Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin PEG hóa

ẶT VẤN Ề Hiện nay ung thƣ đang là một trong những bệnh nan y gây ra những thách thức vô cùng to lớn cho nền y học hiện đại. Đặc thù của thuốc điều trị ung thƣ là có độc tính rất cao với tế bào và gây ra rất nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng trên cơ thể con ngƣời. Vì vậy mà ngày càng có nhiều nghiên cứu nhằm mục đích nâng cao hiệu quả điều trị và cải thiện chất lƣợng cuộc sống cho các bệnh nhân. Ngay từ khi ra đời dạng bào chế liposome đã tạo bƣớc đột phá lớn trong điều trị ung thƣ do những đặc điểm ƣu việt của nó nhƣ khả năng mang thuốc, kiểm soát giải phóng thuốc và khả năng đƣa thuốc tới đích. Doxorubicin là một trong những thuốc chống ung thƣ đƣợc nghiên cứu khá sâu rộng trên thế giới và đã cho ra đời rất nhiều sản phẩm thƣơng mại nhƣ Doxil, Myocet. Tại Việt Nam, liposome mới đƣợc phát triển trong vài năm gần đây và trƣờng đại học Dƣợc là nơi đi tiên phong trong việc nghiên cứu về liposome doxorubicin. Các nghiên cứu bƣớc đầu đã đạt đƣợc những kết quả khích lệ, tuy nhiên cho đến thời điểm hiện tại mới chỉ dừng lại ở việc bào chế liposome quy ƣớc với 2 thành phần là phospholipid và cholesterol. Liposome quy ƣớc rất dễ bị bắt giữ bởi đại thực bào và nhanh chóng thanh thải khỏi hệ tuần hoàn. Chƣa có nghiên cứu nào về việc sử dụng dẫn chất polyme nhƣ PEG để tăng thời gian tuần hoàn và giảm tốc độ thanh thải của liposome. Hơn nữa các nghiên cứu cũng đang gặp khó khăn trong việc nâng cao độ ổn định cho chế phẩm. Để giải quyết các vấn đề này đề tài “Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin PE hóa” đƣợc thực hiện với hai mục tiêu chính: 1. Bào chế và khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng hỗn dịch liposome doxorubicin PEG hóa 2 mgml. 2. Theo dõi độ ổn định của liposome doxorubicin PEG hóa trong vòng 6 tháng

N Ô T Ị LAN

N N U O Ế LIPOSOME DOXORU N PE ÓA

K ÓA LUẬN TỐT N ỆP Ư SĨ

Người hướng dẫn:

1 ThS Nguyễn Văn Lâm

2 DS Lê Phương Linh

Nơi thực hiện:

Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội

NỘI – 2015

Bào Chế trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện để em hoàn thành khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới:

ThS Nguyễn Văn Lâm,

DS Lê Phương Linh

Là những người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khóa luận

Em cũng trân trọng cám ơn PGS.TS Phạm Thị Minh Huệ Cô đã đưa ra những

góp ý quan trọng để khóa luận của em được hoàn thiện hơn

Xin cảm ơn các thầy cô và anh chị kĩ thuật viên đã hỗ trợ em trong suốt quá trình nghiên cứu

Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã thường xuyên động viên, giúp đỡ để

em hoàn thành tốt đề tài của mình

Hà Nội, tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Ngô Thị Lan

1.1 Doxorubicin 2

1.1.1 Công thức, tính chất lý hóa 2

1.1.2 Dược động học, cơ chế tác dụng, chỉ định, các chế phẩm trên thị trường 2 1.2 Đại cương về liposome 3

1.2.1 Khái niệm, cấu tạo 3

1.2.2 Phân loại 4

1.2.3 Những nghiên cứu trong nước về liposome 8

1.3 Liposome biến đổi bằng cách PEG hóa 9

1.3.1 Khái niệm PEG hóa 9

1.3.2 Ưu, nhược điểm của liposome PEG hóa 9

1.3.3 Đặc tính của PEG 10

1.3.4 Ảnh hưởng của thành phần PEG lên liposome 11

1.3.5 Phương pháp gắn PEG vào liposome 13

1.3.6 Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin PEG hóa trên thế giới 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2 Nguyên vật liệu 16

2.1.3 Phương tiện nghiên cứu 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Phương pháp bào chế liposome doxorubicin 17

2.2.2 Phương pháp đánh giá liposome doxorubicin PEG hóa tạo thành 19

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 22

2.2.4 Điều kiện thí nghiệm 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn 23

3.3 Theo dõi độ ổn định của chế phẩm liposome doxorubicin PEG hóa 32

3.4 Bàn luận 37

3.4.1 Về lựa chọn thành phần vỏ lipid cho liposome 37

3.4.2 Về khảo sát một số yếu tố đến chất lƣợng liposome 37

3.4.3 Về độ ổn định chế phẩm liposome doxorubicin PEG hóa 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

2000)-1,2-distearoyl-8 EE Hiệu suất liposome hóa

9 EPR Hiệu ứng tăng tính thấm và thời gian lưu

15 LCL Long-circulating liposome - liposome tuần hoàn dài

16 LUV Large unilamellar vesicles - các liposome đơn lớp lớn

17 MPS Mononuclear phagocyte system - hệ đại thực bào đơn nhân

18 PDI Polydispersity index - chỉ số đa phân tán

19 PEG Polyethylen glycol

20

PEG-DSPE

1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phospho ethanolamin-N-Methoxy Polyethylene glycol

21 pHSLs [pH-sensitive (acidic-triggered) liposomes] - liposome nhạy

cảm với pH

22 PP Phosphat

26 TLs [Thermosensitive (heat-triggered) liposomes] - liposome nhạy

cảm với nhiệt

27 Tt/tt Thể tích/thể tích

ảng 3.1 Kết quả đo mật độ quang các mẫu dung dịch DOX ở bước sóng 233 nm và 481 nm (pH 4) 23

