KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN VI KHUẨN Pseudomonas SINH LIPASE TRONG MỘT SỐ NGUỒN NƢỚC THẢI CHỨA LIPID

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN VI KHUẨN Pseudomonas SINH LIPASE TRONG MỘT SỐ NGUỒN NƢỚC THẢI CHỨA LIPID Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: ĐẶNG THỊ THANH TUYỀN Niên khóa: 2008 - 2012 Tháng 7/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN VI KHUẨN Pseudomonas SINH LIPASE TRONG MỘT SỐ NGUỒN NƢỚC THẢI CHỨA LIPID Hƣớng dẫn khoa học ThS TRẦN NGỌC HÙNG Sinh viên thực ĐẶNG THỊ THANH TUYỀN Tháng 7/2012 LỜI CẢM ƠN  Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám hiệu trƣờng Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập trƣờng Các thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học thầy cô trực tiếp giảng dạy tận tình truyền đạt kiến thức cho suốt bốn năm qua  Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Trần Ngọc Hùng tận tình hƣớng dẫn bảo cho nhiều kiến thức quý báu suốt thời gian thực khóa luận Ban Giám đốc anh chị phòng thí nghiệm Cơng ty TNHH Gia Tƣờng tạo điều kiện thuận lợi để tơi thực khóa luận tốt nghiệp  Xin gửi lời cảm ơn đến tất bạn bè, tập thể lớp Công nghệ sinh học 34 bên tôi, chia động viên suốt thời gian qua  Con thành kính ghi ơn cha mẹ tất ngƣời thân gia đình ln nguồn động viên khích lệ to lớn cho thời gian học tập Sinh viên Đặng Thị Thanh Tuyền i TÓM TẮT Đề tài: “Khảo sát diện vi khuẩn Pseudomonas sinh lipase số nguồn nƣớc thải chứa lipid” nhằm mục đích thu thập chủng vi sinh vật sinh lipase có ý nghĩa quan trọng việc giúp tìm nguồn thu nhận lipase có hoạt tính cao, từ có ứng dụng lĩnh vực công nghiệp xử lý môi trƣờng Từ mẫu nƣớc thải lò giết mổ gia súc, mẫu nƣớc thải nhà máy chế biến cá mẫu nƣớc thải từ kênh dẫn nƣớc thải sinh hoạt, tiến hành làm giàu dùng để phân lập chủng vi khuẩn mục tiêu có khả phân giải mỡ môi trƣờng đặc trƣng nhƣ môi trƣờng Seliber môi trƣờng Ran chứa chất mỡ bò nhƣ nguồn carbon nhất, kết hợp với việc kiểm tra đặc tính hình thái, sinh hóa đặc trƣng cho chủng Pseudomonas nhằm thu đƣợc chủng có đặc tính sinh hóa tƣơng tự Pseudomonas Kết thu đƣợc 21 tổng số 48 chủng có đặc tính sinh hóa tƣơng tự Pseudomonas Bao gồm chủng thu đƣợc từ nguồn nƣớc thải lò mổ; chủng từ nƣớc thải nhà máy chế biến cá da trơn chủng thu đƣợc từ nguồn nƣớc thải kênh rạch tự nhiên Trong số đó, có 11 chủng đƣợc phân lập môi trƣờng Ran 10 chủng đƣợc phân lập môi trƣờng Seliber Cuối tiến hành định tính khả sinh lipase chủng Pseudomonas thu đƣợc môi trƣờng LB chứa Tween 80 Trong đó, nhận thấy có 16 chủng có khả sinh lipase nuôi cấy môi trƣờng LB chứa Tween 80 1% Trong đó, chủng S3, S8, R7 R8 đƣợc phân lập từ mẫu nƣớc thải lò giết mổ gia súc cho thấy vòng phân giải Tween 80 lớn sau ngày nuôi cấy nhiệt độ phòng ii SUMMARY The study entitled: “Survey of the presence of Pseudomonas producing lipase biosynthesis in some wastewater containing