Ứng dụng phương pháp RT – PCR (REVERSE TRANSCRIPTASE – POLYMERASE CHAIN REACTION ) để phát hiện vi rút dịch tả lợn trên đoạn gen e2

Ứng dụng phương pháp RT – PCR (REVERSE TRANSCRIPTASE – POLYMERASE CHAIN REACTION ) để phát hiện vi rút dịch tả lợn trên đoạn gen E2Ứng dụng phương pháp RT – PCR (REVERSE TRANSCRIPTASE – POLYMERASE CHAIN REACTION ) để phát hiện vi rút dịch tả lợn trên đoạn gen E2Ứng dụng phương pháp RT – PCR (REVERSE TRANSCRIPTASE – POLYMERASE CHAIN REACTION ) để phát hiện vi rút dịch tả lợn trên đoạn gen E2Ứng dụng phương pháp RT – PCR (REVERSE TRANSCRIPTASE – POLYMERASE CHAIN REACTION ) để phát hiện vi rút dịch tả lợn trên đoạn gen E2

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

LỜI CẢM ƠN iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG BIỂU v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Hiểu biết về vi rút DTL và bệnh do vi rút DTL gây ra 3

2.1.1 Lịch sử căn bệnh 3

2.1.2 Bệnh do vi rút DTL gây ra 11

2.2 Phương pháp RT - PCR 18

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu 22

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

3.3 Nguyên vật liệu 22

3.3.1 Giống vi rút DTL 22

3.3.2 Hoá chất, sinh phẩm 22

3.4 Phương pháp nghiên cứu 23

3.4.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào 23

3.4.2 Phương pháp gây nhiễm vi rút DTL trên dòng tế bào PK15a 26

3.4.3 Chiết tách, tinh sạch RNA của vi rút DTL 26

3.4.4 Phương pháp tổng hợp cDNA 27

3.4.5 Thiết kế mồi đặc hiệu gen vùng noncoding E2 của vi rút DTL 28

3.4.6 Phương pháp PCR 28

3.4.7 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR 29

3.4.8 Phương pháp giải trình tự gene 29

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Kết quả nuôi cấy tế bào 30

4.2 Kết quả gây nhiễm vi rút DTL trên dòng tế bào PK15a 31

4.3 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu 32

4.4 Tối ưu hóa điều kiện phản ứng RT - PCR 33

4.5 Ứng dụng RT - PCR phát hiện đoạn gen noncoding E2 vi rút DTL 34

4.6 Xác định trình tự nucleotide của đoạn gen ncE2 vi rút DTL 35

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Đề nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành báo cáo khóa luận tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi còn nhận được sự giúp đỡ tận tình của nhiều cá nhân và tập thể Nhân dịp này cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới:

TS Trần Đức Hoàn khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang, TS Trần Thị Thanh Hà, Bộ môn Hóa sinh - Miễn dịch, Viện Thú y Quốc gia đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.

Các thầy cô trong khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang

Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS Đặng Vũ Hoàng và toàn thể các nhân viên Bộ môn Hóa sinh - Miễn dịch, Viện Thú y đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi trong quá trình thực tập khóa luận tốt nghiệp.

Tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

Xin chân trọng cảm ơn!

Bắc Giang, ngày tháng năm 2018

Sinh viên

Đặng Phương Anh

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

3’NTR 3’ nontranslated

BDV Border disease virus

BVDV Bovine viral diarrhea virus

cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid

CSF Classical Swine Fever

CSFV Classical Swine Fever virus

dNTP deoxy nucleoside triphosphate

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Ribonucleic Acid

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Thành phần PCR cho 25 µl phản ứng 29Bảng 3.2 Chu trình nhiệt PCR 29Bảng 4.1 Các thông số kỹ thuật của primer khuếch đại vùng noncoding E2 virút DTL 33

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Bản đồ tình trạng bệnh DTL của các nước thành viên của tổ chức Thú

y thế giới cập nhật lần cuối vào tháng 5 năm 2017 4

Hình 2.2 Cấu trúc bộ gen Flavivirus 10

Hình 2.3 Sơ đồ nguyên lý phản ứng RT - PCR 19

Hình 4.1: Tế bào PK15a sau 24 giờ nuôi cấy với độ phóng đại 20X 30

Hình 4.2 Tế bào PK15a gây nhiễm vi rút DTL với độ phóng đại 40X 31

Hình 4.3 Trình tự gen vi rút DTL đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu NCBI được sử dụng để thiết kế mồi đặc hiệu cho vùng noncoding E2 32

Hình 4.4: Phổ điện di sản phẩm phản ứng RT - PCR 33

Hình 4.5: Phổ điện di sản phẩm phản ứng RT - PCR chủng VN91 phân lập 34

Hình 4.6 Trình tự gen của gen ncE2 vi rút DTL được tách dòng 35

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngày nay, với những mô hình chăn nuôi quy mô công nghiệp ngày càngphát triển thì kéo theo đó dịch bệnh ngày càng trở nên phức tạp Trong đó, bệnhDịch tả lợn (DTL) cổ điển (Classical Swine Fever - CSF) là một trong những bệnhtruyền nhiễm nguy hiểm trên đàn lợn bởi sự lây lan mạnh, tỷ lệ chết cao (85 -100%) cho mọi lứa tuổi và gây ra những thiệt hại nặng nề về kinh tế ( Nguyễn Thị

Phương Duyên và cs, 2001) Bệnh DTL do vi rút thuộc chi Pestivi rút,

họ Flaviviridae gây ra; bệnh lây lan chủ yếu qua đường tiêu hóa và đường hô

hấp do tiếp xúc trực tiếp với lợn ốm hoặc gián tiếp qua các chất bài tiết, thức ăn,nước uống, dụng cụ chăn nuôi Nguyễn Tiến Dũng, 1999; Bhaskar et al, 2015)

