slide kiểm nghiệm thuốc 56

LOGO Bộ mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY –HPLC) Giới thiệu chung  Sắc ký lỏng hiệu cao - sắc ký lỏng áp suất cao  Kỹ thuật phân tích dựa sở phân tách chất pha tĩnh chứa cột, nhờ dòng di chuyển pha động lỏng áp suất cao Sắc ký lỏng dựa chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng  Khi phân tích chất hòa tan dung mơi thích hợp tách nhiệt độ thường  Sắc ký thường hoàn thành thời gian ngắn (khoảng 30 phút) Chỉ thành phần có hệ số chọn lọc khác phân tích HPLC Giới thiệu chung  Ngày HPLC sử dụng nhiều lĩnh vực phân tích hố học nói chung kiểm tra chất lượng thuốc phân tích sinh dược học nói riêng  Trong phân tích thuốc phương pháp sắc ký, phần lớn dược điển sử dụng sắc ký phân bố Giới thiệu chung Ứng dụng (1) Định tính (2) Thử tạp chất (3) Định lượng Giới thiệu chung Định tính Mẫu thử So sánh thời gian lưu chất phân tích dung dịch thử với thời gian lưu chất chuẩn dung dịch chuẩn chạy Đk sắc ký Mẫu chuẩn Giới thiệu chung Định lượng Phương pháp chuẩn ngoại Phương pháp thêm chuẩn Phương pháp chuẩn nội Phương pháp chuẩn hóa diện tích Nội dung Thông số đặc trưng Hệ số dung lượng k’ Hệ số chọn lọc α Hệ số đối xứng F Số đĩa lý thuyết hiệu lực cột N Độ phân giải Rs Thông số đặc trưng Hệ số dung lượng k’ Tối ưu: < k’ < K : hệ số phân bố Vs : thể tích pha tĩnh Vm: thể tích pha động Qs: lượng chất pha tĩnh Qm: lượng chất pha động tR : thời gian lưu t’R : thời gian lưu hiệu chỉnh t0: thời gian chết Thông số đặc trưng Hệ số chọn lọc α 1,05 ≤ α ≤ 2,0 Hệ số đối xứng F W: Chiều rộng pic đo 1/20 chiều cao pic a: Khoảng cách từ đường vng góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước vị trí 1/20 chiều cao pic Các PP định lượng HPLC Phương pháp chuẩn ngoại Chuẩn hóa điểm Nồng độ xấp xỉ CX : nồng độ mẫu thử CS : nồng độ chất chuẩn SX (HX): diện tích (chiều cao) pic mẫu thử SS (HS): diện tích (chiều cao) pic mẫu chuẩn Các PP định lượng HPLC Phương pháp chuẩn ngoại Chuẩn hóa nhiều điểm Khoảng tuyến tính - Pha dãy dd chuấn với nồng độ tăng dần - Thu S (H) pic điểm - Vẽ đồ thị S (H) theo C - Hàm có dạng Y = a.X + b - Từ S (H) pic chất cần tìm xác định nồng độ Y S (H) dd thử Các PP định lượng HPLC Phương pháp chuẩn nội  Áp dụng phân tích mẫu phải xử lý phức tạp (chiết tách ) đặc biệt mẫu vừa phức tạp vừa có hàm lượng thấp chất cần định lượng  Có thể giúp cực tiểu hóa sai số gây nên máy móc kỹ thuật Các PP định lượng HPLC Phương pháp chuẩn nội Thêm vào mẫu chuẩn lẫn mẫu thử lượng chất tinh khiết, tiến hành sắc ký điều kiện Chất thêm gọi chuẩn nội  Sắc ký điều kiện Chuẩn  Dựa vào S (H) pic lượng (nồng độ) chuẩn, chuẩn nội mẫu thử, xác định hàm lượng thành phần Thử cần định lượng mẫu thử cách xác Các PP định lượng HPLC Phương pháp chuẩn nội Xác định hệ số đáp ứng Fx - mC , mIS : khối lượng chất chuẩn chuẩn nội - CC , CIS : nồng độ chuẩn chuẩn nội - SC , SIS : diện tích pic chuẩn chuẩn nội Các PP định lượng HPLC Phương pháp chuẩn nội