khi kiểm tra sản phẩm đều không vượt ngưỡng cho phép của TCVN 7974 : 2008 Trà túi lọc Bạc hà với tỷ lệ Bạc hà Châu Á và Bạc hà Châu Âu được chọn lần lượt 3 : 2 và 2 : 3, trà bột hương Bạc hà với tỷ lệ tinh dầu Bạc hà lần lượt 0,5% và 1% cho sản phẩm được ưu chuộng hơn

Từ khóa : trà Bạc hà, tiêu chuẩn vi sinh, độ ẩm trà, Bạc hà túi lọc, trà bột Bạc hà

To develop a wide variety of mint tea which is safe and favored, the research

“Construction the manufacturing process for Mint tea by Mentha arvensis Linn” was

performed

Two species of mint (Mentha arvensis L and Mentha piperita) were grown in

plant nurseries at Department of Biotechnology, Nong Lam university, Ho Chi Minh city, in which the use of fertilizers or pesticides was strictly controlled After harvest and selection, mint leaves were mixed with other components to make tea bag

Essential oils of Mentha arvensis L extracted from leaves was mixed with green tea

powder to make tea powder Mint tea then was dried at high temperature to decrease moisture and inhibit the growth of fungi and bacteria Finally, organoleptic examinations were performed to determine which the taste and scent is favored

Obtained the result that tea dried at 65oC for 1 hour had moisture content less 9% in tea bag and less 1% in the mint flavor tea powder All microorganisms are listed in the TCVN 7974:2008 standard for tea were safety in the threshold The tea

bag containing Mentha arvensis L and Mentha piperita at the ratio of 2 : 3 or 3 : 2,

respectively, was considered to be a better flavored tea Regarding to mint tea powder, the oil content is 0,5% or 1% was preferred

Key words: Mint tea, microorganisms standard, moisture content, mint tea bag, mint flavor tea powder

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG – BIỂU ĐỒ - SƠ ĐỒ vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về cây Bạc hà 3

2.2.1 Nguồn gốc cây Bạc hà 3

2.2.2 Cây Bạc hà Châu Á (Mentha arvensis L.) 3

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 13

3.2 Vật liệu nghiên cứu 13

3.2.1 Nguyên liệu sử dụng 13

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 13

3.2.3 Hóa chất 13

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 14

3.3.1 Lựa chọn nguyên liệu 14

3.3.2 Chuẩn bị nguyên liệu 15

3.3.3 Tìm thời gian và nhiệt độ sấy thích hợp 15

3.3.4 Xác định độ ẩm trong sản phẩm 15

3.3.5 Thực hiện các phản ứng kiểm tra vi sinh cho sản phẩm 16

3.3.5.1.Chuẩn bị hóa chất 16

3.3.5.2.Qui trình định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí 17

3.3.5.3.Qui trình định lượng tổng số Coliform 17

3.3.5.4.Qui trình định lượng nấm men, nấm mốc 18

3.3.5.5.Qui trình định tính Salmonella 18

3.3.6 Xác định tỷ lệ các thành phần trong trà 19

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

4.1 Kết quả xác định độ ẩm của sản phẩm 21

4.2 Kết quả kiểm nghiệm vi sinh của sản phẩm 22

4.2.1 Kết quả định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí trong sản phẩm 22

4.2.2 Kết quả định lượng Coliform trong sản phẩm 23

4.2.3 Kết quả định lượng nấm men, nấm mốc trong sản phẩm 24

4.2.4 Kết quả định tính Salmonella trong sản phẩm 25

4.3 Kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm 26

4.3.1 Kết quả đánh giá cảm quan thông qua thị hiếu 26

4.3.1.1.Kết quả đánh giá cảm quan thông qua thị hiếu mẫu trà lá 26

4.3.1.2.Kết quả đánh giá cảm quan thông qua thị hiếu mẫu trà bột 28

4.3.2 Kết quả đánh giá cảm quan bằng phương pháp cho điểm 30

4.3.2.1.Kết quả đánh giá cảm quan trà túi lọc Bạc hà 30

4.3.2.2.Kết quả đánh giá cảm quan trà bột hương Bạc hà 31

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32

5.1 Kết luận 32

5.2 Đề nghị 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

WHO: World Health Organization

TCN: Trước công nguyên

CDs: Cyclodextrins

CGTase: Enzyme cyclodextrin glycosyltransferase

VRB: Violet Red Bile Agar

BGBL: Brilliant Green Bile Lactose Broth

TBG: Tryptone Bile Green

TSA: Tryptic Soy Agar

XLD: Xylose lysine deoxycholate agar

DRBC: Dichoran Rose Bengal Chloramphenicol

TSI: Triple sugar iron

SPW: Salin Peptone Water

CFU: Colony – forming unit

BPW: Buffer Peptone Water

TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

DANH SÁCH CÁC BẢNG – BIỂU ĐỒ - SƠ ĐỒ

Tên bảng Trang

Bảng 3.1 Thí nghiệm bổ sung bạc hà Châu Âu vào trà bạc hà 19

Bảng 3.2 Thí nghiệm bổ sung tinh dầu bạc hà trà bột 20

Bảng 3.3 Mức độ quan trọng cho từng chỉ tiêu (TCVN 3218 – 2011) 20

Bảng 4.1 Độ ẩm của trà ở các mức nhiệt độ và thời gian sấy khác nhau 21

Bảng 4.2 Kết quả định lượng vi sinh vật hiếu khí 23

Bảng 4.3 Kết quả định lượng nấm men sau 5 ngày 25

Bảng 4.4 Kết quả định lượng nấm mốc sau 5 ngày 25

Bảng 4.5 Kết quả khảo sát thị hiếu về tỷ lệ phối trộn của trà túi lọc Bạc hà 27

Bảng 4.6 Kết quả khảo sát thị hiếu về tỷ lệ phối trộn của trà bột hương Bạc hà 29