Trong công tác chẩn đoán hay phòng và trị bệnh, các phương pháp truyềnthống dựa trên dịch tễ lâm sàng hiện ngày càng bộc lộ nhiều khuyết điểm vàkhông thể theo kịp tình hình diễn biến của bệnh như hiện nay Trong khi đó hiệnnay việc áp dụng công nghệ sinh học vào chẩn đoán bệnh đang phát huy tácdụng rất hiệu quả đặc biệt là việc chẩn đoán nhanh và chính xác mầm bệnh vàgóp phần không nhỏ trong quá trình điều trị cũng như ngăn chặn dịch bệnh lấylan Trong thú y, sinh học phân tử với trọng tâm là công nghệ di truyền đã đượcứng dụng khá sớm trong chẩn đoán, phòng và trị bệnh trên nhiều đối tượng gâybệnh, trong đó có bệnh dịch tả lợn được coi là một trong 4 bệnh “đỏ” của ngànhchăn nuôi Việt Nam

Để phân tích chính xác virus gây bệnh DTL với những virus khác cùngchi Pestivirus như BVDV, BDV , kỹ thuật RT - PCR trở nên hữu ích với nhữngđoạn gene như 5’NTR, E2, NS5B trong việc phân biệt chủng vi rút DTL và tổngkết sự phân biệt chủng vi rút DTL ở nhiều nước trên thế giới kể cả châu Á; kếtquả cho thấy mối liên giữa các chủng ở một số nước Gene E2 là một trongnhững gene quan trọng trong bộ gene của vi rút DTL được sử dụng nhiều trong

những nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền vi rút Vì vậy việc thựchiện đề tài “ Ứng dụng phương pháp RT – PCR (REVERSE TRANSCRIPTASE– POLYMERASE CHAIN REACTION ) để phát hiện vi rút dịch tả lợn trênđoạn gen E2” nhằm ứng dụng vào công tác chẩn đoán bệnh và tạo tiền đề chonhững nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền vi rút DTL sau này.

1.2 Mục tiêu của đề tài

Phát hiện được vi rút DTL dựa trên đoạn gen E2 bằng kĩ thuật RT – PCR.Xác định trình tự nucleotide của đoạn gen ncE2 vi rút DTL

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Hiểu biết về vi rút DTL và bệnh do vi rút DTL gây ra

2.1.1 Lịch sử căn bệnh

2.1.1.1 Trên thế giới

Bệnh DTL được đưa vào danh sách loại A của Tổ chức Thú y Thế giới(OIE) như 1 bệnh truyền lây mạnh và gây thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôilợn của thế giới (Moennig et al, 2003) Những nghiên cứu trước đây cho thấybệnh lây lan chủ yếu qua đường mũi và miệng Ngoài ra, vi rút DTL cũng bịtruyền lây qua tinh dịch hay thức ăn tạp nhiễm (Floegel et al, 2000)

Quá trình phát triển của bệnh DTL khá phức tạp và diễn biến dưới nhiềuthể bệnh khác nhau, tùy thuộc vào độc lực của vi rút, sự tương tác giữa vi rút và

cơ thể vật chủ (Paton and Greiser - Wilke, 2003) Nhìn chung, các thể bệnh cóthể được phân loại như sau: Nhiễm sau khi sinh (post-natal infections): bao gồmthể quá cấp, cấp tính và á cấp tính; Nhiễm qua nhau thai (trans-placentalinfections); Nhiễm mạn tính (persistent infections) (Koenen et al, 1996; NguyễnTiến Dũng, 1999)

Bệnh DTL được mô tả lần đầu vào năm 1810 ở Tennessce và ổ dịch đầu tiênđược ghi nhận vào năm 1833 tại bang Ohio của Mỹ, sau đó bệnh lan rộng ra khắpChâu Mỹ, Châu Âu và Châu Á ( Nguyễn Tiến Dũng, 1999; Paton and Greiser -Wilke, 2003) Năm 1978 bệnh hoàn toàn bị khống chế ở Bắc Mỹ và sau đó cũng

đã được thanh toán ở Úc và toàn bộ các nước ở Tây Âu (Paton and Greiser-Wilke,2003; Singh and Rajak, 2017) Mặc dù đã có nhiều nỗ lực trong công tác kiểm soátdịch bệnh, song bệnh DTL vẫn còn xuất hiện ở một số nước thành viên Châu Âu vàgây thiệt hại nặng về kinh tế Cụ thể: ở Hà Lan, chi phí trực tiếp để khống chế bệnhDTL lên tới 93 triệu USD năm 1983 - 1985 Nhiều ổ dịch nghiêm trọng đã xảy ra ở

Bỉ, Đức năm 1994, và Pháp năm 1997 (Moennig, 2000) Hơn nữa bệnh DTL vẫncòn là vấn nạn và lây lan mạnh mẽ ở Nam và Trung Mỹ, vùng Caribbean, Châu Á

và Đông Âu (Moennig, 2000; Moennig et al, 2003) Hiện nay, tuy dịch đã được

khống chế, nhưng bệnh vẫn xảy ra lẻ tẻ như ở Hà Lan năm 1997 - 1998 (Crauwels

et al, 2003), và vi rút DTL vẫn lưu hành tại một số nước ở châu Âu (Blome et al,2010; Bhaskar et al, 2015)

