thực hành enzim protein

Bài Xác định hoạt tính enzyme amylase, protease, cellulase phương pháp khuếch tán đĩa thạch Cơ sở lý thuyết việc xác định hoạt tính (hoạt độ tương đối) enzyme phương pháp khuếch tán đĩa thạch quan sát chuyển hóa chất enzyme thông qua việc nhuộm màu chất việc tạo màu sản phẩm tạo thành Nguồn enzyme gồm enzyme nội bào thu từ mô, tế bào động vật, thực vật, vi sinh vật, enzyme ngoại bào thu từ dịch enzym tiết môi trường nuôi cấy vi sinh vật Enzyme thử hoạt tính - Enzyme protease thu từ dứa, đu đủ - Enzyme amylase thu từ nước bọt, giá đỗ - Enzyme cellulose thu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Tách chiết enzyme - Từ dứa (protease) Bromelain loại protease có nhiều phế liệu dứa vỏ, lõi, chồi Phế liệu dứa -> nghiền nhỏ, thêm đệm phosphate 0,1M, pH 7,0 -> chiết lọc -> ly tâm -> thu enzyme thô - Từ đu đủ (protease) Dùng loại đu đủ non, đu đủ già (chưa chín), dùng khăn lau vỏ, lấy dao rạch đường không sâu, hứng nhựa vào cốc Hòa tan nhựa tươi đệm phosphate 0,1M pH 7,0 Thu dịch enzyme thô - Từ giá đỗ (amylase) Chọn phần hạt đậu chưa nảy mầm mang mầm ngắn giá đỗ -> nghiền mịn, thêm đệm phosphate 0,1M, pH 7,0 -> chiết lọc -> ly tâm -> thu enzyme thô - Từ nước bọt (amylase) Lấy 1.5 ml dung dịch nước bọt cho vào ống eppendorf, ly tâm 10.000 vòng/ phút 10 phút, loại bỏ cặn Lưu ý: Tất thao tác 40C - Từ dịch nuôi cấy vi khuẩn (cellulose) Lấy 1.5 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn cho vào ống eppendorf, ly tâm 10.000 vòng/ phút 10 phút, loại bỏ cặn 3 Môi trường thử hoạt tính enzyme phương pháp khuếch tán đĩa thạch - Amylase 50 – 100 µl dịch chiết enzyme nhỏ vào giếng đục đĩa thạch với 2% agar % tinh bột (cơ chất) đệm phosphate 0,1M, pH Đĩa thạch nhỏ dịch chiết ủ 30ºC, 4h Thuốc nhuộm lugol (hòa 2g KI 5ml nước cất cho tan hết, sau cho thêm 1g I vào, sau cho nước cất đến đủ 300ml, lắc đều) - Protease 50 – 100 µl dịch chiết enzyme nhỏ vào giếng đục đĩa thạch với 2% agar 0,1% gelatin (cơ chất) đệm phosphate 0,1M, pH Đĩa thạch nhỏ dịch chiết ủ 30ºC, 4h Nhuộm amido đen 10B 0,1% dung dịch methanol, axit acetic, nước cất theo tỷ lệ 3: 1: Tẩy dung dịch pha amino đen - Cellulase 50 – 100 µl dịch chiết enzyme nhỏ vào giếng đục đĩa thạch với 2% agar 1% CMC (Carboxymethyl cellulose) đệm phosphate 0,1M, pH Đĩa thạch nhỏ dịch chiết ủ 30ºC, 4h Thuốc nhuộm lugol Nếu dịch chiết có hoạt tính amylase, protease, cellulase tạo vòng suốt quanh giếng thạch chứa dịch enzyme Vùng tinh bột chưa bị phân giải có màu nâu tím Vùng protein chưa bị phân giải có màu xanh Vùng cellulose chưa bị phân giải có màu nâu tím Hoạt độ tương đối enzyme xác định qua hệ số phân giải: D – d (mm) Trong đó: D đường kính vòng phân giải (mm), d đường kính lỗ thạch (mm) Bài Xác định hoạt độ amylase Xây dựng đồ thị chuẩn Maltose Cơ sở lý thuyết Amylase thủy phân tinh bột (amylose, amylopectin), glycogen cách thủy phân liên kết α-1,4 glycosid Sản phẩm sau phản ứng hỗn hợp đường