lipid” was carried out at Gia Tuong limited liability company C2 area, D block, Tsunami industrial park, Binh Duong province to collect of microorganisms producing lipase have important implications in helping to find sources of receiving highly active lipase, which have applications in many fields of industry and environmental treatment Two wastewater samples from cattle slaughterhouses, one from fish processing plant and two wastewater samples from sewage canals, were enriched for isolation of strains of bacteria on Seliber medium and Ran medium containing beef fat substances such as sole carbon source, combined with checking morphological features with characteristics similar biochemical Pseudomonas Twenty one out of 48 strains with biochemical characteristics similar to Pseudomonas were obtained, which were strains from two sources slaughterhouse wastewater, strains from wastewater fish processing plant and strains obtained from two sources of natural sewage canals Eleven of these isolated strains, were isolated on Ran medium and 10 strains were isolated on Seliber medium Finally qualitate of capacity of lipase biosynthesis of Pseudomonas was performed using LB medium containing 1% Tween 80 By which, 16 strains were found In particular, strains S3, S8, R7 and R8 were isolated from slaughterhouse wastewater samples showed the biggest diameter resolution of Tween 80 after days of culture at room temperature iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT KHÓA LUẬN ii SUMMARY iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii Chƣơng MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài .2 1.3 Nội dung thực Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Vi khuẩn Pseudomonas 2.1.1 Lịch sử phát 2.1.2 Phân loại .4 2.1.3 Đặc điểm vi khuẩn Pseudomonas 2.1.3.1 Hình thái .4 2.1.3.2 Sinh lý 2.1.3.3 Sinh hóa 2.1.4 Cách phân lập Pseudomonas 2.1.5 Tác hại Pseudomonas .7 2.1.5.1 Đối với thực vật 2.1.5.2 Đối với động vật 2.1.5.3 Đối với ngƣời 2.1.6 Ứng dụng vi khuẩn Pseudomonas 2.1.7 Cơ chế tổng hợp lipase Pseudomonas 2.2 Enzyme lipase 10 2.2.1 Giới thiệu enzyme lipase .10 2.2.2 Nguồn thu nhận lipase 11 2.2.3 Tính chất đặc hiệu lipase từ vi sinh vật .11 2.2.4 Ứng dụng lipase 12 2.3 Một số nghiên cứu nƣớc 13 2.3.1 Trong nƣớc 13 2.3.1 Một số nghiên cứu nƣớc .13 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .13 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 13 3.2 Vật liệu 13 3.2.1 Nguồn gốc mẫu thí nghiệm 13 3.2.2 Vi sinh vật đối chứng 14 iv 3.2.3 Thiết bị, hóa chất mơi trƣờng 13 3.2.3.1 Thiết bị dụng cụ 13 3.2.3.2 Hóa chất 13 3.2.3.3 Môi trƣờng 13 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 14 3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 14 3.3.2 Phƣơng pháp phân lập chủng vi sinh vật phân giải lipid .14 3.3.3 Phƣơng pháp kiểm tra sinh hóa chủng Pseudomonas 15 3.3.4 Phƣơng pháp định tính khả sinh lipase