Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng ung thư của loài hải miên ircinia echinata (keller, 1889)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ THỊ TRANG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ CỦA LOÀI HẢI MIÊN IRCINIA ECHINATA (KELLER, 1889) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ THỊ TRANG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ CỦA LOÀI HẢI MIÊN IRCINIA ECHINATA (KELLER, 1889) Chuyên ngành: Hóa Hữu Mã số: 60440114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN XUÂN NHIỆM Hà Nội – Năm 2017 LỜI CẢM ƠN Luận văn hoàn thành Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam với hỗ trợ kinh phí đề án nghiên cứu trọng điểm “Nghiên cứu khai thác dược liệu từ hải miên vùng biển Đông Bắc Việt Nam theo định hướng hoạt tính diệt tế bào ung thư” Mã số: VAST.TĐ.ĐAB.01/13-15 Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, bên cạnh cố gắng nỗ lực thân, nhận động viên giúp đỡ lớn nhiều cá nhân tập thể Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Xuân Nhiệm - Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Namngười tận tình hướng dẫn, giúp đỡ suốt trình nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới đồng nghiệp thuộc phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hoá sinh biển tạo điều kiện, hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian làm luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Khoa Hoá học Phòng Sau đại học, Trường Đại Khoa học Tự nhiên đào tạo giúp đỡ suốt thời gian học tập trường Tôi trân trọng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè động viên giúp đỡ vượt qua khó khăn để hoàn thành luận văn Hà Nội,01 tháng 8năm 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng công trình khác Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ việc hoàn thành luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm số liệu luận văn Hà Nội,01 tháng 8năm 2017 Đỗ Thị Trang MụC LụC LỜI CAM ĐOAN Mục lục I Danh mục chữ viết tắt III Danh mục bảng V Danh mục hình VI ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1- TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan loài hải miên 1.1.1 Giới thiệu chung hải miên .3 1.1.2 Giới thiệu chung giốngIrcinia 1.1.3 Nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học giống Ircinia 1.2 Tổng quan ung thư 15 1.3 Tình hình nghiên cứu loài hải miên Việt Nam 17 Chương 2- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phương pháp phân lập hợp chất .19 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học hợp chất 19 2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro 20 2.3 Hóa chất thiết bị 22 2.3.1 Hóa chất 22 2.3.2 Thiết bị 22 Chương 3- THỰC NGHIỆM 23 3.1 Xử lý mẫu nghiên cứu 23 3.2 Quy trình phân lập hợp chất 23 3.3 Các thông số vật lí hợp chất phân lập 25 3.3.1 Hợp chất IE1: (7E,12E,20Z,18S)-variabilin 