triomaltose, maltose, glucose dextrin (tùy thuộc vào nguồn chất) Sơ đồ phản ứng xúc tác viết tóm tắt dạng Tinh bột (glycogen) Amylase Đường khử + dextrin 3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS DNSA) có màu vàng, phản ứng với đường khử, DNS bị khử thành 3-amino-5-nitrosalicylic acid (màu nâu đỏ) có khả hấp thụ mạnh ánh sáng bước sóng 540 nm 3,5-dinitrosalicylic acid Khử 3-amino,5-nitrosalicylic acid Lượng 3-amino-5-nitrosalicylic tạo thành phụ thuộc vào hàm lượng đường khử có dung dịch Dựa vào mối tương quan người ta xác định hoạt độ enzyme amylase u cầu: • Sinh viên giải thích ngun lý phương pháp định hoạt độ amylase thông qua việc định lượng đường khử • Biết cách xây dựng đồ thị chuẩn maltose • Biết cách xác định hoạt độ amylase dựa vào đồ thị chuẩn Vật liệu • Dung dịch enzyme amylase (nước bọt, giá đỗ) • Maltose • Các dung dịch đệm Chuẩn bị a Dung dịch tinh bột hòa tan: 1% đệm PBS 0,05M pH 6,5 (hoặc đệm acetate) Cách chuẩn bị: Cân 0,5 g tinh bột hòa tan cho vào cốc thủy tinh 50 ml đệm PBS 0.05M pH 6,5 Hồ hóa lò vi sóng, để nguội, dẫn nước cất lại đến 50 ml Bảo quản 40C b Dung dịch maltose chuẩn 10mM Cân 36 mg maltose, hòa tan 10 ml nước cất c Thuốc thử DNSA (Dinitrosalicylic Acid Reagent Solution, 1%) Hòa tan hỗn hợp gồm có: 1g dinitrosalicylic acid, 200 mg phenol tinh thể, 50mg sodium sulphite, g Potassium sodium tartrate (Rochelle salt), g NaOH 100 ml nước d Mẫu phân tích: Amylase từ nước bọt: Lấy ml dung dịch nước bọt cho vào ống eppendorf, ly tâm 10.000 rpm 10 phút 4ºC, loại bỏ cặn Chọn phần hạt đậu chưa nảy mầm mang mầm ngắn giá đỗ -> nghiền mịn, thêm đệm phosphate 0,1M, pH 7,0 -> chiết lọc -> ly tâm -> thu enzyme thô Lập đường chuẩn Cho vào ống nghiệm Nước cất (ml) 1,95 1,75 1,5 1,0 0,5 Dung dịch Maltose (ml) 0,05 0,25 0,5 1,0 1,5 Dung dịch thuốc thử (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 o Lắc ống nghiệm, đặt vào bể 100 C 10 phút, làm nguội đến t phòng Bổ sung nước cất (ml) 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 Tổng thể tích (ml) 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 Nồng độ Maltose ống nghiệm 0,05 0,25 0,5 1,5 ĐC 1,0 7,0 10,0 (mM) Đo quang phổ bước sóng 540 nm, cuvette ml, đường kính cuvette cm (Lưu ý phải pha loãng) Mẫu đối chứng tương tự thay dung dịch maltose chuẩn nước cất Giá trị OD540 mẫu tính OD540 mẫu (đo được) – OD540 đối chứng Xây dựng đường chuẩn dựa điểm thu được, trục tung giá trị OD 540, trục hoành hàm lượng maltose (mM) Xác định hoạt độ Cho vào ống nghiệm • Dung dịch tinh bột 0,5 ml • Dung dịch enzyme 0,02 ml • Đệm PBS 0,1 M pH 6,5 0,48 ml Ủ 37 C 10 phút (nếu thay đổi thời gian ủ cần ghi lại phản ứng đến tính tốn sau này) • Bổ sung thuốc thử 1,0 ml Trộn đều, đặt bể nước sôi 10 phút, sau làm nguội đến nhiệt độ phòng • Bổ sung nước cất 8,0 ml • Tổng thể tích 10 ml Trộn đo quang phổ Mẫu đối chứng tương tự dung dịch enzyme bị làm bất hoạt nhiệt độ cao (95 oC 30 phút) Giá trị