ảng 3.2 Độ ổn định của các công thức liposome chưa mang dược chất 25

ảng 3.3 Độ ổn định của công thức có 1 %mol DSPE-PEG2000………… 25

ảng 3.4 Độ ổn định của công thức có 5 %mol DSPE-PEG2000 ………… 26

ảng 3.5 Độ ổn định của công thức có 10 %mol DSPE-PEG2000… 26

ảng 3.6 Độ ổn định của mẫu có môi trường ngoài là HEPES pH 7,5 (HES) và Phosphat pH 7,5 (PP) 30

ảng 3.7 Công thức bào chế mẫu theo dõi độ ổn định 33

ình 1.2 Kích thước một số loại liposome 4

ình 3.1 Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ 23

Hình 3.2 Hình ảnh chụp TEM của ba công thức C1, C2, C3 27

ình 3.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và loại đệm tới hiệu suất liposome hóa 29

ình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hiệu suất liposome hóa của 2 công thức sử dụng môi trường ngoài HEPES 7,5 và phosphat 7,5 30 ình 3.5 Hình thức sau 28 ngày của hai mẫu HEPES 7,5 và phosphat 7,5 31

ình 3.6 Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của tá dược đẳng trương tới hiệu suất liposome hóa 32

ình 3.7 Đồ thị biểu diễn độ ổn định của công thức M1 sau 6 tháng 33

ình 3.8 Đồ thị biểu diễn độ ổn định của công thức M2 sau 6 tháng 34

ình 3.9 Đồ thị biểu diễn độ ổn định của công thức M3 sau 6 tháng 34

ình 3.10 Đồ thị so sánh sự thay đổi KTTP, PDI của 3 công thức sau 6 tháng 35

Hình 3.11 Đồ thị so sánh hiệu suất liposome hóa (EE%) 3 công thức sau 6 tháng 35

ình 3.12 Hình thức 3 công thức M1, M2, M3 sau 6 tháng 36

ẶT VẤN Ề

Hiện nay ung thư đang là một trong những bệnh nan y gây ra những thách thức

vô cùng to lớn cho nền y học hiện đại Đặc thù của thuốc điều trị ung thư là có độc tính rất cao với tế bào và gây ra rất nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng trên cơ thể con người Vì vậy mà ngày càng có nhiều nghiên cứu nhằm mục đích nâng cao hiệu quả điều trị và cải thiện chất lượng cuộc sống cho các bệnh nhân

Ngay từ khi ra đời dạng bào chế liposome đã tạo bước đột phá lớn trong điều trị ung thư do những đặc điểm ưu việt của nó như khả năng mang thuốc, kiểm soát giải phóng thuốc và khả năng đưa thuốc tới đích Doxorubicin là một trong những thuốc chống ung thư được nghiên cứu khá sâu rộng trên thế giới và đã cho ra đời rất nhiều sản phẩm thương mại như Doxil, Myocet

Tại Việt Nam, liposome mới được phát triển trong vài năm gần đây và trường đại học Dược là nơi đi tiên phong trong việc nghiên cứu về liposome doxorubicin Các nghiên cứu bước đầu đã đạt được những kết quả khích lệ, tuy nhiên cho đến thời điểm hiện tại mới chỉ dừng lại ở việc bào chế liposome quy ước với 2 thành phần là phospholipid và cholesterol Liposome quy ước rất dễ bị bắt giữ bởi đại thực bào và nhanh chóng thanh thải khỏi hệ tuần hoàn Chưa có nghiên cứu nào về việc sử dụng dẫn chất polyme như PEG để tăng thời gian tuần hoàn và giảm tốc độ thanh thải của liposome Hơn nữa các nghiên cứu cũng đang gặp khó khăn trong việc nâng cao độ

ổn định cho chế phẩm Để giải quyết các vấn đề này đề tài “Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin PE hóa” được thực hiện với hai mục tiêu chính:

1 Bào chế và khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng hỗn dịch liposome doxorubicin PEG hóa 2 mg/ml

2 Theo dõi độ ổn định của liposome doxorubicin PEG hóa trong vòng 6 tháng

hexopyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(2-hydroxyacetyl)-1 Tính chất: Tinh thể hay bột vô định hình màu vàng cam, không mùi Dung dịch 5

mg/ml có pH từ 4 - 5,5 Tan trong nước, methanol, acetonitril, tetrahydrofuran Không tan trong chloroform, aceton, ethyl ether, benzen, ether dầu [30]

Nhóm amino của doxorubicin có Pka là 8,15; doxorubicin bao gồm cấu trúc anthraquinon thân dầu với đường amin thân nước ở trạng thái bị proton hóa [11], [15]

Doxorubicin là chất nhạy cảm với ánh sáng ở nồng độ thấp Tuy nhiên, ở nồng độ

điều trị thì doxorubicin được cho là không bị phân hủy đáng kể bởi ánh sáng và không nhất thiết phải có biện pháp riêng để bảo vệ doxorubicin khỏi ánh sáng [30]

1.1.2 ược động học, cơ chế tác dụng, chỉ định, các chế phẩm trên thị trường

1.1.2.1 Dược động học

Sau khi tiêm tĩnh mạch doxorubicin nhanh chóng phân bố đến các mô phổi, gan, tim, lách, thận Doxorubicin bị chuyển hóa ở gan tạo thành doxorubicinol Khoảng 40 - 50% lượng doxorubicin bị đào thải qua mật trong 5 – 7 ngày ở dạng chưa chuyển hóa, 5% bị đào thải qua nước tiểu trong 5 ngày Doxorubicin không

qua được hàng rào máu não nhưng qua được nhau thai và bài tiết được qua tuyến sữa

Doxorubicin khi gắn với liposome PEG hóa có thời gian tồn tại trong vòng tuần hoàn kéo dài hơn và ít phân bố tới các mô hơn Liposome doxorubicin phân bố nhiều tới các mô ung thư có hệ mạch máu không bình thường [30]