25 3.3.2 Hợp chất IE2:(12E,20Z)-8-hydroxyvariabilin .25 3.3.3 Hợp chất IE3: 8-hydroxyisovariabilin 25 3.3.4 Hợp chất IE4:5α,6α-epoxy-3β,7α-dihydroxycholest-8-ene 25 3.3.5 Hợp chất IE5: 5α,6α-epoxy-3β,7α-dihydroxycholest-8(14)-ene 26 3.3.6 Hợp chất IE6: furoscalarol 26 3.3.7 Hợp chất IE7: 3β,5,6β-trihydroxy- cholest-7-en 26 3.3.8 Hợp chất IE8:3β-hydroxycholest-5-en-7-one 26 3.4 Đánh giá khả ức chế phát triển tế bào ung thư in vitro hợp chất 27 Chương 4- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất 28 4.1.1 Hợp chất IE1:(7E,12E,20Z,18S)-variabilin 28 I 4.1.2 Hợp chất IE2: (12E,20Z)-8-hydroxyvariabilin 33 4.1.3 Hợp chất IE3: 8-hydroxyisovariabilin 37 4.1.4 Hợp chất IE4: 5α,6α-epoxy-3β,7α-dihydroxycholest-8-ene 42 4.1.5 Hợp chất IE5: 5α,6α-epoxy-3β,7α-dihydroxycholest-8(14)-ene 47 4.1.6 Hợp chất IE6: furoscalarol 51 4.1.7 Hợp chất IE7: 3β,5,6β-trihydroxycholest-7-ene 56 4.1.8 Hợp chất IE8: 3β-hydroxycholest-5-en-7-one 61 4.1.9 Danh sách hợp chất phân lập từ loài hải miên Ircinia echinata 65 4.2.Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập 66 Kết luận 67 Kiến Nghị 67 Các công trình công bố 68 Tài liệu tham khảo 69 II DANH MụC CHữ VIếT TắT Kí hiệu 13 Diễn giải Carbon-13 Nuclear Magnetic Cộng hưởng từ hạt nhân Resonance cacbon 13 Proton Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từhạt nhân proton A-549 Lung adenocarcinoma epithelialcell Tế bào ung thư phổi CC Column chromatography Sắc kí cột DEPT Distortionless Enhancement by Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Polarisation Transfer Dulbecco’s Modified Eagle Medium Dulbecco’s Modified Eagle C-NMR Tiếng Anh H-NMR DMEM Medium DMSO Dimethylsulfoxide Dimethylsulfoxide HeLa Human henrietta lack cell Tế bào ung thư cổ tử cung người HepG2 Human hepatocellular carcinoma cell Tế bào ung thư gan người HL-60 Human acute myelocytic leukemia Tế bào ung thư bạch cầu người cell HMBC HSQC IC50 Heteronuclear mutiple Bond Tương tác dị hạt nhân qua Connectivity nhiều liên kết Heteronuclear Single-Quantum Tương tác dị hạt nhân qua Coherence liên kết Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm KB Human mouth epidermoid carcinoma Tế bào ung thư biểu mô người cell LNCaP Human prostatic carcinoma cell Tế bào ung thư tuyến tiền liệt người LU-1 Human lung carcinoma cell Tế bào ung thư phổi người III MCF-7 Human breast carcinoma cell Tế bào ung thư vú người NF-B Nuclear Factor-kappa B Yếu tố nhân kappa B OVCAR-3 Ovarian carcinoma cell Tế bào ung thư buồng trứng RP-18 Reserve phase C-18 Chất hấp phụpha đảo C-18 SRB Sulforhodamine B Sulforhodamine B TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TMS Tetramethylsilane Tetramethylsilane WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới IV DANH MụC CÁC BảNG Bảng 4.1 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR IE1 hợp chất