Cộng đồng Châu Âu đã thiết lập và đưa ra một chường trình nhằm phòng,chống và tiến tới thanh toán bệnh do vi rút DTL cho các nước thành viên dựatrên việc tiêu huỷ các đàn nhiễm bệnh, đồng thời tăng cường các biện pháp vệsinh cũng như pháp chế thú y Ở Châu Á, các nước phát triển như Nhật Bản,Hàn Quốc, Singapore dịch đã hoàn toàn bị khống chế Trong cam kết của cácnước ASEAN, Malaysia đã cam kết thanh toán bệnh DTL vào năm 2015,Philippine, Indonesia, Brunei, Thái Lan năm 2020, các nước khác đều có lộ trìnhkhống chế và thanh toán bệnh DTL (Bhaskar et al, 2015; Rios et al, 2017)

Hình 2.1 Bản đồ tình trạng bệnh DTL của các nước thành viên của tổ chức

Thú y thế giới cập nhật lần cuối vào tháng 5 năm 2017

(Nguồn OIE: http://www.oie.int)

2.1.1.2 Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, bệnh DTL được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1923 - 1924bởi Houdener Từ đó đến nay vẫn còn tồn tại phổ biến và luôn luôn là mối đedoạ nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi lợn nước ta (Đào Trọng Đạt andNguyễn Tiến Dũng, 1985; Nguyễn Tiến Dũng, 1999)

Năm 1960 bệnh xảy ra ở Nghệ An, Phú Thọ Năm 1968 có 481 ổ dịch đượcphát hiện ở miền bắc, tiếp đó năm 1971 bệnh DTL đã xảy ra ở 11 trại lợn xungquanh Sài Gòn Năm 1974 xảy ra ở 17 tỉnh thành phía bắc làm thiệt hại hơn 4 vạncon lợn Bệnh đã lây lan sang các tỉnh ở Nam Bộ năm 1981, Thừa Thiên Huế năm

1990 ( Nguyễn Tiến Dũng, 1999; Nguyễn Thị Phương Duyên và cs, 2001)

Các tỉnh thuộc Trung Trung Bộ dịch xảy ra tương đối rộng vào các năm

1976 - 1978: năm 1976 có 17 ổ dịch, năm 1977 có 36 ổ dịch, năm 1978 có 18 ổdịch (Báo cáo dịch tễ tháng 11 năm 1978, Cục Thú y)

Từ những năm 1980 trở lại đây, theo chương trình quốc gia phòng chốngcác bệnh truyền nhiễm quan trọng nói chung và bệnh DTL nói riêng trên đàn lợnbằng việc sử dụng vắc xin đã thu được những thành quả nhất định, do đó đãphần nào khống chế được dịch bệnh Mặc dù vậy bệnh DTL vẫn xem là mộttrong những bệnh nguy hiểm, là mối đe dọa tiềm ẩn đối với ngành chăn nuôi ởnước ta Bệnh DTL ở nước ta xảy ra quanh năm, tuy nhiên do thời tiết thay đổi(thể hiện rõ ở miền Bắc) và do biến động số lượng của đàn lợn trong năm nênbệnh có lúc tăng lúc giảm (Bùi Quang Anh, 2001)

Ngoài ra, sự bùng phát của bệnh DTL còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tốnhư tỷ lệ tiêm phòng cho đàn lợn, lợn trưởng thành đã có miễn dịch bị giết mổ,lợn con thay đàn bổ sung vào chưa kịp tiêm phòng làm cho tỷ lệ lợn mẫn cảmtrong đàn tăng lên Một số nghiên cứu trong nước gần đây đã cho thấy, 40% sốlợn ở lò mổ dương tích với vi rút DTL (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2002; TrầnThị Dân và cs, 2003)

Việc tiêm phòng theo mùa vụ và tiêm phòng bổ sung thường xuyên gópphần ổn định và hạn chế sự lây lan của dịch, nhưng trong sản xuất thực tế vìnhiều lý do nên việc tiêm phòng chưa thực hiện đúng quy định, do đó bệnh DTLvẫn xảy ra vào các tháng trong năm Lợn bệnh thường thể hiện ở thể mạn tính vàcác trường hợp khác là do nhiễm vi rút khi sơ sinh, bệnh có thể kéo dài và làmột trong những nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn con (Nguyễn Tiến Dũng và

cs, 2002; Phạm Hồng Sơn, 2005; Nguyễn Thị Hạnh Thu và Trần Hạnh Từ,2005)

Theo nghiên cứu của Bùi Quang Anh và cộng sự thì lợn con sau tiêm vắcxin sau 21 ngày thì tỷ lệ huyết thanh có kháng thể kháng vi rút DTL là 91,81% và

tỷ lệ bảo hộ với vi rút DTL là 84,66%, sau đó giảm dần và đến 90 ngày tuổi giảmxuống còn 87,77%, tỷ lệ bảo hộ 78,88% Đến 180 ngày tỷ lệ huyết thanh học cókháng thể DTL giảm xuống còn 50,9% và tỷ lệ bảo hộ với vi rút DTL chỉ còn35,15% Kết quả cho thấy cần phải tiêm vắc xin nhắc lại sau 6 tháng để lợn duy trìđược tỷ lệ bảo hộ có khả năng chống lại vi rút DTL (Bùi Quang Anh, 2001)

2.1.1.3 Cấu trúc của vi rút DTL

Những mô tả đầu tiên về vi rút gây bệnh DTL đã chỉ ra rằng vi rút DTL

thuộc chi Pestivirus, họ Flaviviridae Vi rút DTL có quan hệ mật thiết và có

chung tính kháng nguyên với vi rút gây bệnh tiêu chảy ở bò (BVDV) và vi rútgây bệnh biên giới ở cừu (BDV), cả hai loại vi rút này đều có khả năng gây bệnhtiêu chảy trên lợn Vi rút gây bệnh DTL là thuộc loại RNA vi rút nhỏ một sợi và

có vỏ bọc ngoài là lipoprotein, đường kính 40 - 50nm, khác hẳn với DNA vi rútlớn gây bệnh DTL châu phi (African swine fever - ASF), mặc dù cả hai loại virút này đều gây những triệu chứng lâm sàng và bệnh tích tương tự nhau (Meyers

et al, 1989; Hoffmann et al, 2005; Leifer et al, 2010a)