Bảng 4.7 Kết quả đánh giá cảm quan trà túi lọc Bạc hà ở các mức nhiệt độ 30

Bảng 4.8 Kết quả đánh giá cảm quan trà bột hương Bạc hà ở các mức nhiệt độ 31

Biểu đồ 4.1 Kết quả khảo sát thị hiếu theo giới tính về tỷ lệ phối trộn của trà túi lọc Bạc hà 27

Biểu đồ 4.2 Kết quả khảo sát thị hiếu theo giới tính về tỷ lệ phối trộn của trà bột hương Bạc hà 28

Sơ đồ 5.1 Quy trình tạo sản phẩm trà lá 32

Sơ đồ 5.2 Quy trình tạo sản phẩm trà bột hương Bạc hà 33

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cây Bạc hà Châu Á 3

Hình 2.2 Cây Bạc hà Châu Âu 4

Hình 2.3 Công thức cấu tạo menthol 6

Hình 2.4 Công thức cấu tạo menthone 7

Hình 2.5 Trà Matcha được nghiền và đóng gói tại Nhật Bản 9

Hình 2.6 Cây cỏ ngọt 10

Hình 2.7 Cấu trúc phân tử β – cyclodextrin 12

Hình 3.1 Hai giống Bạc hà Mentha arvensis L và Mentha piperita 14

Hình 4.1 Trà Bạc hà sau khi sấy 21

Hình 4.2 Bột trà xanh hương Bạc hà sau khi sấy 22

Hình 4.3 Kết quả trong môi trường BGBL sau 48 giờ 24

Hình 4.4 Màu nước trà từ các mẫu trà túi lọc Bạc hà được sấy ở 3 mức nhiệt độ 28

Hình 4.5 Màu nước trà từ các mẫu bột trà xanh hương Bạc hà được sấy ở 3 mức nhiệt độ 29

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay, do áp lực công việc, mọi người thường gặp tình trạng căng thẳng kéo dài dẫn đến các rối loạn về thần kinh, suy nhược cơ thể và giảm sút hiệu quả làm việc Ngoài ra, căng thẳng kéo dài còn dẫn đến các tình trạng bệnh lý cơ thể như hen suyễn, tim mạch, ung thư, loét dạ dày Tại Việt Nam, theo tài liệu của chính phủ năm

2000, tỷ lệ mắc bệnh trầm cảm là 2,47% dân số Một khảo sát 7400 lãnh đạo doanh nghiệp trên 36 quốc gia do Công ty nghiên cứu thị trường, kế toán và kiểm toán Grant Thornton thực hiện năm 2010, Việt Nam có tỷ lệ doanh nhân chịu áp lực là 72%, xếp thứ 3 trong số các nước được khảo sát

Tinh dầu Bạc hà từ xưa vẫn được biết đến với nhiều tác dụng dược lý đối với

thần kinh và cơ thể Tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis kết hợp với thuốc thông

thường có khả năng làm giảm số lượng loét, tổng số axit, khối lượng dịch vị dạ dày

và độ pH trong ibuprofen ở mô hình chuột loét dạ dày (Londonkar và ctv, 2009) Theo Bác sĩ Hoàng Xuân Đại (2013): “Tinh dầu bạc hà có tác dụng tốt cho hệ tiêu hóa và chữa trị các bệnh đường ruột, cảm sốt, thông mũi, mát họng, giảm căng thẳng

và mất ngủ, tốt cho răng và giúp lưu thông máu làm tinh thần thông thoáng và sảng khoái, tăng cường hệ miễn dịch, giảm đau” Trong tinh dầu Bạc hà Châu Âu ngoài menthol còn chứa thêm một số hợp chất thứ cấp khác có lợi cho sức khỏe như flavonoid lợi mật, menthofuran tạo mùi hương dịu ngọt Để tạo được sản phẩm trà dạng túi lọc có hương vị mới, đề tài chọn bổ sung thêm Bạc hà Châu Âu vào thành phần

Mặt khác, trong bột trà xanh cũng chứa nhiều hợp chất có tác dụng thư giãn thần kinh và đang được bán trên thị trường, đây là nguồn nguyên liệu phù hợp cho ý tưởng tạo sản phẩm trà xanh hương Bạc hà ở dạng hòa tan Để làm giảm sự lấn át mùi hương từ trà, hạn chế sự thất thoát tinh dầu Bạc hà trong quá trình gia nhiệt và tăng độ hòa tan cho sản phẩm, đề tài chọn bổ sung thêm tinh bột biến tính β – cyclodextrin vào thành phần phối trộn của trà Để tạo dư vị ngọt cho trà, đề tài chọn

bổ sung Cỏ ngọt vào thành phần Do Stevia trong Cỏ ngọt tạo dư vị ngọt cho các sản phẩm trà mà không ảnh hưởng các bệnh nhân đái tháo đường

Hy vọng nghiên cứu này có thể thỏa mãn được phần nào cho nhu cầu cải thiện sức khỏe của mọi người

1.2 Yêu cầu

- Tìm được phương pháp sấy đảm bảo độ ẩm thích hợp, mùi thơm dễ chịu, vị thanh ngọt hài hòa, không chứa một số vi sinh vật có hại

