tìm hiểu về sắc kí lớp mỏng

Trong c¸c s¾c ký, kü thuËt SKLM lµ phư¬ng ph¸p –Ýt ®ßi hái thiÕt bÞ phøc t¹p nhÊt –c¸ch tiÕn hµnh còng thuéc lo¹i ®¬n gi¶n nhÊt. • SKLM –bæ sung những gi¸ trÞ míi cho c¸c phư¬ng ph¸p s¾c ký, –®ưîc chuyÓn tõ s¾c ký cét sang s¾c ký cét hë, –®Ó t¸ch những lîng nhá hçn hîp c¸c chÊt. • SKLM cã thÓ lµ sù kÕt hîp cña nhiÒu c¬ chÕ s¾c ký kh¸c nhau. 

• Trong các sắc ký, kỹ thuật SKLM là phương pháp

–ít đòi hỏi thiết bị phức tạp nhất

–cách tiến hành cũng thuộc loại đơn giản nhất

II Sắc ký lớp mỏng

• Yêu cầu trang thiết bị cần thiết đơn giản

• Cho kết quả nhanh, rất thuận tiện cho theo dõi phản

ứng, dự đoán nhanh các chất

• Thời gian thực hiện ngắn hơn so với sắc ký cột và sắc

ký giấy

• Khá kinh tế nên rất hiệu quả trong thăm dò kết quả

của nhiều quá trỡnh khác nhau

SKLM øng dông chñ yÕu cho

Cũng nh tất cả các phương pháp sắc ký khác, quá trinh tách xẩy ra khi cho pha động chuyển động qua pha tĩnh

• Pha tĩnh được rải thành lớp mỏng trên một giá đỡ phẳng

• Pha động thấm theo lớp mỏng chủ yếu dưới tác dụng của lực mao quản 

1 Nguyên tắc của SKLM

Trong quá trinh di chuyển của pha động:

• nhờ các quá trinh hấp phụ và giải hấp phụ được

lặp đi lặp lại

• do hệ số phân bố khác nhau

 mà những chất khác nhau di chuyển theo hướng chuyển động (pha động) với các tốc độ khác nhau Kết quả: mỗi chất trong hỗn hợp phân tích sẽ ở các

vị trí khác nhau trên bản mỏng  được tách riêng 

1 Nguyên tắc của SKLM

Giá đỡ:

• thường là các tấm kính phẳng được cắt sẵn

• Hiện nay, giá đỡ dạng tấm phẳng kim loại (nhôm) hay plastic cho các bản mỏng tráng sẵn

• Giá đỡ kiểu này:

– thuận tiện cho việc vận chuyển

–chia nhỏ bản mỏng lớn thành các bản mỏng phù hợp 

1 Nguyên tắc của SKLM

Đoạn đường chất tan đi được là

từ tuyến xuất phát đến tâm của

vết sắc ký

Rf cũng là tỷ số giữa tốc độ di

chuyển của chất tan và của dung

môi trên bản mỏng 

a Các hệ số đánh giá sự di chuyển của các

- Nếu Rf = 0: chất tan hoàn toàn không di chuyển,

- Nếu Rf= 1:chất tan di chuyển cùng tốc độ với dung môi hay là không bị chất hấp phụ hấp phụ

Còn dùng giá trị hR f : hR f = 100.R f 

a Các hệ số đánh giá sự di chuyển của các chất:

• chất lượng và hoạt tính của chất hấp phụ

• bề dầy của lớp mỏng

• tính chất, thành phần và độ tinh khiết của pha động

• độ bão hoà dung môi trong binh sắc ký

• phương pháp khai triển sắc ký

• tốc độ di chuyển của pha động

• đoạn đường pha động đi đợc

• vị trí đa chất tan lên bản mỏng

• lượng mẫu đa lên bản mỏng

• ảnh hưởng của chất tan khác, chất tạo phức, pH, nhiệt độ

• độ chính xác của phép đo khoảng cách.

