ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP REVERSE TRANSCRIPTASE POLYMERASE CHAIN REACTION (RTPCR) ĐỂ PHÁT HIỆN Laem Singh virus TRÊN TÔM SÚ NUÔI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP REVERSE TRANSCRIPTASE POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR) ĐỂ PHÁT HIỆN Laem Singh virus TRÊN TÔM SÚ NUÔI Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊ PHƯƠNG TÚ Niên khóa: 2007 - 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP REVERSE TRANSCRIPTASE POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR) ĐỂ PHÁT HIỆN Laem Singh virus TRÊN TÔM SÚ NUÔI Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS NGUYỄN VIẾT DŨNG TRẦN THỊ PHƯƠNG TÚ Tháng 07 năm 2011 LỜI CẢM ƠN Con xin kính dâng lên cha mẹ lòng biết ơn sâu sắc, người sinh thành, dưỡng dục để có ngày hơm nay! Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, tơi nhận nhiều ủng hộ giúp đỡ từ thầy cô bạn bè Nay xin chân thành cảm ơn đến: - Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Mơn Công Nghệ Sinh Học tất thầy cô tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt thời gian học trường - Thầy Nguyễn Viết Dũng, người hết lòng hướng dẫn kỹ thuật nội dung đề tài suốt trình thực tập tốt nghiệp Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II - Thạc sĩ Cao Thành Trung anh chị làm việc Trung Tâm Quan Trắc Cảnh Báo Mơi Trường Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ, tạo điều kiện thuận lợi máy móc thiết bị hóa chất q trình thực đề tài Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II - Các bạn sinh viên lớp cơng nghệ sinh học khóa 2007 - 2011 đồng hành, động viên suốt thời gian học tập thực đề tài tốt nghiệp TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2011 Trần Thị Phương Tú i TÓM TẮT Laem Singh Virus (LSNV) cho có diện mẫu tôm sú mắc hội chứng chậm lớn (MSGS) Thái Lan xem nguyên nhân dẫn đến MSGS Hội chứng chậm lớn gây thiệt hại nghiêm trọng cho nông dân nuôi tôm Thái Lan Tại Việt Nam, chưa công bố nghiên cứu loại virus Mục đích nghiên cứu nhằm áp dụng quy trình RT-PCR bước xét nghiệm sàng lọc chẩn đoán để phát LSNV mẫu tôm sú thu thập Việt Nam Với hai loại enzyme thành phần hóa chất thiết kế đặc biệt, phản ứng RTPCR thực thành công eppendorf nhất, bao gồm trình tổng hợp cDNA trình khuếch đại hiệu có tính đặc hiệu cao Khi tiến hành kiểm tra tính đặc hiệu, kết cho thấy quy trình có tính đặc hiệu mẫu tơm nhiễm LSNV, khơng có tín hiệu tơm nhiễm virus khác: Yellow head virus (YHV), Gill associated virus (GAV), Taura symdrom virus (TSV), Infectious myonecrosis virus (IMNV) Kết đánh giá độ nhạy với trình tự RNA đích cho thấy, quy trình phát đến 1000 phản ứng khuếch đại Có thể áp dụng quy trình thực tế để phát LSNV tơm sú, với hàm lượng tối thiểu 1000 trình tự RNA LSNV μl dịch ly trích RNA từ tôm nhiễm LSNV Tỷ lệ nhiễm LSNV mẫu thu thập ghi nhận sau: 1% tôm giống, 3,7% tôm thương phẩm 22% tôm bố mẹ số tỉnh thăm dò có diện LSNV tơm sú ni gồm : Ninh Thuận, Bình Thuận, Cần Thơ Nghiên cứu cho thấy áp dụng quy trình việc chọn lựa giống LSNV phát sớm virus tôm sú nuôi tôm sú bố mẹ ii SUMMARY Thesis: Application of reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) method to detect Laem Singh Virus infected black tiger shrimp (Penaeus monodon) It has been reported that Laem Singh Virus (LSNV) presented in shrimp samples from shrimp growing areas of Thailand exhibiting monodon slow growth syndrome or MSGS In present study, a one-step RT-PCR was