mơi trƣờng Tween 80 17 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 4.1 Kết phân lập chủng vi sinh vật phân giải lipid 19 4.2 Kết kiểm tra sinh hóa 20 4.4 Kết định tính lại khả sinh lipase .26 4.5 Một số hình ảnh q trình thí nghiệm 30 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 27 5.1 Kết luận 27 5.2 Đề nghị 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO .28 PHỤ LỤC 28 v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome DNA Deoxyribonucleic Acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid G+C Guanine + Cytosine H2 O2 Hydrogen peroxide KIA Kligler Iron Agar LB Luria Bertani MR Methyl Red NA Nutrient Agar O/F Oxydation/fermention RNA Ribonucleic Acid TTC Triphenyl Tetrazolium Chloride UV Ultra Violet KIA Kriglers Iron Agar USA United States of America vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Ứng dụng lipase công nghiệp 12 Bảng 3.1 Một số thử nghiệm riêng sau xác định Pseudomonas 17 Bảng 4.1 Đặc tính khuẩn lạc phân lập mơi trƣờng Seliber 19 Bảng 4.2 Đặc tính khuẩn lạc phân lập môi trƣờng Ran 20 Bảng 4.3 Kết kiểm tra sinh hóa chủng phân lập mơi trƣờng Seliber 22 Bảng 4.4 Kết kiểm tra sinh hóa chủng phân lập môi trƣờng Ran 22 Bảng 4.5 Một số thử nghiệm sinh hóa khác chủng Pseudomonas phân lập 25 Bảng 4.6 Khả sinh tổng hợp lipase chủng Pseudomonas mơi trƣờng LB có chứa 1% Tween 80 28 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Trang Hình 2.1 Sự thủy phân tổng hợp chất triacylglycerol xúc tác enzyme lipase 11 Hình 4.1 Kết kiểm tra sinh hóa 23 Hình 4.2 Kết thử nghiệm riêng 25 Hình 4.3 Kết định tính Tween 80 27 Sơ đồ 3.1 Phƣơng pháp phân lập chủng vi sinh vật phân giải lipid 16 Sơ đồ 3.2 Các bƣớc xác định Pseudomonas thử nghiệm sinh hóa 17 viii A B 3 C D E F G H Hình 4.1 Kết kiểm tra sinh hóa A) Nhuộm Gram chủng R7; B) Nhuộm Gram chủng S9; C) Thử nghiệm O/F 1: chủng S8, 2: chủng S9, 3: E col; D)Thử nghiệm lên men lactose 1:P aeruginosa, 2: B subtillis, 3: chủng R10; E) Thử nghiệm catalase chủng Trái: B subtilis, phải: chủng S8; F) Thử nghiệm oxidase mẫu 1: B subtilis, 2: E.coli, 3: chủng R7; G) Thử nghiệm KIA 1: không cấy, 2: chủng S8 làm kiềm mặt ,3: chủng S21 sinh hơi, 4: Azotobacter làm acid môi trường,5:chủng R11, 6: Chủng S6 sinh H2S; H) Thử nghiệm tính di động chủng1:P fluorescens, 2: khơng cấy, 3: chủng S4 22 Có 13 chủng phân lập đƣợc môi trƣờng Seliber 13 chủng phân lập đƣợc môi trƣờng Ran đƣợc kiểm tra thêm số thử nghiệm sinh hóa khác không đặc trƣng cho chủng Pseudomonas Kết đƣợc trình bày bảng 4.5 Bảng 4.5 Một số thử nghiệm sinh hóa khác chủng Pseudomonas phân lập Thử nghiệm Citrate Yêu cầu (đặc điểm) (+) xanh dƣơng Số chủng thử nghiệm 26 Kết 26(+) ( - ) khơng chuyển màu Indole (+) vòng đỏ mặt 26 26(-) 26 26(-) ( - ) khơng có vòng đỏ MR (+) màu đỏ ( - ) không chuyển màu Urea (+) màu hồng 26 (+): S4, S22, S16, R1, R7, R14, R15 26 ( - ): S8, R14, R15, S4 26 26 ( - ): R2, R14, R15 (+): R7, R22 ( - ) không chuyển màu Gelatine (+) chảy gelatin 4oC ( - ) gelatin đông 4oC Huỳnh quang Lên men glucose (+) chuyển vàng (-) không chuyển màu Các chủng Pseudomonas phân lập đƣợc có khả sử dụng citrate nhƣ nguồn carbon nhất, indole MR âm tính Trên mơi trƣờng Urea gelatin chủng cho kết dƣơng tính có đặc điểm giống làm đổi màu mơi trƣờng King’ B, bề mặt khuẩn lạc nhăn Sau kiểm tra sinh hóa chủng, kết phân lập đƣợc môi trƣờng Seliber 13 chủng môi trƣờng Ran 13 chủng Những chủng phân lập mơi trƣờng có hình thái khuẩn lạc giống sau làm King B cho kết sinh hóa đƣợc xếp thành chủng Sau xếp Seliber 11 chủng mẫu có chủng, mẫu có chủng, mẫu có chủng, mẫu có chủng, mẫu có chủng mơi trƣờng Ran 10 chủng mẫu có chủng, mẫu có chủng, mẫu có chủng, mẫu có chủng, mẫu có chủng 23 A B C E D F Hình 4.2 Kết số thử nghiệm riêng A) thử nghiệm citrate 1: không cấy, 2: P.aeruginosa, 3:E coli, 4: chủng S4; B)Thử nghiệm indole 1: B subtilis, 2: E coli, 3: chủng S14; C ) Thử nghiệm MR 1: Không cấy, 2: E coli, 3: P aeruginosa, 4: chủng S8; D) Thử nghiệm Urea 1: chủng R1; 2:chủng R13; E) Chủng R8 phát huỳnh quang cấy môi trường King B; F)Thử nghiệm gelatin A: B subtilis, B: E coli, C: chủng S18; G) Thử nghiệm lên men glucose 1:P aeruginosa, 2: B subtillis, 3: chủng R10 Pseudomonas tồn phổ biến môi trƣờng đất, nƣớc Kết phân lập lại cho thấy chủng Pseudomonas tồn với số lƣợng lớn môi 24 G trƣờng phân lập nhƣng đa dạng lồi khơng cao Bên cạnh Pseudomonas, mẫu nƣớc thu nhận xuất số lƣợng lớn lồi vi khuẩn khác có khả sống mơi trƣờng với nguồn carbon chất béo Điều nguồn gốc mẫu nƣớc có số điều kiện chƣa phù hợp với sinh lý, sinh hóa Pseudomonas nhƣ tốc độ dòng chảy, thời gian lƣu trữ nguồn nƣớc thải thành phần chất béo nguồn nƣớc không đa dạng 4.4 Kết định tính lại khả sinh lipase Cấy 21 chủng Pseudomonas phân lập đƣợc lên môi trƣờng LB bổ sung 1% Tween 80 Chủng sinh lipase mạnh thể mức độ tạo quầng kết tủa trắng đục Quầng kết tủa rộng chủng thể hoạt tính lipase mạnh Ủ chủng nhiệt độ phòng thời gian ngày Kết đƣợc trình bày bảng: Hình 4.3 Định tính sinh enzyme lipase (1) Chủng S7, (2) Azotobacter Trong tổng số 21 chủng đƣợc phân lập, có 15 chủng có khả sinh lipase kiểm tra môi trƣờng LB chứa 1% Tween 80 Trong đó, khả sinh tổng hợp lipase chủng Pseudomonas phân lập từ lò mổ cao nơi khác Phân lập theo phƣơng pháp Nguyễn Lân Dũng (1974) đem lại kết tƣơng đƣơng với phƣơng pháp Quyền Đình Thi cộng (2003), nhƣng kết đinh tính lại khả sinh lipase phƣơng pháp phân lập Quyền Đình Thi lại đem lại kết tốt hơn, 100% chủng sau phân lập có khả sinh lipase Dựa khảo sát khả sinh lipase 102 chủng Pseudomonas ta nhận thấy đa phần chủng có khả sinh lipase Kết cho tƣơng đƣơng sau định tính khả sinh lipase chủng Pseudomonas phân lập đƣợc 25 Bảng 4.6 Khả sinh tổng hợp lipase chủng Pseudomonas STT Tên chủng S3 Khả sinh Lipase + Đƣờng kính vòng kết tủa (mm) 10 S4 + S7 + S8 + 10 S10 - S14 + S16 - S18 - S22 + 10 S24 + 11 S25 - 12 R1 + 13 R2 + 14 R7 + 15 15 R8 + 12 16 R10 + 17 R13 + 18 R15 - 19 R16 + 20 R18 + 21 R22 + 26 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Đã phân lập đƣợc 21 chủng có đặc tính sinh hóa tƣơng tự Pseudomonas, bao gồm 10 chủng thu đƣợc từ nguồn nƣớc thải lò mổ; chủng từ nƣớc thải nhà máy chế biến dầu cá da trơn chủng thu đƣợc từ nguồn nƣớc thải kênh rạch tự nhiên Trong số đó, có 11 chủng phân lập mơi trƣờng Ran 11 chủng đƣợc phân lập môi trƣờng Seliber Trong tổng số 21 chủng đƣợc phân lập, nhận thấy có 15 chủng có khả sinh lipase kiểm tra môi trƣờng LB chứa Tween 80 1% Trong đó, chủng S3 đƣợc phân lập từ mẫu nƣớc thải lò mổ 1; S8 phân lập từ mẫu nƣớc thải lò mổ 2; R7 R8 phân lập từ mẫu nƣớc thải lò mổ cho thấy vòng phân giải Tween 80 lần lƣợt 15 mm 12 mm lớn thể kết tủa trắng đục xung quang đƣờng cấy 5.2 Đề nghị Sử dụng phƣơng pháp sinh học phân tử để định danh xác lồi Pseudomonas phân lập đƣợc Tiến hành đo hoạt tính enzyme lipase chủng vừa phân lập đƣợc Sử dụng kit API 20E nhằm kiểm tra nhanh nhiều tiêu sinh hóa khác Thử nghiệm khả sinh lipase chủng nhiều môi trƣờng khác Nghiên cứu điều kiện nhân sinh khối chủng Pseudomonas an tồn có khả sinh tổng hợp lipase cao 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Tiến Dũng 2002 Tài liệu giáo trình mơn phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm Nguyễn Lân Dũng 1974 Một số phương pháp nghiên cứu Vi sinh vật học, Tập Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Cao Ngọc Điệp, 2005 Ảnh hƣởng dịch vi khuẩn Pseudomonas spp lên lúa cao sản trồng đất phù sa cần thơ Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ Bùi Hồng Quân Nguyễn Đức Lƣợng 2009 Tối ƣu hóa sinh tổng hợp lipase từ Pichia anomala VTCC Y0787 sử dụng ma trận PLACKETT – BUURMAN phƣơng pháp đáp ứng bề mặt- Phƣơng ấn cấu trúc có tâm Tạp chí cơng nghệ sinh học (4) 493-500 Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Bẩy, Mai Thị Thanh, Nguyên Thị Thảo, Lê Thị Thu Giang, Nguyễn Thị Tuyết Nhung Nguyễn Ngọc Dũng 2003 Phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp lipase từ nƣớc thải khảo sát hoạt tính lipase 102 chủng Pseudomonas Tạp chí Di truyền ứng dụng : 37-41 Tài liệu tiếng Anh Bisen P S., Debnath M and B K S Godavarthi 2012 Microbes concepts and applications Wiley J and Sons (eds) Wiley – Blackwell Canada P Cornelis 2008 Pseudomonas: Genomics and Molecular Biology Caister Academic Press Great Britain D H Bergey and J G Holt; 1994 Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th edition Lippincott Williams and Wilkins USA L I Grover-Lakomia and E Fong 1999 Microbiology for heath and careers th edition Delmar publisher USA 10 Bauman, Robert 2007 Cummings San Fancisco Microbiology (2nd edition) Pearson Benjamin 11 Ece Yapasan 2008 Partial purification and characterization of lipase enzyme from a Pseudomonas strain The Graduate School of Engineering and Sciences