Tìm hiểu về HPLC và ứng dụng

Sắc ký là kỹ thuật tách các cấu tử ra khỏi hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau của mỗi cấu tử đối pha tĩnh và pha động. Một pha nằm cố định tại một chỗ, gọi là pha tĩnh, Pha di chuyển theo một hướng xác định gọi là pha động, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. HPLC ( High performance liquid chromatography): Là phương pháp tách trong đó pha động là một chất lỏng, còn pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn được phân chia dưới dạng tiểu phân. Quá trình SKL dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại trừ theo kích cỡ. Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kĩ thuật tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp. Ưu điểm của HPLC: Thể tích tiêm lượng mẫu nhỏ Pha tĩnh gồm các hạt nhỏ kích cỡ từ (35µm) Mẫu và chất lỏng đi qua cột thông qua áp lực được cung cấp bởi một máy bơm.

TÌM HIỂU VỀ HPLC VÀ ỨNG DỤNG NỘI DUNG Giới thiệu qua HPLC Kiến thức sắc ký PHẦN I: KIẾN THỨC CƠ BẢN 1.1 Định nghĩa sắc ký 1.2 Một số đại lượng đặc trưng 1.3 Độ phân giải 1.4 Các tham số sắc ký 1.5 Phương trình đường cong Van Deemter 1.1 KHÁI NIỆM CƠ BẢN - Sắc ký kỹ thuật tách cấu tử khỏi hỗn hợp dựa lực khác cấu tử đối pha tĩnh pha động Một pha nằm cố định chỗ, gọi pha tĩnh, Pha di chuyển theo hướng xác định gọi pha động, chúng di chuyển với tốc độ khác tách khỏi 1.2 CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG 1.2.1 THỜI GIAN LƯU tr2 tr1 t’r1 to To : Thời gian lưu chết t’r1 : Thời gian lưu thực chất A t’r2 : Thời gian lưu thực chất B t’r2 TR1 : Thời gian lưu chất A TR2 : Thời gian lưu chất B Thời gian lưu chất thời gian tính từ bơm mẫu vào cột chất khỏi cột đạt giá trị cực đại 1.2 Hệ số phân bố K (tỉ số phân bố khối lượng ) Hệ số phân bố chất cho biết khả phân bố chất hai pha cộng với sức chứa cột tức tỷ số lượng chất tan pha tĩnh lượng chất tan pha động thời điểm cân Nếu K nhỏ tR nhỏ tách Nếu K lớn Peak bị dỗng Trong thực tế K’ từ 1- tối ưu 1.3 Độ chọn lọc α Độ chọn lọc cho biết hiệu tách hệ thống sắc ký ,khi 02 chất A ,B có K’ A va K’B khác có khả tách, mức độ tách biểu thị độ chọn lọc α = K’B / K’A Với điều kiện K’B > K’A với  khác khả tách rõ ràng α: phụ thuộc vào pha tĩnh, pha động chất chất tan = 1.02 = 1.16 = 1.20 1.4 Số đĩa lý thuyết N Đại lượng đặc trưng cho hệ thống tách số đĩa lý thuyết N Đĩa lý thuyết định nghĩa miền mà cân động nồng độ cấu tử pha tĩnh pha động thiết lập Chiều cao đĩa lý thuyết H= L/N L: chiều dài cột N: số đĩa lý thuyết 1.4 Số đĩa lý thuyết N Số đĩa lý thuyết bề dày đĩa phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: - đường kính hạt pha tĩnh, hình dạng kiểu hạt - Điều kiện chế tạo, độ xốp, kích thước lỗ xốp hạt pha tĩnh - Bản chất, cấu trúc phân tử chất tan - Loại, tốc độ thành phần pha động trình sắc ký - Độ nhớt, pH pha động… 70 71 PHẦN II: KHÓ KHĂN VÀ NGUỒN GỐC PHÁT SINH LỖI 2.1 SỰ PHỐI TRỘN CỦA PHA ĐỘNG 72 73 74 2.1 SỰ PHỐI TRỘN CỦA PHA ĐỘNG 75 2.1 SỰ PHỐI TRỘN CỦA PHA ĐỘNG 76 2.2 PH pha động 77 • Thơng thường khuyến cáo kiểm tra PH pha động, có tách hợp chất ion or trình ion hóa xảy Việc thay nước tinh khiết hệ đệm để đạt điều kiện ổn định, bền vững phần 1.14 PH phân tách phải thấp pKS hợp chất liên quan 2.2 PH pha động 78  nortriptyline: pka10.76  Amitriptyline : pka =9,24 2.2 PH pha động 79 2.2 PH pha động 80 Điều kiện sắc ký: Mẫu nicotine and salicylic acid Cột 4.0 mm × 25 cm Pha tĩnh : LiChrospher 60 RP-Select B, µm (reversed phase C8) Pha động 67 mM citrate buffer pH 5.65, 5.85 or 6.05/methanol Tốc độ dòng 1.5 ml/ph UV: 240 nm 2.3.Thêm số tác nhân vào đệm 81 Đối với việc chuẩn bị dung mơi cho pha động khơng có PH mà số thành phần khác thêm vào như: muối trung tính, thuốc thử ion, or dung mơi hữu Giai đoạn nên điều chỉnh PH, Và ảnh hưởng đến khả tách khơng?????? 2.3.Thêm số tác nhân vào đệm 82 Đối với việc bị dung mơi cho pha động khơng cóCPH số Sample: 0.5 chuẩn mL solution with α-chymotrypsinogen, cytochrome andmà lysozyme thành phần10 khác Column: mmđược × 10thêm cm vào như: muối trung tính, thuốc thử ion, or dung môi hữu tĩnh: Mono S HR, 10 µm (strong cation exchanger) Pha Pha động: 20 mM trisodium citrate pH 4.9 với gradient 0- 0.5M NaCl / 50:50/40 min, tốc độ dòng : mL min−1 Detector: UV 280 nm 2.4 Ảnh hưởng acid nồng độ acid pha động 83 PH ổn định thu dung dịch đệm (acid or bazo muối tương ứng) với khả đủ lớn nhiên, trình tách thực với việc thêm vào acid or bazo Những trường hợp việc chuẩn bị pha động đơn giản nhiên phương pháp không đảm bảo ổn định PH Khơng có nồng độ acid ảnh hưởng đến q trình tách mà phụ thuộc vào chất acid Điều kiện sắc ký 84 Mẫu: Thành phần dược phẩm tạp chất Cột: 4.6 mm × 15 cm Pha tĩnh: HALO fused core C18, 2.7 µm (reversed phase C18) Pha động: A: water với 0.05, 0.1 or 0.2 % loại acid khác B: acetonitrile Chương trình chạy: 13 13-25 25-30 Nhiệt độ: 40oC Detector: UV: 220 nm 40- 60 % kênh B 60- 98% kênh B 98% kênh B Tốc độ dòng: 1.2ml/ph ... đối xứng T (Tailing factor) Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng Peak sắc ký đồ thu T tính tỷ số độ rộng 02 nửa Peak điểm 1/10 chiều cao Peak : T = a/b a b Peak dạng đối xứng... p2 t o L2c  1.4 Đường cong Van Deemter 2 .Tìm hiểu HPLC MỤC LỤC 19 Phần 1: Tổng quan sắc ký Phần 2: Những khó khăn nguồn gốc phát sinh lỗi 1.1 Hệ thống HPLC 2.1 Qúa trình trộn pha động 1.2 Giới... Trong thực tế Peak cân đối ( Gass) độ phân giải tối thiểu để 02 Peak tách R =1.0 Trong phép định lượng R=1,5 phù hợp Độ phân giải phụ thuộc vào hệ số chọn lọc α, số đĩa lý thuyết N, hệ số lưu