Nghiên cứu bào chế Nano Doxorubicin đa chức năng

Header Page of 116 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC LÊ THỊ MỸ HẠNH NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NANO DOXORUBICIN ĐA CHỨC NĂNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HÀ NỘI – 2017 Footer Page of 116 Header Page of 116 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC LÊ THỊ MỸ HẠNH NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NANO DOXORUBICIN ĐA CHỨC NĂNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC KHÓA: QH.2012.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS HÀ PHƯƠNG THƯ PGS TS DƯƠNG THỊ LY HƯƠNG HÀ NỘI - 2017 Footer Page of 116 Header Page of 116 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Dương Thị Ly Hương TS Hà Phương Thư, hai cô tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ trình nghiên cứu thực đề tài Hai cô động viên cho hướng giải vấn đề, để hoàn thành mục tiêu đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ths Lê Thị Thu Hương, chị cho lời khuyên bổ ích suốt trình nghiên cứu Tôi xin cảm ơn anh, chị làm việc phòng Nano Y sinh, Viện Khoa học vật liệu, Viện hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam, người nhiệt tình giúp đỡ để hoàn thành khóa luận Cuối xin chân thành cảm ơn thầy cô anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Bào chế - Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ trình nghiên cứu Hà Nội ngày 09 tháng 06 năm 2017 Sinh viên Lê Thị Mỹ Hạnh Footer Page of 116 Header Page of 116 DANH MỤC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT % GP Phần trăm giải phóng AD Alginat - doxorubicin ADFo Alginat – doxorubicin – acid folic ADR Phản ứng có hại thuốc Alg Alginat CS% Phần trăm tế bào sống sót DLS Tán xạ laze ánh sáng động DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimethyl Sulfoside DOX Doxorubicin ECG Điện tâm đồ EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride FAD Fe3O4 – alginat - doxorubicin FADF Fe3O4 – alginat – doxorubicin- acid folic FESEM Kính hiển vi điện tử quét- phát xạ trường (Field Emission Scanning Electron Microscope) HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao IC50 Nồng độ thuốc ức chế 50% đối tượng thử FTIR Phổ hồng ngoại KTTP Kích thước tiểu phân MEME Minimum Essential Medium with Eagle’s salt MNP Hạt nano sắt từ (Magnetic nano particles) NHS N-hydroxysuccinimide PSF Penicillin- Streptomycin sulfate - Fungizone SRB Sulfo Rhodamine B TCA Trichloro Acetic acid Footer Page of 116 Header Page of 116 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung hệ nano 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Ứng dụng công nghệ nano lĩnh vực y dược 1.2.Tổng quan doxorubicin 1.2.1 Cấu trúc hóa học 1.2.2 Tính chất lí hóa 1.2.3.