applicated for use as a diagnostic screening test for the detection of LSNV in Vietnam With two enzymes and specially developed buffer, the reaction has been successfully implemented in a single tube, including the efficient, highly specific reverse transcription and PCR The results showed that the assay revealed high specificity for LSNV and no signal was observed in cases of samples infected with other viruses: TSV, YHV, GAV, IMNV The analysis of sensitivity indicated that the assay could detect 1000 copies of target RNA sequence The prevalence of LSNV infection on shrimp was recorded as follows: 1% in seed shrimp, 3,7% in commercial shrimp and 22% of the broodstock The study suggests that this assay can be applied to the selection of LSNV - free seed shrimp as well as early detection of LSNV in cultured and broodstock shrimp Keywords: Laem Singh Virus, RT-PCR iii MỤC LỤC Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng ix Danh sách hình x Phụ lục 42 Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu tôm sú 2.2 Một số bệnh thường gặp tôm sú 2.2.1 Virus gây bệnh đống trắng (WSSV) 2.2.2 Virus gây bệnh đầu vàng (YHV) 2.2.3 Virus gây kết dính mang (GAV) 2.2.4 Virus gây tơm còi (MBV) 2.2.5 Virus gây hoại tử khối gan tụy (NHP) 2.2.6 Hội chứng Taura (TSV) 2.3 Hội chứng tăng trưởng chậm (MSGS) Laem Singh virus (LSNV) 2.3.1 Các nghiên cứu nước 2.3.2 Nghiên cứu nước 10 2.4 Các phương pháp dự chuẩn bệnh tôm 10 2.4.1 Quan sát lâm sàng 10 2.4.2 Quan sát mô học 10 2.1.1.1 Mô học truyền thống .10 2.1.1.2 Phương pháp hóa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry) 11 iv 2.4.3 Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) 11 2.4.4 Kỹ thuật sinh học phân tử 12 2.1.1.3 Lai phân tử 12 2.1.1.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 13 2.5 Kỹ thuật dòng hóa .17 2.6 Kỹ thuật giải trình tự 18 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 3.1 Thời gian địa điểm thực 19 3.2 Máy móc, thiết bị 19 3.3 Hóa chất 19 3.1.1 Hóa chất cố định vật liệu di truyền 19 3.1.2 Hóa chất tách chiết RNA .19 3.1.3 Hóa chất RT-PCR 20 3.1.4 Hóa chất điện di gel agarose 20 3.1.5 Hóa chất tạo dòng 21 3.4 Phương pháp nghiên cứu 22 3.1.1 Hướng tiếp cận nghiên cứu 22 3.1.2 Phương pháp thu mẫu 22 3.1.3 Phương pháp ly trích RNA tơm trizol 23 3.1.4 RT-PCR phát LSNV 23 3.1.5 Phương pháp điện di gel agarose 24 3.1.6 Phương pháp chụp hình gel 25 3.1.7 Phương pháp tinh sản phẩm sau PCR điện di 25 3.1.8 Phương pháp dòng hóa sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy .25 3.1.9 Phương pháp chuyển vector pGEM-T Easy mang sản phẩm PCR .26 3.1.10.Phương pháp kiểm tra dòng tế bào E coli JM 109 mang vector 26 3.1.11.Phương pháp nhân sinh khối tế bào E coli JM 109 chứa vector 26 3.1.12.Phương pháp tinh vector tái tổ hợp 27 3.1.13.Phương pháp phiên mã ngược DNA_LSNV .27 3.5 Các bước thực 28 3.1.1 Phương pháp RT-PCR phát LSNV .28 3.1.1.1 Thí nghiệm phát LSNV mẫu nghi nhiễm 28 v 3.1.1.2 Thí nghiệm dòng hóa giải trình tự 28 3.1.1.3 Thí nghiệm tối ưu nhiệt độ lai .29 3.1.1.4 Thí nghiệm xác định giới hạn phát phương pháp 29 3.1.1.5 Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu phương pháp 29 3.1.2 Ứng dụng kiểm tra LSNV mẫu thực 30 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Phương pháp RT-PCR bước phát LSNV 31 4.1.1 Phát LSNV mẫu nghi nhiễm 31 4.1.2 Dòng hóa giải trình tự 31 4.1.3 Tối ưu nhiệt độ lai 32 4.1.4 Giới hạn phát phương pháp 33 4.1.5 Xác định tính đặc hiệu phương