Nghiên cứu tính kháng sinh của enterobacter tại bệnh viện đa khoa trung ương thái nguyên

Trong những năm gần đây, tỷ lệ bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn đề kháng kháng sinh tăng lên rõ rệt ở cả môi trường bệnh viện và cộng đồng [19].Nguyên nhân chủ yếu là do sử dụng kháng sinh k

PHẠM THỊ YẾN

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA ENTEROBACTER

TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA TRUNG ƢƠNG THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Thái Nguyên – năm 2016

PHẠM THỊ YẾN

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA ENTEROBACTER

TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn 1 TS Phạm Bằng Phương :

2 PGS.TS.BS Lưu Thị Kim Thanh

Thái Nguyên – năm 2016

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.BS Lưu Thị Kim Thanh – Trưởng khoa Vi sinh Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên và TS.Phạm Bằng Phương Giangr viên khoa Công nghệ sinh học-Công nghệ thực phẩm Đại học Nông Lâm Thái Nguyên người đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn giúp đỡ và tạo điều kiện đầy đủ

về trang thiết bị và hóa chất để tôi thực hiện khá luận tốt nghiệp.`

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã dạy dỗ và trang bị cho tôi kiến thức bổ ích trong suốt 4 năm học qua

Qua đây tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các cán bộ, kỹ thuật viên phòng xét nghiệm Vi sinh Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên đã giúp tôi hoàn thành đề tài này

Xin cảm ơn gia đình, bạn bè và tập thể lớp Công nghệ sinh học k43 đã luôn động viên, khích lệ giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016

Sinh viên

Phạm Thị Yến

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.1: Kết quả nhuộm soi các bệnh phẩm (n=305) 35

Bảng 3.2: Kết quả nuôi cấy các bệnh phẩm 36

Bảng 3.3: Kết quả phân lập trong các bệnh phẩm (n=94) 37

Bảng 3.4: Kết quả phân lập cấp độ loài trong bệnh phẩm (n=23) 39

Bảng 3.5: Độ kháng kháng sinh của loài Enterobacter Aerogenes 40

Bảng 3.6 Độ kháng kháng sinh của loài Enterobacter Cloacae 41

Bảng 3.7: Độ kháng kháng sinh của Enterobacter 43

Bảng 3.8: Tổng số chủng đa kháng kháng sinh của Enterobacter 48

Bảng 3.9: Kết quả các kiểu đa kháng kháng sinh của Enterobacter 48

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Tính chất của Enterobacter 32

Hình 2.2 Phản ứng VP dương tính 32

Hình 2.3 Hình thái khuẩn lạc Enterobacter 32

Hình 2.4 Lên men đương glucose 32

Hình 2.5 Chuyên hóa nitrat thành nitrit 33

Hình 2.6 Xác định men Coagulase 33

Hình 2.7 phản ứng catalase 33

Hình 2.8 Tính nhạy cảm kháng sinh 33

Hình 2.9 Khả năng di đông của 34

Hình 2.10 Lên men đường Mannit 34

Hình 3.1: Kết quả nhuộm soi các bệnh phẩm 35

Hình 3.2 Tỷ lệ nuôi cấy dương tính các loại bệnh phẩm 36

Hình 3.3: Tỷ lệ Enterobacter và vi khuẩn khác trong các bệnh phẩm 38

Hình 3.4 Tỷ lệ nhạy cảm và kháng kháng sinh của Enterobacter 44

Hình 3.5: Tỷ lệ các kiểu đa kháng sinh của Enterobacter 49

DANH MỤC VIẾT TẮT

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC HÌNH iii

DANH MỤC VIẾT TẮT iv

MỤC LỤC v

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

2.1 Xác định tỉ lệ nhiễm trùng do Enterobacter ở một số bệnh nhân đến khám và điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên 2

2.2 Xác định mức độ kháng kháng sinh của Enterobacter với một số kháng sinh 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

3.1 Phân lập Enterobacter từ một số bệnh phẩm 2

3.2 Đánh giá mức độ kháng kháng sinh của các chủng Enterobacter phân lập được 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Lược sử nghiên cứu Enterobacter 3

1.2 Sự phân bố của Enterobacter 3

1.3 Hình thái, cấu tạo và sự sinh sản 4

1.3.1 Hình thái, cấu tạo 4

1.3.2 Sự sinh sản của Enterobacter 4

1.4 Cấu tạo chung của vi khuẩn 4

1.4.1 Thành tế bào 4

1.4.2 Màng tế bào chất 5

1.4.3 Tế bào chất 5

1.4.4 Thể nhân 6

1.4.5 Bao nhầy 6

1.4.6.Tiên mao 6

1.4.7 Bào tử 6

1.5 Đặc điểm sinh học của Enterobacter 7

1.5.1 Tính chất nuôi cấy 7

1.5.2 Một số tính chất hóa sinh cơ bản 7

1.5.3 Sức đề kháng 7

1.5.4 Kháng nguyên 7

1.5.5 Đặc tính và các yếu tố độc lực 8

1.6 Hội chứng độc lực do Enterobacter gây ra 9

1.7 Kháng sinh 9

1.7.1 Khái niệm 9

1.7.2 Phân loại kháng sinh 9

1.7.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh lên tế bào vi sinh vật 11