Định tính 1.2.4 Định lượng 1.2.5 Dược lí, chế tác dụng định 1.2.6 Dược động học 1.2.7 Tác dụng không mong muốn 1.2.8 Các dạng thuốc chứa doxorubicin 1.3 Chất mang thuốc polyme alginat 1.3.1 Đặc điểm cấu trúc 1.3.2 Tính chất natri alginat 1.3.3 Ứng dụng ngành dược 1.4 Tác nhân hướng tế bào ung thư acid folic: 1.4.1 Công thức hóa học 1.4.2 Tính chất lý hóa 10 1.4.3 Ứng dụng acid folic bào chế dạng thuốc hướng đích 10 1.5 Hạt nano sắt từ ứng dụng bào chế thuốc sinh học: 10 1.5.1 Công thức hóa học oxid sắt từ 10 1.5.2 Tính chất 10 1.5.3 Ứng dụng hạt nano oxid sắt từ vào liệu pháp tăng thân nhiệt điều trị ung thư 11 1.5.4 Các kĩ thuật chế tạo hạt nano oxid sắt từ 11 1.5.5 Ổn định hạt nano oxid sắt từ 12 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 Footer Page of 116 Header Page of 116 2.1 Đối tượng 13 2.2 Nguyên liệu, hóa chất 13 2.3 Thiết bị 14 2.4 Phương pháp nghiên cứu: 14 2.4.1 Phương pháp chế tạo hệ dẫn thuốc 14 2.4.2 Phương pháp xác định đặc trưng lí hóa 16 2.4.3 Phương pháp đánh giá hiệu suất mang thuốc mức giải phóng doxorubicin in vitro 18 2.4.4 Phương pháp đánh giá khả gây độc tế bào 19 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Các đặc trưng hóa lý vật liệu 21 3.1.1 Phổ hồng ngoại 21 3.1.2 Hình dạng kích thước 22 3.1.3 Độ bền kích thước hạt môi trường lỏng 24 3.1.4 Khả đốt nhiệt cảm ứng 27 3.2 Hiệu suất mang thuốc, khả giải phóng hệ môi trường pH 5,5 7,4; tác dụng in vitro hệ tế bào thường Vero dòng tế bào ung thư Hep – G2, Hela, LU – 28 3.2.1 Hiệu suất mang doxorubicin hệ dẫn 28 3.2.2 Khả giải phóng hệ dẫn môi trường pH 5,5 7,4 28 3.2.3 Tác dụng in vitro dòng tế bào thường Vero dòng tế bào ung thư Hep – G2, Hela, LU – 32 KẾT LUẬN 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 Footer Page of 116 Header Page of 116 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1: Đặc trưng cấu trúc alginat: Hình 2: Sơ đồ phản ứng tạo amid có xúc tác EDC NHS Hình 3: Sơ đồ chế tạo hệ 15 Hình 4: Hệ thí nghiệm đốt nóng cảm ứng từ (a) minh hoạ bố trí thí nghiệm đốt nóng cảm ứng từ (b) 17 Hình 5: Phổ IR DOX, AD, ADFo, acid folic alginat 21 Hình 6: Đồ thị so sánh phổ IR FAD, FADFo Fe3O4 22 Hình 7: Ảnh FESEM vật liệu FA 23 Hình 8: Ảnh FESEM vật liệu: 23 Hình 9: Sự phân bố kích thước tiểu phân chất lỏng mẫu FA 24 Hình 10: Sự phân bố kích thước tiểu phân chất lỏng mẫu AD 24 Hình 11: Sự phân bố kích thước tiểu phân chất lỏng mẫu ADFo 25 Hình 12: Sự phân bố kích thước tiểu phân chất lỏng mẫu FAD 25 Hình 13: Sự phân bố kích thước tiểu phân chất lỏng mẫu FADF 25 Hình 14: Khả đốt nhiệt FAD Hình 15: Khả đốt nhiệt FADF 27 Hình 16: So sánh khả đốt nhiệt mẫu FAD mg/ml FADF mg/ml 27 Hình 17: Đồ thị % giải phóng DOX hệ pH 7,4 30 Hình 18: Đồ thị % giải phóng DOX hệ pH 5,5 30 Hình 19: Đồ thị so sánh % giải phóng DOX AD, ADFo pH 7, 5,5 31 Hình 20: Đồ thị so sánh % giải phóng DOX FAD FADF pH 7,4 5,5 31 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Kích thước trung bình hạt Zeta phân bố chất lỏng 26 Bảng 2: Hiệu suất mang thuốc hệ 28 Bảng 3: % giải phóng DOX môi trường pH 5,5 28 Bảng 4: % giải phóng DOX môi trường pH 7,4: 29 Bảng 5: Giá trị IC50 hệ 32 Footer Page of 116 Header Page of 116 MỞ ĐẦU Ung thư bệnh gây tử vong