pháp 35 4.2 Ứng dụng quy trình onestep RT-PCR kiểm tra virus LSNV 36 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .37 6.1 Kết luận 37 6.2 Đề nghị 37 Chương TÀI LIỆU THAM KHẢO .38 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp: Base pair ctv: Cộng tác viên cDNA: Complementary Deoxyribonucleotide acid DEPC: Diethyl Pyrocarbonate DNA: Deoxyribonucleic Acid DNA/RNA_LSNV: Trình tự DNA/RNA Laem Sing virus dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate EDTA: Ethylendiaminetetraacid acetic EtBr: Ethidium Bromide FAO: Food and Agriculture Organization kD: Kilo Dalton kb: Kilo base LSNV: Laem Singh virus LO: Cơ quan bạch huyết MSGS: Hội chứng tăng trưởng chậm MW: Khối lượng phân tử mRNA: Messenger Ribonucleic acid NSX: Nhà sản xuất PCR: Polymerase chain reaction pGEM-LSNV: Vector pGEM-T Easy mang trình tự DNA LSNV RIA II: Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II RT-PCR: Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction rpm: Vòng/phút Ta : Annealing temperature Taq : Thermus aquaticus TBE: Tris Boric Ethylendiaminetetraacid acetic Tm: Melting temperature UV: Ultra violet μl: Micro lít vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Thành phần dung dịch TBE (Tris/Borate/EDTA) .21 Bảng 3.2 Thành phần dung dịch loading dye 21 Bảng 3.3 Thành phần môi trường LB (Luria-Bertani) chứa ampicilline 21 Bảng 3.4 Bảng thống kê số lượng mẫu thực thu tỉnh thăm dò 22 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng RT-PCR phát LSNV 24 Bảng 4.1 Bảng thống kê chi tiết số lượng mẫu thực 49 viii nhắc lượng mẫu ly trích RNA, ly trích q nhiều mẫu dẫn đến ức chế phản ứng RT-PCR Hàm lượng mẫu kiến nghị nghiên cứu 100 mg mơ, thể tích nước hòa tan cuối kiến nghị 100 μl Giới hạn phát (còn gọi độ nhạy) quy trình nhân tố quan trọng để đánh giá chất lượng quy trình PCR Giới hạn phát giúp đánh giá sơ mức độ nhiễm virus tôm Đối với quy trình RT-PCR bước thí nghiệm này, đạt giới hạn phát đến 1000 sao/μl dịch ly trích RNA từ mẫu tơm sú nghĩa quy trình thiết kế thành cơng Quy trình phát sớm LSNV nhiễm tôm sú giai đoạn phát triển khác mật độ nhiễm bệnh tôm đạt từ 1000 sao/μl dịch ly trích RNA từ mẫu tơm sú trở lên 4.1.5 Xác định tính đặc hiệu Tơm sú vật chủ nhiều tác nhân gây bệnh Một số DNA virus RNA virus xác định tác nhân nguy hiểm thường gặp tôm Sú nuôi Việt Nam Yellow head virus (YHV), Gill associated virus (GAV), Taura Symdrom virus (TSV), Infectious Myonecrosis virus (IMNV) Chúng tơi sử dụng mẫu có chứa RNA từ loại virus YHV, GAV, TSV, IMNV để kiểm tra tính đặc hiệu phương pháp RT-PCR nghiên cứu (-) TSV YHV GAV IMNV (+) M Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm khuyếch đại thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu quy trình RT-PCR YHV, GAV, TSV, IMNV: kết khuyếch đại mẫu ly trích RNA tơm nhiễm Yellow head virus, Gill associated viru, Taura Symdrom virus, Infectious Myonecrosis virus; (-): Đối chứng âm; (+): Đối chứng dương; M: Thang DNA 100bp Sau khuếch đại điện di theo bố trí thí nghiệm nêu (Mục 3.5.1.5.), băng sản phẩm đặc trưng cho LSNV xuất mẫu chứng dương LSNV, mẫu lại khơng có tín hiệu (Hình 4.6) Như vậy, sau lần thử độ đặc hiệu quy 35 trình cho kết giống nhau, mẫu chứng dương xuất băng tín hiệu 197 bp đặc trưng cho LSNV Trong phạm vi nghiên cứu này, quy trình hồn tồn đặc hiệu với LSNV Kết thí nghiệm kiểm tra độ nhạy độ đặc hiệu khẳng định: áp dụng thành cơng quy trình RT-PCR Kallaya Sritunyalucksana ctv (2006) để phát LSNV Việt