Về mặt cấu trúc, bộ gen của vi rút DTL chỉ gồm một khung đọc mở đơnlớn (open reading frame - ORF) và có chiều dài khoảng 12,3 kb (Meyers andThiel, 1996; Meyers et al, 1996) Dự vào phân tích trình tự toàn bộ genome của

vi rút DTL, các nhà khoa học đã chia vi rút DTL làm 3 nhóm chính và 4 phânnhóm phụ, bao gồm: 1.1, 1.2, 1.3; 2.1, 2.2, 2.3; 3.1, 3.2, 3.3, và 3.4 Nhóm 1 lànhóm có lịch sử lâu đời nhất và gây bệnh phổ biến ở châu Âu trong giai đoạn

1920 - 1970; nhóm 2 là tác nhân gây ra những ổ dịch vào thập niên 90 (Paton et

al, 2000) Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các ổ dịch ở Hà Lan và Anh gây rabởi vi rút DTL thuộc genotype 2.1 (Oleksiewicz et al, 2003; Sarma et al, 2011;Postel et al, 2012) Vi rút DTL thuộc nhóm 3 là phổ biến nhất ở Châu Á (Sakoda

et al, 1999; Sabogal et al, 2006; Sun et al, 2013)

Những nghiên cứu về cấu trúc của vi rút DTL cho thấy khung đọc mở của

vi rút này mã hóa cho một glycoprotein có kích thước khoảng 3900 amino axit,gồm 4 protein cấu trúc (C, Erns, E1, và E2), p7 và 7 protein không cấu trúc (Npro,NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) (Lowings et al, 1996; Meyers andThiel, 1996; Crauwels et al, 2003; Deng et al., 2005; Desai et al, 2010; Sun et al,2013) Một polyprotein lớn được dịch mã từ RNA của vi rút sẽ được xử lý thànhnhững protein vi rút riêng biệt Protein đầu tiên mã hoá là Npro một proteinkhông cấu trúc có nhiệm vụ phân cắt vị trí Npro/C Peptidase ký chủ phân cắtnhững vị trí C/Erns, E1/E2, E2/p7 và p7/NS2 với sự phân cắt không hoàn toàn ở

vị trí E2/p7 NS2 - 3 được phân cắt bởi autoprotease NS2 Sự phân cắt củapolyprotein hình thành NS4A, NS4B, NS5A và NS5B được thuỷ phân bởienzyme protease serine NS3 - 4A (Lowings et al, 1996)

- Npro là autoprotease không cấu trúc có hoạt tính thuỷ phân protein Npro khôngcần thiết đối với sự sao chép vi rút Npro cũng hoạt động như một chất đối kháng của sựhoạt hoá IRF-3 và sự sản xuất ra interferon (IFN), ức chế sự phiên mã IRF - 3 ở những

tế bào nhiễm vi rút DTL Những đột biến bỏ đi Npro của vi rút DTL đã được đề xuất đểlàm nguyên liệu sản xuất vắc xin vi rút sống (Lowings et al., 1996)

- Protein cấu trúc:

+ C (mã hoá protein p14): là protein của nucleocapsid Đầu cuối C (C terminus) của protein C ở vi rút DTL đã được xác định và được định vị ở phần

-kỵ nước của chuỗi peptide tín hiệu bên trong (internal signal peptide) khởi đầu

sự di chuyển của Erns vào trong khoang mạng lưới nội chất (Bhaskar et al, 2015)

+ Erns (mã hoá protein gp44/48), E1(gp33), E2(gp55): là các protein vỏ E2

và Erns có tính kháng nguyên mạnh nhất Erns có tác dụng hỗ trợ thải vi rút qua mộtmàng đặc biệt, được tiết ra từ tế bào nhiễm, đặc điểm nổi bật của Erns là hoạt tínhribonuclease với tính chuyên biệt đối với gốc uridine Những kháng thể ức chếhoạt tính ribonuclease có khuynh hướng trung hoà tính nhiễm vi rút, sự đột biến ở

Erns phá huỷ hoạt tính ribonuclease gây nên gia tăng số lượng vi rút Erns tái tổ hợp

là một độc chất đối với tế bào bạch huyết trong ống nghiệm, có thể kết hợp với sựgiảm bạch cầu ở nhiễm tự nhiên Mặc dù độc tính tế bào là một đặc điểm nổi bậtcủa những enzyme ribonuclease hoà tan khác nhưng người ta chưa rõ là hoạt tínhribonuclease của Erns có liên quan đến độc tính của nó hay không Vùng đầu cuối

C (C - terminal) của Erns có thể khởi động sự di chuyển của nó qua màng tế bào,

có thể coi như là mục tiêu hoặc chức năng trong tế bào Tuy nhiên, Erns tái tổ hợpcũng có thể nối một cách vững chắc với bề mặt tế bào qua sự tương tác vớiglycosaminoglycan và ức chế sự lây nhiễm (Lowings et al, 1996)

+ E1 và E2 là những protein màng không thể thiếu E2 của vi rút DTL tái

tổ hợp có thể kết hợp với các tế bào và ngăn chặn sự lây nhiễm của vi rút DTL.Mặc dù vai trò quan trọng của những glycoprotein ở vi rút là lắp ráp và tiếpnhận nhưng những kháng thể đối với Erns hoặc E2 có thể trung hoà tính lâynhiễm của vi rút và cả hai kháng nguyên này có thể tạo ra tính sinh miễn dịchbảo vệ