hàng đầu giới Theo ước tính Hiệp hội quốc tế phòng chống bệnh ung thư năm giới có khoảng 14,1 triệu người mắc bệnh ung thư nửa số có triệu người nước kinh tế phát triển, có Việt Nam Đối phó với bệnh nguy hiểm này, có nhiều thuốc chữa bệnh ung thư đời Doxorubicin (DOX) hoạt chất sử dụng phổ biến Tuy nhiên, bào chế dạng qui ước, DOX gây nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng, có kích thước hạt nhỏ, phân bố thuốc đến tế bào lành tế bào ung thư Do đó, việc nghiên cứu, phát triển doxorubicin thành hệ phân phối thuốc hướng đích xu tất yếu việc điều trị bệnh ung thư Thuốc hướng đích phát triển dựa hai chế Cơ chế thứ nhắm đích bị động, tạo hệ dẫn thuốc có kích thước nano, vào mô ung thư mô có đường kính mao mạch lớn, mà không vào mao mạch nhỏ có mô lành Nhờ tính tương thích sinh học cao, dễ phân hủy sinh học, kích thước phân tử lớn nên phân tử polyme alginat ứng dụng rộng rãi để làm chất mang hệ phân phối thuốc nano [1],[ 16] Cơ chế thứ hai nhắm đích chủ động Các nhà khoa học gắn lên hệ tác nhân hướng đích, có liên kết đặc hiệu với thụ thể có bề mặt tế bào ung thư Acid folic tác nhân sử dụng hiệu hệ phân phối thuốc [5] Bên cạnh đó, việc gắn lên hệ hạt nano oxid sắt từ, sau dùng từ trường tác động vào định hướng thuốc tập trung vào vùng cần điều trị Ngoài khả hướng đích, hạt nano oxid sắt từ làm tăng nhiệt độ khối u [10], nhờ mà hỗ trợ tác dụng điều trị bệnh kết hợp với doxorubicin Dựa bốn yếu tố trên, với mong muốn tạo hệ phân phối thuốc hướng đích, tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu bào chế nano doxorubicin đa chức ” Mục tiêu đề tài: Chế tạo hệ dẫn thuốc cấu trúc nano đa chức từ alginat, doxorubicin, acid folic Fe3O4 Đánh giá hiệu suất mang thuốc, khả giải phóng doxorubicin hệ môi trường pH 5,5 7,4; đánh giá tác dụng in vitro hệ tế bào thường Vero dòng tế bào ung thư : Hep – G2, Hela, LU-1 Footer Page of 116 Header Page of 116 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung hệ nano 1.1.1 Định nghĩa Công nghệ nano công nghệ nghiên cứu, phát triển sử dụng vật liệu siêu nhỏ kích thước nanomet, đồng thời khai thác đặc tính tượng xuất vật chất kích thước nano [19] 1.1.2 Ứng dụng công nghệ nano lĩnh vực y dược Trong thập niên gần đây, công nghệ nano sử dụng công cụ để nghiên cứu phát triển dạng thuốc mới, cách dùng cho dược chất có sẵn, qua khắc phục hạn chế dược chất dạng thuốc truyền thống tan, không bền, sinh khả dụng thấp, thời gian lưu hệ tuần hoàn ngắn… Trong điều trị ung thư, ứng dụng công nghệ nano để chế tạo thuốc tác dụng đích 1.2.Tổng quan doxorubicin 1.2.1.Cấu trúc hóa học Công thức phân tử: C27H29NO11.HCl Khối lượng phân tử: 579,99 Tên khoa học: (8S,10S)-10-{[(2R,4S,5S,6S)-4-amino-5-hydroxy-6- methyloxan-2-yl]oxy}-6,8,11-trihydroxy-8-(2-hydroxyacetyl)-1-methoxy5,7,8,9,10,12-hexahydrotetracene-5,12-dione [17] Công thức cấu tạo: [17] Footer Page of 116 Header Page 10 of 116 1.2.2.Tính chất lí hóa Ở nhiệt độ phòng, doxorubicin tinh thể hay bột vô định hình, màu