OD540 mẫu tính OD540 mẫu – OD540 đối chứng Cách tính hoạt độ 7.1 Định nghĩa hoạt độ amylase theo đơn vị quốc tế (IU) Unit (1U) hoạt độ enzyme (khơng phải lượng enzyme) tạo mg glucose/ maltose phút điều kiện tối ưu 1Unit (1U) hoạt độ enzyme (không phải lượng enzyme) tạo μM glucose/ maltose phút điều kiện tối ưu α-Amylase α-Amylase Glucose + Maltose −−−> Oligosaccharides −−−> Starch (polysaccharide) (mono/disaccharides) [Blue with iodine] [Red with iodine] [Yellow with iodine] 7.2 Cách tính Tính tốn lượng đường khử tạo thành sau phản ứng enzyme dựa vào đường chuẩn Maltose làm bước Tính tốn lượng đường khử tạo thành sau phản ứng enzyme dựa vào đường chuẩn Maltose làm bước Hoạt độ thể tích (Unit/ ml mẫu) = (µmol maltose x 50)/10 Hoạt độ riêng (Unit/ mg protein) = Hoạt độ thể tích/ hàm lượng protein Giải thích: Lượng Maltose (µmol) tương ứng với số Unit Tuy nhiên, thể tích enzyme lấy cho phản ứng 0,02 ml phải nhân với 50 Thời gian phản ứng enzyme 10 phút phải chia cho 10 Bài Xác định nồng độ protein phương pháp khác (Biuret, Lowry, Bradford) I Định lượng nồng độ protein phương pháp Biuret Phương pháp Biuret phương pháp đơn giản để định lượng protein Phương pháp nhạy so với phương pháp Lowry Bradford 100 – 1000 lần Là sở phương pháp Lowry Phương pháp gồm phản ứng, bắt giữ kim loại Cu 2+ protein tạo thành phức hệ Cu2+ - protein, phản ứng thứ phản ứng oxy hóa khử Cu 2+ tác dụng với acid amin phân cực, tyrosine, triptophan (acid amin dạng khử) để tạo thành Cu+ acid amin dạng oxy hóa Việc tạo ion Cu + phản ứng oxy hóa sở để tạo độ nhạy phản ứng Biuret Lowry Ion Cu + có màu xanh hấp thụ cực đại bước sóng 540 nm Giá trị OD540 tỉ lệ thuận với số liên kết peptide, tức kích thước số lượng protein/ peptide Hóa chất - Thuốc thử Biuret: 1.50 g cupric sulfate pentahydrate (CuSO4 5H2O) 6.0 g sodium potassium tartrate tetrahydrate (NaKC4H4O6.4 H2O) Hòa tan 500 ml H2O cất Thêm 300 ml NaOH 10% Thêm 1g KI, lắc cho tan, thêm nước cất đến thể tích lít Bảo quản lọ tối - Cân 100 mg BSA (bovine serum albumin) hoà tan 10 ml nước, ta dung dịch gốc có nồng độ 10 mg/ml Bảo quản 4ºC Chỉ dùng tuần Lập đồ thị đường chuẩn Lấy ống nghiệm, đánh số từ – 6, cho chất tham gia phản ứng vào ống nghiệm bảng sau: Bảng lập đồ thị đường chuẩn BSA H2 O STT BSA 10 mg/ml ( (ml) m Thuốc thử Biuret (ml) Nồng độ protein (mg/ml) l) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 2 2 2 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 Lắc đều, để yên ống nghiệm 20 phút nhiệt độ phòng Sau đo mật độ quang bước sóng 540 nm Giá trị OD 540 ống nghiệm từ – sau trừ giá trị OD540 ống xây dựng đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang theo nồng độ protein chuẩn (BSA) (Đồ thị đường chuẩn) Xác định hàm lượng protein phương pháp Biuret Xác định hàm lượng protein mẫu BSA pha sẵn (không cho biết hàm lượng pha) Cho vào ống nghiệm 0.5 ml dung dịch mẫu ml thuốc thử Biuret, lắc đều, để yên 20 phút nhiệt độ phòng, dung dịch có màu xanh Đo OD bước sóng 540 nm Lấy giá trị OD540 mẫu trừ OD540 ống nghiệm thay mẫu nước cất chiếu vào đồ thị chuẩn để suy lượng protein có dung dịch mẫu II Phương pháp Lowry Phương pháp định lượng protein Lowry phương pháp sử dụng rộng rãi để xác định xác nồng độ protein Phương pháp kết hợp phản ứng Biuret phản ứng Folin-Ciocalteau Bước đầu phản ứng, protein liên kết với đồng môi trường kiềm Bước tiếp theo, phức chất đồng protein (chủ yếu protein chứa amino acid nhóm tryptophan tyrosine) khử hỗn hợp photphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất mầu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại bước sóng 660nm Cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein phạm vi định Dựa vào mức độ hấp thụ quang học protein chuẩn, ta xác định hàm lượng protein mẫu nghiên cứu Hóa chất - Dung dịch A: 4g NaOH (0,1M) 20g Na2CO3 (2%) pha 1000 ml nước cất - Dung dịch B: 0,5g CuSO4.5H2O (0,5%) pha dung dịch sodium potassium tartrate tetrahydrate 1% (NaKC4H4O6.4 H2O) Dung dịch C: Hỗn hợp hai dung dịch A B theo tỉ lệ 49:1 (pha trước dùng) - Thuốc thử Folin – Ciocalteu Merck, trước dùng pha lỗng để có nồng độ N - Albumin huyết bò (BSA) 1mg/ml 2 Xây dựng đường chuẩn BSA Hàm lượng protein tan dung dịch xác định theo phương pháp Lowry, dùng albumin huyết bò (BSA) làm chất chuẩn Cân 0,01g (10mg) hoà tan 10ml nước, ta dung dịch gốc có nồng độ 1mg/ml Sau pha lỗng dung dịch gốc nước cất với nồng độ 20, 40, 60, 80, 100, 120 µg/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn STT Blank BSA (1 mg/ml) (µl) 10 20 30 40 50 60 H2O (µl) Dung dịch C (ml) 500 490 480 470 460 450 440 2 2 2 Nồng độ protein (µg/ml) 12 16 20 24 - Mẫu thí nghiệm: lấy xác 0,5ml dung dịch BSA nồng độ pha loãng cho vào ống nghiệm, thêm vào ống 2ml dung dịch C để nhiệt độ phòng 10 phút, sau cho 0,25ml thuốc thử folin (1N) đem so mầu với bước sóng 660nm - Mẫu đối chứng: lấy 0,5 ml nước cất cho vào ống nghiệm, thêm vào 2ml dung dịch C bước tiến hành mẫu thí nghiệm Qua lần lặp lại thí nghiệm xây dựng đường hồi quy Kết xử lý theo phương pháp thống kê thông thường Xác định hàm lượng protein phương pháp Lowry Sử dụng mẫu BSA chuẩn bị sẵn để xác định hàm lượng protein Thay lấy 0,5 ml dung dịch BSA chuẩn, lấy 0,5 ml dung dịch protein cho vào ống nghiệm Các bước làm tương tự cách xây dựng đồ thị chuẩn trình bày Ghi lại giá trị OD 660 Lưu ý: Để đảm bảo độ xác, hàm lượng protein mẫu lớn cần phải pha loãng với dung dịch đệm phù hợp nước cất trước định lượng Dựa vào đồ thị chuẩn, xác định hàm lượng protein mẫu nghiên cứu III Định lượng protein phương pháp Bradford Có nhiều phương pháp xác định hàm lượng protein mẫu nghiên cứu dựa vào máy đo quang phổ Phổ biến số phương pháp đo độ hấp thụ trực tiếp vùng ánh sáng tử ngoại (UV), Lowry, Smith copper Bradford Ở trình bày phương pháp Bradford có nhiều ưu điểm: nhanh, nhạy, xác ổn định Tuy nhiên giống với phương pháp khác, Bradford phụ thuộc