- Protein p7 theo sau những protein cấu trúc, gồm một vùng đảm đươngnhiệm vụ trung tâm đối với việc tách đầu cuối kỵ nước và protein này là cànthiết cho sự nhân lên và lây nhiễm của vi rút DTL nhưng không đòi hỏi trongquá trình sao chép RNA P7 của pestivirus được phân cắt một cách không hiệuquả từ E2 qua peptidase đặc biệt E2 - p7 không phân cắt không cần thiết đối với

sự sao chép trong nuôi cấy tế bào và cả hai E2 - p7 và p7 giúp tế bào kết hợp với

nhau Tuy nhiên, chưa biết rõ p7 là một protein cấu trúc hay không cấu trúc mặc

dù nó không được phát hiện trong vi rút tinh sạch Pestivirus có p7 thì có thểhình thành những kênh ion tham gia trong sự lắp ráp và tiếp nhận của vi rút(Lowings et al, 1996; Rios et al, 2017)

- Protein không cấu trúc:

+ Protein NS2 là một enzyme thuỷ phân protein chứa cysteine đã đượcnhận diện Sự phân cắt NS2 - 3 thiết yếu đối với sự sao chép RNA của pestivirus

và hiệu quả phân cắt NS2 - 3 được điều chỉnh bởi một chaperone tế bào và cóthể xác định tính gây bệnh tế bào Vùng NS2 - 3 tham gia lắp ráp vi rút

+ NS3 chứa một vùng protease serine ở đầu cuối N và một helicase RNA

ở đầu cuối C Protease serine NS3 đòi hỏi NS4A như là một yếu tố hỗ trợ.Protease serine NS3 - 4A phân cắt giữa leucine và những amino acid khôngphân cực nhỏ Hoạt tính protease serine ảnh hưởng đến sự sao chép RNA vi rút,đóng vai trò thiết yếu trong khả năng tồn tại của vi rút

+ NS4A hoạt động như một yếu tố hỗ trợ hoạt tính protease serine NS3.NS4A và NS4B không đóng vai trò thiết yếu trong sự sao chép RNA của vi rút

+ NS5A và NS5B hiện diện dưới dạng hai sản phẩm phân cắt hoàn toàncũng không khác gì NS5A - 5B không phân cắt Chức năng của NS5A chưađược biết rõ NS5B mang đặc điểm enzyme polymerase RNA phụ thuộc RNA(RdRp - RNA dependent RNA polymerase) (Patil et al, 2012; Rios et al, 2017)

Các protein cấu trúc đóng vai trò quan trọng trong khả năng tạo đáp ứngmiễn dịch của vi rút DTL, trong đó hai protein cấu trúc vỏ, Erns và E2, là nhữngprotein có khả năng sinh miễn dịch mạnh nhất (Paton and Greiser - Wilke, 2003)

Hình 2.2 Cấu trúc bộ gen Flavivirus

(nguồn: https://viralzone.expasy.org) 2.1.1.4 Sức đề kháng của vi rút DTL

Sức đề kháng của vi rút DTL phụ thuộc vào trạng thái vật lý của chấtchứa vi rút, vi rút trong dịch nuôi cấy tế bào sẽ bị vô hoạt ở 600C trong 10 phút,

vi rút có thể tồn tại 27 ngày ở thịt đông lạnh, 73 ngày ở tuỷ xương và 168 ngày ởthịt xông khói Trong môi trường thiên nhiên, ở nhiệt độ thấp dưới 100C vi rútsống và giữ nguyên độc lực gây bệnh hàng tháng Ở nhiệt độ bình thường 18 -

300C, chúng có thể sống nhiều tuần, nhưng dưới ánh sáng trực tiếp của mặt trờithì chúng không tồn tại lâu hơn 10 giờ Trong chuồng và phân, vi rút bị bất hoạtsau vài ngày.Vi rút dễ bị tiêu diệt ở nhiệt độ cao trên 750C, bị vô hoạt ở 600Ctrong 10 phút, 560C trong 1 giờ Vi rút bị tiêu diệt trong môi trường có chất làmtan lipid, có enzyme protease (Đào Trọng Đạt và Nguyễn Tiến Dũng., 1985)

Vi rút dịch tả lợn bất hoạt ở pH <3 hoặc pH>11, rất nhạy cảm với Ete,Chloroform, PVP iodine, Benzalkonium, Dezoxicholat Natri, nước vôi 10%,Formol 1 - 2% Phencol, Hyzol,…nhưng khá bền vững với Trypsin Thuốc sát

khuẩn hữu hiệu thường dùng hiện nay là PVP.iodine 10%, B.K.Vet, Formol 1,5

- 2%, Virkon.S….(Bùi Quang Anh, 2001)

2.1.2 Bệnh do vi rút DTL gây ra

2.1.2.1 Nguyên nhân

Bệnh do một loại vi rút có cấu trúc RNA thuộc chi Pestivirus,

họ Flaviviridae gây ra Vi rút tồn tại lâu ở ngoài môi trường, có thể sống sót vài

ngày trong phân lợn, vài tháng đến vài năm trong thịt đông lạnh Tuy nhiên, đây

là loại vi rút có sức đề kháng yếu, dễ bị tiêu diệt ở nhiệt độ cao và các chất sáttrùng thông thường như xút (NaOH) 2%, nước vôi 5%