1.1.2.2 Cơ chế tác dụng

Doxorubicin là một thuốc thuộc nhóm anthracyclin [3] Cơ chế tác dụng của doxorubicin đã được nghiên cứu sâu rộng Doxorubicin là một tác nhân xen vào giữa phân tử ADN và ức chế topo-isomerase II Doxorubicin hình thành gốc tự do,

từ đó gây peroxy hóa lipid và có thể phá hủy ADN bằng cách phá vỡ chuỗi đơn, chuỗi kép và làm tổn thương các base (purin và pyrimidin) Tuy nhiên người ta vẫn chưa chứng minh được anthracyclin tạo ra các gốc tự do ở trong nhân, do đó cơ chế này vẫn còn được tranh cãi [15], [31]

1.1.2.3 Chỉ định

Ung thư vú, u xương ác tính (sarcom xương) và u xương Ewing, u mô mềm, u khí phế quản, u lympho ác tính cả hai dạng Hodgkin và không Hodgkin, ung thư biểu

mô tuyến giáp (carcinoma tuyến giáp) Ung thư đường tiết niệu và sinh dục: ung thư

tử cung, ung thư bàng quang, ung thư tinh hoàn Khối u đặc ở trẻ em: Sarcom cơ vân, u nguyên bào thần kinh, u Wilm, bệnh leucemi cấp [1]

1.1.2.4 Các chế phẩm trên thị trường

Thuốc tiêm dung dịch doxorubicin 2 mg/ml: Adorucin, Adriamycin, Adrim

Thuốc tiêm liposome doxorubicin: Caelyx, Doxil, Lipo-dox, Myocet

Bột đông khô pha tiêm 10 mg, 20 mg, 50 mg, 150 mg: Adriblastina, Doxorubicina

1.2 ại cương về liposome

1.2.1 Khái niệm, cấu tạo

Là một hệ mang thuốc gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng tâm có kích thước thay đổi từ hàng chục nanomet đến hàng chục micromet [6], [7], [8], [25]

ình 1.2 Kích thước một số loại liposome [5]

1.2.2.2 Theo cấu tạo, thành phần

Liposome quy ước

Là liposome có cấu tạo lớp vỏ chủ yếu là phospholipid và cholesterol Liposome quy ước không được biến đổi bề mặt cũng như lớp vỏ nên chúng chỉ có chức năng nang hóa, bảo vệ dược chất bên trong, nếu đường dùng là tiêm tại chỗ thì liposome

có tác dụng giải phóng dược chất kéo dài [7], [27] Liposome quy ước có nhược

điểm là rất dễ bị bắt và phá hủy bởi các đại thực bào trong máu và hệ thống lưới nội

mô ở gan và lách; khả năng hướng tới đích tác dụng còn kém và thụ động chủ yếu phụ thuộc vào kích thước của liposome và khả năng đi qua khe hở thành mạch ở các

mô ung thư; chưa kiểm soát được khả năng giải phóng dược chất Mặc dù vậy, nếu

tế bào bị bệnh thuộc hệ thống thực bào đơn nhân thì chính việc bắt giữ khi di chuyển trong hệ tuần hoàn lại là ưu điểm của các liposome quy ước [27]

Liposome biến đổi

Là những liposome được biến đổi thành phần vỏ hoặc bề mặt để có những đặc tính mới

A Biến đổi thành phần vỏ liposome bằng cách sử dụng các loại phospholipid

khác nhau sẽ nhận được những liposome nhạy cảm với các tác nhân bên ngoài như nhiệt độ, ánh sáng, từ tính Khi nhận được các kích thích từ bên ngoài, lớp vỏ lipid sẽ biến đổi dẫn đến tăng tính thấm đối với dược chất, do

đó dược chất sẽ nhanh chóng giải phóng ra khỏi liposome Do vậy những liposome này gọi là những liposome kiểm soát giải phóng (trigger release)

B Biến đổi bề mặt liposome bằng các phân tử khác nhau sẽ được liposome

tuần hoàn dài hay liposome vận chuyển chủ động đến đích tác dụng Các chất hay được sử dụng để làm phối tử gắn lên bề mặt liposome vận chuyển chủ động là những chất có số lượng thụ cảm (receptor) lớn tại mô đích [7]

A Liposome biến đổi thành phần vỏ

Liposome nhạy cảm nhiệt độ [Thermosensitive (heat-triggered)liposomes - TLs]

Hệ liposome được bào chế bằng các lipid có nhiệt độ chuyển pha (Tm) cao hơn nhiệt độ sinh lý, dược chất được giải phóng tại vị trí khối u bằng cách tăng thân nhiệt tại chỗ TLs có ưu điểm là không phụ thuộc vào hiệu ứng EPR (hiệu ứng tăng tính thấm và thời gian lưu) do được kiểm soát trong suốt quá trình điều trị, thuốc được giải phóng rất nhanh trong các mạch máu của khối u, sau đó là sự hấp thu nhanh chóng của các tế bào xung quanh Ngoài ra, thuốc được phân phối tới khối u

ở dạng tự do, góp phần cải thiện sinh khả dụng và khả năng xâm nhập khối u

Nhược điểm chính khi sử dụng liposome loại này là không hiệu quả trong điều trị khối u đã di căn vì sử dụng TLs đòi hỏi phải có hiểu biết chính xác về vị trí khối u [14] Tại thời điểm hiện nay công ty Celsion Corporation (USA) đã bào chế thành công thuốc tiêm liposome doxorubicin nhạy cảm nhiệt độ (ThermoDox) và đang thử nghiệm lâm sàng pha III trên bệnh nhân ung thư gan và pha II trên bệnh ung thư

vú [7]

Liposome nhạy cảm ánh sáng (light-sensitive liposome)