vào thành phần axit amin phân tử protein ngưỡng nồng độ protein có mẫu Nguyên lý phương pháp Bradford dựa vào thay đổi trạng thái tồn Coomassie Blue G: cation (màu đỏ), trung tính (màu xanh cây) anion (màu xanh da trời) Dưới điều kiện axit mạnh, Coomassie Blue G chủ yếu tồn trạng thái bị proton hóa bị gắn H+ gọi cation có màu đỏ Ở trạng thái Coomassie Blue G có độ hấp thụ cực đại bước sóng 470 nm Tuy nhiên, gắn với protein, chuyển sang dạng ổn định trạng thái khơng bị proton hóa (unprotonated) hay gọi anion có màu xanh da trời Trong trình phản ứng tạo phức với protein có dạng tương tác hóa học xảy Dạng cation (màu đỏ) chuyển điện tử tự vào nhóm ion hóa có phân tử protein dẫn đến việc bộc lộ số vùng kị nước phân tử protein Những vùng phản ứng với vùng không phân cực Coomassie G thơng qua lực van der Waals (giữa nhóm amin mang điện tích dương nhóm mang điện tích âm chất màu khoảng cách gần nhau) Liên kết đồng thời giữ ổn định thêm tương tác ion hấp thụ nhóm Độ ánh sáng dung dịch chứa hỗn hợp protein thuốc thử đo bước sóng 595 nm Độ hấp thụ ánh sáng tỉ lệ với hàm lượng protein có mẫu Hàm lượng protein có mẫu xác định dựa vào đường chuẩn albumin Chú ý: Về chất phương pháp Bradford không xác định số lượng liên kết peptide mà đo có mặt số amino acid định, chẳng hạn arginine Người ta cho arginine chịu trách nhiệm việc gắn thuốc thử Bradford với protein Ngoài amino acid mang gốc kị nước (hydrophobic amino acid) phản ứng với thuốc thử Dung dịch thuốc thử Bradford 5X Hòa tan 100 mg (0,1 g) Coomasie Blue 50 ml Ethanol tuyệt đối (99,99%) Bổ sung 100 ml axit phosphoric (H3PO4 85%) Hỗn hợp khuấy 10 phút tủ hút sau bổ sung nước cất thể tích 200 ml (nếu cần lọc) Chia nhỏ thành lọ nhỏ bảo quản tối Trước sử dụng pha loãng dung dịch thuốc thử Bradford thành 1X (pha loãng lần từ dung dịch gốc) Chẳng hạn lấy 10 ml Bradford 5X, bổ sung 40 ml nước cất có 50 ml dung dich thuốc thử 1X Thuốc thử 1X sử dụng ngày 1.4 Tiến hành thí nghiêm 1.4.1 Xây dựng đồ thị chuẩn Pha dung dịch gốc BSA 10 mg/ml (cân 10 mg BSA hòa tan hồn tồn ml nước cất) Từ dung dịch gốc pha loãng thành dung dịch chuẩn có nồng độ giảm dần (xem bảng) Ống eppendorf Các hóa chất H2O (µl) 420 450 460 950 * ** Nồng độ BSA gốc 10mg/ml (µl) 60 50 40 50 * ** Tổng thể tích (µl) 480 500 500 1000 * ** Nồng độ cuối (mg/ml) 1,25 1,0 0,8 0,5 0,25 0,125 (*) Ống số 5: lấy 500 µl dung dịch từ ống số 4, bổ sung thêm 500 µl H2O (**) Ống số 6: lấy 500 µl dung dịch từ ống số 5, bổ sung thêm 500 µl H2O Xây dựng đường chuẩn Chuẩn bị dãy ống nghiệm sạch, đánh số thành ống Lần lượt cho vào ống nghiệm hóa chất theo bảng sau: Ống nghiệm (Đ/chứng) 100 100 100 100 100 100 Bradford 1X (ml) 5 5 5 H2O (µl) 0 0 0 100 1,25 1,0 0,8 0,5 0,25 0,125 BSA từ dung dịch chuẩn (µl) Hàm lượng protein có ống nghiệm (mg/ml) Để tăng độ xác đường chuẩn, tương ứng với nồng độ chuẩn BSA nên lặp lại lần (sử dụng lần nhắc lại ống nghiệm cho lần) Sau trộn đều, ống nghiệm để