1.8 Đề kháng kháng sinh 13

1.8.1 Khái niệm 13

1.8.2 Các kiểu đề kháng của vi sinh vật 13

1.8.3 Cơ chế đề kháng kháng sinh 15

1.8.4 Nguồn gốc của sự đề kháng kháng sinh 16

1.9 Cơ chế đề kháng kháng sinh của Enterobacter 16

1.10 Biện pháp hạn sự đề kháng vi khuẩn 17

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Các thiết bi và hóa chất 19

2.2.1 Thiết bị và dụng cụ 19

2.2.2 Hóa chất 19

2.3 Môi trường nuôi cấy, phân lập, xác định tính chất sinh hóa và làm kháng sinh đồ 20

2.4 Các khoanh giấy kháng sinh 24

2.5 Phương pháp nghiên cứu 25

2.5.1 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm 25

2.5.2 Kỹ thuật phân lập 26

2.5.3 Kỹ thuật kháng sinh đồ 30

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Kết quả nhuộm soi, nuôi cấy và phân lập 35

3.1.1 Kết quả nhuộm soi 35

3.1.2 Kết quả nuôi cấy 36

3.1.3 Kết quả phân lập Enterobacter 37

3.2 Kết quả xác định loài trong chi Enterobacter 39

3.3 Kết quả xác định mức độ đề kháng kháng sinh của loài Enterobacter 40

3.4 Kết quả xác định mức độ đề kháng kháng sinh của Enterobacter 43

3.5 Kết quả các kiểu đa kháng của các chủng Enterobacter 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

KẾT LUẬN 50

KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

Trong những năm gần đây, tỷ lệ bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn đề kháng kháng sinh tăng lên rõ rệt ở cả môi trường bệnh viện và cộng đồng [19].Nguyên nhân chủ yếu là do sử dụng kháng sinh không hợp lý tạo điều kiện cho vi khuẩn phơi nhiễm nhiều với kháng sinh dẫn đến nhiều cơ hội để chúng phát triển và lây lan tính kháng kháng sinh [19] Sự kết hợp giữa kháng thuốc do nhiễm sắc thể và kháng thuốc do plasmid làm cho

Enterobacteriaceae là những vi khuẩn có khả năng biến đổi nhất trong tất cả

các vi khuẩn về mức độ mẫn cảm với thuốc kháng sinh Một vi khuẩn điển hình thuộc họ này có khả năng đề kháng với nhiều loại kháng sinh là

Enterobacter [7], Enterobacter là một loại trực khuẩn Gram âm, phân bố chủ

yếu ở đường tiêu hóa dưới của người và động vật, chúng tồn tại dễ dàng ở môi trường đất, nước,không khí…Trong giới hạn một đề tài tốt nghiệp chúng tôi chỉ nghiên cứu Enterobacter ở trên người

Enterobacter có khả năng sản xuất ra penicillinase phá hủy vòng β- lactam, cấu trúc cơ bản của kháng sinh penicillin G, Ampicillin…làm cho các kháng sinh này mất tác dụng

Hiện nay chưa có vaccine nào đặc hiệu để phòng nhiễm khuẩn do Enterobacter, chỉ có kháng sinh mới có vai trò hữu hiệu trong các bệnh nhiễm

khuẩn do Enterobacter Song do thói quen sử dụng thuốc kháng sinh tùy tiện của con người làm tăng tính kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung và của Enterobacter nói riêng.Ngay cả một số kháng sinh vốn có tác dụng mạnh trước kia thì nay không còn hiệu quả trong điều trị, việc điều trị phải trông chờ vào những kháng sinh mới

Vì vậy việc tìm hiểu về Enterobacter, đặc biệt là sự đề kháng kháng sinh của chúng trong giai đoạn hiện nay là cần thiết giúp cho cộng đồng nhân dân nối chung, các thầy thuốc nói riêng có thái độ đúng đắn trong việc phòng

và điều trị bệnh do vi khuẩn đáng quan tâm này

Xuất phát từ yêu càu thực tế, chúng tôi chọn đề tài tốt nghiệp: ‘‘Nghiên cứu tính kháng kháng sinh của Enterobacter tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương tỉnh Thái Nguyên’’

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Xác định tỉ lệ nhiễm trùng do Enterobacter ở một số bệnh nhân đến khám và điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên

2.2 Xác định mức độ kháng kháng sinh của Enterobacter với một số kháng sinh

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Phân lập Enterobacter từ một số bệnh phẩm

3.2 Đánh giá mức độ kháng kháng sinh của các chủng Enterobacter phân lập được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Lược sử nghiên cứu Enterobacter

Những nghiên cứu dịch tễ học đầu tiên về Enterobacter được thực hiên trong việc truyền nhiễm ngang trong các bệnh viện và