Liposome có thể được tạo thành với các lipid nhạy cảm với ánh sáng Các tác nhân nhạy cảm ánh sáng như dẫn chất porphyrin, chlorins, phthalocyanines tạo ra oxy nguyên tử sau khi phơi nhiễm ánh sáng và được sử dụng để kích thích tiêu diệt các

tế bào ung thư Liposome nhạy cảm ánh sáng được ứng dụng nhiều trong điều trị những khối u nông [14]

Liposome nhạy cảm pH [pH-sensitive (acidic-triggered) liposomes – pHSLs]

Được bào chế từ các phospholipid nhạy cảm với pH thấp (< 7), dưới tác động của

pH acid trong nội bào hoặc ở khối u, lớp vỏ liposome sẽ bị phá vỡ và giải phóng dược chất ra khỏi liposome Hệ phân phối thuốc chỉ có thể bị phá vỡ trong endosomes/lysosomes, giải phóng dược chất theo cơ chế dung hợp với màng tế bào

Ví dụ điển hình cho liposome loại này là các liposome có thành phần lớp vỏ gồm dioleylphosphoethanolamine (DOPE) và cholesterylhemisuccinate (CHEMS) Những thành phần này gây ra sự mất ổn định màng liposome ở pH acid yếu, cho phép hợp nhất với màng endosome/lysosome và giải phóng thuốc vào trong tế bào chất [14]

Liposome có từ tính (Magnetic liposomes –MLs)

Các phân tử sắt oxid Fe3O4 hoặc γ-Fe2O3 được gắn vào bên trong liposome, tạo nên các liposome có tính từ MLs cho phép phân phối thuốc có kiểm soát nhờ tác dụng của một từ trường bên ngoài Các MLs có thể được dùng cho mục đích chẩn đoán bệnh, để chữa trị ung thư và kết hợp với các thuốc khác để giải phóng có kiểm soát cho các liệu pháp chữa trị hiệu quả và an toàn hơn MLs chia làm hai loại là MLs cổ điển (classical ML) bao gồm một tiểu phân oxid sắt ~ 15 nm được bao quanh bởi

một lớp màng kép lipid Khi bên trong chứa đầy các tiểu phân nano oxid sắt thì sẽ không còn cấu trúc nhân nước Loại này không cho phép gắn các thuốc thân nước Loại thứ hai bao gồm các liposome kích thước khoảng 100 - 500 nm bao quanh một vài tiểu phân nano oxid sắt kích thước 1 - 10 nm phân tán trong một nhân nước, cho phép gắn đồng thời nhiều thuốc thân nước [14]

Liposome giải phóng nhờ siêu âm [Echogenic (ultrasound-triggered) liposomes –

B Liposome biến đổi bề mặt

Liposome tuần hoàn dài (long-circulating liposome): Được bào chế từ

phospholipid trung hòa có nhiệt độ chảy cao, được bao bề mặt bằng các phân tử polyme thân nước như PEG, vì vậy liposome có cấu trúc không gian cồng kềnh nên tránh được sự nhận diện của quá trình opsonin hóa làm tăng thời gian lưu trú trong

hệ tuần hoàn Với kích thước nhỏ (100 – 200 nm) liposome dễ dàng xâm nhập vào

mô ung thư mà không qua được thành mạch của mô lành Đây được gọi là hiệu ứng tăng tính thấm và thời gian lưu (EPR) Liposome tuần hoàn dài vận chuyển thuốc theo cơ chế thụ động dựa trên thời gian lưu trú lâu trong hệ tuần hoàn của liposome

và tính thấm cao của thành mạch mô ung thư [7]

Liposome vận chuyển chủ động (active targeted liposome): Được chức năng hóa

bề mặt bằng các phối tử (ligand) được nhận biết bởi các thụ cảm (receptor) trên bề mặt tế bào mô đích Những liposome này được nghiên cứu để vận chuyển chủ động đến mô ung thư Tế bào ung thư sản sinh ra rất nhiều các protein, hormon, enzym có tính kháng nguyên và những kháng nguyên này sẽ được nhận biết bởi các kháng thể tương ứng Trên bề mặt tế bào ung thư có chứa gấp nhiều lần kháng nguyên cũng

như thụ cảm so với các mô lành Ví dụ như thụ cảm của các yếu tố tăng trưởng (folat receptor, transferrin receptor), protein trên bề mặt tế bào nội mô ung thư [7]

1.2.3 Những nghiên cứu trong nước về liposome

Tại ộ môn ào chế, ThS Nguyễn Văn Lâm đã nghiên cứu và đưa ra được công

thức và quy trình bào chế cho thuốc tiêm liposome DOX 2 mg/ml Liposome được bào chế bằng phương pháp hydrat hóa film với thành phần màng lipid gồm SPC và Chol (7 : 3, tỉ lệ mol), giảm kích thước tiếu phân bằng siêu âm, đổi môi trường ngoài liposome là amoni sulfat bằng hệ thống lọc tiếp tuyến tự động, tạo ra các liposome có sự chênh lệch pH hai bên màng Sau đó bơm hỗn dịch này vào các lọ thủy tinh có chứa bột đông khô của DOX và ủ ở 50oC trong 15 phút Kết quả tạo ra liposome DOX có kích thước dưới 200 nm, hiệu suất liposome hóa trên 80% Đánh giá tác dụng của liposome DOX trên khối u động vật cho thấy ưu thế vượt trội của thuốc tiêm dạng liposome so với dạng dung dịch, đặc biệt là trên khối u dưới da [5]