- Xác định tỷ lệ phối trộn thích hợp cho ra sản phẩm trà mới

- Kiểm tra, đánh giá sản phẩm qua số lượng vi sinh vật có hại, nấm men, nấm mốc, ẩm độ trong sản phẩm

1.3 Nội dung thực hiện

- Sấy trà ở 3 điều kiện nhiệt độ 65o trong 1 giờ; 65o trong 45 phút và 80o trong

15 phút; 80o trong 45 phút

- Kiểm tra độ ẩm và vi sinh cho sản phẩm

- Chọn sản phẩm đạt tiêu chuẩn về vi sinh và ẩm độ, tìm tỷ lệ thành phần thích hợp thông qua phương pháp đánh giá cảm quan sản phẩm

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây Bạc hà

2.2.1 Nguồn gốc cây Bạc hà

Nguồn gốc của cây Bạc hà là một điều bí ẩn, nhưng cây dã có từ lâu, lá khô từng được tìm thấy trong tháp Ai Cập có từ khoảng 1000 năm TCN Người Hy Lạp

và La Mã đã từng đánh giá cao giá trị của cây (Chevallier, 1993)

Từ thế kỷ 18, họ Bạc hà đã được nghiên cứu khá nhiều Năm 1753, Linnaeus đã đặt tên cho 33 chi, 223 loài và xếp chúng vào 2 phân lớp: 2 nhị (Diandria) và 4 nhị với 2 nhị dài và 2 nhị ngắn (Didynamia) Sau Linnaeus, các tác giả Adanson (1763), Moench (1794) đã công bố thêm các taxon và sắp xếp chúng theo kiểu của Linnaeus Mãi đến năm 1789, nhờ công trình nghiên cứu của Jussieu họ Bạc hà mới chính thức

được coi là một taxon riêng dưới tên gọi Labiatae Juss (họ Hoa môi) Năm 1836, Lindley đã đặt tên khác cho họ này là Lamiaceae Lindl (lấy từ tên chi Lamium) Tuy nhiên, nhiều nhà thực vật vẫn quen gọi là Labiatae Theo luật Danh pháp hiện hành,

họ này có thể dùng cả 2 tên Labiatae (họ Hoa môi) và Lamiaceae (họ Bạc hà) (Trích

dẫn bởi Vũ Xuân Phương, 2000)

2.2.2 Cây Bạc hà Châu Á (Mentha arvensis L.)

 Đặc điểm hình thái

Cây thân thảo đứng, cao 30 – 60 cm, có thân ngầm Thân vuông, nhẵn hay có lông tơ ngắn ở phần non

Lá hình trứng – hình bầu dục, cỡ 3 -7 x 1 – 3,5

cm, chóp lá nhọn, gốc tù hay tròn, mép xẻ răng cưa, nhẵn ở mặt trên, có điểm tuyến và lông rải rác trên gân ở mặt dưới

Hoa nhỏ, màu trắng hồng hay tím hồng, mọc thành cụm Lá bắc nhỏ, hình dùi Đài hình chuông

có 5 răng đều nhau Tràng màu tím hay trắng Nhị hướng thẳng, dài bằng nhau, thò khỏi tràng, chỉ nhị nhẵn, bao phấn 2 ô song song

Hình 2.1 Cây Bạc hà Châu Á

Quả hình trứng, dài 0,6 – 0,8 mm, màu nâu

Các bộ phận trên mặt đất có lông gồm lông che chở và lông bài tiết tinh dầu

2.2.3 Cây Bạc hà Châu Âu (Mentha piperita L.) – Bạc hà cay

Hình 2.2 Cây Bạc hà Châu Âu

 Đặc điểm sinh học

Cây thích nghi ở môi trường sáng và ẩm, ưa đất phù sa, đất thịt Cây được trồng bằng hạt vào mùa xuân và thu hoạch trước khi cây ra hoa vào mùa hè

 Phân bố

Bạc hà cay được trồng nhiều làm cây kinh tế ở khắp Bắc Mĩ, Châu Âu và Châu

Á Tại Việt Nam, cây được trồng ở Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Nội (Văn Điển, Từ Liêm) và một số tỉnh khác (Vũ Xuân Phương, 2000)

2.2.4 Thành phần hóa học trong tinh dầu Bạc hà

2.2.4.1 Thành phần hóa học trong tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L

Tinh dầu là thành phần chủ yếu trong cây Bạc hà Hàm lượng tinh dầu trong Bạc hà thường từ 0,5% đến 1%, có khi lên tới 1,3% đến 1,5% Bằng phương pháp lựa chọn giống, Liên Xô cũ đã có những loại Bạc hà chứa hàm lượng tinh dầu đạt từ 5,2% đến 5,6% tinh dầu (tính trên cây, đã được trừ ẩm độ)

Tinh dầu Bạc hà là chất lỏng không màu hay vàng nhạt, có mùi Bạc hà đặc biệt,

vị cay, sau mát Nhẹ hơn nước, không tan trong nước nhưng dễ tan trong ethanol 90o, tan trong 2 – 3 thể tích ethanol 70o thành phần có trong tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L được phân tích bằng sắc ký khối phổ như sau: α – pinene 0,13%, β –

terpinene 0,009%, β – pinene 0,19%, β – myrcene 0,7%, 3 – octanol 0,66%, limonene 0,51%, eucalyptol 0,09%, terpineol Z – β 0,05%, isopulegol 0,43%, menthone 8,09%, isomenthone 1,64%, neomenthol 1,91%, menthol 80,92%, isomenthol 0,13%,