Nghiên cứu mang tính bươc ngoặt được thực hiện bởi Flynn và đồng nghiệp vào năm 1987 đã nhấn mạnh tầm quan trọng của Enterobacter từ hệ sinh vật đường ruột nội sinh gây nên các bệnh nhiễm trùng trong nghiên cứu

87 bệnh nhân trải qua phẫu thuật tim, tất cả các bệnh nhân đã theo dõi trước

và sau khi phẫu thuật, Cefazolin được dùng cho tất cả các bệnh nhân 23% bệnh nhân bị xâm nhiễm và 49% bệnh nhân bị xâm nhiễm sau 72 giờ sau phẫu thuật

Enterobacter cũng có thể lây lan trực tiếp từ người này qua người khác nếu không thực hiện đầy đủ các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn, đặc biệt là rửa tay Trong một nghiên cứu sử dụng một kỹ thuật PCR , Davin-Regli và các đồng nghiệp nghiên cứu 185 mẫu phân lập lâm sàng của E.aerogenes thu thập từ hai bệnh nhân ICU (Một đơn vị chuyên sâu chăm sóc ) trong khoảng thời gian một năm từ một bệnh viện ở Pháp

Enterobacter được thích nghi để gây nhiễm trùng bệnh viện, vì nó là phổ biến trong môi trường và có thể tồn tại trên da và khô bề mặt cũng như lặp lại trong nước bị ô nhiễm Nhiều ổ dịch đã được mô tả, bao gồm nhiễm trùng đường ruột do cho ăn ô nhiễm, độ ẩm không khí và thiết bị điều trị hô hấp và nước thủy liệu pháp trong một đơn vị bỏng

1.2 Sự phân bố của Enterobacter

Enterobacter phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể tìm thấy chúng

ở nơi có nước và nguồn năng lượng tối thiểu, chúng cư trú ở đường tiêu hóa dưới của người và động vật [7]

1.3 Hình thái, cấu tạo và sự sinh sản

1.3.1 Hình thái, cấu tạo

Enterobacter có dạng hình que, thường có chiếu dài 2-4µm và chiều rộng 0,4-0,5µm, hai đầu tròn, chiều dài có khả năng thay đổi Enterobacter

bắt màu Gram âm, thường không có vỏ có lông xung quanh, có khả năng di động và không sinh nha bào [7]

1.3.2 Sự sinh sản của Enterobacter

1.4 Cấu tạo chung của vi khuẩn

Vi khuẩn là những vi sinh vật đơn bào, không có màng nhân Chúng có cấu trúc và hoạt động đơn giản hơn so với các tế bào có màng nhân

Vi khuẩn có thể có rất nhiều dạng nhưng chúng có cấu tạo chung như sau:

 Chức năng của thành tế bào

- Duy trì hình dạng tế bào

- Hỗ trợ sự chuyển động của tiên mao

- Giup tế bào đề kháng với các lực tác động bên ngoài

- Cần thiết cho quá trình phân cắt bình thường của tế bào

- Ngăn một số chất có hại xâm nhập vào tế bào

- Có liên quan mật thiết đến tính kháng nguyên, tính gây bệnh

1.4.2 Màng tế bào chất

Màng tế bào chất được gọi là màng tế bào hay còn gọi là màng sinh chất, dày khoảng 4-5mm

 Cấu tạo:

Màng tế bào cấu tạo bởi hai lớp photpholipit Hầu hết màng tế bào của

vi khuẩn không chứa các sterol như cholesterol, do đó không cứng như các tế bào của tế bào nhân thật

 Chức năng của màng tế bào:

- Khống chế sự vận chuyển cũng như trao đổi ra vào của các chất dinh dưỡng, các sản phẩm trao đổi chất

- Duy trì áp suất thẩ thấu bình thường trong tế bào

- Là nơi sinh tổng hợp các thành phần của tế bào và các polymer của vỏ nhày

- Đây là nơi tiến hành các quá trình photphoril hóa và photphoril quang hợp

- Là nơi tổng hợp nhiều enzyme, các protein hô hấp

- Cung cấp năng lượng cho sự vận động của tiên mao

1.4.3 Tế bào chất

Tế bào chất là vùng dịch thể dạng keo chứ các chất hòa tan trong suốt

và các hạt như ribosom, trong đó tới 80% là nước.Trong tế bào chất là protein, axit nucleic, hydratcacbon, lipit, các ion vô cơ và nhiều chất có khối lượng phân tử khác

Tế bào chất của vi khuẩn không di động bên trong tế bào, cũng không chứa bộ khung tế bào.Ribosom nằm tự do trong tế bào chất, chiếm 70% khối lượng khô tế bào vi khuẩn.Ribosom của tế bào vi khuẩn chịu tác đông của rất nhiều chất kháng sinh như: streptomycine, neomycine, ttracyline…

1.4.4 Thể nhân

Nhân của vi khuẩn không phải là nhân thật, chỉ tồn tại ở chất nhân Nhân có vai trò rất lớn trong sự tổng hợp protein của tế bào và di tuyền các tính trạng cho thế hệ sau