Năm 2014 Nguyễn Thu Trang đã nghiên cứu và xây dựng được quy trình bào chế

liposome DOX 2 mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol Công thức bào chế gồm HSPC và Chol (10:3, kl/kl) Quá trình bào chế trải qua các bước: Hòa tan HSPC, Chol trong ethanol và đệm citrat trong nước, tiêm nhanh pha ethanol vào dung dịch đệm kết hợp khuấy trộn bằng máy đồng nhất hóa, cô đặc mẫu bằng hệ thống lọc tiếp tuyến tự động, đổi đệm bên ngoài liposome bằng HEPES pH 7,4 và gắn dược chất Liposome thu được có KTTP < 0,2 µm, PDI ~ 0,2 và hiệu suất liposome hóa đạt 90% Nghiên cứu đã xây dựng được quy trình bào chế và đánh giá được sự ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi, nhiệt độ, ảnh hưởng của quá trình làm giảm KTTP tới KTTP và hiệu suất liposome hóa Nghiên cứu cho thấy bào chế liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol đã khắc phục được một số nhược điểm của phương pháp hydrat hóa film như thời gian bào chế dài, phải sử dụng phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân, tuy nhiên phương pháp này cũng còn tồn tại những hạn chế nhất định như tỉ lệ pha loãng ethanol quá lớn nên phải trải qua giai đoạn cô đặc để giảm thể tích đồng thời chưa kiểm soát được lượng ethanol tồn dư trong chế phẩm thuốc tiêm [9]

Nhìn chung các nghiên cứu trong nước chủ yếu tập trung vào bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của liposome DOX quy ước, chưa có nghiên cứu nào về các liposome sử dụng dẫn chất polyme như PEG để làm tăng thời gian tuần hoàn và giảm tốc độ thanh thải trong huyết tương

1.3 Liposome biến đổi bằng cách PE hóa

1.3.1 Khái niệm PE hóa

Liposome PEG hóa còn được gọi là liposome ngụy trang Để tồn tại lâu trong hệ thống tuần hoàn bề mặt vỏ các liposome được đưa thêm nhóm thân nước có kích thước lớn, tương hợp sinh học là PEG nhằm tạo ra một lớp áo bảo vệ cho liposome

để thoát khỏi quá trình opsonin hóa, sự tấn công của đại thực bào và hệ thống lưới nội mô tại gan Các liposome PEG hóa hướng đích theo cơ chế thụ động, do thời gian lưu hành trong tuần hoàn tăng nên thời gian tập trung ở mô đích tăng nhờ hiệu ứng EPR [23], [24], [27], [28]

1.3.2 Ưu, nhược điểm của liposome PE hóa

Ưu điểm của liposome PE hóa

- Ưu điểm nổi bật nhất là giảm mạnh hấp thu vào MPS (hệ đại thực bào đơn nhân)

và kéo dài thời gian tuần hoàn do đó cải thiện được sự phân bố vào các mô được tưới máu [16], [19] Blume và các cộng sự đã làm sáng tỏ được thời gian tuần hoàn trong máu tăng là do giảm tương tác giữa các liposome với các protein trong huyết tương và các protein trên bề mặt tế bào [19] Liposome biến đổi bề mặt bằng cách PEG hóa sẽ hình thành một lớp nước bao quanh liposome do tương tác giữa polyme – PEG và phân tử nước, nhờ đó mà ngăn cản được hiện tượng opsonin hóa [26],

- Khác với liposome quy ước, dược động học của liposome PEG hóa không phụ thuộc vào liều Việc tăng liều sử dụng ít làm tăng tốc độ thanh thải của thuốc, tốc độ thanh thải chỉ tăng nhanh trong trường hợp liều rất thấp [13]

- Độc tính trên tim, suy tủy, rụng tóc và nôn giảm đáng kể so với doxorubicin truyền thống khi dùng với liều đạt hiệu quả tương đương [19]

Nhược điểm của liposome PE hóa

- Việc PEG hóa không giúp liposome hoàn toàn tránh khỏi sự hấp thu của các tế bào thuộc hệ thống lưới nội mô Moghimi và Szebeni (2003) đã kiểm tra một cách chính xác những cơ chế để đạt được thời gian tuần hoàn kéo dài của các liposome “ngụy trang” Nghiên cứu cho thấy liposome PEG hóa không hoàn toàn trơ về mặt sinh học và đã có một số bằng chứng cho thấy rằng polyme có thể gây ra hoạt hóa hệ thống bổ thể [19]

- Liposome DOX PEG hóa làm tăng thời gian tuần hoàn trong máu đồng thời cũng làm tăng cả thời gian tiếp cận với các mô lành trong cơ thể, do vậy có khả năng gây

ra một số tác dụng không mong muốn khác [18]

1.3.3 ặc tính của PE

PEG là một polyether diol thẳng có nhiều đặc tính hữu ích

 Tương thích sinh học với cơ thể,

 Hòa tan trong nước và nhiều dung môi hữu cơ,

 Độc tính thấp,

 Tính kháng nguyên và khả năng tạo miễn dịch thấp,

 Thải trừ tốt,

 Dễ dàng hợp nhất polyme với lipid [19]

Những đặc tính này cho phép PEG được ứng dụng nhiều trong lâm sàng bao gồm cả lĩnh vực y sinh hóa [19] PEG và dẫn chất của nó được sử dụng rộng rãi để cải thiện dược động học và độ ổn định của các hệ mang thuốc [22] Khối lượng phân tử và cấu trúc của phân tử PEG có thể được điều chỉnh cho từng mục đích cụ thể [19]

1.3.4 Ảnh hưởng của thành phần PE lên liposome

Ảnh hưởng của tính linh động chuỗi PEG

- Độ linh động của chuỗi PEG ảnh hưởng tới thời gian tuần hoàn của liposome Độ linh động càng cao thì khả năng ức chế hiện tượng opsonin hóa và sự phát hiện của các protein và kháng thể càng cao Tuy nhiên độ linh động của PEG trên bề mặt liposome rất khó được đánh giá bằng các phân tích thí nghiệm, tác dụng của độ linh động PEG trên độ ổn định liposome chủ yếu được thảo luận trên cơ sở mô phỏng tính toán [10]

- Abe.K và các cộng sự (2015) tiến hành nghiên cứu đánh giá sự ảnh hưởng của cholesterol tới độ linh động của chuỗi PEG với nồng độ cholesterol khảo sát từ 0-30