2.1.2.2 Loài mắc

Vi rút DTL có mặt hầu khắp các quốc gia trên thế giới và lợn là ký chủduy nhất (bao gồm cả lợn nhà và lợn rừng) Bệnh có thể lây từ lợn rừng sang lợnnhà hoặc ngược lại Các loài động vật khác và người không mắc bệnh này (ĐàoTrọng Đat và Nguyên Tiến Dũng, 1985; Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2002; PhạmHồng Sơn, 2005; Nguyễn Thị Hạnh Thu và Trần Hạnh Từ, 2005) Nhiều tác giả

đã gây bệnh cho chuột nhắt, gà, ngựa, trâu nhưng bệnh không biểu hiện trênnhững loài vật thí nghiệm này Năm 1941, Tenbroek thông báo về việc nuôi cấythành công vi rút DTL trong môi trường tế bào dịch hoàn lợn trong dung dịchTyrode (1 Anh, 2001) Năm 1950, Corone và Albis thực hiện thí nghiệm tiêmtruyền vi rút DTL vào phôi trứng vịt và đã thích ứng với vi rút DTL trên phôivịt Sau đời thứ 8 cấy truyền qua phôi vi rút đã mất độc lực với lợn nhưng gâyđược miễn dịch cho lợn Fonanelli và cộng sự (1995) đã thử tiêm cho phôi gànhưng không thành công (Bùi Quang Anh, 2001)

2.1.2.3 Phương thức truyền lây

Nguồn lây truyền mầm bệnh là các chất bài tiết, dịch tiết, máu, hạch lâm

ba, lách của lợn bệnh chứa vi rút Những lợn khỏi bệnh sau 2 tháng vẫn bài thảimầm bệnh ra ngoài môi trường làm nguồn lây nhiễm cho cá thể khác Nhữnglợn con bị nhiễm bệnh này sẽ thải ra một lượng lớn vi rút, và các triệu chứng

lâm sàng có thể xuất hiện sau một vài tháng Do đó, chúng bị lây nhiễm trongsuốt đời sống và sẽ không dễ để phát hiện (van Oirschot, 2003).

Theo các nghiên cứu cho thấy vi rút lây truyền theo chiều ngang và theochiều dọc: Lây truyền vi rút theo chiều ngang trực tiếp giữa các con ốm với conkhỏe, hoặc lây gián tiếp qua các chất bài tiết, qua thức ăn, nước uống, dụng cụchăn nuôi, phương tiện vận chuyển hay do tiếp xúc với các động vật mang mầmbệnh Lây truyền vi rút theo chiều dọc từ mầm bệnh trong các phôi (vanOirschot, 2003) Lây truyền theo chiều dọc thường dẫn đến chết non, hoặcnhững con lợn con sinh ra bị bệnh, do lợn mẹ mang bệnh (carrier sows) thườngsinh ra các con lợn con bị nhiễm bệnh (Paton and Greiser - Wilke, 2003; vanOirschot, 2003)

2.1.2.4 Lứa tuổi

Bệnh thường xảy ra ở mọi lứa tuổi song tập trung nhiều nhất ở lợn contheo mẹ và lợn mới cai sữa Trong những năm gần đây việc tiêm phòng đã đượcchú ý do vậy tuổi mắc phụ thuộc nhiều vào sức đề kháng và tình trạng miễn dịchcủa đàn lợn Lợn đực và lợn nái không biểu hiện triệu chứng lâm sang nhưng có

tỷ lệ mang trùng vi rút DTL (Đào Trọng Đạt và Nguyễn Tiến Dung, 1985)

Theo Bùi Quang Anh và cộng sự, lợn từ 2 - 6 tháng tuổi có tỷ lệ mắc bệnhDTL cao nhất trong tổng số lợn mắc bệnh, lợn con theo mẹ 19,42%; lợn trên 6tháng tuổi 12,08%; còn lợn nái và lợn đực tỷ lệ mắc bệnh DTL thấp nhất 0,21-2,46% nhưng lại là nguồn mang trùng và lây lan dịch bệnh (Bùi Quang Anh,2001)

2.1.2.5 Chất chứa của vi rút

Khi vào cơ thể lợn, vi rút DTL di hành đến khắp nơi, có thể tồn tại và pháttriển ở mọi cơ quan, mô tổ chức của cơ thể Trong cơ thể con vật ốm, vi rút cónhiều nhất trong máu (thời kỳ con vật sốt) Các cơ quan phủ tạng: hạch lâm ba, lálách, các chất bài xuất, bài tiết (nước mắt, nước mũi, phân,…) chứa nhiều vi rút

2.1.2.6 Triệu chứng

Thời gian nung bệnh từ 3 - 7 ngày và tuỳ theo độc lực của vi rút, lứa tưổi,giống, thể trạng, trạng thái miễn dịch mà bệnh có thể xuất hiện ở một trong 4 thểvới các triệu chứng như sau:

* Thể quá cấp tính (còn gọi là bệnh dịch tả lợn trắng): Thường xuất hiện ởđầu ổ dịch, lợn con mẫn cảm với thể này hơn lợn trưởng thành Con vật ủ rủ cao

độ, sốt kịch liệt, chết nhanh khi chưa xuất hiện triệu chứng bệnh tích đặc trưng,con vật dẫy dụa rồi chết nhanh trong vòng 24 - 48 giờ, tỷ lệ chết tới 100%

* Thể cấp tính: Thể này thường gặp, thời gian nung bệnh từ 2 - 4 ngày.Lợn có các triệu chứng chung: ủ rũ, kém ăn, rồi bỏ ăn, sốt cao 41 - 420C kéo dàiđến lúc gần chết, lợn con thường nằm chồng đống lên nhau ở góc chuồng