vàng cam, không mùi, dễ tan nước, methanol, acetonitrin, tetrahydrofuran Khi phân tán nước có kích thước < 10 nm Doxorubicin không tan chloroform, aceton, ethyl ether, benzen, ether dầu dung môi hữu khác [17] Dung dịch 5mg/ml nước có pH 4,5 – 6, màu đỏ Ở pH > 9, DOX chuyển thành dạng base không bền, tạo dung dịch có màu tím Do đó, DOX có vai trò chất thị màu [17] Doxorubicin chất nhạy cảm với ánh sáng nồng độ thấp Tuy nhiên nồng độ điều trị doxorubicin coi không bị phân hủy đáng kể ánh sáng không cần có biện pháp riêng để bảo vệ DOX khỏi ánh sáng [4] DOX hấp thụ ánh sáng vùng UV-VIS 1.2.3.Định tính Doxorubicn định tính phương pháp sắc kí lớp mỏng dùng hệ dung môi 1-butanol/ acid acetic/ nước Ngoài dùng phương pháp HPLC phương pháp đo quang UV- VIS để phát có mặt DOX [15] 1.2.4 Định lượng DOX định lượng phương pháp đo quang bước sóng 233 nm 480 nm, phương pháp HPLC [15] 1.2.5 Dược lí, chế tác dụng định Cơ chế tác dụng doxorubicin chưa rõ ràng, nhiều nhà khoa học đồng ý với giả thiết rằng: DOX xen vào cấu trúc xoắn kép ADN vị trí cặp base Guanin – Cytosin tạo phức hợp bền vững gây ức chế ADN phụ thuộc vào enzyme ARN- polymerase, làm rối loạn chức trình tổng hợp ADN khiến tế bào ung thư không nhân lên DOX gây gián đoạn mạnh chu kỳ phát triển tế bào giai đoạn phân bào S giai đoạn gián phân nhiên tác dụng tới giai đoạn khác chu kỳ phát triển tế bào [4],[ 8] Được định chủ yếu trường hợp: ung thư bàng quang, ung thư phổi, ung thư vú, ung thư dày, ung thư buồng trứng, ung thư tinh hoàn, u lympho dạng Hodgkin không Hodkgin, sarcoma xương mô mềm… DOX dùng Footer Page 10 of 116 Header Page 29 of 116 Hình 6: Đồ thị so sánh phổ IR FAD, FADFo Fe3O4 Quan sát tiếp phổ FAD FADF, đỉnh giống với phổ AD, ADFo, thấy xuất đỉnh 586 cm-1, đỉnh đặc trưng cho liên kết Fe – O (605 cm-1) phân tử Fe3O4 Phân tích chứng tỏ có xuất Fe3O4 hai mẫu FAD FADF Kết luận: Đã chế tạo thành công hệ phân phối thuốc, có thành phần sau:  AD: aginate – doxorubin  ADFo: alginat – doxorubicin – acid folic  FAD: Fe3O4 - alginat – doxorubicin  FADF: Fe3O4 - alginat – doxorubicin - acid folic 3.1.2 Hình dạng kích thước 22 Footer Page 29 of 116 Header Page 30 of 116 Hình 7: Ảnh FESEM vật liệu FA Hình ảnh FESEM FA ( Fe3O4 bọc Aginate) cho thấy hệ tạo thành hạt nano oxid sắt từ có kích thước trung bình từ 30 - 40 nm, phù hợp để ứng dụng việc chế tạo hệ phân phối thuốc cấu trúc nano (b) (a) (c) (d) Hình 8: Ảnh FESEM vật liệu: (a) AD (b) ADFo (b) FAD (d) FADF 23 Footer Page 30 of 116 Header Page 31 of 116 Kết thu từ ảnh FESEM hình cho thấy, mẫu AD, ADFo, FAD FADF dạng rắn có dạng hình cầu độ phân bố tương đối đồng đều, kích thước hạt từ 80 – 100 nm 3.1.3 Độ bền kích thước hạt môi trường lỏng Hình 9: Sự phân bố kích thước tiểu phân chất lỏng mẫu FA Hình 10: Sự phân bố kích thước tiểu phân chất lỏng mẫu AD 24 Footer Page 31 of 116 Header Page 32 of 116 Hình 11: Sự phân bố kích thước tiểu phân chất lỏng mẫu ADFo Hình 12: Sự phân bố kích thước tiểu phân chất lỏng mẫu