%mol Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy sự hợp nhất cholesterol vào trong lớp màng kép lipid làm tăng độ linh động của chuỗi PEG Ngoài ra độ linh động chuỗi PEG cũng tăng đáng kể khi cholesterol bị loại bỏ khỏi lớp màng kép ở nồng độ trên 20 %mol [10]

Ảnh hưởng của khối lượng phân tử PEG

- Việc sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H NMR đã chứng minh

`phân tử lượng của PEG trong PEG-lipids được gắn lên bề mặt liposome có ảnh hưởng đến độ linh động của chuỗi PEG tại bề mặt liposome Khối lượng phân tử PEG tăng sẽ làm tăng độ linh động trên bề mặt liposome [10]

- Trong hầu hết các trường hợp, chuỗi PEG dài hơn sẽ làm tăng thời gian tuần hoàn trong máu tốt hơn Allen và cộng sự (1991) đã báo cáo rằng nồng độ liposome trong máu cao hơn khi sử dụng liposome SM/PC/Chol/DSPE-PEG với khối lượng phân

tử PEG lớn hơn (PEG1900, PEG5000) so với liposome chứa PEG-lipid với PEG chuỗi ngắn hơn (ví dụ PEG750, PEG120) Sử dụng PEG2000 thu được gấp đôi lượng lipid còn lại trong huyết tương so với công thức có PEG phân tử lượng 350 tới 750 [19]

- Một số nghiên cứu gần đây đã đánh giá được ảnh hưởng độ dài chuỗi PEG của các liposome được PEG hóa lên thời gian bán thải ở invivo Dos Santos và các cộng sự

đã thấy rằng các liposome được PEG hóa với 5 %mol PEG350, PEG550, PEG750 thu

được sinh khả dụng và thời gian tuần hoàn trong máu tương tự như liposome được PEG hóa 2 %mol hoặc 5 %mol PEG2000 [23]

- Với các PEG chuỗi dài hơn, Maldiney và cộng sự đã chứng minh được rằng khi che phủ hoàn toàn các liposome với PEG5000, PEG10000 hoặc PEG20000 không làm ảnh hưởng đến sự phân bố sinh học so với PEG2000 [23] Fang và cộng sự lại thấy rằng các liposome được PEG hóa với PEG5000 làm giảm sự hấp thu protein và tăng cường tác dụng tới đích khối u hơn so với các liposome được PEG hóa PEG2000 và PEG1000 [23]

Ảnh hưởng của mật độ PEG

- Mật độ phân tử PEG xác định mức độ che phủ và khoảng cách giữa các phân tử

được gắn vào liposome và xác định hình dạng PEG trên bề mặt liposome

- Walkey và cộng sự đã đánh giá tác dụng của mật độ PEG lên tốc độ thanh thải và hiện tượng opsonin hóa liposome Kết quả cho thấy mức độ opsonin hóa có tỉ lệ với kích thước liposome và mật độ phân tử PEG trên bề mặt, với mật độ PEG cao (> 0,75 PEG/nm2 ) khả năng ức chế quá trình opsonin hóa lên tới 99% so với các liposome không PEG hóa Các liposome với mật độ PEG hóa thấp (< 0,16 PEG/nm2) được hấp thu thông qua cơ chế phụ thuộc vào huyết tương còn các liposome với mật độ PEG hóa cao (> 0,64 PEG/nm2) lại độc lập với huyết tương, tức là bất cứ protein huyết tương nào hấp phụ lên liposome cũng không ảnh hưởng đến quá trình hấp thu liposome [10]

- Phân tử PEG được gắn trên bề mặt của liposome làm giảm mạnh lực hút Van der Waals và tăng lực đẩy giữa các liposome Việc tăng nồng độ PEG làm giảm kết tụ, giảm dần kích thước liposome và cuối cùng hòa tan hoàn toàn LUV vào trong các micell ở 30 %mol DSPE-PEG Kích thước của liposome giảm dần khi tăng nồng

độ DSPE-PEG %mol ngoại trừ 7 ± 2 %mol [15]

- Đối với liposome lượng PEG tối ưu bao phủ lên bề mặt liposome nằm trong khoảng 5 %mol và 9 %mol của PEG2000 Ở nồng độ đó mỗi chuỗi polyme ở dạng cấu trúc hình nấm (mushroom) liên kết yếu với nhau tạo nên sự che phủ toàn bộ bề mặt liposome để ngăn cản hiện tượng opsonin hóa Dưới khoảng này, độ che phủ bề

mặt PEG là chưahoàn toàn, điều này tạo điều kiện để quá trình opsonin hóa diễn ra nhanh chóng Ở nồng độ trên 9 %mol mặc dù mức độ che phủ là hoàn toàn nhưng mật độ cao PEG che phủ trên bề mặt khiến PEG có hình dáng giống bàn chải (brush), điều này làm mất ổn định màng lipid kép do lực đẩy ngang của chuỗi PEG gây ra [23]

- Markus Johnsson và cộng sự đã nghiên cứu các cấu trúc khác ngoài liposome có trong hỗn dịch liposome tạo thành với các nồng độ PEG2000 hoặc PEG5000 khác nhau Các hình ảnh chụp TEM đã cho thấy có sự chuyển dạng từ liposome sang micell cầu thông qua sự hình thành các micell dạng đĩa Cấu trúc micell dạng đĩa xuất hiện ngay ở nồng độ PEG thấp (< 5%), càng tăng nồng độ PEG thì càng hình thành nhiều cấu trúc micell đĩa nhỏ hơn và cho tới nồng độ 19,5 %mol thì chỉ còn một vài liposome, phần còn lại là các micell dạng đĩa có kích thước rất nhỏ Tiếp tục tăng nồng độ PEG-DSPE cấu trúc liposome biến mất hoàn toàn, các micell đĩa

có kích thước giảm dần và tiến lại gần nhau hình thành nên các micelle cầu Xảy ra

sự chuyển đổi tất cả liposome thành các micell dạng đĩa ở nồng độ gần 20 %mol của DPPE-PEG2000 Sự biến đổi cấu trúc này cũng xảy ra tương tự với DSPC và PEG5000 Tuy nhiên, có một vài khác biệt về nồng độ chính xác của PEG-lipid cần thiết cho việc chuyển đổi hoàn toàn liposome vào micell đĩa Sử dụng PEG5000 cần nồng độ 30 - 40 %mol, cao hơn so với PEG2000 (20 %mol) [20]