Nam sở vật chất kỹ thuật RIA II; quy trình RTPCR tối ưu áp dụng thực tế Nghiên cứu rõ tính khả dụng quy trình, mức độ nhiễm virus LSNV phát (1000 RNA/μl dịch ly trích) quy trình hồn tồn đặc hiệu với LSNV, điều chưa nhắc đến nghiên cứu trước 4.2 Ứng dụng quy trình RT-PCR bước kiểm tra LSNV mẫu thực Tiến hành áp dụng quy trình mẫu thực thu từ tỉnh Nam Bộ (Bảng 4.6) Trong số 189 mẫu tôm giống thu tỉnh trên, có mẫu dương tính với LSNV: mẫu Cần Thơ mẫu Bình Thuận 132 mẫu tơm thương phẩm thu tỉnh cho kết dương tính mẫu thu Ninh Thuận, mẫu sú thương phẩm lại âm tính Các mẫu tơm thương phẩm khơng có dấu hiệu MSGS Đáng ý tỷ lệ nhiễm LSNV sú bố mẹ, tổng số 23 mẫu sú bố mẹ dương tính với LSNV, mẫu dương tính thu từ Ninh Thuận mẫu dương tính thu từ Cần Thơ Dữ liệu cho thấy, LSNV xuất tỉnh tiến hành thăm dò Các tỉnh có diện LSNV Ninh Thuận, Bình Thuận Cần Thơ Trong đó, Cần Thơ tỉnh có số mẫu nhiễm LSNV cao (5/12 mẫu thu thập) Tỷ lệ nhiễm LSNV sơ số tỉnh Nam Bộ: 1% tôm giống 3,7% tôm thương phẩm 22% tôm bố mẹ Như vậy, LSNV có mặt ba giai đoạn phát triển tôm sú Điều đặt vấn đề: làm cách để kiểm soát giống virus tránh lây nhiễm virus từ vùng sang vùng khác Tôm bố mẹ nguồn sản xuất giống bệnh, cần chọn lọc kỹ kỹ thuật có độ nhạy độ đạc hiệu cao với virus LSNV Quy trình RT-PCR nghiên cứu áp dụng mục đích Tôm giống trước thả nuôi cần phải kiểm tra để kiểm sốt an tồn sinh học mần bệnh nguồn tôm sú giống 36 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Nghiên cứu xây dựng thành cơng quy trình RT-PCR bước phát LSNV tôm sú Việt Nam hóa chất tự pha phòng thí nghiệm RIA II Nghiên cứu xác định độ đặc hiệu quy trình, điều chưa nhắc đến báo cáo trước Quy trình phát Laem Singh virus, virus khác: Yellow head virus (YHV), Gill associated virus (GAV), Taura Symdrom virus (TSV), Infectious Myonecrosis virus (IMNV) khơng cho tín hiệu áp dụng quy trình RTPCR bước nghiên cứu Quy trình phát 1000 RNA_LSNV phản ứng khuếch đại Có thể áp dụng quy trình thực tế để phát LSNV với nồng độ tối thiểu 1000 sao/μl dịch ly trích RNA từ mẫu tôm sú Việt Nam Đây nghiên cứu độ nhạy quy trình RT-PCR phát LSNV Kết áp dụng quy trình RT-PCR bước mẫu thu Ninh Thuận, Bình Thuận, Cần Thơ, Vũng Tàu, Bến Tre, Sóc Trăng cung cấp thông tin mức độ nhiễm LSNV tôm sú giai đoạn phát triển khác nhau: 1% tôm giống; 3,7% tôm thương phẩm 22% tôm bố mẹ 5.2 Đề nghị Số liệu thu cho thấy LSNV nhiễm ba giai đoạn phát triển tôm sú Hai giai đoạn tôm bố mẹ tôm giống giai đoạn đáng quan tâm Nên áp dụng quy trình RT-PCR bước nghiên cứu để kiểm sát sú giống LSNV Việt Nam 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Thị Hoàng Oanh 2008 Giáo trình ngun lý kỹ thuật chẩn đốn bệnh thủy sản Trường Đại học Cần Thơ Gudkovs N 2008 Tài liệu thực hành phòng thí nghiệm Dự án “Nâng cao lực phòng xét nghiệm virus tơm Việt Nam” ACIAR, Úc phối hợp với Bộ NN&PTNT ĐH Cần Thơ, Việt Nam Hồ Huỳnh Thùy Dương 1998 Sinh học phân tử (Khái niệm - Phương pháp - Ứng dụng) Tái lần thứ Nhà xuất Giáo dục, TP HCM Hoàng Thị Dung 2006 Xác định giới tính đu đủ (Carica papaya L.) Bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi thiết kế dựa vào vùng AND liên kết với gen quy định giới tính nhiễm sắc thể giới tính Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Cơng nghệ Sinh học, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Huỳnh Vĩnh Khang 2006 Nghiên cứu số virus (TMV, CMV) gây bệnh Ớt huyện Củ Chi, TP Hồ Chí Minh kỹ thuật ELISA xây dựng quy trình phát CMV kỹ thuật