thực hành enzim protein

Lập đồ thị đường chuẩn Lấy 6 ống nghiệm, đánh số từ 1 – 6, cho các chất tham gia phản ứng vào từng ống nghiệm như bảng sau: Bảng lập đồ thị đường chuẩn BSA STT BSA 10 mg/ml ml H2O m l T

Bài 1 Xác định hoạt tính các enzyme amylase, protease, cellulase bằng phương pháp

khuếch tán đĩa thạch

Cơ sở lý thuyết của việc xác định hoạt tính (hoạt độ tương đối) của các enzyme bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch là quan sát sự chuyển hóa cơ chất của mỗi enzyme thông qua việc nhuộm màu cơ chất hoặc việc tạo màu của sản phẩm tạo thành

Nguồn enzyme gồm enzyme nội bào thu từ mô, tế bào động vật, thực vật, vi sinh vật, enzyme ngoại bào thu từ dịch enzym được tiết ra môi trường nuôi cấy vi sinh vật

1 Enzyme thử hoạt tính

- Enzyme protease thu từ dứa, đu đủ

- Enzyme amylase thu từ nước bọt, giá đỗ

- Enzyme cellulose thu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn

2 Tách chiết enzyme

- Từ dứa (protease)

Bromelain là một loại protease có nhiều trong phế liệu dứa như vỏ, lõi, chồi

Phế liệu dứa -> nghiền nhỏ, thêm đệm phosphate 0,1M, pH 7,0 -> chiết lọc -> ly tâm -> thu được enzyme thô

- Từ đu đủ (protease)

Dùng loại quả đu đủ non, đu đủ già (chưa chín), dùng khăn lau sạch vỏ, lấy dao rạch những đường không quá sâu, hứng nhựa vào cốc Hòa tan nhựa tươi trong đệm phosphate 0,1M pH 7,0 Thu được dịch enzyme thô

- Từ giá đỗ (amylase)

Chọn phần hạt đậu chưa nảy mầm hoặc mang lá mầm ngắn của giá đỗ -> nghiền mịn, thêm đệm phosphate 0,1M, pH 7,0 -> chiết lọc -> ly tâm -> thu được enzyme thô

- Từ nước bọt (amylase)

Lấy 1.5 ml dung dịch nước bọt cho vào ống eppendorf, ly tâm 10.000 vòng/ phút trong

10 phút, loại bỏ cặn

Lưu ý: Tất cả các thao tác ở 40C

- Từ dịch nuôi cấy vi khuẩn (cellulose)

Lấy 1.5 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn cho vào ống eppendorf, ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 10 phút, loại bỏ cặn

3 Môi trường thử hoạt tính enzyme bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch

- Amylase

50 – 100 µl dịch chiết enzyme được nhỏ vào giếng đục trên đĩa thạch với 2% agar và 1

% tinh bột (cơ chất) trong đệm phosphate 0,1M, pH 7.

Đĩa thạch đã được nhỏ dịch chiết được ủ ở 30ºC, trong 4h

Thuốc nhuộm là lugol (hòa 2g KI trong 5ml nước cất cho tan hết, sau đó cho thêm 1g I2 vào, sau đó cho nước cất đến đủ 300ml, lắc đều)

- Protease

50 – 100 µl dịch chiết enzyme được nhỏ vào giếng đục trên đĩa thạch với 2% agar và

0,1% gelatin (cơ chất) trong đệm phosphate 0,1M, pH 7.

Đĩa thạch đã được nhỏ dịch chiết được ủ ở 30ºC, trong 4h

Nhuộm bởi amido đen 10B 0,1% trong dung dịch methanol, axit acetic, nước cất theo tỷ

lệ 3: 1: 6 trong 1 giờ Tẩy bằng dung dịch pha amino đen

- Cellulase

50 – 100 µl dịch chiết enzyme được nhỏ vào giếng đục trên đĩa thạch với 2% agar và

1% CMC (Carboxymethyl cellulose) trong đệm phosphate 0,1M, pH 7.