Ở những đàn lợn mẫn cảm, lúc đầu chỉ có một số con mắc, nhưng saukhoảng 10 ngày bệnh sẽ lây ra toàn đàn Do vi rút tác động đến bộ máy tiêu hoánên con vật có biểu hiện nôn mửa Trong thời gian sốt con vật đi táo, khi thânnhiệt hạ con vật đi ỉa chảy nặng: phân loãng nhiều nước, thối khắm, có khi cócục máu và các mảng thượng bì niêm mạc bong tróc ra

Do vi rút tác động lên bộ máy hô hấp nên con vật có biểu hiện: viêm niêmmạc mũi, chảy nước mũi lúc đầu trong sau đục đặc dần, có khi đóng lại ở khoémũi làm cho vành mũi nứt nẻ Con vật ho lúc đầu ho ít, ho khan về sau ho nhiều

Có trường hợp nốt xuất huyết to bằng hạt ngô, tím bầm, nằm lặn sâu ở tổ chức

liên kết dưới da Lợn chết trong vòng 1 tuần sau khi biểu hiện triệu chứng bệnh,

tỷ lệ chết có thể 100%

* Thể mãn tính: Thể này do chủng vi rút có độc lực trung bình gây nênhoặc từ thể cấp tính chuyển sang Con vật có triệu chứng như thể cấp tính, gầycòm, ỉa chảy liên miên, lúc sốt lúc không, bỏ ăn, mắc các bệnh kế phát do vikhuẩn Bệnh kéo dài vài tuần hoặc hàng tháng trước khi chết

Vi rút có thể truyền qua nhau thai nên nếu lợn nái mắc bệnh, tuỳ theochủng vi rút và thời gian mang thai, lợn có biểu hiện sảy thai, thai chết lưu hoặc

đẻ non Nếu lợn nái mắc bệnh khi mang thai lúc 50 - 70 ngày, có thể sinh con cómang mầm bệnh Con đẻ ra có thể bị chết ngay hoặc một số lúc đầu sinh ra biểuhiện bình thường sau có biểu hiện run rẩy, còi cọc, không sốt, chết sau một vàituần hoặc vài tháng được gọi là “dịch tả lợn phát muộn”

* Thể không điển hình: Thể này biểu thị dưới các dạng rất khác nhau nhưrối loạn sinh sản hoặc bệnh lý sinh sản (sảy thai, chết lưu, thai gỗ, dị dạng gâyrun rẩy bẩm sinh, rối loạn vận động,…) chậm lớn, chết rải rác Hơn nữa, trongcác trường hợp không điển hình, vi rút DTL có thể lưu hành một cách không rõràng nhất là ở lợn sinh sản với các trường hợp lâm sàng nổ ra lẻ tẻ khi có cácđiều kiện không thuận lợi (Nguyễn Thị Phương Duyên và cs, 2001; Moennig et

al, 2003)

Thể không điển hình là thể khó phân biệt của bệnh DTL vì bệnh kéo dài

và không có các thời kỳ rõ rệt Thể bệnh nhẹ hơn bình thường và thường chỉ mộtloại phủ tạng có bệnh tích: chẳng hạn chỉ phổi, ruột hay thần kinh đặc biệt bịbệnh Triệu chứng sẽ dễ quan sát ở những con lợn trong trạng thái có sức khoẻkém Lợn chậm phát triển và suy dinh dưỡng, các bệnh tích và triệu chứngkhông giống bệnh DTL thông thường (Moennig et al, 2003)

2.1.2.6 Bệnh tích

Trong thể cấp tính, xác chết thường gầy, phân bết xung quanh hậu môn,quan sát rõ nhất là hiện tượng xuất huyết Trên da, đặc biệt ở những vùng da

mỏng có nhiều điểm, nốt xuất huyết Niêm mạc miệng, lợi viêm xuất huyết, cókhi có mụn loét nông hay sâu, phủ bựa màu trắng xám hoặc màu vàng nhạt.

Xuất huyết trên bề mặt phổi: điểm xuất huyết to nhỏ không đều bằng đầumũi kim hoặc đầu đinh ghim Phổi có nhiều đám viêm với màu sắc khác nhau:

đỏ, nâu Viêm niêm mạc khí quản, phế quản; trên bề mặt niêm mạc có nhiềudịch nhớt và bọt màu hồnh

Bệnh tích đặc trưng tập trung tại đường tiêu hoá: viêm niêm mạc dạ dày,nhất là vùng thân vị và hạ vị có những đám, mảng xuất huyết hoặc loét; xuấthuyết và loét niêm mạc ruột nhất là ở các mảng Payer; có các mốt loét hình cúc

áo trên niêm mạc van hồi manh tràng, đôi khi có nốt loét niêm mạc ruột già

Hạch lâm ba sưng, xuất huyết đặc trưng; có thể quan sát thấy xuất huyết ở 3trạng thái: xuất huyết toàn bộ hạch làm cho hạch tím bầm như quả mồng tơi hayquả mận chín; xuất huyết vùng rìa hạch; xuất huyết thành dải, có vân như đá hoa

Lách thường không sưng hoặc ít sưng Trên bề mặt có điểm xuất huyếtbằng đầu kim hoặc đầu đinh ghim Vùng rìa lách do nhồi huyết hình thànhnhững đám tổ chức bị hoại tử, thường có màu tím đen, hình tam giác, đỉnhhướng vào trong, nhìn rìa lách có hình răng cưa lồi lõm không đều

Thận có nhiều điểm xuất huyết lấm tấm như đầu ghim ở vỏ thận và tủy thận,

bể thận ứ máu hoặc có cục máu Niêm mạc bàng quang bị tụ huyết, xuất huyết

Túi mật căng hoặc teo, niêm mạc túi mật xuất huyết li ti, có khi tập trunglại thành từng đám