Các yếu tố ảnh hởng đến Rf trong SKLM

a Các hệ số đánh giá sự di chuyển của các chất

 Giá trị R x :

Việc ổn định giá trị Rf thờng gặp rất nhiều khó khăn

về kỹ thuật  tiến hành song song với chất đối chứng

trên cùng một bản mỏng nghĩa là tiến hành sắc ký

trong cùng một điều kiện

Chất đối chiếu: chất chuẩn của chất định phân lập hay

chất có Rf gần với chất đang cần nghiên cứu

Khi đó người ta sử dụng một đại lượng mới là Rx

Rx =

Đoạn đ-ờng chất định phân đi đ-ợc

Đoạn đ-ờng chất đối chiếu đi đ-ợc

=

a Các hệ số đánh giá sự di chuyển của các chất:

 Giá trị RM:

• Người ta thấy rằng có sự liên hệ giữa giá trị RM

và số lượng nhóm CH2 có trong cấu tạo phân tử

của các hợp chất hữu cơ

• Có mối liên hệ giữa giá trị Rf , RM với hệ số K

) 1

b Các hệ số đánh giá sự tách của các chất:

) ( )

( )

(

) (

) (

) (

10 10

10 10

10

B M A

M B

M

A M

B M

A M

R R

R

R R

(

) ( )

(

.

B f

A f

B f

A f

R R

R

R N

c Các hệ số đánh giá sự hiệu nghiệm của bản

mỏng:

 Số đĩa lý thuyết N:

Chiều cao đĩa lý thuyết H:

2 2

)

.(

16 )

.(

16

m

R l

.

3 Pha tĩnh-Chất hấp phụ:

• Trong SKLM, sử dụng nhiều loại chất hấp phụ

• Chất hấp phụ đợc sử dụng phổ biến là: silicagel, nhôm oxid, kieselguhr, cellulose, nhựa trao đổi ion

• Ngoài ra ngời ta còn dùng các chất hấp phụ biến tính

là các chất hấp phụ thông thờng nhng đợc tẩm các chất lỏng hữu cơ nh:

4 Pha động:

Trong sắc ký hấp phụ việc chọn đúng dung môi ý nghĩa rất quan trọng

Khi chọn dung môi phải chú ý đến các yếu tố sau:

- phải hoà tan tơng đối tốt tất cả các cấu tử cần phân tích

- bị hấp phụ tối thiểu trên pha tĩnh (chất hấp phụ)

- khả năng xẩy ra phản ứng hoá học với chất tan cũng nh

chất hấp phụ

- độ bay hơi, sự phân lớp khi dùng hỗn hợp dung môi

- sự tinh khiết của dung môi nhất là các dung môi không

phân cực phải không đợc chứa các dung môi phân cực nh alcol và nhất là nớc.

4 Pha động:

Đoạn đường dung môi đi được l x phụ thuộc vào thời gian t

theo công thức thực nghiệm: l x 2 = b.t + a với a và b là

các hằng số phụ thuộc điều kiện sắc ký

Quãng đ-ờng dmôi đi (l x )

Tốc độ di chuyển của dung môi

4 Pha động:

Lượng dung môi không phân bố đều trên bản mỏng mà cũng giảm dần dần dọc theo hớng khai triển và phần đầu và cuối thay đổi khá nhiều

Rf

Vđ

Cã thÓ chia qu¸ tr×nh SKLM thµnh c¸c giai

• Hiện nay các bản mỏng thờng được tráng sẵn có thể tẩm chất phát huỳnh quang hay không

• Tuy nhiên trong một số trường hợp ngời dùng vẫn

có thể phải tự tráng lấy bản mỏng đáp ứng cho yêu cầu riêng

• Hoạt hoá bản mỏng: Các bản mỏng tráng sẵn hay

tự tráng trước khi sử dụng phải đợc hoạt hoá Thông thờng các bản mỏng đợc hoạt hoá trong khoảng 30 phút ở 110oC.