α – terpineol 0,16%, pulegone 0,48%, piperitone 0,6%, thymol 0,4%, β – bourbonene 0,11%, caryophyllene 0,84%, α – caryophyllene 0,11%, germacrene D 0,99%, β – bisabolene 0,7% (Nguyễn Trung Tín và Nguyễn Phương Vỹ, 2008) Trong tinh dầu Bạc hà, 2 thành phần quan trọng là menthol và menthone

Menthol có công thức phân tử là C10H19OH là một terpenoid Trong điều kiện nhiệt độ phòng thường tồn tại ở trạng thái rắn dạng tinh thể hình kim, không màu, trong suốt, không tan hoặc ít tan trong nước Menthol có mùi Bạc hà, mùi của D – menthol yếu hơn L – menthol, vị gây tê, hòa tan tốt trong rượu, este, cloroform,

benzen, dầu thực vật, acid acetic, SO2 và NH3 lỏng Neomenthol có tính độc và luôn

đi kèm menthol Để tách riêng neomenthol ra khỏi menthol, cho hỗn hợp tác dụng với acid succinic hoặc acid phthalic, neomenthol, sẽ tạo thành este với hai acid trên

và tách riêng ra khỏi menthol Menthol trong tinh dầu chủ yếu ở trạng thái tự do nhưng một phần ở dạng kết hợp với acid acetic – dạng este Cả dang tự do và dạng kết hợp cộng lại gọi là menthol toàn phần Với tinh dầu giàu menthol (trên 70%), có thể chiết xuất một phần menthol với nguyên tắc: làm lạnh tinh dầu từ từ để có tinh thể menthol to đều giúp phân tách tinh dầu dễ dàng hơn Lúc đầu có thể kết tinh ở nhiệt độ 14 oC rồi đến 10 oC và 5 oC Khi menthol không kết tinh thêm nữa thì đưa xuống nhiệt độ lạnh thấp hơn Việc lọc lấy menthol phải tiền hành trong điều kiện nhiệt độ thấp Menthol thu được đem rửa nhiều lần bằng nước lạnh nhằm loại hết phần tinh dầu còn sót lại Hong khô menthol tự nhiên trên khay ở nhiệt độ 25 – 26oC với luồng gió thổi nhẹ (nếu nhiệt độ vượt quá 26 oC có thể làm bay hơi một phần menthol) và thu được menthol thô Tinh chế menthol thô bằng cách kết tinh lại trong ethanol sẽ thu được loại dược dụng

Hình 2.3 Công thức cấu tạo menthol

( http://chemistry.about.com )

Menthone có công thức phân tử là C10H18O, là một monoterpen có công thức cấu tạo tương tự với menthol, chỉ khác ở nhóm chức rượu –OH được thay thế bằng oxi Trong tự nhiên L – menthone là dạng phổ biến nhất

Khi cất tinh dầu, người ta để cây héo trong vòng 24 giờ rồi mới cất để chuyển hóa menthone thành menthol

Hình 2.4 Công thức cấu tạo menthone

( http://commons.wikimedia.org )

2.2.4.2 Thành phần hóa học trong tinh dầu Bạc hà Mentha piperita

Bạc hà cay chứa các flavonoid (menthosid, isorhoifolin, hesperetin, eriodictyol – 7 – O – rutinoid, luteolin – 7 – O – rutinosid và rutin), phytol, các tocopherol (α và ), carotenoid (α và β), betain, cholin, azulen, acid rosmarinic và tanin Các flavonoid

có tác dụng lợi mật trên chó

Bạc hà cay còn chứa 0,1 đến 1% (thông thường là 0,3 – 0,4%) tinh dầu, trong

đó có menthol 29 – 48%, menthone 20 – 31%, menthyl acetat 3 – 10%, menthofuran

1 – 7%, limonen Ngoài ra, trong tinh dầu còn chứa các thành phần: viridiflorol, pulegon 1 – 11%, 1, 8 cineol 6 – 7,5%, piperitone, caryophylen, bisabolen, isomenthol, isomenthone, α và β pinen, neomenthol, ledol, d – tran – sabinen hydrat, bicycloelemen… (Nguyễn Thượng Đồng và ctv, 2005)

Lá non chứa nhiều menthone hơn lá già Ở nụ hoa có nhiều menthofuran Menthofuran có mùi thơm dễ chịu, cần thiết có trong tinh dầu với một lượng nhỏ Tuy nhiên, nếu có nhiều sẽ dễ bị oxi hóa, tinh dầu dễ hóa nhựa Tinh dầu Bạc hà

Mentha piperita có mùi thơm mát, dễ chịu

2.2.5 Giá trị từ cây Bạc hà

Tinh dầu Bạc hà có tác dụng kháng khuẩn Trong thử nghiệm in vitro trên một

số chủng vi khuẩn và nấm, tinh dầu Bạc hà cay có tác dụng ức chế các vi khuẩn Gram dương mạnh hơn so với các vi khuẩn Gram âm và ức chế sự nảy mầm của bào

tử nấm men, nấm mốc, nấm da

Tinh dầu Bạc hà bốc hơi nhanh, gây cảm giác mát và tê tại chổ, được dùng trong trường hợp đau dây thần kinh, xoa bóp nơi sưng đau như khớp xương, thái dương khi nhức đầu Cây Bạc hà là một vị thuốc chữa loét dạ dày, làm giảm bài tiết dịch vị và giảm đau (Đỗ Tất Lợi, 2001) Cơ thắt Oddi, được gây co bởi morphin hydroclorid, và được dãn ra khi tiêm vào tĩnh mạch động vật thí nghiệm nhũ dịch tinh dầu Bạc hà cay với liều 0,1 – 1 mg/kg (Đỗ Huy Biên và ctv, 2005)

