Nghiên cứu bào chế liposome mang phức amphotericin b với cyclodextrin

Thông tin tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Amphotericin B là một trong những kháng sinh chống nấm thế hệ đầu tiên, nó bắt đầu được đưa vào sử dụng năm 1957. Trong nhiều năm, amphotericin B vẫn là một thuốc chống nấm hiệu quả nhất để điều trị nấm toàn thân. Tuy nhiên, do có nhiều hạn chế như là dược chất thân dầu, không tan trong nước, có nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng, đặc biệt là tác dụng phụ trên thận gây khó khăn trong việc ứng dụng trong lâm sàng. Để tăng hiệu quả điều trị cũng như hạn chế các tác dụng phụ nghiêm trọng của thuốc, hàng loạt nghiên cứu về các hệ mang thuốc mới ra đời. Dạng chế phẩm tiêm ban đầu của aqmphotericin B là dạng micell (chế phẩm Fungizone). Tuy nhiên ở dạng bào chế này, amphotericin B không bền trong hệ tuần hoàn và nhanh chóng chuyển từ dạng miccell sang dạng lipoprotein gây độc cho tế bào vật chủ, đặc biệt là độc tính trên thận. Tiếp đến, dạng bào chế liposome của amphotericin B thể hiện nhiều ưu điểm song hàm lượng amphotericin B sử dụng thấp, chỉ khoảng 9 mol % so với tổng lipid. Sự kết hợp amphotericin B với cyclodextrin tạo thành phức hợp, đưa phức hợp vào khoang nước của liposome là một hướng nghiên cứu mới đầy triển vọng. Dạng bào chế này có thể tận dụng những ưu điểm đồng thời khắc phục được yếu điểm hàm lượng dược chất thấp của liposome nhằm nâng cao hiệu quả điều trị, giảm độc tính, tăng liều sử dụng của amphotericin B.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ THUỶ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME MANG PHỨC AMPHOTERICIN B VỚI CYCLODEXTRIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ THUỶ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME MANG PHỨC AMPHOTERICIN B VỚI CYCLODEXTRIN Người hướng dẫn: TS. Trần Thị Hải Yến Nơi thực hiện: Bộ môn bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới: TS. Trần Thị Hải Yến Là người thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các thầy cô, các kỹ thuật viên bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện để em hoàn thành khóa luận này. Nhân đây, em cũng gửi lời cảm ơn các thầy cô trong ban giám hiệu, các phòng ban và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo em suốt 5 năm học tập tại trường. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã giúp đỡ, động viên em trong quá trình học tập và làm khóa luận. Hà Nội, tháng 5 năm 2015. Sinh viên Phạm Thị Thuỷ MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 2 1.1. Amphotericin B 2 1.1.1. Nguồn gốc 2 1.1.2. Công thức hóa học 2 1.1.3. Đặc tính hoá lý 2 1.1.4. Tác dụng dược lý 3 1.1.5. Dược động học 4 1.1.6. Chỉ định 4 1.1.7. Tác dụng không mong muốn 5 1.1.8. Liều dùng 5 1.1.9. Một số chế phẩm tiêm của amphotericin B trên thị trường 5 1.2. Liposome chứa phức hợp cyclodextrin 6 1.2.1. Phức hợp cyclodextrin- amphotericin B 6 1.2.2. Liposome chứa phức hợp cyclodextrin- amphotericin B 8 1.3. Bào chế liposome chứa phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 12 1.3.1. Bào chế phức hợp amphotericin B-cyclodextrin 12 1.3.2. Bào chế liposome thô chứa phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 12 1.3.3. Đồng nhất và giảm kích thước tiểu phân liposome 13 1.4. Một số nghiên cứu về liposome chứa phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 14 CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu 15 2.2. Nội dung nghiên cứu 16 2.3. Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1. Qui trình bào chế phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 16 2.3.2. Qui trình bào chế liposome chứa phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 18 2.3.3. Phương pháp làm giảm và đồng nhất kích thước tiểu phân 20 2.3.4. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 20 2.3.5. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của liposome chứa phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 22 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1 Xây dựng phương pháp định lượng amphotericin B trong phức hợp và trong hỗn dịch liposome 26 3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của tá dược HPβCD và tá dược lipid đến phương pháp đo quang phổ UV – VIS 26 3.1.2. Đường chuẩn biểu thị sự tương quan giữa nồng độ amphotericin B trong methanol và mật độ quang 27 3.2 Khảo sát một số yếu tố thuộc về qui trình và công thức bào chế ảnh hưởng đến đặc tính của phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 29 3.2.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của loại cyclodextrin trong công thức bào chế phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 29 3.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian ủ để hình thành phức hợp tới đặc tính của phức hợp 30 3.2.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của lượng dược chất ban đầu tới đặc tính của phức hợp 31 3.3. Đánh giá một số đặc tính của phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 33 3.3.1. Đánh giá hình thức, hình thái của phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 33 3.3.2. Phân tích nhiệt vi sai phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 33 3.4. Nghiên cứu bào chế liposome chứa phức hợp amphotericin B- cyclodextrin . 35 3.4.1. Đánh giá hình thức, hình thái, kích thước tiểu phân, thế zeta của mẫu liposome chứa phức hợp 35 3.4.2. Đánh giá hiệu suất liposome hoá và hàm lượng dược chất trong liposome 36 3.4.3. Đánh giá giải phóng in vitro 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Viết tắt Từ/cụm từ đầy đủ 1 α-CD Anphacyclodextrin 2 β-CD Beta cyclodextrin 3 HPβCD Hydroxyl propyl beta cyclodextrin 4 AMB Amphotericin B 5 CD Cyclodextrin 6 Chol Cholesterol 7 DĐVN Dược điển Việt Nam 8 DMPC α – Dimyristoylphosphatidylcholin 9 DMPG 1- α-Dimyristoylphosphatidylglycerol 10 DSPG Distearoylphosphatidylglycerol 11 HSPC Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogennated soy phosphatidylcholine) 12 KTTP Kích thước tiểu phân 13 LTT Lọc tiếp tuyến 14 NSX Nhà sản xuất 15 PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index) 16 TKHH Tinh khiết hoá học 17 USP United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ) 18 Z average Kích thước tiểu phân trung bình DANH MỤC BẢNG BIỂU Số hiệu Tên bảng biểu Trang Bảng 1.1. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường 6 Bảng 2.1. Nguyên liệu 15 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tá dược HPβCD tới phương pháp đo quang UV-VIS 25 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tá dược lipid tới phương pháp đo quang UV-VIS 26 Bảng 3.3 Mật độ quang của các dung dịch chuẩn trong methanol 27 Bảng 3.4 Thành phần công thức bào chế phức hợp thay đổi loại CD 28 Bảng 3.5 Kết quả ảnh hưởng của loại cyclodextrin đến hàm lượng AMB trong phức hợp. 28 Bảng 3.6 Kết quả ảnh hưởng của thời gian hình thành phức hợp tới hàm lượng AMB trong phức hợp 30 Bảng 3.7 Thành phần công thức bào chế phức hợp thay đổi khối lượng dược chất ban đầu. 31 Bảng 3.8 Kết quả ảnh hưởng của khối lượng AMB ban đầu tới hàm lượng AMB trong phức hợp 31 Bảng 3.9 Kết quả KTTP, phân bố KTTP và thế zeta của liposome chứa phức hợp AMB-CD. 35 Bảng 3.10 Thành phần công thức bào chế liposome thường và lipsome chứa phức hợp. 35 Bảng 3.11 Kết quả sự khác biệt về hiệu suất liposome hoá giữa mẫu liposome thường và liposome chứa phức hợp. 36 Bảng 3.12 Kết quả sự khác biệt về hàm lượng AMB giữa các mẫu liposome AMB thường và liposome chứa phức hợp AMB- CD. 37 Bảng 3.13 Kết quả đánh giá giải phóng invitro của liposome AMB thường và liposome chứa phức hợp AMB-CD. 38 DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Số hiệu Tên hình vẽ, đồ thị Trang Hình 1.1. Công thức hoá học của AMB. 2 Hình 1.2. Cấu trúc liposome. 