5 Kỹ thuật tiến hành sklm:

a Chuẩn bị bản mỏng:

• Trong định tính có thể đa mẫu lên bản mỏng bằng các mao quản thuỷ tinh hoặc vi pipet

• Trong định lượng hay bán định lượng, độ chính xác của kết quả phụ thuộc rất nhiều vào độ chính xác của lượng mẫu đưa vào sắc ký

• Khi đó việc dùng các thiết bị chấm có định mức chính xác là rất cần thiết

• Lượng mẫu và vị trí đưa mẫu lên bản mỏng cũng

có nhiều ảnh hưởng đến kết quả 

5 Kỹ thuật tiến hành sklm:

b Đưa mẫu lên bản mỏng:

• là cho pha động di chuyển qua pha tĩnh để tách hỗn hợp phân tích thành các cấu tử nằm ở các vị trí khác nhau trên bản mỏng

• Tuỳ theo hướng chuyển động và thành phần của pha động mà có thể có các cách khai triển sau:

– Sắc ký đi lên –Sắc ký đi xuống –Sắc ký liên tục –Sắc ký lặp

–Sắc ký đa bậc –Sắc ký hai chiều 

5 Kỹ thuật tiến hành sklm:

c Khai triển:

3 3

3

2 21

TuyÕn dung m«i 1

TuyÕn dung m«i 2

1 2

4 3

S

d Hiện sắc đồ:

 Hiện sắc đồ bằng phơng pháp hoá học:

• Đây là phơng pháp phổ biến nhất

• Phun lên bản mỏng một hoặc một vài thuốc thử có khả năng tạo màu đặc trng với chất cần tách

• Các dung dịch này được gọi là dung dịch hiện màu

• Thiết bị phun khá đơn giản: tạo ra các hạt nhỏ dạng sơng

mù để tránh làm hỏng lớp mỏng hay biến dạng sắc ký,

• Lượng thuốc thử đủ tạo màu không dùng d quá nhiều

• Sắc đồ có thể hiện lên ngay sau khi phun hay sau khi sấy nóng ở 80-100 o C Nếu chưa đủ cũng phải chờ bản mỏng nguội hẳn mới phun tiếp để tránh bị rạn nứt, vụn ra 

• Có rất nhiều loại thuốc hiện màu khác nhau

• Một số chất hữu cơ có thể hiện màu bằng dung dịch iod 0,5% trong CHCl3 hoặc bằng hơi iod

• Một thuốc thử chung cho các chất hữu cơ là dung dịch KMnO4 trong H2SO4 đặc Những vết sẽ hiện màu trắng trên nền hồng.

d Hiện sắc đồ:

• Các chất có khả năng hấp thụ tử ngoại hay lớp mỏng có chứa các chất huỳnh quang / phun thuốc hiện huỳnh quang Khi soi dưới đèn UV sẽ thấy các vết tối ứng với vết của chất

• Với các chất có khả năng huỳnh quang, khi chiếu tia tử ngoại lên bản mỏng sẽ thu đợc các vết phát sáng màu khác nhau

• Các đèn tử ngoại thường dùng là các đèn 254 nm và 366nm.

6 ứng dụng của sklm trong phân

tích kiểm nghiệm

a Phân tích định tính:

• Trong trường hợp này không cần thật sự quan tâm đến giá trị Rf mà chỉ cần biết thứ tự chuyển động của các vết trong hỗn hợp

• Phương pháp này thường áp dụng cho các chất vô cơ vi:

– giá trị Rf của chúng rất không ổn định,

–có nhiều thuốc thử thích hợp để tạo ra các màu đặc trưng với các ion vô cơ khác nhau.

a Phân tích định tính:

 Dựa vào giá trị Rf:

• Mỗi chất trong một hệ sắc ký có một Rf đặc trng

• Giá trị Rf phụ thuộc rất nhiều yếu tố:

• chất hấp phụ (loại, hoạt tính, bề dày ),

• pha động (thành phần, độ tinh khiết, tốc độ di chuyển ),

• độ bão hoà dung môi trong bình,

• chiều dài khai triển, nhiệt độ, lợng mẫu, pH và các chất lạ,

• cách xác định tâm (với các vết không cân xứng) độ chính xác của phép đo độ dài

 Do vậy trong định tính việc so sánh với chất chuẩn là cần thiết.

a Phân tích định tính:

 Dựa vào các thiết bị gắn kèm:

Hiện nay SKLM có thể kết hợp với các trang thiết bị hiện

đại giúp cho việc xác định các chất đợc chính xác hơn Ví

dụ như:

• kết hợp HPTLC với FTIR

• kết hợp HPTLC-MS 

KÕt hîp HPTLC víi FTIR

KÕt hîp HPTLC-MS

• Mét øng dông thö tinh khiÕt rÊt hay gÆp kh¸c:

• nhËn biÕt s¬ bé thµnh phÇn cña hçn hîp ph¶n øng,

• c¸c ph©n ®o¹n cña chiÕt xuÊt

• c¸c ph©n ®o¹n cña s¾c ký cét 

UV/VIS

IR MS

c ĐÞnh lîng:

• ChuyÓn tÊt c¶ vÕt cÇn ph©n tÝch trªn b¶n máng vµo mét dung m«i thÝch hîp

• Tinh khiÕt ho¸ mÉu ®o b»ng c¸c c¸ch kh¸c nhau,

• TiÕn hµnh thùc hiÖn c¸c phÐp ®o thÝch hîp như ®o quang, ®o huúnh quang, cùc phæ 

c Định lợng:

 Định lợng sau khi tách các chất khỏi bản mỏng

• Để lấy chất khỏi lớp mỏng dùng:

– dao sắc cạo tất cả bột ở vết vào bình

– phễu con có màng xốp úp ngợc và hút chân không vào cuống phễu

• Sau đó dùng dung môi hoà tan chất và lọc bỏ chất hấp phụ

• Xử lý và định lợng dịch lọc bằng các phơng pháp thích hợp.

c Định lợng:

 Định lợng sau khi tách các chất khỏi bản mỏng

• Ppháp này: kết quả đáng tin cậy nhng mất thời gian

• Ngoài những sai số của quá trinh sắc ký, phương pháp này có thể gặp thêm một số trở ngại và sai số sau:

• Độ tinh khiết của chất hấp phụ: tạp chất trong chất hấp phụ và chất kết dính (nếu có), đặc biệt là sắt phải không

có hoặc được làm sạch trước khi tiến hành sắc ký

• Độ tinh khiết của dung môi: phải đuổi hết dung môi sau khi khai triển, dung môi hoà tan chất phải không ảnh hưởng đến phép đo tiếp theo

• Không chuyển hết chất trên bản mỏng vào dung dịch 

 Định lợng trực tiếp trên bản mỏng:

Các chú ý khi chuẩn bị bản mỏng cho định lượng:

• Các dd chuẩn và thử phải được chuẩn bị như nhau: cùng một loại dung môi, các yếu tố ảnh hưởng khác

•Mẫu thử và mẫu chuẩn phải ở các vị trí cạnh nhau

•Nồng độ mẫu thử và chuẩn phải gần nhau

•Nếu xây dựng dẫy chuẩn thi nồng độ thấp nhất phải ở mức

có thể phát hiện, mẫu có C max gấp 5-10 lần mẫu C min

•Số lần và thể tích chấm các dd chuẩn và thử phải như nhau

•Đoạn di chuyển của chất chuẩn và thử phải như nhau: bão hoà dung môi rất quan trọng

• Chọn dung môi triển khai sao cho các vết lận cận không chồng chập đến vết phân tích 