tham khảo 29 Bảng 4.2 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR IE2 hợp chất tham khảo 34 Bảng 4.3 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR IE3 hợp chất tham khảo 39 Bảng 4.4 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR củaIE4 hợp chất tham khảo 43 Bảng 4.5 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR củaIE5 hợp chất tham khảo 48 Bảng 4.6 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR IE6 hợp chất tham khảo 52 Bảng 4.7 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR IE7 hợp chất tham khảo 57 Bảng 4.8 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR IE8 hợp chất tham khảo 62 Bảng 4.9 Kết đánh giá hoạt tính gây độc tế bào hợp chất 66 V DANH MụC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh số loài hải miên thuộc giống Ircinia Hình 1.2 Hình thái tổ chức mô từ dạng bình thường đến phát triển thành khối u 16 Hình 1.3 Sơ đồ hình thành phát triển bệnh ung thư 17 Hình 3.1 Mẫu hải miên I echinata thu thập Hạ Long 23 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài hải miên I echinata 24 Hình 4.1 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất IE1 28 Hình 4.2.Phổ 1H-NMR hợp chấtIE1 30 Hình 4.3.Phổ 13C-NMR hợp chất IE1 31 Hình 4.4.Phổ DEPT hợp chất IE1 31 Hình 4.5.Phổ HSQC hợp chất IE1 32 Hình 4.6.Phổ HMBC hợp chấtIE1 32 Hình 4.7 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất IE2 33 Hình 4.8.Phổ 1H-NMR hợp chất IE2 35 Hình 4.9.Phổ 13C-NMR hợp chất IE2 35 Hình 4.10.Phổ DEPT hợp chất IE2 36 Hình 4.11.Phổ HSQC hợp chất IE2 36 Hình 4.12.Phổ HMBC hợp chất IE2 37 Hình 4.13 Cấu trúc hóa học IE3 hợp chất tham khảo IE2, IE3a 37 Hình 4.14 Các tương tác HMBC hợp chất IE3 40 Hình 4.15 Phổ HR-ESI-MS hợp chất IE3 40 Hình 4.16 Phổ 1H-NMR hợp chất IE3 40 Hình 4.17 Phổ 13C-NMR hợp chất IE3 41 Hình 4.18 Phổ HSQC hợp chất IE3 41 Hình 4.19 Phổ HMBC hợp chất IE3 42 Hình 4.20 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất IE4 42 Hình 4.21 Phổ 1H-NMR hợp chất IE4 44 Hình 4.22 Phổ 13C-NMR hợp chất IE4 45 Hình 4.23 Phổ DEPT hợp chất IE4 45 Hình 4.24 Phổ HSQC hợp chất IE4 46 Hình 4.25 Phổ HMBC hợp chất IE4 46 Hình 4.26 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất IE5 47 Hình 4.27 Phổ 1H-NMRcủa hợp chấtIE5 49 Hình 4.28 Phổ 13C-NMR hợp chất IE5 49 Hình 4.29 Phổ DEPT hợp chất IE5 50 Hình 4.30 Phổ HSQC hợp chất IE5 50 VI 3.3.5 Hợp chất IE5: 5α,6α-epoxy-3β,7α-dihydroxycholest-8(14)-ene Chất bột vô định hình màu trắng Độ quay cực: [ ] =‒47.4(c=0.1, MeOH) Công thức phân tử: C27H44O3 Khối lượng phân tử: 416.64 H-NMR (CD3OD) 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 4.5 3.3.6 Hợp chất IE6: furoscalarol Chất dầu không màu Độ quay cực: [ ] =+58.2 (c=0.1, MeOH) Công thức phân tử: C27H40O4 Khối lượng phân tử: 428.29 H-NMR (CDCl3) 13C-NMR (CDCl3): Xem Bảng 4.6 3.3.7 Hợp chất IE7: 3β,5,6β-trihydroxy-cholest-7-en