RT-PCR Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Melba G Bondad-Reantaso 2005 Hướng dẫn chẩn đoán bệnh động vật thủy sản Châu Á Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Trang 171 - 222 Tiếng Anh Alcivar Warren,A., R.M Overstreet, A.K Dhar, K Astrofsky, W.H Carr, J Sweeny and J.M Lotz 1997 Genetic susceptibility of cultured shrimp (Penaeus vannamei) to infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus and Baculovirus penaei: Possible relationship with growth status and metabolic gene expression J Invertebr Pathol 70(3): pp 190 - 197 Anantasomboon, g., Sriurairatana, S., Flegel, T W., and Whithyachumnarnkul, B (2006) Unique lesions and viral-like particles found on growth retarded black tiger shrimp Penaeuas monodon from East Africa Aquaculture, 253 (1 - 4), pp 197 - 203 Belcher, C.R and P R Yo ung 1998 Colourimetric PCR-based detection of monodon baculovirus in whole Penaeus monodon postlarvae J Virol Methods 74(1): pp 21 - 29 10 Chalermporn Ongvarrasopone, Ekapol Chomchay and Sakol Panyim 2010 Antiviral effect of PmRab7 knock-down on inhibition of Laem-Singh virus replication in black tiger shrimp Antiviral Research Volume 88, 116 - 118 11 Chayaburakul, K., Nash, G., Pratanpipat, P., Sriurairatana, S., Withyachumnarnkul, B., 2004 Multiple pathogens found in growth-retarded black tiger shrimp Penaeus monodon cultivated in Thailand Dis Aquat Org 60, pp 89 - 96 12 Chayaburakul, K., Nash, G., Pratanpipat, P., Sriurairatana, S., Withyachumnarnkul, B., 2004 Multiple pathogens found in growth-retarded black tiger shrimp Penaeus monodon cultivated in Thailand Dis Aquat Org 60, pp 89 - 96 38 13 Chou, H.Y., C.Y Huang, C.H Wang, H.C Chiang and C.F Lo 1995 Pathogenicity of a baculovirus infection causing white spot syndrome in cultured penaeid shrimp in Taiwan Dis Aquat Org 23: 165-173 14 Cowley, J.A, C.M Dimmock, C Wongteerasupaya, V Boonsaeng, S Panyam and P.J Walker 1999 Yellow head virus from Thailand and gill-associated virus from Australian are closely related but distinct viruses Dis Aquat Org 36: pp 153 - 157 15 Cowley, J.A., C.M Dimmock, K.M Spann and P.J Walker 2000b Gillassociated virus of Penaeus monodon prawns: an invertebrate virus with ORF 1a and ORF 1b genes related to arteri- and coronaviruses J Gen Virol 81: 1473 1484 16 D.V Lightnera, R.M Redmana and T.A Bella 1982 Observations on the geographic distribution, pathogenesis and morphology of the baculovirus from Penaeus monodon Fabricius Aquaculture.Volume 32, Pages 209 - 233 17 Dixon, H and J Dorado 1997 Managing Taura syndrome virus in Belize: A case study Aquac Mag 23(2): pp 30 - 42 18 Flegel, T.W., 2006 The special danger of viral pathogens in shrimp translocated for aquaculture Science Asia 32, 215 - 231 19 Frelier,P.F., R.F Sis,T.A Bell and D.H Lewis 1992 Microscopic and ultrastructural studies of necrotizing hepatopancreatitis in Texas cultured shrimp (Penaeus vannamei) Vet Pathol 29: 269 - 277 20 Gangnonngiw, W., Anantasomboon, G., Sang-oum, W., Sriurairatana, S., Sritunyalucksana, K., Flegel, T.W., In press Non-virulence of a recombinant shrimp nidovirus is associated with its non structural gene sequence and not a large structural gene deletion Virology 21 Gray, S., Gildow, F.E., 2003 Luteovirus-aphid interactions Ann Rev Phytopathol Volume 41, 539 - 566 22 Holthius, L B., 1980 FAO species catalogue Vol I Shrimps and prawns of the World An annotated catalogue of species of interest to