Đĩa thạch đã được nhỏ dịch chiết được ủ ở 30ºC, trong 4h

Thuốc nhuộm là lugol

Nếu dịch chiết có hoạt tính amylase, protease, cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh giếng thạch chứa dịch enzyme Vùng tinh bột chưa bị phân giải có màu nâu tím Vùng protein chưa bị phân giải có màu xanh Vùng cellulose chưa bị phân giải có màu nâu tím

Hoạt độ tương đối của enzyme được xác định qua hệ số phân giải: D – d (mm) Trong đó: D là đường kính vòng phân giải (mm), d là đường kính lỗ thạch (mm)

Bài 2 Xác định hoạt độ amylase Xây dựng đồ thị chuẩn Maltose

1 Cơ sở lý thuyết

Amylase thủy phân tinh bột (amylose, amylopectin), glycogen bằng cách thủy phân liên kết α-1,4 glycosid Sản phẩm sau phản ứng có thể là hỗn hợp của các đường triomaltose, maltose, glucose và các dextrin (tùy thuộc vào nguồn cơ chất)

Sơ đồ phản ứng xúc tác được viết tóm tắt dưới dạng

3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS hoặc DNSA) có màu vàng, khi phản ứng với các đường khử, DNS sẽ bị khử thành 3-amino-5-nitrosalicylic acid (màu nâu đỏ) có khả năng hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 540 nm

Lượng 3-amino-5-nitrosalicylic được tạo thành phụ thuộc vào hàm lượng đường khử có trong dung dịch Dựa vào mối tương quan này người ta xác định được hoạt độ của enzyme amylase

2 Yêu cầu:

• Sinh viên giải thích được nguyên lý của phương pháp định hoạt độ amylase thông qua việc định lượng đường khử

• Biết cách xây dựng đồ thị chuẩn maltose

• Biết cách xác định hoạt độ amylase dựa vào đồ thị chuẩn

3 Vật liệu

• Dung dịch enzyme amylase (nước bọt, giá đỗ)

• Maltose

• Các dung dịch đệm

4 Chuẩn bị

a Dung dịch tinh bột hòa tan: 1% trong đệm PBS 0,05M pH 6,5 (hoặc đệm acetate)

Cách chuẩn bị:

Cân 0,5 g tinh bột hòa tan cho vào cốc thủy tinh 50 ml đệm PBS 0.05M pH 6,5

Hồ hóa bằng lò vi sóng, để nguội, dẫn nước cất lại đến 50 ml Bảo quản ở 40C

b Dung dịch maltose chuẩn 10mM

Tinh bột (glycogen) Amylase Đường khử + dextrin

3,5-dinitrosalicylic acid Khử 3-amino,5-nitrosalicylic acid

Cân 36 mg maltose, hòa tan trong 10 ml nước cất

c Thuốc thử DNSA (Dinitrosalicylic Acid Reagent Solution, 1%)

Hòa tan hỗn hợp gồm có: 1g dinitrosalicylic acid, 200 mg phenol tinh thể, 50mg sodium sulphite, 6 g Potassium sodium tartrate (Rochelle salt), 1 g NaOH trong 100 ml nước

d Mẫu phân tích:

Amylase từ nước bọt: Lấy 2 ml dung dịch nước bọt cho vào ống eppendorf, ly tâm 10.000 rpm trong 10 phút ở 4ºC, loại bỏ cặn

Chọn phần hạt đậu chưa nảy mầm hoặc mang lá mầm ngắn của giá đỗ -> nghiền mịn, thêm đệm phosphate 0,1M, pH 7,0 -> chiết lọc -> ly tâm -> thu được enzyme thô

5 Lập đường chuẩn

Lắc đều các ống nghiệm, đặt vào bể 1000C trong 10 phút, làm nguội đến to phòng

Nồng độ Maltose trong các ống nghiệm

(mM)

Đo quang phổ ở bước sóng 540 nm, cuvette 2 ml, đường kính cuvette 1 cm (Lưu ý có thể phải pha loãng) Mẫu đối chứng tương tự chỉ thay dung dịch maltose chuẩn bằng nước cất

Giá trị OD 540 của các mẫu được tính bằng OD 540 mẫu (đo được) – OD 540 đối chứng Xây

dựng đường chuẩn dựa trên 5 điểm thu được, trong đó trục tung là giá trị OD540, trục hoành là hàm lượng maltose (mM)

6 Xác định hoạt độ

Cho vào ống nghiệm

• Đệm PBS 0,1 M pH 6,5 0,48 ml

Ủ ở 370C trong 10 phút (nếu thay đổi thời gian ủ thì cần ghi lại phản ứng đến tính toán sau này)

• Bổ sung thuốc thử 1,0 ml

Trộn đều, đặt trong bể nước sôi 10 phút, sau đó làm nguội đến nhiệt độ phòng

Trộn đều đo quang phổ như trên

Mẫu đối chứng tương tự nhưng dung dịch enzyme đã bị làm bất hoạt bằng nhiệt độ cao (95oC trong 30 phút)

Giá trị OD540 của các mẫu được tính bằng OD540 mẫu – OD540 đối chứng

7 Cách tính hoạt độ

7.1 Định nghĩa hoạt độ amylase theo đơn vị quốc tế (IU)

1 Unit (1U) là hoạt độ enzyme (không phải là lượng enzyme) có thể tạo ra 1 mg glucose/ maltose trong 1 phút dưới các điều kiện tối ưu

1Unit (1U) là hoạt độ enzyme (không phải là lượng enzyme) có thể tạo ra 1 μM glucose/ maltose trong 1 phút dưới các điều kiện tối ưu

Starch (polysaccharide) −−−> Oligosaccharides −−−> Glucose + Maltose

(mono/disaccharides) [Blue with iodine] [Red with iodine] [Yellow with iodine]

7.2 Cách tính

Tính toán lượng đường khử được tạo thành sau phản ứng enzyme dựa vào đường chuẩn Maltose đã làm ở bước trên

Tính toán lượng đường khử được tạo thành sau phản ứng enzyme dựa vào đường chuẩn Maltose đã làm ở bước trên

Hoạt độ thể tích (Unit/ ml mẫu) = (µmol maltose x 50)/10

Hoạt độ riêng (Unit/ mg protein) = Hoạt độ thể tích/ hàm lượng protein

Giải thích: Lượng Maltose (µmol) tương ứng với số Unit Tuy nhiên, thể tích enzyme lấy cho phản ứng

là 0,02 ml do đó phải nhân với 50 Thời gian phản ứng enzyme là 10 phút do đó phải chia cho 10

Bài 3 Xác định nồng độ protein bằng các phương pháp khác nhau (Biuret, Lowry, Bradford)

I Định lượng nồng độ protein bằng phương pháp Biuret

Phương pháp Biuret là phương pháp đơn giản nhất để định lượng protein Phương pháp này kém nhạy hơn so với phương pháp Lowry và Bradford 100 – 1000 lần Là cơ sở của phương pháp Lowry Phương pháp này gồm 2 phản ứng, đầu tiên là sự bắt giữ kim loại Cu2+ của các protein tạo thành phức hệ Cu2+ - protein, phản ứng thứ 2 là phản ứng oxy hóa khử Cu2+ tác dụng với các acid amin phân cực, tyrosine, triptophan (acid amin ở dạng khử) để tạo thành

Cu+ và các acid amin ở dạng oxy hóa Việc tạo ra các ion Cu+ của phản ứng oxy hóa là cơ sở để tạo ra độ nhạy của phản ứng Biuret và Lowry Ion Cu+ có màu xanh hấp thụ cực đại ở bước sóng 540 nm Giá trị OD540 tỉ lệ thuận với số liên kết peptide, tức là kích thước cũng như số lượng của protein/ peptide

1 Hóa chất

- Thuốc thử Biuret: 1.50 g cupric sulfate pentahydrate (CuSO4 5H2O) và 6.0 g sodium potassium tartrate tetrahydrate (NaKC4H4O6.4 H2O) Hòa tan trong 500 ml H2O cất Thêm 300

ml NaOH 10% Thêm 1g KI, lắc cho tan, thêm nước cất đến thể tích 1 lít Bảo quản trong lọ tối

- Cân 100 mg BSA (bovine serum albumin) hoà tan trong 10 ml nước, ta được dung dịch gốc

có nồng độ là 10 mg/ml Bảo quản ở 4ºC Chỉ dùng trong 2 tuần

2 Lập đồ thị đường chuẩn

Lấy 6 ống nghiệm, đánh số từ 1 – 6, cho các chất tham gia phản ứng vào từng ống nghiệm như bảng sau:

Bảng lập đồ thị đường chuẩn BSA

STT BSA 10 mg/ml

(ml)

H2O ( m l)

Thuốc thử Biuret

(ml)

Nồng độ protein

(mg/ml)

Lắc đều, để yên các ống nghiệm trong 20 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm Giá trị OD540 của các ống nghiệm từ 2 – 6 sau khi trừ đi giá trị

OD540 của ống 1 sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng

độ protein chuẩn (BSA) (Đồ thị đường chuẩn)

3 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Biuret

Xác định hàm lượng protein của mẫu BSA đã được pha sẵn (không được cho biết hàm lượng pha)

Cho vào ống nghiệm 0.5 ml dung dịch mẫu và 2 ml thuốc thử Biuret, lắc đều, để yên trong 20 phút ở nhiệt độ phòng, dung dịch có màu xanh Đo OD ở bước sóng 540 nm

Lấy giá trị OD540 của mẫu trừ đi OD540 của ống nghiệm thay mẫu bằng nước cất rồi chiếu vào đồ thị chuẩn để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu

II Phương pháp Lowry

Phương pháp định lượng protein của Lowry là phương pháp được sử dụng rộng rãi để xác định chính xác nồng độ protein Phương pháp này là một sự kết hợp của phản ứng Biuret

và phản ứng Folin-Ciocalteau Bước đầu phản ứng, protein liên kết với đồng trong môi trường kiềm Bước tiếp theo, phức chất đồng protein (chủ yếu là protein chứa amino acid nhóm tryptophan và tyrosine) khử hỗn hợp photphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất mầu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 660nm

Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu

1 Hóa chất

- Dung dịch A: 4g NaOH (0,1M) và 20g Na2CO3 (2%) pha trong 1000 ml nước cất

- Dung dịch B: 0,5g CuSO4.5H2O (0,5%) pha trong dung dịch sodium potassium tartrate tetrahydrate 1% (NaKC4H4O6.4 H2O) Dung dịch C: Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ

lệ 49:1 (pha trước khi dùng)

- Thuốc thử Folin – Ciocalteu của Merck, trước khi dùng pha loãng để có nồng độ bằng 1 N

- Albumin huyết thanh bò (BSA) 1mg/ml

2 Xây dựng đường chuẩn BSA

Hàm lượng protein tan trong dung dịch được xác định theo phương pháp Lowry, dùng albumin huyết thanh bò (BSA) làm chất chuẩn

Cân 0,01g (10mg) hoà tan trong 10ml nước, ta được dung dịch gốc có nồng độ là 1mg/ml Sau đó pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất với các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100,

120 µg/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn

STT BSA (1 mg/ml)

(µl) H2O (µl)

Dung dịch C (ml) Nồng độ protein

(µg/ml)

- Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dung dịch BSA ở nồng độ pha loãng như trên cho vào ống nghiệm, thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch C để ở nhiệt độ phòng 10 phút, sau đó cho 0,25ml thuốc thử folin (1N) đem so mầu với bước sóng 660nm

- Mẫu đối chứng: lấy 0,5 ml nước cất cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch

C và các bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm

Qua 3 lần lặp lại thí nghiệm có thể xây dựng đường hồi quy Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê thông thường

3 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry

Sử dụng 3 mẫu BSA được chuẩn bị sẵn để xác định hàm lượng protein Thay vì lấy 0,5

ml dung dịch BSA chuẩn, lấy 0,5 ml dung dịch protein cho vào ống nghiệm Các bước tiếp theo làm tương tự như cách xây dựng đồ thị chuẩn đã trình bày ở trên Ghi lại giá trị OD660

Lưu ý: Để đảm bảo độ chính xác, nếu hàm lượng protein trong mẫu quá lớn cần phải pha

loãng với dung dịch đệm phù hợp hoặc nước cất trước khi định lượng

Dựa vào đồ thị chuẩn, xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu

III Định lượng protein bằng phương pháp Bradford

Có nhiều phương pháp xác định hàm lượng protein trong một mẫu nghiên cứu dựa vào máy đo quang phổ Phổ biến nhất trong số đó là các phương pháp đo độ hấp thụ trực tiếp ở vùng ánh sáng tử ngoại (UV), Lowry, Smith copper và Bradford Ở đây trình bày phương pháp Bradford vì có nhiều ưu điểm: nhanh, nhạy, chính xác và ổn định Tuy nhiên cũng giống với các phương pháp khác, Bradford cũng phụ thuộc vào thành phần axit amin của phân tử protein