FAD Hình 13: Sự phân bố kích thước tiểu phân chất lỏng mẫu FADF 25 Footer Page 32 of 116 Header Page 33 of 116 Bảng 1: Kích thước trung bình hạt Zeta phân bố chất lỏng Mẫu FA AD ADFo FAD FADF Kích thước trung bình (nm) 54 331 305 279 218 PDI 0,112 0,425 0,275 0,185 0,114 Thế zeta (mV) -42 -12,7 -29,7 -39 -34,5 Từ bảng cho thấy mẫu FA có kích thước hạt nhỏ, độ bền, độ ổn định cao, thích hợp để ứng dụng làm hệ phân phối thuốc nano Trong hệ dẫn tạo thành, hệ AD có kích thước hạt lớn (331 nm), số PDI cao (0,425) cho thấy hạt mẫu có kích thước không đồng Hệ Zeta thấp (-12,7 mV), điều chứng tỏ rằng, phân tán nước, mẫu AD ổn định bền Mẫu FADF FAD có kích thước hạt nhỏ (218 nm 279 nm), số PDI thấp (0,114 0,185) cho thấy hệ tạo thành có kích thước hạt đồng Bên cạnh đó, hệ Zeta lớn ( -34,5 -39 mV) nên khẳng định FADF FAD hệ ổn định bền vững, phù hợp với việc ứng dụng làm thuốc để chữa bệnh cho người Các mẫu có Fe3O4 FAD, FADF có kích thước tiểu phân nhỏ độ ổn định hẳn mẫu Fe3O4 AD ADFo Điều khẳng định Fe3O4 có vai trò làm ổn định hệ phân phối thuốc mà thành phần có doxorubicin alginat Nhìn vào bảng số liệu ta thấy, kích thước hạt mẫu đo phổ tán xạ laze động có kích thước lớn so với ảnh chụp FESEM Điều giải thích sau: hạt thuốc bọc polyme phân tán môi trường nước, polyme ưa nước tương tác với nước làm cho hạt có kích thước lớn Kích thước hạt mẫu sau bọc chụp ảnh FESEM thường nhỏ so với kích thước hạt chụp phương pháp tán xạ laze động nhóm tác giả công bố thời gian qua [7],[ 9] Ở trạng thái rắn trạng thái lỏng phân tán dung dịch, bốn hệ có kích thước dao động từ 80 – 331 nm, nằm vùng kích thước nano mục tiêu thứ đề tài Kết luận: Đã chế tạo thành công hệ nano doxorubicin 26 Footer Page 33 of 116 Header Page 34 of 116 3.1.4 Khả đốt nhiệt cảm ứng 55 FAD mg/ml FAD mg/ml FAD mg/ml 50 60 55 45 Nhiet (oC) Nhiet 50 40 35 45 40 35 30 30 25 25 -200 200 400 600 20 -200 800 1000 1200 1400 1600 Thoi gian 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Thoi gian (s) Hình 14: Khả đốt nhiệt FAD Hình 15: Khả đốt nhiệt FADF 55 FAD 2mg/ml 50 Nhiet (oC) 45 40 35 30 25 -200 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Thoi gian (s) Hình 16: So sánh khả đốt nhiệt mẫu FAD mg/ml FADF mg/ml Quan sát hình 14,15,16 cho thấy vật liệu FAD FADF có khả tạo nhiệt cảm ứng tỉ lệ thuận theo nhiệt độ thời gian Tuy nhiên, vật liệu FADF có khả tạo nhiệt cảm ứng tốt vật liệu FAD Kết luận: FAD FADF hai hệ đa chức năng, kết hợp hóa trị liệu (doxorubicin) nhiệt trị liệu (Fe3O4) hệ phân phối thuốc điều trị ung thư 27 Footer Page 34 of 116 Header Page 35 of 116 3.2 Hiệu suất mang thuốc, khả giải phóng hệ môi trường pH 5,5 7,4; tác dụng in vitro hệ tế bào thường Vero dòng tế bào ung thư Hep – G2, Hela, LU – 3.2.1 Hiệu suất mang doxorubicin hệ dẫn Bảng 2: Hiệu suất mang thuốc hệ Mẫu AD ADFo FAD FADF Hiệu suất mang thuốc (%) 82,7 89,1 85,6 88,4 Hiệu suất mang doxorubicin hệ dẫn tạo thành cao Hệ AD có hiệu suất mang thuốc thấp hệ ADFo có hiệu suất mang