of İzmir Institute of Technology in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science 28 12 Gupta R, Gupta N and P Rathi 2004 Bacterial lipase: an overview of production, purification and biochemical properties Apply microbiol Biotechnol 64 pp: 763-781 13 Marie Zarevúcka 2012 Olive Oil as Inductor of Microbial Lipase Olive Oil – Constituents, Quality, Health Properties and Bioconversions Boskou Dimitrios (eds), Agricultural and Biological Sciences pp 457 – 470 14 Moore E R B., Tindall B F., Martins Dos Santos V A P., Pieper D H., Ramos J L., and N J Palleroni 2006 Nonmedical : Pseudomonas Prokaryotes Martin D Stanby F., Eugene R., Karl-heinz S and E Stackebrandt (eds) Springer USA pp:646-703 15 O Lysenko 1961 Pseudomonas- An attempt at a general classification J gen Microbiol 25 pp: 379-408 16 Rahman R N Z A., Salleh A B and M Basri 2006 Lipase: introduction New lipases and proteases Nova Science publishers, Inc, Newyork, pp 2-22 17 Sharma R., Chisti Y and U C Banerjee 2001 Production, purification, characterizatio, and applications of lipases Biotechnology Advances 19 pp: 627-662 18 V L Sutter 1968 Identification of Pseudomonas species isolated from hospital environment and human sources Applied microbiology 16 pp: 1532-1538 19 J Van camp, Huyghebaert A.and P Goeman 1998 Enzymatic synthesis of structured modified fats Structural modified foot fats: synthesis, biochemistry, and use A B Christophe (eds) AOCS press, USA 20 E N Vulfson 1994 Lipases - their structure, biochemistry and applications Industrial applications of lipases Woolley P and S B Peterson(eds) Cambridge Univ Press pp 271–88 Tài liệu internet 21 www.Vietsciences2.free.fr/ /phuongphapthucnghiem-dinhtenvk04.htm cập 22 tháng năm 2012 truy 22 www.vea.gov.vn/vn/khoahoccongnghe/congnghemt/xulynuocthai/Pages/Côngn ghệxửlýnƣớcnƣớcthảiởViệtNam–thựctrạngvàtháchthức.aspx truy cập ngày tháng năm 2012 23 www.vast.ac.vn/index.php?option=com_content&view=article&id=1387%3An ghien-cu-va-s-dng-ch-phm-sinh-hc-t-vi-khun-i-khang-kim-soat-nm-hi-caytrng&catid=27%3Asan-pham-cong-nghe&Itemid=143&lang=vi truy cập ngày tháng năm 2012 29 24 www.gopetsamerica.com/bio/bacteria/pseudomonas.aspx truy cập ngày tháng năm 2012 25 www.docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:SXrv6EFIflAJ:ihph.org/Downlo adFolder/nguyenquoctuan%252013%252004%25202009.pdf+&hl=vi&gl=vn&pid=bl &srcid=ADGEESibvr47QfrEh8NQR8m1ksJ6UMh1dVCcW3FuSGOIp5cmwCdtrc20 FSOrycxdC7QpkNT3wM339zElWKXCfQHFQyZOPmIGMu5AKF3lsd_ActpmZPOjl2wXXp1c2DyK6g2F4SzvHh&sig=AHIEtbTbZYnMtxzPYWrV KYcUEJet0G4ECw truy cập ngày tháng năm 2012 26 www.10.40.0.1/cgibin/hotspotlogin.cgi?res=notyet&uamip=10.40.0.1&uampor t=3990&challenge=3946b1418c98937ebb5023e3786f5ee2&called=00-15-17DA1923&mac=4C0F6E6C5BC8&ip=10.40.2.146&nasid=coova3&sessionid=503a38 5600000008&userurl=http%3a%2f%2fwww.zimbio.com%2fSymptoms%2bof%2bM RSA%2farticles%2f7kKxPNSoXfw%2fOrigin%2bof%2bthe%2bname%2bPseudomo