8 Hình 1.3. Phân tử HSPC và DSPG. 9 Hình 1.4. Thiết bị đùn ép mini extruder. 14 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế phức hợp AMB-CD. 17 Hình 2.2 Sơ đồ qui trình bào chế liposome chứa phức hợp AMB-CD bằng phương pháp hydrat hoá màng phim. 19 Hình 2.3 Cơ chế của phương pháp sử dụng máy lọc tiếp tuyến loại bỏ phần AMB ở dạng phức hợp AMB-CD không nằm trong liposome. 23 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ AMB và độ hấp thụ quang. 27 Hình 3.2 Kết quả chụp SEM của mẫu nguyên liệu AMB (a) và phức hợp AMB-HPβCD (b). 32 Hình 3.3 Kết quả phân tích DSC của mẫu AMB (a), mẫu HPβCD (b) và mẫu phức hợp AMB-HPβCD (c). 34 Hình 3.4 Đồ thị đánh giá giải phóng in vitro liposome chứa phức AMB-CD và liposome AMB thường. 39 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Amphotericin B là một trong những kháng sinh chống nấm thế hệ đầu tiên, nó bắt đầu được đưa vào sử dụng năm 1957. Trong nhiều năm, amphotericin B vẫn là một thuốc chống nấm hiệu quả nhất để điều trị nấm toàn thân. Tuy nhiên, do có nhiều hạn chế như là dược chất thân dầu, không tan trong nước, có nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng, đặc biệt là tác dụng phụ trên thận gây khó khăn trong việc ứng dụng trong lâm sàng. Để tăng hiệu quả điều trị cũng như hạn chế các tác dụng phụ nghiêm trọng của thuốc, hàng loạt nghiên cứu về các hệ mang thuốc mới ra đời. Dạng chế phẩm tiêm ban đầu của aqmphotericin B là dạng micell (chế phẩm Fungizone). Tuy nhiên ở dạng bào chế này, amphotericin B không bền trong hệ tuần hoàn và nhanh chóng chuyển từ dạng miccell sang dạng lipoprotein gây độc cho tế bào vật chủ, đặc biệt là độc tính trên thận. Tiếp đến, dạng bào chế liposome của amphotericin B thể hiện nhiều ưu điểm song hàm lượng amphotericin B sử dụng thấp, chỉ khoảng 9 mol % so với tổng lipid. Sự kết hợp amphotericin B với cyclodextrin tạo thành phức hợp, đưa phức hợp vào khoang nước của liposome là một hướng nghiên cứu mới đầy triển vọng. Dạng bào chế này có thể tận dụng những ưu điểm đồng thời khắc phục được yếu điểm hàm lượng dược chất thấp của liposome nhằm nâng cao hiệu quả điều trị, giảm độc tính, tăng liều sử dụng của amphotericin B. Để ứng dụng cyclodextrin làm chất mang thuốc và cải thiện độ tan của thuốc trong nước, triển khai đề tài “ Nghiên cứu bào chế liposome mang phức aphotericin B với cyclodextrin “ nhằm mục tiêu : 1. Xây dựng được qui trình bào chế phức hợp cyclodextrin- amphotericin B. 2. Bào chế được liposome mang phức hợp cyclodextrin- amphotericin B. 3. Đánh giá được một số đặc tính: kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân và hiệu suất tạo liposome, giải phóng in vitro. [...]... KTTP, phân b KTTP, hàm lượng thuốc và sự kệt tụ có thể xảy ra khi lưu trữ trong thời gian dài [24] 1.3 B o chế liposome chứa phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 1.3.1 B o chế phức hợp amphotericin B- cyclodextrin Phương pháp b o chế phức hợp được sáng chế năm 1989 b i các nhà khoa học Wing-Sun Chow , Shirley C Chen , Peter Timmins và sau đó được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu b o chế phức hợp... pháp này thường hạn chế do quy mô của b dụng cụ nhỏ[19] 14 Hình 1.4: Thiết b đùn ép mini extruder[5] 1.4 Một số nghiên cứu về liposome chứa phức hợp amphotericin B- cyclodextrin Chakraborty và cộng sự đã b o chế liposome chứa phức hợp AMB-HPβCD b ng phương pháp tiêm ethanol Phức hợp AMB-CD được b o chế b ng phương pháp trộn khô, HPβCD và AMB được trộn lẫn, sau đó đem đi nghiền bi, hỗn hợp rắn sau... (Spectrumlab- Mỹ)  Cân phân tích Satorius BP121S, máy đo pH InoLab, tủ sấy, tủ lạnh, cân kỹ thuật, các dụng cụ thủy tinh, lọ thủy tinh trung tính 2.2 Nội dung nghiên cứu - Xây dựng phương pháp định lượng AMB trong phức hợp và