Trong Bạc hà cay, ngoài menthol trong tinh dầu có tác dụng gây tê còn có flavonoid có tác dụng lợi mật Trong thành phần tinh dầu Bạc hà cay còn chứa menthofuran tạo nên một mùi thơm dịu

Tinh dầu Bạc hà còn được ứng dụng làm hương liệu trong kỹ nghệ thực phẩm, làm thơm ngon bánh kẹo, rượu khai vị, nước súc miệng, thuốc đánh răng, hương liệu thuốc

lá, mỹ phẩm… thuốc bôi chữa đau răng (thuốc bỏng Bonain) gồm 1 phần menthol, 1

phần phenol, và 1 phần cocain (Nguyễn Khang và Phạm Văn Khiển, 2001)

2.2 Tổng quan về trà Matcha Nhật Bản

2.2.1 Lịch sử trà Matcha Nhật Bản

Trà là một thức uống với hơn 5.000 năm lịch sử Người ta bắt đầu uống trà từ khoảng 2.500 năm trước Công nguyên Khu vực Tây Nam tỉnh Vân Nam, Trung Quốc được biết đến như là nơi khai sinh của trà Vào thế kỉ thứ 7 trà đã trở nên phổ biến trên toàn đất trước Trung Hoa Chính các nhà sư Phật giáo đã có công mang trà

ra tới cộng đồng

Matcha được sử dụng bởi các nhà sư Phật giáo từ thời cổ đại Các nhà sư tự bào chế thuốc từ các loại thực vật khác nhau Từ khi được phát hiện, trà đã được biết đến như một loại thuốc Bởi vậy các nhà sư Phật giáo đã nghiền trà ra thành bột như họ vẫn nghiền các loại cây cỏ khác để làm thuốc Matcha ra đời từ đó

Năm 1191 Thiền Sư Eisei đã đưa ý tưởng mới mang tính cách mạng về việc uống trà từ Trung Quốc sang Nhật Bản Eisai đi khắp đất nước và trồng cây trà Trong cuốn sách "Kissa yojoki" Eisei viết "Trà là phương thuốc tuyệt vời của tinh hoa và có khả năng làm cho cuộc sống của một người đầy đủ hơn và toàn vẹn hơn Trà có một sức mạnh phi thường trong việc kéo dài tuổi thọ của một ai đó Nơi nào

mà conngười trồng cây trà, nơi đó con người sẽ sống lâu " Từ thời điểm đó, Matcha

đã trở thành một loại "thuốc bí mật" của tu sĩ Phật giáo và triều đình

Vào thế kỉ thứ 6, một thiền sư khác đã định hướng cho hình ảnh của trà ở Nhật Bản: Sen – no – Rikyu phát minh ra nghi lễ trà đạo Loại trà duy nhất được sử dụng trong nghi lễ trà đạo nổi tiếng là trà xanh Matcha Dần dần khi trà đạo được coi như là một hình thức nghệ thuật, Matcha đã trở nên phổ biến trong tầng lớp Samurai uy quyền

ở Nhật Bản Trong nhiều thế kỷ, Matcha vẫn là một bí mật của giới tinh hoa Nhật Bản Nhưng giờ đây nó là một tái khám phá vô cùng thú vị của thế giới trà hiện đại

2.2.2 Trà Matcha Nhật Bản

Trà xanh dùng để chế biến Matcha cần được giữ trong bóng mát, hạn chế ánh nắng mặt trời bằng cách phủ bên trên lớp nylon nông nghiệp màu đen từ khoảng cuối tháng tư trong vòng 30 ngày Điều này sẽ làm tăng chất diệp lục có trong từng lá trà non, giúp lá trà có màu xanh thẫm, đồng thời tăng chất L – Theanine, chất thư giãn tự nhiên trong lá trà xanh, giúp giảm đi vị chát, tạo cho trà hậu vị ngọt dịu, không gắt Vào mùa thu hoạch, người trồng trà cẩn thận chọn hái bằng tay những lá trà tươi nhất, mượt mà nhất Sau quá trình chọn lọc, tinh chế kỹ lưỡng, những lá trà tinh khiết được nghiền dưới đá nghiền Granite trong phòng thoáng sạch với nhiệt độ được điều chỉnh phù hợp nhằm đảm bảo không khí trong lành được đòi hỏi nghiêm ngặt để có thể sản xuất Matcha Nhằm duy trì hương vị, người ta mất khoảng cả giờ đồng hồ để nghiền 40 gam lá trà chất lượng cao để sản xuất ra Matcha thơm ngon Để đạt được màu trà, hương vị tốt nhất, giai đoạn tinh chế cuối cùng sẽ giúp Matcha có màu xanh tươi tự nhiên, đảm bảo tốt cho sức khoẻ và an toàn vệ sinh thực phẩm

Hình 2.5 Trà Matcha được nghiền và đóng gói tại Nhật Bản

( http://www.freshteacompany.eu/c-1949166/matcha/ )

Hình 2.6 Cây cỏ ngọt

2.2.3 Các hợp chất có ích của trà Matcha

Trong Matcha có chứa các chất dinh dưỡng có thể đem lại lợi ích lớn như: Chất chống oxy hóa: Tea – catechines, đặc biệt là EGCG một chất chống oxy hóa rất tốt 30% trọng lượng của các loại trà xanh đã sấy khô là EGCG Trong Matcha, tỷ lệ này là 70% Trong mỗi Gram Matcha có khoảng 70 mg catechins, cao hơn nhiều so các loại trà túi lọc thông thường