và ngưỡng nồng độ của protein có trong mẫu

Nguyên lý của phương pháp Bradford là dựa vào sự thay đổi giữa 3 trạng thái tồn tại của Coomassie Blue G: cation (màu đỏ), trung tính (màu xanh lá cây) và anion (màu xanh da trời) Dưới điều kiện axit mạnh, Coomassie Blue G chủ yếu tồn tại ở trạng thái bị proton hóa

do bị gắn 2 H+ hoặc còn gọi là cation có màu đỏ Ở trạng thái này Coomassie Blue G có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 470 nm Tuy nhiên, khi gắn với protein, nó chuyển sang dạng ổn định

ở trạng thái không bị proton hóa (unprotonated) hay còn gọi là anion và có màu xanh da trời Trong quá trình phản ứng tạo phức với protein có 2 dạng tương tác hóa học xảy ra Dạng cation (màu đỏ) chuyển các điện tử tự do của nó vào các nhóm có thể ion hóa có trong phân tử protein dẫn đến việc bộc lộ một số vùng kị nước trong phân tử protein Những vùng này sẽ phản ứng với vùng không phân cực của Coomassie G thông qua lực van der Waals (giữa các nhóm amin mang điện tích dương và nhóm mang điện tích âm của chất màu ở khoảng cách rất gần nhau) Liên kết này đồng thời cũng được giữ ổn định thêm bởi sự tương tác ion giữa 2 hấp thụ nhóm này Độ ánh sáng của dung dịch chứa hỗn hợp protein và thuốc thử được đo ở bước sóng 595

nm Độ hấp thụ ánh sáng tỉ lệ với hàm lượng protein có trong mẫu Hàm lượng protein có trong mẫu sẽ được xác định dựa vào đường chuẩn albumin

Chú ý: Về bản chất phương pháp Bradford không xác định số lượng các liên kết peptide

mà đo sự có mặt của một số amino acid nhất định, chẳng hạn như arginine Người ta cho rằng arginine chịu trách nhiệm trong việc gắn thuốc thử Bradford với protein Ngoài ra các amino acid mang gốc kị nước (hydrophobic amino acid) cũng phản ứng với thuốc thử này

Dung dịch thuốc thử Bradford 5X

Hòa tan 100 mg (0,1 g) Coomasie Blue trong 50 ml Ethanol tuyệt đối (99,99%) Bổ sung 100 ml axit phosphoric (H3PO4 85%) Hỗn hợp được khuấy đều 10 phút trong tủ hút sau

đó bổ sung nước cất cho đến thể tích 200 ml (nếu cần có thể lọc) Chia nhỏ thành các lọ nhỏ hơn và bảo quản trong tối

Trước khi sử dụng pha loãng dung dịch thuốc thử Bradford thành 1X (pha loãng 5 lần từ dung dịch gốc) Chẳng hạn lấy 10 ml Bradford 5X, bổ sung 40 ml nước cất sẽ có 50 ml dung dich thuốc thử 1X Thuốc thử 1X chỉ sử dụng trong ngày

1.4 Tiến hành thí nghiêm

1.4.1 Xây dựng đồ thị chuẩn

Pha dung dịch gốc BSA 10 mg/ml (cân 10 mg BSA hòa tan hoàn toàn trong 1 ml nước cất) Từ dung dịch gốc pha loãng thành các dung dịch chuẩn có nồng độ giảm dần (xem bảng)

(*) Ống số 5: lấy 500 µl dung dịch từ ống số 4, bổ sung thêm 500 µl H 2 O

(**) Ống số 6: lấy 500 µl dung dịch từ ống số 5, bổ sung thêm 500 µl H 2 O

Xây dựng đường chuẩn

Chuẩn bị một dãy các ống nghiệm sạch, đánh số trên thành ống

Lần lượt cho vào các ống nghiệm các hóa chất theo bảng sau:

Ống nghiệm

BSA từ các dung dịch chuẩn (µl) 100 100 100 100 100 100 0

Hàm lượng protein có trong mỗi