thuốc cao Kết lí giải hệ AD hình thành liên kết amid gắn phân tử DOX alginat lại với nhau, nên hiệu suất không cao hệ ADFo có thêm acid folic tạo thêm cầu nối gắn kết với phân tử DOX Ngoài ra, với có mặt phân tử Fe3O4 làm tăng hiệu suất mang thuốc so với hệ AD có alginat doxorubicin 3.2.2 Khả giải phóng hệ dẫn môi trường pH 5,5 7,4 Bảng 3: % giải phóng DOX môi trường pH 5,5 Mẫu Thời gian (h) AD FAD FADF ADFo 0 0 15,2 10,7 7,5 7,1 21,3 16,7 11,7 10,8 12 26,1 20,7 14,4 13,4 18 31,6 25,3 17,9 16,3 24 35,9 29,7 19,9 18,2 36 38 32,5 24,2 22,4 48 40,2 34,3 25,6 23,8 28 Footer Page 35 of 116 Header Page 36 of 116 Bảng 4: % giải phóng DOX môi trường pH 7,4: Mẫu AD FAD FADF ADFo 0 0 7,8 6,9 5,4 5,1 11,8 9,4 8,5 7,9 12 17,7 13,5 10,9 9,6 18 21,4 16,3 12,4 13,2 24 24,3 18,4 14,7 15,6 36 29,4 23,1 17,4 16,8 48 31,4 24,5 19,5 17,8 Thời gian (h) 29 Footer Page 36 of 116 Header Page 37 of 116 35 30 %GP 25 20 15 10 10 20 30 40 50 Thoi gian (h) Hình 17: Đồ thị % giải phóng DOX hệ pH 7,4 40 35 % GP 30 25 20 15 10 10 20 30 40 50 Thoi gian Hình 18: Đồ thị % giải phóng DOX hệ pH 5,5 30 Footer Page 37 of 116 Header Page 38 of 116 40 35 % GP (%) 30 25 20 15 10 10 20 30 40 50 Thoi gian (Gio) Hình 19: Đồ thị so sánh % giải phóng DOX AD, ADFo pH 7, 5,5 30 25 % GP (%) 20 15 10 10 20 30 40 50 Thoi gian (Gio) Hình 20: Đồ thị so sánh % giải phóng DOX FAD FADF pH 7,4 5,5 Từ kết cho thấy: Trong môi trường pH 5,5 7,4, lượng doxorubicin từ hệ dẫn tăng dần theo thời gian Sau 48 giờ, pH 5,5 pH 7,4 phần trăm doxorubicin giải phóng 31 Footer Page 38 of 116 Header Page 39 of 116 mẫu dao động từ 17,8 – 40,2 % Như khả giải phóng chậm, từ từ liên tục hệ dẫn thuốc giống việc chia nhỏ liều doxorubicin truyền kéo dài, giúp làm giảm tác dụng không mong muốn thuốc Mô hình giải phóng thuốc hệ hai môi trường pH giống nhau: giải phóng nhanh, tăng dần vòng đầu, sau tốc độ giải phóng thuốc chậm dần Hệ dẫn thuốc AD có khả giải phóng thuốc nhanh nhất, sau đến FAD, FADF giải phóng chậm hệ dẫn ADFo Tại môi trường pH tế bào ung thư – pH 5,5, tốc độ giải phóng doxorubicin hệ nhanh hẳn so với môi trường pH sinh lý – 7,4 Kết nghiên cứu “pH-sensitive polymeric micelles formed by doxorubicin conjugatedprodrugs for co-delivery of doxorubicin and paclitaxel” tác giả Yakun Ma, Xiaohui Fan Lingbing Li [2] Có thể lý giải kết alginat gắn với DOX thông qua liên kết amid NHCO Ở môi trường pH 5,5, trình thủy phân amid thành alginat DOX diễn nhanh so với môi trường pH 7,4 Do đó, lượng doxorubicin giải phóng môi trường pH 5,5 lớn môi trường pH 7,4 Kết với mục tiêu chế tạo hệ dẫn thuốc hướng đích, giải phóng thuốc nhanh môi trường tế bào ung thư, giải phóng chậm môi trường tế bào lành 3.2.3 Tác dụng in vitro dòng tế bào thường Vero dòng tế bào ung thư Hep – G2, Hela, LU – Bảng 5: Giá trị IC50 hệ Hep- G2 Hela LU-1 Vero AD 3,57 4,66 3,17 37,63 ADFo 3,01 4,02 3,3 13,4 FAD 16,24 28,11 (-) (-) FADF 6,21 14,62 (-) (-) DOX 2,4 0,35 Dòng TB Mẫu 32 Footer Page 39 of 116 10,34 Header Page 40 