Thể mạn tính, thường quan sát thấy các nốt loét hình cúc áo ở đường tiêuhoá, nắp thanh quản và thanh quản

Bệnh tích vi thể không đặc trưng, nếu có là hiện tượng thoái hoá nhu mô

tổ chức hạch lympho, tăng sinh tế bào thành ruột

Bệnh dịch tả lợn bẩm sinh gây hiện tượng sảy thai, thai chết lưu hoặc đẻnon Con non mắc các dị tật bẩm sinh như sự bất thường trong hình thànhmyelin thần kinh, tiểu não, phổi không phát triển hoàn thiện, não nhỏ

2.1.2.7 Chẩn đoán

a) Chẩn đoán lâm sàng

Dựa trên các triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh: ủ rũ, kém ăn, rồi

bỏ ăn, sốt cao 41- 420C kéo dài đến lúc gần chết, lợn con thường nằm chồngđống lên nhau ở góc chuồng; con vật có biểu hiện nôn mửa, trong thời gian sốtcon vật đi táo, khi thân nhiệt hạ con vật đi ỉa chảy nặng; viêm kết mạc và giácmạc mắt, viêm niêm mạc mũi, chảy nước mũi lúc đầu trong sau đục đặc dần, cókhi đóng lại ở khoé mũi làm cho vành mũi nứt nẻ; đi siêu vẹo, loạng choạng, liệthai chân sau hoặc liệt nửa thân sau; tỷ lệ chết có thể là 100%

Cần chẩn đoán phân biệt với một số bệnh sau: bệnh phó thương hàn, bệnhđóng dấu, bệnh tụ huyết trùng, bệnh giả dại

b) Chẩn đoán vi rút học

Phân lập vi rút được coi là phương pháp xác định vi rút với độ nhạy và

độ đặc hiệu cao nhất Có thể phân lập vi rút từ mẫu bệnh phẩm, máu Vi rútDTL sau đó sẽ được nuôi cấy trên môi trường thận lợn Sau đó sử dụng phảnứng miễn dịch huỳnh quang để xác định sự nhân lên của vi rút

Phản ứng kháng thể huỳnh quang trực tiếp là phương pháp xác định vi rútDTL cho kết quả nhanh, đáng tin cậy Để phân biệt vi rút DTL với các pestiviruskhác, cần phải sử dụng kháng thể đơn dòng Mẫu thường được sử dụng là hạchamidan Trong thể á cấp tính hoặc mạn tính, mẫu thường được lấy để làm phảnứng là hồi tràng Tuy nhiên, độ nhạy của phương pháp này không như phân lập

vi rút, tuy phản ứng âm tính nhưng chưa chắc lợn không mắc bệnh DTL

Phản ứng ELISA dễ thực hiện, có thể sử dụng để chẩn đoán sớm bệnhDTL ở đàn lợn, cho kết quả sau 36 giờ Phản ứng sandwich ELISA thường sửdụng kháng thể đơn dòng phát hiện các loại kháng nguyên của vi rút Nguyênliệu được sử dụng để tiến hành là mẫu bệnh phẩm, huyết thanh, huyết tương,buffy coat, hoặc máu toàn phần được chống đông bằng EDTA

PCR được sử dụng để phát hiện vi rút DTL, RNA của vi rút có thể pháthiện được từ mẫu máu của lợn sống hoặc mẫu bệnh phẩm Phản ứng cho kết quảnhanh, có độ tin cậy cao.

c) Chẩn đoán huyết thanh học

Trong nghiên cứu bệnh DTL, dùng phản ứng ELISA dựa trên nguyên lýcạnh tranh giữa kháng thể có trong huyết thanh kháng vi rút DTL và kháng thểđơn dòng đặc hiệu kháng glycoprotein gp 55 của vi rút DTL, giúp hạn chế phảnứng chéo với các pestivirus khác Phương pháp này có thể phát hiện kháng thểsau khi nhiễm 10 - 15 ngày

Phương pháp trung hòa: để phát hiện kháng thể trung hoà vi rút DTL cótrong huyết thanh Sử dụng huyết thanh pha loãng theo cơ số 2, trộn với vi rútDTL nồng độ 100TCID50/ml Sau khi ủ 1 giờ, hỗn dịch được cho vào đĩa môitrường tế bào PK 15 (lặp lại thí nghiệm trong 2 giếng) Sau 2 - 4 ngày, tế bàođược nhuộm với kháng thể đặc hiệu kháng vi rút DTL Hiệu giá kháng thể chính

là logarit của độ pha loãng huyết thanh cao nhất có khả năng ngăn cản sự nhânlên của vi rút ở 1 - 2/2 giếng phản ứng

Vì có phản ứng chéo giữa các pestivirus, huyết thanh cần chẩn đoán phảiđược trung hoà với các chủng BVDV và BDV chuẩn Nếu hiệu giá kháng thểgiữa các vi rút chênh lệch nhau ≥ 4 lần thì mới được kết luận về nguyên nhânbệnh Phương pháp này thường được sử dụng để kiểm tra mang tính sàng lọcnhững đàn xung quanh ổ dịch để đề xuất biện pháp phòng chống dịch

2.1.2.8 Phòng và kiểm soát bệnh

Các quy tắc trong việc kiểm soát bệnh là:

Hạn chế việc tiếp xúc giữa các lợn bằng việc giảm mật độ đàn: Việc hạnchế lợn tiếp xúc với nhau giúp hạn chế sự lan truyền của mầm bệnh Lợn tiếpxúc với nhau trực tiếp bằng mũi, dụng cụ chăn nuôi, phân và con người Sự lâytruyền mạnh hơn ở những ô chuồng có mật độ cao