Axit amin: L - theanine là một acid amin chủ yếu có thể được tìm thấy trong trà xanh L - theanine có tác dụng làm dịu, thư giãn và làm chậm tác dụng của Teaine

Teaine: Tea - caffeine Caffeine cũng được biết đến với tác dụng kích thích thần kinh

2.3 Cây Cỏ ngọt

Cỏ ngọt (Stevia Rebaudiana) thuộc họ

Cúc Asteraceae còn được gọi là cỏ đường, cỏ mật có nguồn gốc từ Nam Mỹ Từ năm 1908

Cỏ ngọt đã được biết đen khi hai nhà khao học Reseback (1908) và Dieterich (1909) đã chiết xuất được glucoside từ lá Cỏ ngọt Đến năm

1931 Bridel và Lavieille mới xác định được glucoside đó chính là Stevioside, chất ngọt cơ bản tạo nên độ ngọt ở loại cây này

Cỏ ngọt là loài mang lại nhiều lợi ích cả

về kinh tế lẫn dược liệu Giá của đường từ Cỏ ngọt trên thị trường hiện nay là 1,5 triệu đồng/kg trong khi đường mía chỉ khoảng 20.000 đồng/kg

Với độ ngọt gấp 300 lần đường mía, lại không làm tăng lượng đường huyết nên việc sử dụng đường từ Cỏ ngọt thay cho đường mía rất có ích đối với các bệnh nhân đái tháo đường Ngoài ra còn có tác dụng giãn thành mạch toàn thân nên rất tốt cho người bị cao huyết áp Stevia trong Cỏ ngọt có tác dụng chống lại các bệnh dạ dày, giảm đau đớn và giúp tiêu hóa tốt hơn Một nghiên cứu trên chuột của Planas (1968), khi cho chuột cống trắng cái và đực uống nước có 5% cao Cỏ ngọt sẽ có tá dụng ngừa thai (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thanh Tâm, 2013)

Cỏ ngọt cũng được dùng nhiều trong thực phẩm Tại Nhật Bản, Cỏ ngọt được dùng rộng rãi để pha chế làm tăng độ ngọt của các loại thực phẩm khác nhau Được tạo thành đường dạng viên nhằm hạn chế sử dụng đường Saccharose Ngoài ra, cây

Cỏ ngọt còn được dùng trong chế biến rượu màu, nước hoa quả, các loại bánh kẹo, các món tráng miệng đông lạnh, ướp các loại hải sản sây khô, chế biến dấm

Trong công nghệ chế biến mỹ phẩm, Cỏ ngọt được ứng dụng trong các loại sữa làm mượt tóc, kem làm mềm da…

dễ cho đi electron

Cyclodextrins (CDs) được sản xuất từ tinh bột bằng phản ứng vòng hóa các chuỗi glucopyranose mạch thẳng nhờ enzyme cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) cùng với α-amylase Đầu tiên tinh bột được hồ hóa bằng nhiệt độ hoặc sử dụng α-amylase, sau đó bổ sung CGTase cho chuyển hóa CGTases có thể tổng hợp nên tất cả các dạng cyclodextrin, do vậy sản phẩm là hỗn hợp của 3 loại phân tử vòng chính với tỷ lệ phụ thuộc vào enzym sử dụng: mỗi CGTase có đặc tính riêng của nó

về tỷ lệ α : β : γ Tách chiết 3 loại phân tử cyclodextrin cần dựa vào khả năng tan trong nước khác nhau của mỗi phân tử: β – CD tan kém trong nước (18,5 g/l hoặc 16,3 mM) (tại nhiệt độ 25oC) có thể thu dễ dàng thông qua sự hình thành tinh thể trong khi α – và γ – CDs dễ tan hơn (lần lượt là 145 và 232 g/l) thường được tách chiết bằng kỹ thuật sắc ký khối phổ nhưng đắt và mất nhiều thời gian Có thể tổng hợp bằng cách bổ sung tác nhân phức hợp trong bước chuyển đổi của enzyme – tác nhân (thường các dung môi hữu cơ như toluene, acetone hoặc ethanol) để hình thành nên phức hợp với cyclodextrin sau đó kết tủa Sự hình thành phức hợp từ sự chuyển

odextrin đưdụng trong

ng độc: Cáchành phần p

và chúng lu

g tạo phức:

chất khác n

id hữu cơ, cn…(Hicks,

ủa phân tử phần tử đượthể sẽ đượcCDs Nhìn c

ng mại chủ y

ược ứng dụ

g Công nghệ

c β – CDs nphổ biến chouôn trao đổi

β – CDs cónhau bao gồcác chất thơ1996) Đâychủ thể β –

ợc bao bọc b

c bao bọc mchung, một

ụng trong nh

ệ Thực phẩnày đã đượ

o sản xuất tchất bởi cá

ó thể tạo ph

ồm các chất

ơm chất khí

y là hiện tượ– CDs Ở pbên trong đưmột phần haphần tử β –amin, các m

hiều lĩnh vự

ẩm

ợc chấp nhậthực phẩm

ác vi sinh vậhức bao (d

t béo mạch

í, các hợp cợng một khhức này β –ược gọi là c

ay toàn bộ v– CDs sẽ chmàu tự nhiên

nh sinh học

ử β – cyclod

dia.org )

tủa, do vậyderman và c

ật tại ruột kạng khách

h thẳng, cáchất phân cựhách thể bị – CDs đượccác phần tửvào trong lỗhứa một phầ

n có trong t

c có trong t

dextrin

y làm giàu ctv, 2000)