tối nhiệt độ phòng khoảng 20 phút Đo độ hấp thụ ánh sáng bước sóng 595 nm Vẽ đường chuẩn Excel sử dụng kết đo Trong trục tung giá trị OD, trục hồnh hàm lượng protein Tuyến tính hóa thành phương trình tương quan hàm lượng protein OD 1.4.2 Xác định hàm lượng protein phương pháp Bradford Yêu cầu: xác định hàm lượng mẫu BSA pha sẵn Thay lấy 100 µl dung dịch BSA chuẩn, lấy 100 (µl) dung dịch protein cho vào ống nghiệm Bổ sung ml thuốc thử Bradford (1X) Các bước làm tương tự cách xây dựng đồ thị chuẩn trình bày Ghi lại giá trị OD Lưu ý: Để đảm bảo độ xác, hàm lượng protein mẫu lớn cần phải pha loãng với dung dịch đệm phù hợp nước cất trước định lượng 1.4.3 Cách tính hàm lượng Cách tính: Sau đối chiếu giá trị OD thu với đường chuẩn tính nồng độ protein tương ứng mẫu cần phân tích Hàm lượng protein tính số mg protein có X µl mẫu phân tích Bài Xác định hoạt độ protease sử dụng chất Casein Các protease phân cắt liên kết peptide Trong phòng thí nghiệm, hoạt độ protease thường cần xác định so sánh Phương pháp phân tích hoạt độ protease khơng đặc hiệu sử dụng quy trình chuẩn để xác định hoạt độ protease Trong phương pháp này, casein đóng vai trò làm chất Khi protease phân giải protein, amino acid tyrosine giải phóng với amino acid đoạn pepide Folin Ciocalteus, hay Folin’s reagent chủ yếu phản ứng với tyrosine tự tạo phức chất có mầu xanh định lượng thơng qua việc đo quang phổ hấp thụ Càng nhiều tyrosine giải phóng, nhiều phức chất màu tạo thành hoạt độ enzyme mạnh Trị số hấp thụ hoạt động enzyme so sánh với đường chuẩn, xây dựng tyrosine nồng độ biết Từ đường chuẩn, hoạt độ enzyme mẫu nghiên cứu xác định dạng đơn vị (units), tương ứng với micromoles tyrosine giải phóng phút Dựng đường chuẩn tyrosine (Khối lượng phân tử L-tyrosine 181,19) Chuẩn bị dung dịch gốc L-tyrosine chuẩn 1,1 mM: 0.2 mg/ml L-tyrosine hòa tan nước cất (Pha mg Tyrosine 10 ml nước cất ) Từ dung dịch gốc pha thành dãy nồng độ dung dịch sau: Tyrosine (ml) Nước cất (ml) Nồng độ tyrosine (µM) 0,5 0,0125 0,4875 0,0275 0,025 0,475 0,055 0,05 0,45 0,111 0,1 0,4 0,221 0,125 0,375 0,275 - Thêm vào ống nghiệm 1,25ml Na2CO3, sau thêm vào 0,25 ml thuốc thử Folin, lắc - Ủ 37ºC 30 phút - Đo OD660, ghi giá trị máy (Sử dụng ống nghiệm khơng có Tyrosine để blank) - Dựng đường chuẩn tyrosine với trục hoành nồng độ tyrosine (c) tính theo µM, trục tung mật độ quang (OD) Chuẩn bị hóa chất thí nghiệm 2.1 Một số dung dịch đệm - Đệm phosphate 50 mM, pH 7,5 Chuẩn bị cách pha 11,4 mg/ml K 2HPO4 nước cất điều chỉnh pH HCl 1M Dung dịch để 37oC trước sử dụng - 500 mM dung dịch Na2CO3 chuẩn bị việc pha 53 mg/ml Na2CO3 khan nước cất 2.2 Dung dịch protease 1g dứa + 1ml đệm phosphate 0,1M pH -> nghiền mịn -> ly tâm 10.000 vòng/phút, 10 phút, 40C -> thu dịch 2.3 Dung dịch Casein 0.65 % W/v dung dịch casein, chuẩn bị cách trộn 6,5 mg/ml casein 50 mM đệm phosphate Từ từ tăng nhiệt độ dung dịch vừa khuấy nhẹ tới 80-85 oC khoảng 10 phút casein