Chất bột vô định hình màu trắng Độ quay cực: [ ] = ‒21.1 (c=0.1, MeOH) Công thức phân tử: C27H46O3 Khối lượng phân tử: 418.66 H-NMR (CDCl3+CD3OD) 13C-NMR (CDCl3+CD3OD): Xem Bảng 4.7 3.3.8 Hợp chất IE8:3β-hydroxycholest-5-en-7-one Chất dầu không màu Độ quay cực: [ ] = +45.1 (c=0.1, MeOH) Công thức phân tử: C27H44O2 Khối lượng phân tử: 400.33 H-NMR (CDCl3) 13C-NMR (CDCl3): Xem Bảng 4.8 26 3.4 Đánh giá khả ức chế phát triểntế bào ung thư in vitro hợp chất Tất hợp chất phân lập từ loài I echinata đánh giá sơ hoạt tính gây độc tế bào ung thư người nồng độ 100 µg/mL Ở nồng độ này, hợp chất gây chết tế bào ung thư >50% đánh giá nồng độ khác để xác định giá trị IC50 27 CHƯƠNG 4- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất 4.1.1 Hợp chất IE1:(7E,12E,20Z,18S)-variabilin Hình 4.1 Cấu trúc hóa họcvà tương tác HMBC hợp chất IE1 Hợp chất IE1 phân lập dạng chất dầu không màu Phổ 1H-NMR hợp chất IE1 cho biết xuất tín hiệu củasáu proton olefin δH 5.11 (t, J = 6.5 Hz), 5.17 (t, J = 7.5 Hz), 5.30 (d, J = 10.0 Hz), 6.31 (br s), 7.25 (br s) 7.38 (br s); ba proton (δH 6.31, 7.25 7.38) đặc trưng cho vòng furan-3yl, bốn nhóm methyl δH 1.08 (d, J = 7.0 Hz), 1.58 (s), 1.59 (s) 1.76 (s) Phổ 13 C-NMR DEPT hợp chất IE1 xuất tín hiệu 25 cacbon gồm: bảy cacbon không liên kết trực tiếp với hydro (δC 99.01, 126.20, 135.81, 136.52, 144.94, 164.52 173.46), bảy nhóm methine (δC31.87, 112.01, 115.84, 125.21, 125.60, 140.06 và143.73), bảy nhóm methylene (δC25.98, 26.81, 27.43, 29.59, 37.62, 40.71, 40.42) bốn nhóm methyl (δC6.09, 15.90, 16.11, 21.06) Phân tích đặc trưng phổ 1H- 13C-NMR cho biết cấu trúc hợp chất variabilin, lớp chất phổ biến đặc trưng loài hải miên thuộc giống Ircinia 28 Để xác định xác vị trí nhóm chức liên kết đôi, tiến hành đo phổ HSQC phổ HMBC Các tương tác HMBC từ H-5 (δH 2.45) đến C-2 (δC 112.01)/C-3 (δC 126.20)/C-4 (δC 140.06)/C-6 (δC 29.59)/C-7 (δC 125.21) từ H-9 (δH 1.59) đến C-7 (δC 125.21)/C-8 (δC 136.52)/C-10 (δC 40.71) cho phép xác định vòng furan bị C-3 liên kết đôi C-7/C-8 Bảng 4.1 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR IE1 hợp chất tham khảo δC# 143.9 112.2 125.7 140.2 26.1 29.8 125.4 136.7 16.3 40.9 27.6 125.4 136.0 16.0 40.6 27.0 37.8 32.0 21.3 115.3 145.7 166.8 97.5 174.2 6.2 C 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 a) δCa 143.73 112.01 126.20 140.06 25.98 29.59 125.21 136.52 16.11 40.71 27.43 125.60 135.81 15.90 40.42 26.81 37.62 31.87 21.06 115.84 144.94 164.52 99.01 173.46 6.09 DEPT CH CH C CH CH2 CH2 CH C CH3 CH2 CH2 CH C CH3 CH2 CH2 CH2 CH CH3 CH C C C C CH3 # δHa (mult., J= Hz) 7.38 (br s) 6.31 (br s) 7.25 (br s) 2.45 (t, 7.5) 2.25 (q, 7.5) 5.17 (t, 7.5) 1.59 (s) 2.01 (m) 2.10 (q, 6.5) 5.11 (t, 6.5) 1.58 (s) 2.01 (m) 1.40 (m) 1.38 (m) 2.77 (m) 1.08 (d, 7.0) 5.30 (d, 10.0) 1.76 (s) đo CD3OD, δC số liệu của(7E,12E,20Z,18S)-variabilinđo