Thể nhân của vi khuẩn là một nhiễm sắc thể duy nhất cấu tạo bởi một sợi ADN xoắn kép có gắn kết với tế bào chất

Nhiễm sắc thể của vi khuẩn có chiều dài thay đổi trong khoảng 0,25-3µm

1.4.5 Bao nhầy

Bao nhầy là lớp vật chất dạng keo có chiều dài bất định

Căn cứ vào mức độ kích thước của vỏ nhầy mà người ta chia thành: Bao nhày mỏng, bao nhày, khối nhày

Thành phần chủ yếu của khối nhày: polysaccarit, polypeptit và proein

 Chức năng của bao nhầy:

- Bảo vệ vi khuẩn tránh khỏi hiện tượng thự bào của bạch cầu

- Tích lũy một số sản phẩm trao đổi chất

- Giup vi khuẩn bám vào bề mặt của giá thể

1.4.6.Tiên mao

Một tế bào cỏ thể có một hoặc vài tiên mao với kích thước dao động từ 0,01-0,03 x 4-100µm

Có 3 loại tiên mao: đơn mao, chùm mao và chu mao

Thành phần hóa học của tiên mao chủ yếu là protein (chiếm hơn 90%), phần còn lại là các chất vô cơ

1.4.7 Bào tử

Với một số vi khuẩn vào cuối thời kì sinh trưởng, phát triển sẽ sinh bên trong một thể nghỉ có dạng hinh cầu hoặc hình bầu dục được gọi là bào tử hay nội bào tử.Mỗi tế bào chỉ có khả năng sinh một bào tử lên đây không phải là một bào tử có chức năng sinh sôi, nảy nở như nấm.Bào tử có sức đề kháng

cao đối với các nhân tố vật lý và hóa học như: nhiệt độ, tia cực tím, áp suất và các chất sát trùng

Trong thơi kì nghỉ không thấy bào tử vi khuẩn thể hiện bất kì một hoạt động trao đổi chất nào nên người ta gọi là trạng thái sống ẩn.Bào tử có thể giữ đươc sức sống trong vài năm đến vài chục năm [4]

1.5 Đặc điểm sinh học của Enterobacter

1.5.1 Tính chất nuôi cấy

Enterobacter mọc dễ dàng trên môi trường đơn giản thường chỉ có một

năng lượng là cacbon Sinh trưởng nhanh chóng trong cả điều kiện hiếu khí và yếm khí, hình thành các khuẩn lạc có kích thước từ 2-5mm trên thạch và làm đục canh trùng sau nuôi cấy 12-18 giờ [ 7]

1.5.2 Một số tính chất hóa sinh cơ bản

- Lên men đường lactose

Enterobacter tồn tại dễ dàng trong tự nhiên, sống tự do ở những nơi có

nước và nguồn năng lượng tối thiểu.Vi khuẩn này có khả năng sống một thời gian ngắn trên da

Enterobacter thường kháng lại Penicillin G có nồng độ cao,

erythromycin và clindamycin nhưng có thể mẫn cảm với các kháng sinh lactam phổ rộng, aminoglycoside, chloramphenicol… [7]

β-1.5.4 Kháng nguyên

Enterobacter có hai loại kháng nguyên:

 Kháng nguyên thân (kháng nguyên O) nằm trong vách tế bào bản

chất là phức hợp glucid-lipid-protein.Trong đó:

+ Thành phần protein có tính kháng nguyên

+ Thành phần đa đường xác định tính đặc hiệu của kháng nguyên

+ Thành phần lipid kết hợp với đa đường gây tính độc

- Tính chất kháng nguyên thân:

+ Chịu được nhiệt (không bị phá hủy khi bi đun nóng ở 100 trong 2 giờ)

+ Vững bền đối với cồn (không bị phá vỡ khi tiếp xúc với cồn 50%)

+ Rất độc

+ Bị phá hủy bởi focmol 0,5%

+ Kháng nguyên O khi tiếp xúc với kháng thể O tương ứng sẽ tạo nên

hiện tượng ngưng kết O, các hạt ngưng kết nhỏ, lắc khó tan

 Kháng nguyên lông (kháng nguyên H) có bản chất là protein

Kháng nguyên H kích thích cơ thể hình thành kháng thể H và khi gặp

nhau sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết H, trong đó các vi khuẩn ngưng kết lại

với nhau do các lông kết dính lại tạo nên các hạt ngưng kết rất dễ tan khi lắc

- Tính chất kháng nguyên lông:

+ Dễ bị hủy bởi nhiệt độ

+ Bị phá hủy bởi cồn 50% và các enzyme protease

+ Vững bền đối với focmol 0,5%

+ Ngưng kết rất lỏng lẻo, hạt to, lắc dễ tan vì lông rất nhỏ, dài, gấp

khúc và dễ gãy [14,15]