khuyếch tán Đặc biệt lưu ý không đun sôi dung dịch 2.4 TCA Dung dịch 110 mM trichloroacetic acid chuẩn bị việc pha loãng dung dịch gốc 6.1N theo tỷ lệ 1:55 với nước TCA acid mạnh nên phải cẩn thận thao tác 2.5 Thuốc thử Folin Tiến hành thí nghiệm xác định hoạt độ protease - Với ống nghiệm (ống thí nghiệm ống đối chứng), thêm 2,5 ml dung dịch casein 0.65% Để chúng cân bể ổn nhiệt 37oC khoảng phút - Ở ống thí nghiệm, thêm 0,5ml dung dịch enzyme, lắc nhẹ ủ 37oC 10 phút - Thêm 2,5ml TCA vào ống để dừng phản ứng - Ở ống đối chứng, thêm 0,5ml dung dịch enzyme, lắc - Ủ 37oC 30 phút, sau lọc giấy lọc thu dịch - Hút 0,5ml dịch sang ống nghiệm sạch, bổ sung 1,25ml Na 2CO3, sau thêm vào 0,25ml thuốc thử Folin Ủ 37ºC 30 phút Na2CO3 thêm vào để điều chỉnh pH thích hợp cho tạo màu thêm thuốc thử Folin Và mẫu thêm Na 2CO3 trở nên vẩn đục Sau đó, thuốc thử Folin thêm vào phản ứng chủ yếu với tyrosine tự - Ly tâm, đo OD660, ghi giá trị máy Cách tính Định nghĩa đơn vị Anson: đơn vị Anson lượng enzyme tối thiểu điều kiện thí nghiệm (37ºC) thủy phân casein phút tạo thành sản phẩm hòa tan TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD bước sóng 660nm tương ứng với 1µM Tyrosin đường chuẩn Tính tốn hoạt độ protease dựa vào đường chuẩn Tyrosine làm bước - Hoạt độ/ thể tích = µmol Tyrosine V v t v’ V: tổng thể tích phương pháp (ml) v: Thể tích enzyme sử dụng (ml) t : thời gian phản ứng (phút) (10 phút) v’: thể tích sử dụng so màu (Unit/ ml mẫu) Hoạt độ/ thể tích - Hoạt độ/ mg mẫu rắn = mg (mẫu rắn)/ ml enzyme Tóm tắt bước thực Thí nghiệm xác định hoạt độ enzyme protease Ống thí nghiệm (TN) Ống đối chứng (đc) 2,5 2,5 0,5 o Lắc tròn nhẹ ủ 37 C 10 phút 2,5 2,5 0,5 o Ủ 37 C 30 phút Casein (ml) Dung dịch enzyme (ml) TCA (ml) Dung dịch enzyme (ml) Lọc loại bỏ tủa thu dịch Phản ứng màu: Ống thí nghiệm (TN) 0,5 1,25 0,25 lắc đều, ủ 37ºC 30 phút Lọc trước đo (2ml) Dịch lọc (ml) Na2CO3 (ml) Thuốc thử Folin (ml) Ống đối chứng (đc) 0,5 1,25 0,25 Xây dựng đường chuẩn Tyrosine (ml) Nước cất (ml) Na2CO3 (ml) Thuốc thử Folin (ml) 0,0125 0,025 0,05 0,4875 0,475 0,45 1,25 1,25 1,25 0,25 0,25 0,25 lắc đều, ủ 37ºC 30 phút 0,1 0,4 1,25 0,25 0,125 0,375 1,25 0,25 blank 0,5 1,25 0,25 Đo OD660 Bài Điện di protein gel polyacrylamide Yêu cầu: • Sinh viên giải thích vai trò hóa chất chất q trình điên di protein • Có thể thao tác điện di protein Chuẩn bị hóa chất A Mẫu protein: Các mẫu protein đậu tương, amylase nước bọt, amylase khoai lang B Chuẩn bị dung dịch Đệm tách (separating buffer 4X) 500 ml, pH 8,8 1,5 M Tris HCl pH 8,8 0,4% SDS Cách pha:  Tris base (KLPT 121,14) 90,83 g  H2 O 400 ml  Chỉnh pH 8,8 sau bổ sung SDS  10 % SDS 20 ml Dẫn nước đến 500 ml Đệm cô (stacking buffer) 250 ml, pH 6,8 0,5 M Tris-Cl pH 6,8 0,4% SDS Cách pha:  Tris base  H2 O  Chỉnh pH 6,8 sau bổ sung SDS  10 % SDS Dẫn nước đến 15,14 g 200 ml 10 ml 250 ml Đệm mẫu 4X (Sample buffer) (10 ml) 10 ml 20 ml Nồng độ 4X 0,5 M Tris HCl pH 