CD3OD[4] 29 Tương tác HMBC từ H-14 (δH 1.58) tới C-12 (δC 125.60)/C-13 (δC 135.81)/C15 (δC 40.42) cho phép khẳng định vị trí liên kết đôi C-12/C-13 Vị trí liên kết đôi C-20/C-21 khẳng định tương tác HMBC từ H-19 (δH 1.08) tới C-17 (δC 37.62)/C-18 (δC 31.87)/C-20 (δC 115.84) từ H-20 (δH 5.30) tới C-21 (δC 144.94)/C-22 (δC 164.52) Tương tác HMBC H-25 (δH 1.76) C-22 (δC 164.52)/C-23 (δC 99.01)/C-24 (δC 173.46) cho phép xác định vị trí liên kết đôi lại C-22/C-23 Hơn nữa, so sánh số liệu phổ 13 C-NMR IE1 variabilin [4]đo dung môi CD3OD thấy hoàn toàn phù hợp vị trí tương ứng Hợp chất IE1có trung tâm bất đối Vì cấu hình hợp chất xác định dựa so sánh độ quay cực Thực tế, độ quay cực âm IE1([ ] =‒25.9)giống với công bố Balansa cộng (7E,12E,20Z,18S)variabilin([ ] =‒24.8) cho phép xác định xác cấu trúc hóa học hợp chất IE1 (7E,12E,20Z,18S)-variabilin, hợp chất phân lập từ loàiI variabilis John Faukler cộng vào năm 1973 [21] Hình 4.2.Phổ 1H-NMR hợp chấtIE1 30 Hình 4.3.Phổ 13C-NMR hợp chất IE1 Hình 4.4.Phổ DEPT hợp chất IE1 31 Hình 4.5.Phổ HSQC hợp chất IE1 Hình 4.6.Phổ HMBC hợp chấtIE1 32 4.1.2 Hợp chất IE2: (12E,20Z)-8-hydroxyvariabilin Hình 4.7 Cấu trúc hóa họcvà tương tác HMBC hợp chất IE2 Hợp chất IE2 phân lập dạng chất dầu không màu Phổ 1H-NMR hợp chất IE2 cho thấy tín hiệu: năm proton olefin δH 5.17 (t, J = 7.0 Hz), 5.29 (d, J = 10.0 Hz), 6.31 (br s), 7.28 (br s) 7.39 (br s); bốn nhóm methyl δH 1.08 (d, J = 6.5 Hz), 1.15 (s), 1.60 (s) 1.76 (s) Phổ 13 C-NMR DEPT hợp chất IE2 xuất tín hiệu 25 cacbon gồm: bảy cacbon không liên kết trực tiếp với hydro (δC 73.23, 98.50, 126.37, 135.74, 145.20, 165.00, 173.60), sáu nhóm methine (δC 31.79, 111.89, 115.61, 126.02, 140.08, 143.90), tám nhóm methylene (δC 23.51, 25.60, 26.19, 26.78, 37.62, 40.41, 42.17 42.62) bốn nhóm methyl (δC 6.09, 15.81, 21.06 26.87) So sánh tín hiệu phổ 1H 13C-NMR IE2 với IE1 nhận thấy: phổ 1HNMR IE2 vắng mặt proton olefin (vùng trường thấp δH> 5.00) phổ 13 C-NMR IE2 vắng mặt hai tín hiệu cacbon olefin (vùng δC>100.00) thay vào xuất thêm tín hiệu cacbon δC 73.23 cacbon khác vùng δC 42.17 Trong tín hiệu δC 73.23 gợi ý cho có mặt thêm nhóm hydroxyl cấu trúc IE2 so với IE1 Tiếp đó, tương tác HMBC bao gồm: tương tác từ H-5 (δH 2.43) đến C-2 (δC 111.89)/C-3 (δC 126.37)/C-4 (δC 140.08)/C-6 (δC 25.60)/C-7 (δC 42.17) tương tác từ H-9 (δH 1.15) đến C-7 (δC 42.17)/C-8 (δC 73.23)/C-10 (δC 42.62) cho phép 33 Bảng 4.2 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR IE2 hợp chất tham khảo C 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 δC# 142.7 110.9 124.8 138.8 25.1 24.4 41.2 73.9 26.5 41.2 22.5 124.3 135.6 15.9 39.3 25.5 36.5 30.7 20.5 115.7 142.0 162.3 99.2 172.1 6.2 δCb 142.76 110.91 124.87 138.87 25.18 24.42 41.32 73.93 26.61 41.20 22.58 124.35 135.71 16.01 39.24 25.57 36.52 30.73 20.62 115.59 143.10 