 Định lượng trực tiếp trên bản mỏng:

Đo diện tích vết :

 Quan hệ diện tích vết và lượng chất trong vết:

•Việc đo diện tích vết sẽ khách quan hơn

•Sai số cũng nhỏ hơn: 5 -10% và có thể đạt đến 3%

•Diện tích của vết phụ thuộc vào

–lượng chất,

–bề dày và hoạt tính của lớp mỏng,

–thể tích dung dịch mẫu được đa lên bản mỏng, –kích thước cũng nh vị trí của điểm xuất phát 

Đo diện tích vết :

 Quan hệ diện tích vết và lượng chất trong vết:

•Trong khoảng lượng chất từ 1 đến 100 g, có quan hệ tuyến tính: S = a.lgM + b (a, b: hằng số thực nghiệm)

•Một số thực nghiệm chỉ ra rằng căn bậc hai của diện tích vết có quan hệ tuyến tính với logarit khối lượng chất trong một phạm vi khá rộng về nồng độ theo công thức:

M và A là lượng chất và diện tích vết của dung dịch thử

M S và A S là lượng chất và diện tích vết của dung dịch chuẩn

A D là diện tích vết của dung dịch mẫu pha loãng D lần 

D A

A

A

A M









 Định lợng trực tiếp trên bản mỏng:

Đo diện tích vết :

 Một số biện pháp xác định diện tích vết cổ điển:

Diện tích của các vết có thể được xác định bằng nhiều cách khác nhau Sau đây là một số biện pháp cổ điển đã

được sử dụng để xác định diện tích vết:

- Sử dụng thiết bị đo diện tích (diện tích kế)

- Vẽ lại trên giấy ô ly rồi tính số milimet vuông

- Vẽ lại trên giấy can, rồi so sánh diện tích qua trọng lượng bằng phương pháp cân 

– chiều cao của pic tỷ lệ với cường độ màu ở tâm

–chiều rộng pic tỷ lệ chiều dài của vết theo hướng quét

•Hướng quét của chùm sáng theo hướng khai triển sắc ký đồ

và các vết phải tách rời nhau 

Đo mật độ vết bằng densitometer:

Kiểu truyền qua :

•Có thể phun đều lên lớp mỏng dung dịch parafin pha trong ether để cho lớp mỏng trở nên trong

•Sau khi cho bay hết ether, có thể cho vào máy đo mật độ quang 

 Định lượng trực tiếp trên bản mỏng:

Xử lý hinh ảnh với camera kỹ thuật số:

•Những năm gần đây, việc quét bản mỏng với các hệ thống phân tích hinh ảnh, đặc biệt với CCD camera (Charge-Coupled Device camera) trở nên phổ biến hơn

•Lợi thế của kỹ thuật này là có thể:

–Quét bản mỏng với một vùng rộng hơn

–Số điểm ảnh lớn hơn với các thiết bị kỹ thuật số

có độ phân giải ngày càng cao

–Các dữ liệu ảnh đợc xử lý bằng máy tính 

 Định lượng trực tiếp trên bản mỏng:

Xử lý hinh ảnh với máy quét văn phòng :

•Các hệ thống phân tích hinh ảnh thờng có giá thành cao,

có thể dùng máy quét văn phòng (scanner) để thu đợc hinh ảnh bản mỏng

•Hinh ảnh bản mỏng có thể được:

–đo kích thước bằng tay hay tự động trong các chương trinh đồ hoạ trên máy tính

–xử lý với các phần mềm chuyên dụng

•Đây là phương pháp có thể thu được kết quả nhanh và giá thành thấp 

Đo kÝch thưíc vÕt s¾c ký b»ng Measure Tool

kh«ng dïng Color Range 

Đo kÝch thíc vÕt s¾c ký b»ng Measure Tools cã sö dông

Color Range 

Đo tự động diện tích của vết bằng bằng Magic Wand Tool 