6,8 ml 10 ml 0,25 M, pH 6,8 SDS 0,6 g 1,2 g 6% Glycerol ml ml 40% Bromophenol Blue 1% 0,4 ml 0,8 ml 0,04 % H2 O ml 16 ml Sau hòa tan chất, chia nhỏ ống eppendorf, bảo quản – 20 0C Đệm chạy điện di 10X (running buffer) lít pH 8,3 10X SDS Laemmli Running Buffer (0,25 M Tris, 1.92 M Glycine, % SDS, pH 8,3) Cách pha:  Tris base 30,2 g  Glycine 144 g  SDS 10 g  Hòa tan H2O, chỉnh pH 8,3 dẫn nước đến lit Dung dịch acrylamide (30% T, 0,8% C) 200 ml  Acrylamide 58, 42 g  Bis-acrylamide 1,6 g  H2O dẫn từ từ đến 200 ml Dung dịch nhuộm • Coomassie R250 • Glacial acetic acid • Methanol • H2 O Tổng số 1g 100 ml (10%) 400 ml (40%) 500 ml 1000 ml Dung dịch tẩy (Destaining solution)  Methanol  Acetic acid  H2 O Tổng số: 150 ml (15%) 100 ml (10%) 750 ml 1000 ml Chuẩn bị dung dịch khác 10% SDS 10 g SDS/ 100 ml H2O (Bảo quản nhiệt độ thường) 10% APS 10 g APS / 100 ml H2O (Bảo quản 40C vài tuần) Đổ gel điện di Lắp ráp hệ thống điện di theo dẫn giáo viên hướng dẫn Trộn thành phần theo bảng sau: Thực bước theo dẫn giáo viên hướng dẫn Gel tách (separating gel), cho gel Thành phần V H2 O (ml) 1,5 M Tris HCl pH 8,8 (ml) 29:1 Acrylamide:Bis (ml) 10 % APS (µl) TEMED (µl) Tổng thể tích ml Gel cô (separating gel), cho gel 8% 12,1 6,25 6,67 130 20 25 ml % Acrylamide 10 % 12 % 10,5 8,75 6,25 6,25 8,35 10 130 130 20 20 25 ml 25 ml 15 % 6,25 6,25 12.5 130 20 25 ml Thành phần V H2 O 0,5 M Tris HCl pH 6,8 29:1 Acrylamide:Bis 10 % APS TEMED Tổng thể tích (ml) (ml) (ml) (µl) (µl) ml % Acrylamide 5% 5% 5,8 11,6 2,5 1,7 3,33 40 60 20 20 10 ml 20 ml Điện di protein • Sau gel chuẩn bị xong, lắp vào máy, đổ đệm điện di ngập gel • Hút lượng thể tích mẫu protein (1V), cho vào ống eppendorf sau bổ sung 4V đệm mẫu (sample buffer), trộn Đun nước sôi phút, sau để nguội đến nhiệt độ phòng Lưu ý: lượng protein (µg) cho vào giếng điện di từ 5- 10 µg (tùy thuộc vào nguồn protein) Có thể ly tâm sau đun sôi mẫu để loại bỏ cặn • Cho mẫu vào giếng điện di • Lắp nguồn, chạy điện di theo dẫn giáo viên hướng dẫn Nhuộm tẩy gel điện di Sau chạy điện di hoàn tất, lấy gel khỏi kính Cho vào dung dịch nhuộm Lắc vòng sau lấy gel tẩy theo dẫn Quan sát kết quả, chụp ảnh Tài liệu tham khảo: Laemmli UK 2009 Clevage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 227 (5259): 680-685 Bernfeld, P 1955 Amylase alpha and beta Methods Enzymol 1:149-158 ... Điện di protein gel polyacrylamide u cầu: • Sinh viên giải thích vai trò hóa chất chất q trình điên di protein • Có thể thao tác điện di protein Chuẩn bị hóa chất A Mẫu protein: Các mẫu protein. .. Trong trục tung giá trị OD, trục hồnh hàm lượng protein Tuyến tính hóa thành phương trình tương quan hàm lượng protein OD 1.4.2 Xác định hàm lượng protein phương pháp Bradford Yêu cầu: xác định... kim loại Cu 2+ protein tạo thành phức hệ Cu2+ - protein, phản ứng thứ phản ứng oxy hóa khử Cu 2+ tác dụng với acid amin phân cực, tyrosine, triptophan (acid amin dạng khử) để tạo thành Cu+ acid