n.d 99.31 n.d 6.21 δCa 143.90 111.89 126.37 140.08 26.19 25.60 42.17 73.23 26.87 42.62 23.51 126.02 135.74 15.81 40.41 26.78 37.62 31.79 21.06 115.61 145.20 165.00 98.50 173.60 6.09 δHa (mult., J = Hz) 7.39 (br s) 6.31 (br s) 7.28 (br s) 2.43 (t, 7.5) 1.63 (m) 1.49 (m) 1.15 (s) 1.43 (m) 2.00 (m) 5.17 (t, 7.0) 1.60 (s) 2.00 (m) 1.40 (m) 1.40 (m) 2.76 (m) 1.08 (d, 6.5) 5.29 (d, 10.0) 1.76 (s) a) đo CD3OD,b)đo CDCl3, #C 8-hydroxy-12E,20Z-variabilin đo CDCl3[5], n.d:tín hiệu không quan sát phổ13C-NMR xác định vòng furan bị vị trí C-3, vị trí nhóm hydroxy C-8 Cũng giống IE1, tương tác HMBC từ H-14 (δH 1.60) tới C-12 (δC 126.02)/C-13 (δC 135.74)/C-15 (δC 40.41) cho phép khẳng định vị trí liên kết đôi C-12/C-13 Vị trí liên kết đôi C-20/C-21 khẳng định tín hiệu tương tác HMBC từ H-19 (δH 1.08) tới C-17 (δC 37.62)/C-18 (δC 31.79)/C-20 (δC 115.61) từ H-20 (δH 5.29) tới C-21 (δC 145.20)/C-22 (δC 165.00) Tương tác HMBC H25 (δH 1.76) C-22 (δC 165.00)/C-23 (δC 98.50)/C-24 (δC 173.60) cho phép xác định vị trí liên kết đôi C-23/C-24 34 Hơn nữa, so sánh số liệu phổ IE2 với hợp chất 8-hydroxyvariabilin dung môi đo NMR (CDCl3) cho thấy giống vị trí tương ứng [5] cho phép khẳng định IE2 (12E,20Z)-8-hydroxyvariabilin, furanosesterterpene phân lập từ loài hải miên giống Ircinia sp.[27] Hình 4.8.Phổ 1H-NMR hợp chất IE2 Hình 4.9.Phổ 13C-NMR hợp chất IE2 35 Hình 4.10.Phổ DEPT hợp chất IE2 Hình 4.11.Phổ HSQC hợp chất IE2 36 Hình 4.12.Phổ HMBC hợp chất IE2 4.1.3 Hợp chất IE3: 8-hydroxyisovariabilin Hình 4.13 Cấu trúc hóa học IE3và hợp chất tham khảo IE2, IE3a 37 Hợp chất IE3 thu dạng dầu không mầu công thức phân tử xác định C25H36O5 dựa phổ HR-ESI-MS m/z 415.2483 [M‒H]– (tính toán theo lý thuyết cho công thức [C25H35O5]–, 415.2490) Phổ 1H-NMR hợp chất IE3 cho thấy tín hiệu: năm proton olefin [δH 5.07 (d, J = 10.5 Hz), 5.13 (t, J = 6.5 Hz), 6.32 (br s), 7.28 (br s) 7.39 (br s)] ba proton (δH 6.32, 7.28 7.39) đặc trưng cho vòng furan-3-yl, bốn nhóm methyl δH 1.02 (d, J = 6.5 Hz), 1.15 (s), 1.59 (s) 1.63 (s) Phổ 13 C-NMR DEPT hợp chất IE3 xuất tín hiệu 25 cacbon gồm: bảy cacbon không liên kết trực tiếp với hydro, sáu nhóm methine, tám nhóm methylene bốn nhóm methyl Trong đó, bốn tín hiệu cộng hưởng δC 111.90 (CH), 126.39 (C), 140.99 (CH) 143.90 (CH) quy kết cho vòng furan Bảy tín hiệu xuất vùng trường thấp [δC 93.32 (C), 117.96 (CH), 125.66 (CH), 136.12 (C), 148.75 (C), 178.50 (C) 180.04 (C)] cho thấy có mặt ba liên kết đôi nhóm carbonyl Tín hiệu δC 73.24 (C) đặc trưng cho nguyên tử cacbon bậc ba liên kết trực tiếp với oxy Phân tích số liệu phổ 1H-và 13C-NMR của hợp chất IE3 cho thấy số liệu phổ IE3 giống hợp chất 8hydroxyvariabilin (IE2) Sự khác IE3 IE2 nằm vùng tín hiệu vòng lacton (từ C-20 đến C-25) Vị trí nhóm tiếp xác định dựa phân tích phổ hai chiều HMBC Các tương tác HMBC từ H-5 (δH 2.43) đến C-2 (δC 