Hiện nay việc sử dụng PEG2000 nồng độ 5 %mol được chấp nhận để đạt được thời gian tuần hoàn trong máu tối ưu Đây cũng là loại PEG được sử dụng nhiều nhất trong các chế phẩm liposome PEG hóa lưu hành trên thị trường Tuy nhiên việc sử dụng PEG2000 chủ yếu dựa trên sự lựa chọn ngẫu nhiên chứ không phải dựa trên các lý luận khoa học

1.3.5 Phương pháp gắn PE vào liposome

Có nhiều cách để gắn PEG vào liposome, trong đó có ba cách điển hình sau:

- Dùng phương pháp vật lý để hấp thụ polyme vào bề mặt của liposome

- Hợp nhất các PEG-lipid trong quá trình bào chế liposome

- Gắn các nhóm phản ứng tạo liên kết đồng hóa trị lên bề mặt của các liposome đã tạo thành trước [19]

1.3.6 Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin PE hóa trên thế giới

Năm 2015

Neus Lozano và cộng sự đã công bố nghiên cứu về liposome-ICG DOX PEG hóa gắn kháng thể hướng đích đơn dòng (Indocyanine green – ICG) Liposome được bào chế bằng phương pháp hydrat hóa film HSPC/Chol/DSPE-PEG2000(56,3:38,2:5,5; tỉ lệ phần trăm mol) được hòa tan trong chloroform/methanol (4:1, tt/tt), dung môi được bốc hơi dưới áp suất giảm bằng thiết bị cất quay Lớp film mỏng được hydrat hóa với dung dịch dextrose có chứa ICG (có thêm DOX nếu cần tạo liposome-ICG DOX PEG hóa) Giảm kích thước tiểu phân bằng cách đông chảy qua 6 chu kỳ và nén qua màng polycarbonat với kích thước lỗ màng khác nhau Sau

đó tiến hành hợp nhất kháng thể hCTM01 vào liposome vừa tạo thành Nghiên cứu

đã đánh giá được sự tích lũy thuốc trong khối u bằng kĩ thuật MSOT (multispectral optoacoustic tomography) Khả năng tích lũy vượt trội của liposome-ICG PEG hóa gắn kháng thể đơn dòng sau khi truyền tĩnh mạch đã được nghiên cứu so với liposome-ICG PEG hóa không gắn kháng thể đơn dòng sử dụng cả mô hình khối u dương tính phát triển nhanh (4T1) và mô hình khối u phát triển chậm (HT-29) Kết quả cho thấy cả hai công thức đều có tích lũy vượt trội trong các khối u được nghiên cứu Đã quan sát được sự tích lũy nhanh với liposome gắn kháng thể đơn dòng vào thời điểm ngay sau khi truyền, phần lớn ở vị trí rìa khối cho thấy sự liên kết với các thụ thể MUC-1 Ngược lại, các liposome không gắn kháng thể đơn dòng cho thấy

sự tích lũy tại trung tâm của khối u vào thời điểm muộn hơn Nghiên cứu đã thành công trong việc gắn DOX vào trong cả liposome-ICG PEG hóa có hướng đích và không hướng đích Với việc hợp nhất Indocyanine green (ICG) với khả năng hấp thu hình ảnh và phát huỳnh quang nhằm mục đích xác định vị trí khối u, DOX có tác dụng chống ung thư vào liposome PEG hóa, nghiên cứu đã thiết kế được công thức mới có nhiều triển vọng trong tương lai [21]

Năm 2013 Ikumi Sugiyama, Yasuyuki Sadzuka đã nghiên cứu về sự tăng

cường tác dụng chống ung thư của liposome DOX PEG hóa có gắn 2 PEG có phân

tử lượng khác nhau Nghiên cứu đã thiết kế và tổng hợp được PEG-lipid mới: distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-PEG (different double arms PEG, DDA-PEG) bao gồm 2 chuỗi PEG có phân tử lượng 500, 2000 trong một phân tử để tạo liposome biến đổi bề mặt hữu ích hơn trong sử dụng Phương pháp Bangham được sử dụng để bào chế liposome DAA-PEG-modified liposomal doxorubicin (DDA-LDOX) tạo một lớp nước bao quanh liposome ổn định và lớn nhất so với các liposome gắn PEG khác ngay cả khi chỉ thêm một lượng nhỏ Nghiên cứu về sự hấp thu thuốc vào tế bào ung thư thu được kết quả nhóm DDA-LDOX làm tăng nồng độ thuốc trong tế bào ung thư vì nó có khả năng hướng tới đích tác dụng là các tế bào ung thư DDA-LDOX có thời gian tuần hoàn dài trong dòng máu và có mối liên hệ đặc biệt với tế bào ung thư Nó cũng có tác dụng chống ung thư rất mạnh trên chuột được cấy M5076 ovarian sarcoma, điều này xảy ra cả với tế bào đã kháng với DOX Hơn nữa các liposome này có khả năng duy trì nồng độ DOX trong tế bào ung thư trong một thời gian dài Những kết quả này đã cho thấy những lợi ích về tác dụng chống ung thư của DDA-liposome trên tế bào M5076 ovarian sarcoma Nghiên cứu

1,2-đã mở ra một hướng mới trong việc sử dụng dẫn chất polyme cho việc chữa trị chống lại những tế bào ung thư đã kháng thuốc [29]