hỗn dịch liposome - Xây dựng qui trình b o chế phức hợp AMB-CD và khảo sát các yếu tố trong qui trình và công thức b o chế ảnh hưởng đến đặc tính của phức hợp AMB-CD - B o chế liposome. .. dược lý Cơ chế tác dụng: Cơ chế tác dụng của AMB, cũng như của các polyen khác, dựa trên sự liên kết giữa đuôi kỵ nước của AMB với đuôi ergosterol trên màng tế b o nấm, tạo các kênh trên màng tế b o, làm thay đổi tính thấm và tính khử cực của màng tế b o, làm rò gỉ các chất b n trong tế b o ra ngoài và cuối cùng làm chết tế b o nấm AMB cũng có thể liên kết với các cholesterol trên màng tế b o người,... xác 12, giai đoạn tách AMB tự do pH cần duy trì ở 5,5 thì hiệu suất tạo phức là tối ưu [26] 1.3.2 B o chế liposome thô chứa phức hợp amphotericin B- cyclodextrin Liposome chứa phức hợp AMB-CD được b o chế theo phương pháp hydrat hoá màng film trong đó dung dịch hydrat hoá chính là dung dịch phức hợp AMB-CD trong môi trường đệm photphat pH = 5,5 [12] 13 Liposome được tạo ra b i phương pháp này có thể... AMB-CD - B o chế liposome chứa phức hợp AMB-CD và đánh giá các đặc tính của liposome: KTTP, phân b KTTP, hiệu suất liposome hoá, giải phóng in vitro 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Qui trình b o chế phức hợp amphotericin B- cyclodextrin Qui trình b o chế phức hợp AMB-CD như sau: Cân và hoà tan CD trong khoảng 16,5 ml nước cất, sau đó chỉnh pH dung dịch đến pH = 12 b ng dung dịch NaOH 1 N (dung dịch... Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường % TT Tên chế Hàm phẩm lượng Thành phần Dạng cấu mol trúc AM B 1 Fungizone 50 mg 100 2 Abelcet mg/20 ml 50 mg, 3 Amphotec 100 mg AMB và natri deoxycholat Ambisome 50 mg b o Micell 34 Liều dùng chế B t đông khô 1 mg/kg/ngày DMPC: DMPG :AMB Phức hợp (tỷ lệ mol 2 lipid 35 – Hỗn 5 50 dịch mg/kg/ngày lipid là 7:3) Phức hợp AMB với Phức hợp cholesteryl lipid B t 50... [9] 15 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: liposome chứa phức hợp AMB-CD - Nguyên liệu B ng 2.1: Nguyên liệu STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn 1 Amphotericin B Trung Quốc USP 2 α -cyclodextrin Trung Quốc TKHH 3 Β -cyclodextrin Trung Quốc TKHH 4 HP-β -cyclodextrin Trung Quốc TKHH 5 Cholesterol... Chol:AMB (tỷ lệ mol đông khô HSPC:DSPG: 4 Dạng B t Liposome 2:0,8:1:0,4) 10 đông khô 3 -4 mg/kg/ngày 3–5 mg/kg/ngày 1.2 Liposome chứa phức hợp cyclodextrin 1.2.1 Phức hợp cyclodextrin- amphotericin B Cyclodextrin là vòng oligosaccarid có 6, 7 hay 8 các đơn vị đường glucopyranose liên kết với nhau theo liên kết 1-4, với một nhóm hydroxyl thân nước ở b mặt b n ngoài và một khoang kị nước ở trung tâm Các cyclodextrin. .. UV-VIS B trí thí nghiệm: - Pha dung dịch chuẩn AMB trong methanol có nồng độ 4,5 µg/ml (dd1) - Chuẩn b một mẫu thử dung dịch phức hợp HPβCD: b o chế 1 mẫu phức hợp, sử dụng lượng AMB ban đầu 10 mg Hút chính xác 1 ml dung dịch phức hợp vào b nh 10 ml, b sung methanol đến vạch Pha loãng với methanol để thu được dung dịch có nồng độ AMB khoảng 4,5 µg/ml (dd2) - Pha dung dịch HPβCD trong nước, pha loãng b ng . amphotericin B 8 1.3. B o chế liposome chứa phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 12 1.3.1. B o chế phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 12 1.3.2. B o chế liposome thô chứa phức hợp amphotericin B- cyclodextrin. “ Nghiên cứu b o chế liposome mang phức aphotericin B với cyclodextrin “ nhằm mục tiêu : 1. Xây dựng được qui trình b o chế phức hợp cyclodextrin- amphotericin B. 2. B o chế được liposome mang. thái của phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 33 3.3.2. Phân tích nhiệt vi sai phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 33 3.4. Nghiên cứu b o chế liposome chứa phức hợp amphotericin B- cyclodextrin

Ngày đăng: 25/07/2015, 00:45

Xem thêm: Nghiên cứu bào chế liposome mang phức amphotericin b với cyclodextrin