1.5.5 Đặc tính và các yếu tố độc lực

Enterobacter sản xuất yếu tố độc lực có liên quan đến cấu tạo của vách

vi khuẩn

+ Enterobacter có nội độc tố lipopolysaccharide (LPS) gây sốt, giảm

bạch cầu và hoạt hóa các yếu tố đông máu gặp trong các trường hợp nhiễm

khuẩn ở người, đặc biệt là khi vi khuẩn vào tuần hoàn máu gây nhiễm khuẩn huyết [7]

 Các enzyme

- Coagulaza: Men này có khả năng làm đông huyết tương người và

thỏ.Đây là một protein bền vững với nhiệt độ, có tính kháng nguyên yếu Enzyme này có thể tạo huyết cục trong tĩnh mạch, dễ dẫn đến nhiễm khuẩn huyết [7]

1.6 Hội chứng độc lực do Enterobacter gây ra

1.7 Kháng sinh

1.7.1 Khái niệm

Chất kháng sinh được hiểu là các chất hóa học xác định, không có bản chất enzyme, có nguồn gốc sinh học (trong đó phổ biến nhất là từ vi sinh vật), với đặc tính ở nồng độ thấp hoặc rất thấp đẵ có khả năng ức chế mạnh mẽ hoặc tiêu diệt được các vi sinh vật gây bệnh mà vẫn đảm bảo an toàn cho người và động vật điều trị [9]

1.7.2 Phân loại kháng sinh

Có nhiều cách phân loại kháng sinh, tùy theo mục đích nghiên cứu và cách sử dụng thuốc

1.7.2.1 Dựa vào mức độ tác dụng

Thuốc kháng sinh diệt khuẩn (bactericidial antibiotics) gồm những kháng sinh có cơ chế tác dụng đến khả năng tạo vách tế bào, sinh tổng hợp AND và ARN giải phóng men autolyza

Thuốc kháng sinh kìm khuẩn (bacteriostatic antibiotics) gồm các thuốc

ức chế sinh tổng hợp protein của vi khuẩn bằng cách gắn vào các enzyme hay các ribosome 30s, 50s và 70s

1.7.2.2 Dựa vào phổ tác dụng kháng sinh

Nhóm có phổ tác dụng hẹp, chỉ tác dụng lên một loại hay một nhóm vi khuẩn nào đó: penicillin cổ điển chỉ tác dụng lên vi khuẩn Gram dương hay nhóm thuốc chỉ tác dụng lên vi khuẩn Gram âm như streptomycin

Nhóm kháng sinh có phổ tác dụng rộng, chúng có tác dụng với cả vi khuẩn Gram dương, Gram âm, Ricketsiea: chloramphenicol, tetraclin…

Nhóm kháng sinh dùng ngoài hay các thuốc không hoặc ít hấp thụ ở đường tiêu hóa Thuốc thuộc nhóm này thường độc, bao gồm thuốc có tác dụng với vi khuẩn Gram âm như: Bacitraxin, heliomycin, tác dụng với vi khuẩn Gram dương như: Neomycin, polymycin

Nhóm kháng sinh chống lao: Rifamycin

Nhóm kháng sinh chống nấm như: Nystatin, grycefulvin, ampoterytin-B

1.7.2.3 Dựa vào nguồn gốc

Kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn, xạ khuẩn

Nhóm kháng sinh có nguồn gốc hóa dược hay do con người tổng hợp nên

1.7.2.4 Dựa vào cơ chế tác dụng

Dựa vào cơ chế tác dụng người ta chia làm 2 nhóm:

 Nhóm kháng sinh có tác dụng lên tế bào vi khuẩn gồm các thuốc:

- Thuốc tác dụng lên quá trình vách tế bào: Penicillin và thuốc thuộc nhóm β- lactam, vancomycin, baxitracin…

- Thuốc tác dụng lên màng tế bào.Các thuốc này làm rối loạn tính thấm của vỏ màng nguyên sinh chất tế bào vi khuẩn, làm cho chức năng hang rào của màng bị phá hủy, vi khuẩn bị rối loạn quá trình đồng hóa và dị hóa

Do vậy mất khẳ năng lấy chất dinh dưỡng cần thiết và thải các sản phẩm của quá trình dị hóa ra ngoài: colistin, polymycin…

 Nhóm thuốc tác dụng lên hệ phi bào làm rối loạn các hoạt động sống của tế bào trong nguyên sinh chất gồm:

- Thuốc làm rối loạn và ức chế tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn ở mức ribosome.Vi khuẩn không tạo nên các chất tham gia vào quá trình phân chia, di truyền của tế bào.Thuốc gắn vào tiểu phần 30s, 50s và 70s của ribosome trong tế bào vi khuẩn

1.7.2.5 Dựa vào cấu trúc hóa học

Các kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hóa học, từ đó chúng có chung một cơ chế tác dụng và phổ kháng khuẩn tương tự Mặt khác trong cùng một họ kháng sinh, tính chất dược động lực học và sự dung nạp thường khác nhau, và đặc điểm về phổ kháng khuẩn cũng không hoàn toàn giống nhau, vì vậy cũng cần phân biệt các kháng sinh trong cùng một họ

Một số họ (hoặc nhóm) kháng sinh chính:

- Nhóm β – lactam (các penicillin và các cephalosporin )