Fisheries FAO Fish Synopsis No 125 (1) : 1- 271 23 Hossain, M.S., Otta, S.K., Chakraborty, A., Sanath Kumar, H., Karunasagar, I., Karunasagar, I., 2004 Detection of WSSV in cultured shrimps, captured brooders, shrimp postlarvae and water samples in Bangladesh by PCR using different mồis Aquaculture, 237: 59–71 24 Kiatpathomchai W., Boonsaeng V., Tassanakajon A., Wongteerasupaya C., Jitrapakdee S., Panyim S 2001 A non-stop, single ống phản ứng, semi-nested PCR technique for grading the severity of white spot syndrome virus infections in Penaeus monodon Diseases of Aquatic Organisms, Volume 47: 235 - 239 25 Lightner, D.V 1996 A Handbook of Shrimp Pathology and Diagnostic Procedures for Dis- ease of Cultured Penaeid Shrimp World Aquaculture Society, Baton Rouge, LA 304p 26 Lo C.F., Ho C.H., Peng S.E., Chen C.H., Hsu H.C., Chiu Y.L., Chang C.F., Liu K.F., Su M.S., Wang C.H., and Kou G.H., 1996a White spot syndrome baculovirus (WSSV) detected in cultured and captured shrimp, crabs and other arthropods Diseases of Aquatic Organisms, Volume 27: 215-225 27 M Adler, S Schulz, M Spengler 2009 Cytokine Quantification in Drug Development: A comparison of sensitive immunoassay platforms 39 28 Nusra Sittidilokratna, Sirintip Dangtip, Kallaya Sritunyalucksana1, Ravi Babu, Balakrishnan Pradeep, C V Mohan, Nicholas Gudkovs, Peter J Walker, 2009 Detection of Laem-Singh virus in cultured Penaeus monodon shrimp from several sites in the Indo-Pacific region Diseases Of Aquatic Organisms Vol 84: 195 - 200 29 OIE 2000a Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases, Third Edition, 2000 Office In- ternational des Epizooties, Paris, France 237p 30 OIE 2000b Regional Aquatic Animal Disease Yearbook 1999 (Asian and Pacific Region) OIE Representation for Asia and the Pacific Tokyo, Japan 40p 31 Pikul Jiravanichpaisal, Narongsak Puanglarp, Sasithon Petkon, Seri Donnuea, Irene Söderhällb and Kenneth Söderhällb 2007 Fish & Shellfish Immunology Volume 23, 815 - 824 32 Prakasha B K., Raju P Ramakrishna, Indrani Karunasagar1, Iddya Karunasagar1 2007 Detection of Laem-Singh virus (LSNV) in cultured Penaeus monodon from India Diseases Of Aquatic Organisms Vol 77: 83 - 86 33 Pratoomthai, B., Sakaew, W., Sriurairatana, S., Wongprasert, K., Withyachumnarnkul, B., 2008 Retinopathy in stunted black tiger shrimp Penaeus monodon and possible association with Laem-Singh virus (LSNV) Aquaculture Vo lume 284, 53 - 58 34 Promwikorn, W., Boonyoung, P., and Kirirat, P Histological characterization of cuticular depositions throughout the molting cycle of the black tiger shrimp (Penaeus monodon) Songklanakarin J Sci Technol., 2005, 27(3) : 499 - 509 35 Ramos-Vara, JA (2005) "Technical Aspects of Immunohistochemistry" 36 S Leng, J McElhaney, J Walston, D Xie, N Fedarko, G Kuchel (October 2008) "Elisa and Multiplex Technologies for Cytokine Measurement in Inflammation and Aging Research" 37 Sritunyalucksana K, Apisawetakan S, Boon-nat A, Withyachumnarnkul B, Flegel TW 2006 A new RNA virus found in black tiger-shrimp Penaeus monodon from Thailand Virus Res, 118: 31 - 38 Tomoya Kono., Ram Savan., Masahiro Sakai., Toshiaki Itami 2004 Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification Journal of Virological Methods , Volume 115, 1:59 - 65 39 Tzu-Ting Chiou, Jenn-Kan Lu, Jen-Leih Wu, Thomas T Chen, Chi-Fong Ko and Jiann-Chu Chen 2007 Expression and characterisation of tiger shrimp Penaeus monodon penaeidin (mo-penaeidin) in