Ds có nhiều

ốt thập kỷ 1

ng không bịkết

thể và chủ aldehyt, ce

ực như halogiữ, bị bao

c gọi là phầ

ử khách thể

ỗ hang của p

ần tử kháchthực phẩm,hực phẩm,

o bọc

ần tử Các phần

h thể làm tăng

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 7/2013 đến tháng 12/2013, tại Bộ môn Công nghệ Sinh học và Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Nguyên liệu sử dụng

Nghiên cứu thực hiện trên đối tượng chính là cây Bạc hà Châu Á (Mentha arvensis L.) và Bạc hà Châu Âu (Mentha piperita) được trồng trong vườn ươm thuộc

Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường

Ngoài ra, đề tài còn sử dụng thêm các thành phần phụ như:

- Tinh dầu Bạc hà được ly trích từ cây Bạc hà Châu Á (Mentha arvensis L.)

thu hoạch trong vườn ươm Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

- Trà Matcha Nhật Bản được mua tại Công ty Trách nhiệm hữu hạn Trà Xanh Fuji, trụ sở tại Khu B, tòa nhà Indochina Park, số 04 Nguyễn Đình Chiểu, P Đakao, Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh

- Tinh bột biến tính β – cyclodextrin được mua của Công ty Xuân Hải, địa chỉ 197/36, Nguyễn Thị Nhỏ, P 9, Quận Tân Bình, Thành phố Hồ Chí Minh

- Cỏ ngọt dạng bột được mua của Công ty cổ phần Stevina, trụ sở tại Văn phòng 301/5, 99 Lê Duẩn, quận Hoàn Kiếm, Hà Nội; dạng lá được thu hoạch từ vườn ươm Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ

- Bộ ly trích tinh dầu, bếp điện, eppendoff

- Cân phân tích, kéo, tủ sấy, khay, hộp nhựa kín, túi PE vô trùng

- Tủ cấy, pipette, đĩa petri, ống nghiệm, nồi hấp khử trùng, máy votex

3.2.3 Hóa chất

- Dung dịch pha loãng: Buffer Peptone Water (Peptone, NaCl, Na2HPO4, NaH2PO4, nước cất), Salin Peptone Water (peptone, NaCl)

- Môi trường dùng đếm vi sinh vật hiếu khí Plate Count Agar (Tryptone, Glucose, Agar, nước cất)

- Môi trường tổng hợp VRB, BGBL, TBG, môi trường XLD, môi trường phục hồi TSA, môi trường định lượng tổng số nấm men, nấm mốc DRBC

- Môi trường cho phản ứng sinh hóa: TSI, Manitol Phenol Red Broth

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Lựa chọn nguyên liệu

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Tâm (2013) thành công trong việc xác định

tỷ lệ Bạc hà Châu Á và Cỏ ngọt trong trà túi lọc Bạc hà Trong đề tài nghiên cứu này, thành phần trà sẽ được bổ sung thêm Bạc hà Châu Âu, nhằm đa dạng sản phẩm nhờ mùi thơm dịu của menthofuran có trong Bạc hà Châu Âu

Bạc hà được trồng ở vườn ươm cùng điều kiện độ ẩm, ánh sáng và được kiểm soát các yếu tố như thuốc bảo vệ thực vật, phân bón

Cây Bạc hà Châu Á và Châu Âu đều được chọn thu hoạch vào lúc cây ra hoa (khoảng từ 45 – 60 ngày), lúc này lá sẽ cho hàm lượng tinh dầu cao hơn

Lá của 2 giống Bạc hà Châu Á Mentha arvensis L và Bạc hà Châu Âu Mentha piperita được chọn làm nguyên liệu cho nghiên cứu này

Hình 3.1 Hai giống Bạc hà Mentha arvensis L và Mentha piperita

(a) Bạc hà Mentha piperita; (b) Bạc hà Mentha arvensis L

3.3.2 Chuẩn bị nguyên liệu

Bạc hà sau khi thu hoạch ngoài vườn được rửa sạch lại dưới vòi nước, xả bằng nước muối và nước sạch Dàn trải nguyên liệu trên khay và phơi ở nhiệt độ phòng với điều kiện phòng được lau dọn sạch, kín và hạn chế ra vào Trà sau khi phơi ráo nước được cất vào hộp kín, và được cắt nhỏ khoảng 1 mm trước khi sấy

Cân bạc hà, Cỏ ngọt vào 36 khay nhỏ với 9 khay cho mỗi tỷ lệ và dàn trải sao cho mẫu được trải đều và không xếp chồng lên nhau

Cân trà Matcha, β – cyclodextrin, bột Cỏ ngọt và phối trộn với tinh dầu bạc hà rồi cho vào 36 khay nhỏ tương tự như thực hiện với trà lá

Tay phải rửa sạch và lau khô trước khi tiếp xúc với mẫu

3.3.3 Tìm thời gian và nhiệt độ sấy thích hợp

Khi thực phẩm được gia nhiệt đến trên 60oC thì phần lớn các vi sinh vật cũng như enzyme đều bị giảm hoặc đình chỉ hoạt động Do đó nghiên cứu được tiến hành sấy các khay trà theo các mức nhiệt độ và thời gian:

- Mức 1: sấy ở 65oC trong 1 giờ

- Mức 2: sấy ở 65oC trong 45 phút sau đó cho vào hộp kín ủ 5 – 6 giờ rồi sấy thêm 15 phút ở 80oC