- Nhóm aminosid hay aminoglycoside

1.7.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh lên tế bào vi sinh vật

Cho đến nay vấn đề này vẫn là mối quan tâm của các nhà khoa học, kháng sinh ngày càng đa dạng về số lượng, chủng loại và cả về cấu trúc, nên không thể trình bày cơ chế tác động cụ thể của từng kháng sinh Sau đây là một số cơ chế tác động cơ bản:

Từ đó tế bào dễ vỡ môi trường có trương lực bình thường

Ví dụ: Các β – lactam, Vancomycin làm cho vi khuẩn không có vách tế bào và không được bảo vệ và do vậy chúng sẽ bị các tế bào thực nắm bắt và tiêu diệt

 Kháng sinh gây rối loạn chức năng thẩm thấu chọn lọc của màng nguyên tương (như polymycin), làm cho các thành phần bên trong tế bào bị thoát ra ngoài và nước lại dễ dàng vào trong khiến tế bào vỡ

 Kháng sinh ức chế tổng hợp protein bằng cách gắn vào ribosome

Cơ chế :

Giai đoạn 1: Gắn vào thụ thể trên tiểu đơn vị 30s

Giai đoạn 2: Phong bế hoạt tính của phức hợp đầu tiên trong quá trình

thành lập chuỗi peptid

Giai đoạn 3: Thông tin mRNA bị đọc sai lên 1 acid amin không phù hợp Giai đoạn 4: Làm vỡ các polysomes thành monosomes do đó không có chức năng tổng hợp protein

Ví dụ: Nhóm aminoglucosid, tetracycline, chloramphenicol, macrolid Tetracylines: Gắn vào tiểu đơn vị 30s của ribosome để ngăn chặn các amino acid mới gắn vào chuỗi mới được thành lập

Chloramphenicol: Gắn với tiểu phần 50s của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin vào chuỗi polypeptide

Như vậy mỗi kháng sinh chỉ tác động vào một khâu nhất định, một phản ứng sinh vật nhất định của tế bào sống, làm rối loạn dẫn đến ngừng trệ sinh trưởng phát triển của tế bào.Những tế bào đang ở trạng thái nghỉ sẽ không có quá trình sinh tổng hợp các chất nên không bị tác động.Các tế bào đang phát triển nhanh thì dễ bị tác động mạnh

Hầu hết các kháng sinh chỉ tác dụng ức chế mà không giết chết tức khắc vi khuẩn nên khi hết thuốc một số vi khuẩn lại có thể phục hồi lại.Vì vậy, việc sử dụng kháng sinh phải dùng đủ liều để đảm bảo tiêu diệt hết vi khuẩn gây bệnh [4]

vi khuẩn lỵ (Shigella)…kháng lại rất nhiều loại kháng sinh

Việc vi khuẩn kháng lại kháng sinh và kháng lại nhiều kháng sinh trong một thời điểm, gây không ít khó khăn trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, đặc biệt là các bệnh nhiễm khuẩn nặng, cấp tính như nhiễm trùng vết thương, nhiễm trùng vết mổ, nhiễm trùng huyết, áp-xe phủ tạng, bệnh lao phổi, viêm đường sinh dục – tiết niệu…

1.8.2 Các kiểu đề kháng của vi sinh vật

1.8.2.1 Đề kháng tự nhiên

- Khái niệm: Có một số vi sinh vật gây bệnh có khả năng kháng thuốc

tự nhiên với một số chất kháng sinh nhất định do kháng sinh này không tác động lên chúng, dạng đề kháng này gọi là đề kháng tự nhiên

- Nguyên nhân: Do đặc thù và cấu trúc sinh lý của tế bào vi khuẩn gây bệnh.Kiểu đề kháng này bền vững và được di truyền [3]

Yếu tố R có bản chất là plasmid, khi vi sinh vật sống trong môi trường

có kháng sinh, các plasmid kháng thuốc sẽ được hoạt hóa, sao chép tổng hợp

ra vô số plasmid mới Sức đề kháng của tế bào chủ tăng lên nhờ hoạt tính của các plasmid, nhờ đó vi sinh vật gây bệnh vẫn có thể tồn tại và phát triển được trong môi trường có kháng sinh Các yếu tố kháng R này có bản chất là plasmid nên qua biến nạp, tải nạp hay tiếp hợp, chúng dễ dàng vận chuyển qua lại giữa các tế bào, kể cả tế bào không cùng một loài nhưng thuộc loài gần gũi [1],[3]

1.8.2.4 Hiện tượng kháng chéo

- Khái niệm: Là hiện tượng một chủng vi sinh vật có khả năng kháng lại chất kháng sinh nhất định thì cũng có khả năng kháng luôn một số chất kháng sinh khác cùng nhóm cáu trúc hay có đặc tính tương đồng với chất kháng sinh ấy

- Nguyên nhân: Do cấu trúc hóa học của những kháng sinh đó tương tự nhau và do chủng vi sinh vật đó có khả năng tiết ra độc tố giống nhau, mà độc