111.90)/C-3 (δC 126.39)/C-4 (δC 140.99)/C-6 (δC 25.61)/C-7 (δC 42.16) tương tác HMBC từ H-9 (δH 1.15) đến C-7 (δC 42.16)/C-8 (δC 73.24)/C-10 (δC 42.71) cho phép xác định vị trí vòng furan bị C-3, nhóm hydroxy C-8 Tương tác HMBC từ H-14 (δH 1.59) tới C-12 (δC 125.66)/C-13 (δC 136.12)/C-15 (δC 40.74) cho phép khẳng định vị trí liên kết đôi C-12/C-13 Vị trí liên kết đôi thứ hai xác định C-20/C-21 tương tác HMBC từ H-19 (δH 1.02) tới C-17 (δC 38.71)/C-18 (δC 29.77)/C-20 (δC 117.96) từ H-20 (δH 5.07) tới C-21 (δC 148.75)/C-22 (δC 180.04) Ngoài ra, độ chuyển dịch hóa học 13C-NMR vùng trường thấp C-22 (δC 180.04) gợi ý cho có mặt nhóm chức ketone C-22 tương tự hợp 38 chất tham khảo 24-O-methyl-7E,12E,20Z-variabillin(IE3a) (C-22: δC 183.8) [5] Vị trí liên kết đôi lại C-23/C-24 xác định tương tác HMBC H-25 (δH 1.63) C-22 (δC 180.04)/C-23 (δC 93.32)/C-24 (δC 178.50) Tiếp đó, cấu hình liên kết đôi C-12/C-13 C-20/C-21 xác định tương ứng 12E 20Z so sánh giá trị độ chuyển dịch hóa học C-14 (δC 15.86) C-20 (δC 117.96) với giá trị tương ứng hợp chất công bố(C-20: 20Z δC 117.0, 20E δC 121.0)[5],(C-14: 12EδC ~ 16.0, 12Z δC ~ 23)[4].Từ dẫn chứng trên, cấu trúc hóa học IE3 xác định đồng phân (12E,20Z)-8hydroxyvariabilin (IE2) đặt tên 8-hydroxyisovariabilin Bảng 4.3 Số liệu phổ 1H- 13C-NMR hợp chất IE3 hợp chất tham khảo δCa,# 143.90 111.89 126.37 140.08 26.19 25.60 42.17 73.23 26.87 42.62 23.51 126.02 135.74 15.81 40.41 26.78 37.62 31.79 21.06 115.61 145.20 165.00 98.50 173.60 6.09 C 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 OMe a δC@ 142.5 111.1 125.0 138.8 25.0 28.5 123.8 135.7 16.0 39.5 26.6 124.5 134.7 15.8 39.7 25.7 36.3 30.8 20.3 119.5 146.7 183.8 90.1 175.6 4.0 56.4 δCa 143.90 111.90 126.39 140.99 26.19 25.61 42.16 73.24 26.85 42.71 23.52 125.66 136.12 15.86 40.74 26.85 38.71 29.77 22.12 117.96 148.75 180.07 93.32 178.50 5.84 δHa (mult., J= Hz) 7.39 (br s) 6.32 (br s) 7.28 (br s) 2.43 (t, 7.0) 1.62 (m) 1.50 (m) 1.15 (s) 1.48 (m) 2.00 (m) 5.13 (t, 6.5) 1.59 (s) 2.00 (m) 1.45 (m) 1.34 (m)/1.23 (m) 3.68 (m) 1.02 (d, 6.5) 5.07 (d, 10.5) 1.63 (s) Đo CD3OD,#δC số liệu IE2,@C IE3a đo CDCl3[5] 39 Hình 4.14 Các tương tác HMBC hợp chất IE3 Hình 4.15 Phổ HR-ESI-MS hợp chất IE3 Hình 4.16 Phổ 1H-NMR hợp chất IE3 40 ... đề tài Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính kháng ung thư từ loài hải miên Ircinia echinata( Keller, 1889) .Đề tài bao gồm nội dung sau: Phân lập hợp chất từ loài hảimiên Ircinia echinata; ... chưa có nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài hải miên Irciniaechinataở Việt Nam giới Dưới tổng quan nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài thuộc giống Ircinia 1.1.3.1...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ THỊ TRANG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ CỦA LOÀI HẢI MIÊN IRCINIA ECHINATA (KELLER, 1889)