nas&md=447A4895E416E19F6BC0DC5E5CC1D7E1 30 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần môi trƣờng sử dụng Môi trƣờng Seliber Môi trƣờng Ran K2HPO4 1g K2HPO4 5g MgSO4.7H2O 0,3 g (NH4)3PO4 5g CaCl2.6H2O 0,1 g MgSO4.7H2O 1g (NH4)2HPO4 2g CaCl2.6H2O 1g NaCl 0,1 g FeCl3.6H2O vết Agar 20 g NaCl vết Nƣớc lít Thạch 20 g Mơi trƣơng King’ B Peptone 20 g K2HPO4 1,5 g Môi trƣờng lên men lactose Tryptone 10 g NaCl 5g MgSO4.7H2O 1,5 g Cao thịt 1g Agar 15 g Lactose 5g Glycerol 10ml Nƣớc cất lít Phenol red Nƣớc cất 0,018 g lít Mơi trƣờng Simmon citrate agar Môi trƣờng Hugh Leifson Peptone 2,0 g NH4H2PO4 1,0 g 1,0 g K2HPO4 0,3 g K2HPO4 NaCl 5,0 g NaCl Dextrose 10 g Sodium citrate Brommothymol blue 0,05 g MgSO4 0,2 g Agar 3g Bromothymol blue 0,08 g Nƣớc cất lít Agar 13 g 5g 2g Môi trƣờng NA bổ sung TTC Cao thịt Peptone NaCl Agar 3,0 g 5,0 g 5,0 g 12,0 -18,0 g Cao thịt Peptone NaCl Gelatin TTC 0,05 g pH Nƣớc cất lít pH 7,0 ± 0,2 Mơi trƣờng KIA Môi trƣờng gelatin 3,0 g 5,0 g 5,0 g 120 g 6,8 ± 0,2 Môi trƣờng Urea agar Pepton 20 g Peptone 1,0 g Lactose 10 g Dextrose 1,0 g Dextrose 1,0 g NaCl 5,0 g NaCl 5,0 g Potassium phosphate 2,0 g Feric ammonium citrate 0,5 g Urea 20 g Sodium thiosulphate 0,5 g Phenol red 0,012 g Agar 15 g Agar 15 - 20 g Phenol red 0,025g pH Môi trƣờng LB với Tween 80 Pepton 10 g Môi trƣờng canh tryptone Tryptone trypticase 10 g NaCl 5,0 g Nƣớc cất CaCl2 2H2O 0,1 g Agar 9,0 g Nƣớc cất lít Peptone 5g pH 7,4 Glucose 5g Tween 80 1% K2HPO4 NaCl 5g Nƣớc cất lít lít Mơi trƣờng MR-VP broth Phụ lục 2: Cách pha chế thuốc thử Thuốc thử catalase Pha hydroperoxyde Tween 80 theo tỉ lệ : Thuốc thử MR 0,1 g methyl red 300 ml cồn, cho nƣớc vào tới 500 ml Phụ lục 3: Khuẩn lạc môi trƣờng Ran Seliber Chủng S1, S2, S3 Chủng S9, S11 Chủng R3, R4 Chủng R9, R5, R6, R8 Chủng S3, S4, S5 Chủng R3 Chủng S10, S7, S8 Chủng S6, S8 Chủng R1, R3 Chủng R1, R2 Chủng R5, R6, R7, R8 Chủng R5, R7 Chủng S16, S12, S13, S14, Chủng S17, S18, S15 S15 Chủng R12, R14 Chủng R15, R16 Chủng S23, S24 Chủng R10, R11 Chủng R13, R14 Chủng S19, S20, S21, S22 Chủng S25, S26 Chủng R18, R19 Chủng R17 Chủng R20, R21, R22 Phụ lục 4: Định tính khả sinh lipase chủng Chủng S3 Chủng S4 Chủng S7 Chủng S8 Chủng S14 Chủng S22 Chủng S24 Chủng R1 Chủng R2 Chủng R7 Chủng R8 Chủng R10 A B Chủng R18 (A): Chủng R3; (B): Chủng R13 Chủng R22 ... thay đổi thành phần bơ sữa Cải thi n mùi vị Thức uống Nƣớc sốt Thực phẩm dinh dƣỡng Thịt cá Dầu chất béo Tăng cƣờng hƣơng vị Cải thi n chất lƣợng Chuyển hóa ester Cải thi n mùi vị Chuyển hóa ester,... nghiệm 13 3.2.2 Vi sinh vật đối chứng 14 iv 3.2.3 Thi t bị, hóa chất môi trƣờng 13 3.2.3.1 Thi t bị dụng cụ 13 3.2.3.2 Hóa chất 13 3.2.3.3... ATCC 13525, Pseudomonas putida ATCC 49128 (cung cấp Microbiologics® Inc) 3.2.3 Thi t bị, hóa chất mơi trƣờng 3.2.3.1 Thi t bị dụng cụ Các dụng cụ thơng thƣờng phòng thí nghiệm sinh hóa vi sinh nhƣ