đó làm mất tác dụng của một số chất kháng sinh [3]

1.8.3 Cơ chế đề kháng kháng sinh

Cơ chế đề kháng kháng sinh đa dạng và khác nhau tùy từng chủng vi sinh vật nhưng nhìn chung tất cả các sinh vật kháng thuốc có mang gen kháng thuốc trong tế bào Các gen này tạo ra sự đề kháng bằng một trong những cách sau:

- Dưới tác dụng của gen kháng thuốc làm mất hoạt tính của chất kháng sinh hoặc phá hủy cấu trúc của các kháng sinh.Vi khuẩn sản xuất enzyme phá hủy hoạt tính của chất kháng sinh.Ví dụ: Staphylococus sản xuất β- lactamase

+Vi khuẩn mất hoặc thay đổi PBPs (Penicillin biding protein) nên đề kháng penicillin

+Vi khuẩn thay đổi thụ thể trên tiểu đơn vị 50s trên ribosome nên đề kháng Erythromycin

- Tự điều chỉnh hướng trao đổi chất để vô hiệu hóa chất kháng sinh.Ví

dụ như:

+ Vi khuẩn thay đổi đường biến dưỡng làm mất tác dụng của thuốc:

Vi khuẩn sử dụng acid folic có sẵn lên vi khuẩn không còn cần PABA.Từ đó

có khả năng với Sulfornamides

+ Vi khuẩn có enzyme đã bị thay đổi: enzyme bị thay đổi vẫn còn chức năng biến dưỡng nhưng ít bị ảnh hưởng bởi thuốc

1.8.4 Nguồn gốc của sự đề kháng kháng sinh

1.8.4.1 Nguồn gốc không do di truyền

- Vi khuẩn tồn tại nhiều năm trong mô cơ thể và chúng nhân lên cho

ra những thế hệ sau có thể nhạy cảm hoàn toàn với thuốc đã được sử dụng trước đó

- Vi khuẩn mất điểm gắn đặc biệt dành cho thuốc

Ví dụ: plasmid mang gen để tiết β-lactamase

Vật liệu di truyền và plasmid có thể được truyền theo cơ chế sau:

 Biến nạp

 Tải nạp

 Tiếp hợp

 Chuyển vị

1.9 Cơ chế đề kháng kháng sinh của Enterobacter

- Enterobacter co khả năng tiết nhiều loại men beta-lactamse chúng làm bất hoạt các thuốc nhóm beta-lactam bằng cách phá hủy nối amide của vòng beta-lactam [13, 14]

- Enterobacter có một lớp vỏ ngoài cùng có vai trò như một hàng rào che chở cho các PBP nằm ở bên trong, ngăn cản sự khuếch tán kháng sinh vào bên trong.Ngoài ra Enterobacter có khả năng giảm kích thước lỗ hoặc số lượng lỗ khi tăng tổng hợp men beta-lactam [15, 16]

- Biến đổi vị trí gắn kết:

+ Biến đổi các protein liên kết với penicillin

+ Biến đổi vị trí gắn kết ribosome

+ Biến đổi men DNA-gyrase và men toiposomerase

+ Biến đổi các tiến chất ở thành tế bào

+ Biến đổi enzyme đích

- Kháng sinh không thể đến đích tác dụng do khả năng bơm đẩy chủ động của enterobacter [13, 14, 16]

- Enterobacter có khả năng sinh men cephalosporinases bậc cao từ nhiễm sắc thể (men beta-lactam tuyt AmpC) vì thế chúng gây đề kháng rất cao với các thuốc KS nhóm lactamines [12, 16, 17]

1.10 Biện pháp hạn sự đề kháng vi khuẩn

Kháng sinh là chất dùng ức chế sự phát triển của vi khuẩn hoặc tiêu diệt vi khuẩn ngay ở nồng độ thấp Kháng sinh được dùng trong các bệnh nhiễm trùng hoặc điều trị dự phòng những bệnh có khả năng lây dịch hoặc dự phòng trong phẫu thuật [6]

Việc điều trị bằng kháng sinh bên cạnh những mặt hữu ích thì còn có rất nhiều tác hại xấu nếu chúng ta không sử dụng theo đúng chỉ định Hạn chế tác hại khi sử dụng kháng sinh một cách tùy tiện, cụthể là hạn chế hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn, chúng ta cần thực hiện đúng những quy tắ sau:

+ Chỉ dùng kháng sinh điều trị những bệnh nhiễm vi khuẩn (không dùng kháng sinh điều trị bệnh do vi rus)

+ Ngay từ đầu chỉ lên dùng kháng sinh có phổ hẹp

+ Khi đã chọn được kháng sinh thì phải dùng đủ liều lượng đủ thời gian + Hạn chế lây lan mầm bệnh trong đó cả vi khuẩn kháng thuốc bằng cách đặt khâu vô trùng lên hàng đầu

+ Mỗi cơ sở y tế có chương trình giám sát thường xuyên hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn

+ Nghiêm cấm sử dụng kháng sinh tràn lan trong chăn nuôi và giám sát chặt chẽ và việc sử dụng kháng sinh trong thú y