- Mức 3: sấy ở 80oC trong 45 phút

3.3.4 Xác định độ ẩm trong sản phẩm

Sấy cả nắp và đĩa petri trong tủ sấy ở 105oC trong 1 giờ, để nguội trong bình hút

ẩm, cân lại khối lượng đĩa đến 0,001 gam Cân a g mẫu của mỗi khay cho vào đĩa petri, đậy kín, cân lại khối lượng tổng hợp, sấy ở 105oC và cứ sau 3 giờ thì mang ra cho vào bình hút ẩm, để nguội và cân lại một lần cho đến khi khối lượng mẫu không đổi

Xác định độ ẩm trong mẫu trà sau khi sấy theo công thức:

độ ẩm mẫu  %   G a 100%

GVới G: khối lượng mẫu khô trước khi sấy

a: khối lượng mẫu khô sau khi sấy Qui trình kiểm tra ẩm độ dựa vào TCVN 5613 : 2007 về đo độ ẩm của sản phẩm

3.3.5 Thực hiện các phản ứng kiểm tra vi sinh cho sản phẩm

Sản phẩm được kiểm tra sự có mặt của tác nhân vi sinh gây hại cho sức khỏe cũng như chất lượng của sản phẩm theo các Tiêu chuẩn Việt Nam:

- TCVN 4884 : 2005 về định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí có trong sản phẩm

- TCVN 6848 : 2007 về định lượng tổng số Coliform có trong sản phẩm

- Tham chiếu theo ISO 21527 – 2 : 2008 về định lượng nấm men, nấm mốc có trong sản phẩm

- TCVN 4829 (ISO 6579), phương pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch

 Lấy mẫu

Thời gian lấy mẫu kiểm tra là 5 ngày sau khi sấy Mẫu được chọn ngẫu nhiên trong 10 gói mẫu được sản xuất với cùng nhiệt độ và thời gian Mẫu phải đạt yêu cầu sau: bên ngoài bình thường, bao bì không bị rách, nguyên liệu bên trong có màu sắc bình thường như những mẫu sản phẩm khác, không có hiện tượng nào khác với mẫu chung xảy ra

3.3.5.1 Chuẩn bị hóa chất

 Chuẩn bị Buffer:

Salin Peptone Water

Buffer Peptone Water

Dung dịch Peptone Water 0,1%

 Chuẩn bị môi trường

Môi trường định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí Plate Count Agar, pha sẵn vào chai thủy tinh

Môi trường định lượng tổng số Coliform Violet Red Bile Agar, pha sẵn vào chai

thủy tinh, môi trường BGBL (phải có chuông Durham ngược)

Môi trường định lượng nấm men, nấm mốc DRBC

Môi trường dùng phát hiện Salmonella, môi trường tăng sinh chọn lọc TBG, môi

trường phân lập XLD, môi trương phục hồi TSA, môi trường thử sinh hóa TSI, Manitol (nếu phát hiện khuẩn lạc)

Một số môi trường yêu cầu không hấp như VRB, TBG, XLD ta phải hấp nước cất trước rồi mới cho môi trường tổng hợp này vào, đun trong lò vi sóng cho tan agar

3.3.5.2 Qui trình định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí

Pha loãng 1 g mẫu vào 9 ml SPW, đồng nhất mẫu trong túi PE vô trùng để được nồng độ pha loãng đầu tiên Cho 1 ml nồng độ đầu tiên vào ống nghiệm chứa 9 ml SPW rồi đồng nhất để thu nồng độ thứ hai, cứ thế tiến hành cho nồng độ thứ 3

Cho vào mỗi đĩa 1 ml mỗi nồng độ pha loãng, đổ 15 ml môi trường PCA đã đun tan làm nguội đến 45oC vào và xoay đĩa cho hỗn hợp đồng nhất Lưu ý, tránh để thạch chạm vào nắp đĩa Để đĩa ở mặt phẳng ngang chờ môi trường đông đặc rồi lật ngược đĩa và ủ ở tủ ấm 30oC + 1oC trong 24 giờ

Khi thời gian ủ kết thúc, tiến hành đếm tất cả các khuẩn lạc có trên đĩa Chọn các đĩa có khoảng 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa để tính kết quả theo công thức:

Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g) (TPC)

TPC =

⋯Với N: Tổng số khuẩn lạc trên các đĩa

n: Số đĩa tại mỗi nồng độ

V: Thể tích cấy vào đĩa

F: Độ pha loãng

3.3.5.3 Qui trình định lượng tổng số Coliform

Cho vào mỗi đĩa 1 ml mỗi nồng độ pha loãng với SPW, đổ 15 ml môi trường VRB đã đun tan làm nguội đến 45oC vào và xoay đĩa cho hỗn hợp đồng nhất tương tự với cách tiến hành ở định lượng vi sinh vật hiếu khí Đặt điã ở môi trường nằm ngang chờ môi trường đông đặc rồi lật ngược đĩa và ủ 37oC + 0,5oC trong 24 – 48 giờ

Khi thời gian ủ kết thúc, đếm tất cả các khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ đậm, có quầng tủa muối mật và đường kính > 0,5 mm Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng trong số các khuẩn lạc đếm được ở mỗi mẫu cấy sang môi trường BGBL và ủ 37oC + 0,5oC trong

24 – 48 giờ Khi thời gian ủ kết thúc, đếm số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL để tính kết quả theo công thức sau:

Với R là tỷ lệ xác nhận