of 116 Nhận xét: Các mẫu AD ADFo biểu hoạt tính gây độc cho dòng tế bào ung thư (Hep-G2, HeLa, LU-1), gây độc cho dòng tế bào thường (Vero) Các mẫu FAD, FADF biểu hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư (HepG2, HeLa), không gây độc cho dòng tế bào LU-1 tế vào thường (Vero) Bốn hệ tạo thành có hiệu gây độc dòng tế bào ung thư Hep – G2 Hela Bên cạnh đó, thấy acid folic đóng vai trò quan trọng việc làm giảm giá trị IC50 mẫu có mặt acid Các mẫu chứa acid folic ( ADFo, FADF), có giá trị IC50 giảm từ 1,15 – 2,8 lần so với mẫu (AD, FAD) Điều phù hợp với lí thuyết cho acid folic giúp làm tăng khả hướng đích, gây độc tế bào ung thư Trong thí nghiệm này, với có mặt DOX, alginat không làm thay đổi đặc tính hướng đích acid folic Khi thử nghiệm dòng tế bào thường Vero, thấy IC50 hệ bào chế AD, ADFo lớn so với doxorubicin tự Như vậy, hệ AD, ADFo có độc tính thấp so với doxorubicin dạng tự Và đặc biệt, hệ FAD, FADF không gây độc dòng tế bào Hai phân tích chứng tỏ tính an toàn hệ dòng tế bào thường Vero Kết luận: Bốn hệ tạo thành cho thấy đặc tính hướng đích hiệu quả: an toàn với tế bào thường, có tác dụng gây độc dòng tế bào ung thư 33 Footer Page 40 of 116 Header Page 41 of 116 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu chi tiết thảo luận thích hợp, số kết luận rút sau: Đã chế tạo thành công hệ nano doxorubicin đa chức năng: AD, ADFo, FAD, FADF Đánh giá hiệu suất mang thuốc khả giải phóng thuốc hệ pH 5,5 7,4 Bên cạnh đó, đánh giá tác dụng in vitro bốn hệ tạo thành: có tính hướng đích hiệu quả, an toàn tế bào thường, có tác dụng gây độc dòng tế bào ung thư 34 Footer Page 41 of 116 Header Page 42 of 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO Z Ahmad cộng (2006), "alginate nanoparticles as antituberculosis drug carriers: formulation development, pharmacokinetics and therapeutic potential", Indian J Chest Dis Allied Sci 48(3), tr 171-6 Y Ma, X Fan L Li (2016), "pH-sensitive polymeric micelles formed by doxorubicin conjugated prodrugs for co-delivery of doxorubicin and paclitaxel", Carbohydr Polym 137, tr 19-29 L H Reddy cộng (2012), "Magnetic nanoparticles: design and characterization, toxicity and biocompatibility, pharmaceutical and biomedical applications", Chem Rev 112(11), tr 5818-78 S Teletchea cộng (2014), "Novel RANK antagonists for the treatment of bone-resorptive disease: theoretical predictions and experimental validation", J Bone Miner Res 29(6), tr 1466-77 J Xu cộng (2016), "Characterization and evaluation of a folic acid receptor-targeted cyclodextrin complex as an anticancer drug delivery system", Eur J Pharm Sci 83, tr 132-42 Phạm Thị Ngọc Bích (2014), Nghiên cứu tổng hợp Canxi Hydroxy Apatit alginat tách từ rong biển Nha Trang (Việt Nam, Luận văn thạc sĩ khoa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Rute F Domingos cộng (2009), "Characterizing Manufactured Nanoparticles in the Environment: Multimethod Determination of Particle Sizes", Environmental Science & Technology 43(19), tr 7277-7284 Dược thư Quốc gia Việt Nam (2009), Bộ Y tế, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Mikhail Y Berezin Guorong Sun, Jinda Fan, Hyeran Lee, Jun Ma, Ke Zhang, Karen L Wooley and Samuel Achilefu (2010), "Bright fluorescent nanoparticles for developing potential optical imaging contrast agents", Nanoscale, tr 548 - 558 10 Nguyễn Hoàng Hải (2009), "Ứng dụng nano từ tính oxit sắt", http://user.hus.edu.vn/nguyenhoanghai/system/app/pages/recentChanges, tr 11 Trần Đức Hậu (2014), Hóa dược tập 1, Nhà xuất Y học, Bộ Y tế 35 Footer Page 42 of 116 Header Page 43 of 116 12 Greg T Hermanson (2013), Chapter - Zero-Length Crosslinkers, Bioconjugate Techniques (Third edition), Academic Press, Boston, 259-273 13 a Teresinha G da Silva Iane B Vasconcelos, b Gardenia C G Milita˜o,c Thereza A Soares,d Nailton M Rodrigues,e Marcelo O Rodrigues,df Nivan B da Costa Jr.,e Ricardo O Freiree and Severino A Junior (2012), "Cytotoxicity and slow release of the anti-cancer drug doxorubicin from ZIF8", RSC Advance(2), tr 9437 - 9442 14 Lưu Mạnh Kiên (2008), Hạt nano từ tính Fe3O4: tính chất ứng dụng để đánh dấu tế bào xử lí nước bị nhiễm bẩn, Khóa luận tốt nghiệp đại học, Đại học công nghệ - Đại học quốc gia Hà Nội 15 TS Trần Đức Hậu PGS (2007), Hóa dược tập 2, Nhà xuất Y học, Bộ Y tế 16 Cristina de Castro Spadari, Luciana B Lopes Kelly Ishida (2017), "Potential Use of alginate-Based Carriers As Antifungal Delivery System", Frontiers in Microbiology 8, tr 97 17 Sweetman (2009), Martindale: the complete drug reference, Pharmaceutical Press, Everbest Printing Co Ltd 18 Mai Thị Thu Trang (2012), Study of preraration and release control Curcumin loaded magnetic conjugate of Fe3O4 nanoparticles encapsulated by alginate, Viện Khoa học vật liệu, Viện hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam 19 Phạm Thị Minh Huệ Võ Xuân Minh (2013), Kĩ thuật nano liposome ứng dụng dược phẩm mĩ phẩm, Bộ môn Bào chế, Đại học Dược Hà Nội, Tài liệu đào tạo sau đại học 20 Zhiping Zhang Si-Shen Feng (2006), "Nanoparticles of poly(lactide)/vitamin E TPGS copolymer for cancer chemotherapy: Synthesis, formulation, characterization and in vitro drug release", Biomaterials 27(2), tr 262-270 36 Footer Page 43 of 116 ... bệnh kết hợp với doxorubicin Dựa bốn yếu tố trên, với mong muốn tạo hệ phân phối thuốc hướng đích, tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu bào chế nano doxorubicin đa chức ” Mục tiêu đề tài: Chế tạo hệ dẫn...Header Page of 116 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC LÊ THỊ MỸ HẠNH NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NANO DOXORUBICIN ĐA CHỨC NĂNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC KHÓA: QH.2012.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN:... alginat để bảo vệ hạt nano 12 Footer Page 19 of 116 Header Page 20 of 116 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng Các hệ cấu trúc nano doxorubicin đa chức 2.2 Nguyên liệu,