Pp chuẩn điểm Ch + IS  Sch, SIS T + IS  St, SIS Các PP định lượng HPLC Phương pháp chuẩn nội Pp chuẩn nhiều điểm - Chuẩn bị dãy chuẩn có chứa lượng (nồng độ) chất chuẩn khác tất chứa lượng (nồng độ) chuẩn nội - Thu S (H) pic chất chuẩn, chuẩn nội - Vẽ đồ thị SS/SIS (H) theo CS/CIS - Tiến hành mẫu thử tương tự T + IS thu S (H) - Từ ST/ SIS tính CT/CIS theo đồ thị - Từ suy CT Các PP định lượng HPLC Phương pháp chuẩn nội Yêu cầu chất chuẩn nội - Trong điều kiện sắc ký, chất chuẩn nội phải tách hồn tồn có thời gian lưu gần với thời gian lưu chất cần phân tích mẫu thử - Có cấu trúc hố học tương tự chất thử - Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử - Không phản ứng với thành phần mẫu thử - Phải có độ tinh khiết cao dễ kiếm Các PP định lượng HPLC Phương pháp thêm chuẩn  Kỹ thuật phối hợp phương pháp chuẩn ngoại chuẩn nội  Ưu điểm kỹ thuật thêm chuẩn có độ xác cao loại trừ sai số yếu tố ảnh hưởng, đặc biệt ảnh hưởng trình xử lý mẫu (chiết xuất, tinh chế chất từ dạng bào chế ) Các PP định lượng HPLC Phương pháp thêm chuẩn Phương pháp thêm điểm + Chuẩn bị mẫu thử song song + Thêm vào mẫu thử thứ lượng biết chất chuẩn + Tiến hành xử lý mẫu sắc ký điều kiện ΔC CX =SX ΔS ΔC: lượng chất chuẩn them vào ΔS: S (T+C) – S (T) Các PP định lượng HPLC Phương pháp thêm chuẩn Kỹ thuật thêm đường chuẩn - Chuẩn bị dãy hỗn hợp gồm lượng mẫu thử giống chất chuẩn với lượng tăng dần - Vẽ đồ thị S (T+C) theo C thêm vào - Giao điểm đường chuẩn kéo dài với trục hồnh nồng độ chất cần xác định Các PP định lượng HPLC Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm chất hỗn hợp nhiều thành phần tính tỷ lệ phần trăm diện tích pic so với tổng diện tích tất pic thành phần sắc đồ Phương pháp yêu cầu tất thành phần rửa giải đươc phát Tất thành phần có đáp ứng detector (response) Các PP định lượng HPLC Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic VD: hỗn hợp thành phần X, Y, Z Tính lại hệ số đáp ứng liên hệ chất chuẩn SS SX : diện tích pic chuẩn pic thử CS CX : nồng độ chất chuẩn chất thử fS : Suy hệ số hiệu chỉnh chuẩn Các PP định lượng HPLC Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic Ứng dụng:  Trong sắc ký khí chất phân tích có đáp ứng detector ion hóa lửa  Trong HPLC bị hạn chế vì: + Đáp ứng detector với chất phân tích khơng giống + Thường dùng để thử tạp chất liên quan Cảm ơn ý lắng nghe! ... ký, phần lớn dược điển sử dụng sắc ký phân bố Giới thiệu chung Ứng dụng (1) Định tính (2) Thử tạp chất (3) Định lượng Giới thiệu chung Định tính Mẫu thử So sánh thời gian lưu chất phân tích dung... hòa tan dung mơi thích hợp tách nhiệt độ thường  Sắc ký thường hoàn thành thời gian ngắn (khoảng 30 phút) Chỉ thành phần có hệ số chọn lọc khác phân tích HPLC Giới thiệu chung  Ngày HPLC sử dụng... trao đổi ion gọi sắc ký trao đổi ion - Nếu pha tĩnh polyme xốp dextran , ta có sắc ký rây phân tử 3 Các kỹ thuật HPLC Sắc ký phân bố hiệu cao Tuỳ thuộc vào việc sử dụng pha động pha tĩnh người ta