Qua một số nghiên cứu trên ta thấy rằng xu hướng hiện nay trên thế giới là tập trung phát triển các liposome biến đổi bề mặt hoặc biến đổi thành phần cấu tạo

vỏ Bào chế các dạng liposome biến đổi nhằm tăng tính hướng đích, giải phóng thuốc có kiểm soát góp phần tăng tác dụng điều trị, giảm kháng thuốc và tác dụng phụ

ƯƠN 2 Ố TƯ N V P ƯƠN P ÁP N N U

2.1 ối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 ối tượng nghiên cứu

- Liposome PEG hóa

- Liposome DOX PEG hóa

2.1.2 Nguyên vật liệu

Bảng 2.1 ác nguyên vật liệu được sử dụng

3 Phosphatidylcholin dầu đậu nành đã

11 Triton X100 (Octylphenolpoly –

(ethylen glycolether) Amresco Ohio-Mỹ TKHH

12 Túi thẩm tích Spectrum laboratory-Mỹ TCCS

16 Dung dịch tiêm truyền glucose 5% Việt Nam DĐVN

17 Dung dịch tiêm truyền NaCl 0,9% Việt Nam DĐVN

18 Sucrose Fisher – Anh BP

2.1.3 Phương tiện nghiên cứu

- Hệ thống cất quay Rovapor R-210 (hãng Buchi- Đức)

- Thiết bị đùn nén mini-extruder ER1 (Eastern Scientific LLC-USP)

- Thiết bị phân tích kích thước tiểu phân Zetasizer ZS90 (Malvern-Anh)

- Máy ly tâm lạnh Universal 320R (Hettich-Đức)

- Máy quang phổ UV-VIS U-1800 (Hitachi-Nhật Bản)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp bào chế liposome doxorubicin

Dựa theo các kết quả của các nghiên cứu về liposome DOX trước, tiến hành bào chế liposome DOX PEG hóa 2 mg/ml theo phương pháp Bangham qua hai bước:

2.2.1.1 Bào chế liposome chưa mang dược chất

Tạo lớp film lipid khô

- Cân các thành phần theo công thức HSPC, Chol, DSPE-PEG2000, hòa tan hoàn toàn trong cloroform

- Bốc hơi dung môi trên thiết bị cất quay ở nhiệt độ 50oC trong điều kiện chân không, tốc độ quay 50 vòng/phút, thời gian cất quay 12 tiếng

Hydrat hóa film

Hydrat hóa lớp film bằng dung dịch amoni sulfat 250 mM đã lọc qua màng 0,2 µm Tăng tốc độ quay lên 80 vòng/phút, nhiệt độ bể điều nhiệt duy trì ở 50 - 60o

C, mở

van của thiết bị cất quay để hút hết dung dịch đệm amoni sulfat 250 mM vào Sau

90 phút hydrat hóa màng film thu được hỗn dịch liposome có màu trắng đục

Giảm kích thước tiểu phân liposome

Nén hỗn dịch tạo thành qua các màng polycarbonat có kích thước lỗ màng giảm dần

từ 1 µm đến 0,2 µm và 0,1 µm, nhiệt độ duy trì ở 55 – 60oC

Đổi môi trường ngoài liposome

- Sử dụng hệ thống lọc tiếp tuyến tự động để đổi môi trường amoni sulfat bên ngoài liposome bằng các hệ đệm thích hợp

Tiến hành: Bơm tuần hoàn hỗn dịch liposome qua cột lọc, nước sẽ kéo các chất tan thấm qua màng lọc theo chiều vuông góc so với dòng chảy, liposome không đi qua màng được sẽ liên tục được chạy qua cột Do nước bị loại bớt nên sẽ làm giảm áp suất trong bình chứa nên sẽ tạo lực hút đệm HEPES sang để bù vào lượng nước bị loại mất Kết quả là cứ bao nhiêu ml dung dịch cũ bị loại qua màng lọc thì sẽ bù vào bằng bấy nhiêu dung dịch đệm HEPES Theo hướng dẫn của nhà sản xuất thì với thể tích dung dịch đổi gấp 8 lần thể tích hỗn dịch liposome thì sẽ loại được hoàn toàn môi trường cũ Khi pH dịch lọc đạt yêu cầu thì ngừng bổ sung đệm HEPES nhưng vẫn chạy bơm đến khi thể tích hỗn dịch liposome trong bình chưa mẫu bằng 70% so với ban đầu thì ngừng hút liposome và tiếp tục bơm hút dung dịch đệm qua cột để thu hồi các liposome còn bám ở màng lọc về Khi thể tích bình chứa mẫu đạt được thể tích ban đầu thì dừng bơm để kết thúc

- Liposome sau khi đổi đệm được lọc qua màng 0,2 µm

2.2.1.2 Gắn dược chất vào trong liposome đã đổi đệm

- Cân chính xác lượng DOX.HCl để đạt hàm lượng 2 mg/ml, sử dụng thiết bị khuấy

từ để hòa tan và khuếch tán DOX vào trong liposome Ủ trong 15 phút ở nhiệt độ 55

- 60oC để quá trình khuếch tán diễn ra hoàn toàn Lọc chế phẩm qua màng lọc cellulose acetat 0,2 µm

- Liposome được đóng trong lọ thủy tinh 10 ml, đóng nút cao su và siết nắp nhôm, bọc giấy nhôm và bảo quản ở 2 – 8oC

Sơ đồ bào chế liposome DOX PEG hóa

Đổi hệ đệm bên ngoài liposome

Nén qua màng polycarbonat

Lọc vô khuẩn, đóng lọ, đóng nút, siết nắp nhôm Bảo quản 2 - 8oC

µm; 0,1 µm

Dung dịch đổi đệm môi trường ngoài

Khuấy từ 1cm Nhiệt độ: 60oC

Bốc hơi dung môi trong 12h trên thiết bị cất quay Hydrat hóa

Hòa tan HSPC, Chol,