various tissues, during early embryonic development and moulting stages Developmental & Comparative Immunology Volume 31, Pages 132 - 142 40 van Hulten M.C and Vlak J.M., 2001 Identification and phylogeny of a protein kinase gene of white spot syndrome virus Virus Genes, 22: 201 - 207 41 Wang X and Zhan W 2006b Development of an immunochromatographic test to detect White Spot Syndrome Virus of shrimp Aquaculture, 255:196 - 200 42 Wattana Panphut, Saengchan Senapin, Siriporn Sriurairatana, Boonsirm Withyachumnarnkul, Timothy W Flegel, 2011 A novel integrase-containing element may interact with Laem-Singh virus (LSNV) to cause slow growth in giant tiger shrimp BMC Veterinary Research ISSN 1746 - 6148 43 Withyachumnarnkul, B., Boon-Nad, A., Anantasomboon, G., Chayaburakul, K., Sriurairatana, S., Flegel, T.W., 2004 Lymphoid organ extracts of growth retarded 40 Penaeus monodon contain a growth retardation agent, Annual Meeting World Aquaculture Society (WAS) World Aquaculture Society, Honolulu, Hawaii, pp - 44 Zhao-Feng Sun, Chao-Qun Hu, Chun-Hua Ren, Qi Shen 2006 Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps byloop-mediated isothermal amplification Journal of Virological Methods 131:41 - 46 Các webside tham khảo: 45 http://www.biorad.com/ 46 http://www.promega.com/ 47 http://www.oie.com/ 48 http://www.nuoitrongthuysan.com/ 49 http://www.diendansinhhoc.com/ 50 http://library.enaca.org/Health/FieldGuide/html/cv025tau.htm 51 http://en.wikipedia.org/wiki/Immunohistochemistry 52 http://library.enaca.org/Health/Publications/ Slow_grown_syndrome.pdf 53 http://www.fao.org/ 54 http://www.daff.gov.au/ 55 hhttp://sonongnghiepkiengiang.gov.vn/ 41 PHỤ LỤC Hình 2.1 Vòng đời chi Penaeus (W Fischer, 1978 FAO Species Identification Sheets for Fishery Purposes, Western Central Atlantic) Hình 2.2 Dấu hiệu lâm sàng bệnh đốm trắng (WSSV) Penaeus monodon Vỏ tôm P monodon ấu niên bị bệnh đốm trắng Những cặn vơi phía vỏ đốm trắng (DV Lightner/P.Saibaba) Hình 2.3 Biểu chung bệnh đầu vàng (YHV) thể tôm Penaeus monodon bên trái (DV Lightner) (http://www.fao.org/docrep/004/ad497e/ad49 7e05.htm) 42 Hình 2.4 Penaeus monodon nhiễm GAV Đuôi bơi viền thể có màu đỏ D Callinan (http://www.daff.gov.au/) Hình 2.5 Tơm nhiễm MBV (http://sonongnghiepkiengiang.gov.vn/) Hình 2.7 Tơm nhiễm TSV Ảnh phóng to Hình 2.6 Tơm P vannamei giai đoạn ấu niên bị bệnh NHP Khối gan tụy bị teo rõ rệt đến 50% so với bình thường (DV Lightner) nhiều lần phần đuôi cho thấy chuyển màu đỏ, náng có ổ hoại tử biểu mơ (mũi tên) Có vết đen hoại tử mơ vỏ cutin nhiễm virus hội chứng Taura (DV Lightner FAO http://library.enaca.org) 43 Hình 2.8 Phân tích trình tự amino acid có nguồn gốc từ LSNV tơm sú trình tự amino acid loài virus họ Luteoviridae chương trình Blast (Kallaya Sritunyalucksana ctv, 2006) Các điểm có hệ số tương đồng cao đánh dấu màu dấu Bên phải số thứ tự amino acid từ Genbank Bên trái viết tắt tên loài virus thuộc họ Luteoviridae với mã số truy cậm GenBank sau: PLRV, Potato leaf roll virus (AAF31445); BYDV, Barley yellow dwarf virus (BAA01054); SCYLV, Sugarcane yellow leaf virus (AAK66856); CABYV, Cucurbit aphid-borne yellows luteovirus (CAA54251); BChV, Beet chlorosis virus (AAK49964); Mushroom, Mushroom bacilliform virus (AAA53090); LSNV, Laem Singh virus (DQ127905) Hình 2.9 Cây phân lồi di truyền Laem Singh virus (Kallaya Sritunyalucksana ctv, 2006) Tên viết tắt loài virus mà mã truy cập GenBank: PLRV; BYDV; SCYLV; CABYV; BChV; Mushroom; LSNV (hình 2.1); Ibdv (Infectious bursal disease virus, NP690839), Sfv (Semliki forest virus, CAA75053), Rrv (Ross river virus, NP740681), Btv (Bluetongue virus, P13840), JEV (Japanese encephalitis virus, NP059434), Wnv (West nile virus, NP776022) 44 Hình 2.11 Ảnh chụp vi điện tử kết lai chỗ mô tim tôm sú mắc MSMG (Sritunyalucksana ctv, 2006) Hình 2.10 Ảnh chụp hiển vi điện tử sau lai chỗ mô bạch huyết (LO) tôm sú mắc MSMG độ phóng đại khác (Sritunyalucksana ctv, 2006) (a) Độ phóng đại thấp: tín hiệu dương tính tập trung tế bào xung quanh ống (tubule) LO (b) Độ phóng đại cao hơn: tín hiệu dương tính nằm tế bào chất c1c tế bào, thể vùi lớn vùng phỏm cầu (spheroid) khơng có phản ứng với đầu dò Hình 2.12 Ảnh chụp vi điện tử kết lai chỗ mô liên kết khối gan tụy tơm sú khỏe mạnh với mẫu dò LSNV (Sritunyalucksana ctv, 2006) 45 Hình 2.13 Ảnh chụp vi điện tử kết lai chỗ mô bạch huyết tơm sú mắc MSMG với mẫu dò LSNV Ở số mẫu sú khác tín hiệu dương tính xuất vùng phỏm cầu quan bạch huyết (Sritunyalucksana ctv, 2006) Hình 2.14 Ảnh chụp kính hiển vi điện từ (TEM) mẫu hình 2.10 (Sritunyalucksana ctv, 2006) Xuất thể vùi tế bào chất vùng ống LO Ảnh phóng to tiết lộ xuất hạt virus có kích thước khoảng 25 - 30 nm 46 Hình 2.15 Kết sau điện di sản phẩm khuyếch đại với mồi 20AF 20AR nhừng mẫu tôm khác (Sritunyalucksana ctv, 2006) Xuất băng sản phẩm khuyếch đại có khích thước khoảng 200bp Hình 2.16 Sơ đồ phản ứng PCR (Huỳnh Vĩnh Khang, 2006) Hình 2.17 Ngun lý RT-PCR (Đặng Thị Hồng Oanh, 2008) 47 Hình 2.18 Phản ứng ELISA (Huỳnh Vĩnh Khang, 2006) Hình 2.19 Bản đồ vector pGEM-T Easy điểm trình tự tham khảo (Nguồn: www.promega.com) 48 Bảng 4.1: BẢNG THỐNG KÊ CHI TIẾT SỐ LƯỢNG MẪU THỰC VÀ KẾT QUẢ SAU KHI THỰC HIỆN RT-PCR STT SỐ LƯỢNG NGÀY Tôm sú giống 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 14/01/2011 11/02/2011 15/02/2011 25/02/2011 28/02/2011 01/03/2011 02/03/2011 04/03/2011 07/03/2011 08/03/2011 10/03/2011 16/03/2011 17/03/2011 21/03/2011 22/03/2011 23/03/2011 06/04/2011 09/04/2011 13/04/2011 16/04/2011 18/04/2011 19/04/2011 20/04/2011 21/04/2011 22/04/2011 27/04/2011 12/05/2011 12/05/2011 13/05/2011 16/05/2011 20/05/2011 24/05/2011 06/05/2011 Tổng: Tôm sú thương phẩm 13 NGUỒN GỐC Tôm sú bố mẹ 12 4 24 10 12 10 10 10 10 14 8 15 17 5 38 18 189 132 Ninh Thuận Bình Thuận Vũng Tàu Vũng Tàu Bình Thuận Bình Thuận Cân Thơ Ninh Thuận Ninh Thuận Ninh Thuận Cần Thơ Ninh Thuận Ninh Thuận Bình Thuận Bình Thuận Bình Thuận Bến Tre Sóc Trăng Bình Thuận Bến Tre Bình Thuận Bình Thuận Bình Thuận Ninh Thuận Bình Thuận Ninh Thuận Sóc Trăng Bến Tre Bình Thuận Ninh Thuận Bến Tre Sóc Trăng Ninh Thuận 23 Tôm sú giống (+) (-) 13 49 Tôm sú bố mẹ (+) (-) 1 12 4 24 10 12 10 10 10 8 12 15 17 38 5 Tháng 06/2011 Phòng sinh học phân tử.RIAII KẾT QUẢ RT-PCR Tôm sú thương phẩm (+) (-) 3 187 127 17 18 GHI CHÚ ... and 22% of the broodstock The study suggests that this assay can be applied to the selection of LSNV - free seed shrimp as well as early detection of LSNV in cultured and broodstock shrimp Keywords:... RT-PCR: Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction rpm: Vòng/phút Ta : Annealing temperature Taq : Thermus aquaticus TBE: Tris Boric Ethylendiaminetetraacid acetic Tm: Melting temperature UV: Ultra... liên hệ mật thi t với vi khuẩn nội cộng sinh khác động vật nguyên sinh (Frelier, 1992) NHP tìm thấy khối gan tụy, làm hồng cầu bị sưng phồng, tuyến gan tụy bị hóa đen giọt lipid, mơ tuyến gan tụy