+ Sử dụng kháng sinh có tác dụng trong những bệnh nhiễm trùng có nhiều vi khuẩn hợp đòng gây bệnh (thường gặp trong đa chấn thương, viêm tủy xương…) Đối với vi khuản kháng đa kháng sinh thì cần có sự kết hợp thuốc kháng sinh

Có hai phương pháp sử dụng kháng sing trong điều trị:

- Sử dụng kháng sinh mới: chỉ áp dụng cho trường hợp nhiễm khuẩn nặng và kéo dài

- Sử dụng kháng sinh lactam kết hợp với chất chống men lactamase

β-Các chất ức chế β- lactamase là: Sulbactam, Clavlanic acid, Tazobactam.Các chất này sẽ gắn với β-lactamase và làm bất hoạt men này nhờ vậy mà kháng sinh có thể phát huy tác dụng Ngoài ra, chúng ta có thể trực tiếp gắn với PBPs (penicillin biding protein) tăng cường hoạt động của kháng sinh phối hợp

Một số β-lactamase/β-lactamase Inhibobitors: Ampicillin-Sulbactam; Amocillin-Clavularicasid; Cefoperazone-Sulbactam; Ticarcilline-Clavulanic acid; Piperacillin-Tazobactam C [8]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- 305 bệnh phẩm bao gồm: Dịch màng phổi, dịch âm đạo, nước tiểu, dịch não tủy đờm, mủ,dịch tỵ hầu… của một số bệnh nhân đến khám và điều trị tại Bệnh viện Đa khoa trung ương Thái Nguyên

- Chủng Enterobacter phân lập được từ các bệnh phẩm từ bệnh viện

- Máy đặt và khoanh giấy kháng sinh Thụy Điển

- Nước muối NaCl 9‰

- Huyết tương thỏ theo tỷ lệ 1ml máu: 0,35ml Natrixitrat, ly tâm lấy phần huyết tương ở trên

- Nước oxy già

- Thuốc nhuộm Gram: Thuốc nhuộm tím Gentian, dung dịch lugol, cồn 90º, dung dịch fucsin kiềm

2.3 Môi trường nuôi cấy, phân lập, xác định tính chất sinh hóa và làm kháng sinh đồ

Môi trường thạch thường, môi trường thạch máu, môi trường Hinton, môi trường Kligler, môi trường Simmons Xitrat, môi trường Clark-Lubs, môi trường thạch mềm, môi trường Mannit

+ Đổ môi trường ra các đĩa peptri

- Yêu cầu môi trường: Thạch phải tan đều, môi trường không quá cứng hoặc quá mềm pH : 7,4-7,6

 Môi trường thạch máu

- Thành phần:

+ Thạch thường 250ml + Máu thỏ đã tơ huyết 15ml

- Cách pha chế:

+ Đun nóng chảy 250ml thạch thường đựng trong bính cầu, để nguội khoảng 55 -66

+ Cho 15ml máu thỏ vào bình thạch

+ Lấy tay lắc xoay tròn cho máu tan đều

+ Đổ môi trường vào đĩa peptri

-Yêu cầu môi trường: Môi trường phải có màu đỏ tươi, mịn đều, không được ngả màu chocolate (máu đã bi chín), không được có những cục thạch trắng nhỏ (thạch chưa tan hết đã cho máu vào), pH: 7,4-7,6

- Cách pha chế:

+ Cân đong đầy đủ các thành phần của môi trường

+ Cho thạch vào nước đun sôi, khuấy đều liên tục tới khi tan hoàn toàn + Lần lượt cho them các hóa chất vào để hòa tan

+ Điều chỉnh pH 7,4 rồi thêm 6ml dung dịch đỏ phenol 0,5%, khuấy đều + Phân phối ra ống nghiệm 12ml, mỗi ống 3ml, hấp ở 110 trong 30 phút + Lấy ra để môi trường năm nghiêng sao cho mặt nghiêng dài khoảng 2cm

 Môi trường Simmons Xitrat

+ Cân đong đầ đủ các thành phần của môi trường vào bình cầu

+ Đun sôi nhỏ lửa, khuấy đều cho tới khi tan hết

+ Điều chỉnh pH=7,2 cho thêm dung dịch xanh bromothymol, môi trường có màu xanh lá cây

+ Phân phối ra ống nghiệm 12ml, mỗi ống 3ml

+ Hấp 110 trong 30 phút, đem ra để nghiêng cho môi trường đông lại

- Cách pha chế:

+ Cân đong đủ các thành phần vào bình cầu

+ Đun sôi để hòa tan các chất, điều chỉnh pH=7,5

+ Lọc qua giấy lọc phân phối vào ống nghiệm 12ml, mỗi ống 3ml + Hấp 110 trong 30 phút

+ Cân đong đủ các thành phần của môi trường vào bình cầu

+ Đun cách thủy, khuấy đều để hòa tan các chất, điều chỉnh pH=7,6 + Phân phối ra ống nghiệm 12ml, mỗi ống 3ml