Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm

Glucosamin là một hoạt chất quý được sản xuất từ vỏ tôm thông qua nguyên liệu trung gian là chitin hoặc chitosan. Glucosamin chủ yếu được sử dụng trong y học chữa bệnh thoái hoá khớp. Ở người già, chức năng cũng như cấu tạo của khớp có nhiều thay đổi, các tế bào của khớp thoái hoá, trở nên kém linh động. Gân và dây chằng phân đoạn, đóng vôi, khô cằn, trở nên kém bền bỉ, kém co dãn, không chịu được căng lực và dễ bị tổn thương. Sụn trở nên đục màu, xơ hóa, gai xương, khô nước, rạn nứt với nhiều tinh thể canxi làm khớp đau. Khớp co duỗi khó khăn vì màng hoạt dịch mỏng và khô dần

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

Giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản dồi dào chiếm 1/3 tổng sản lượngnguyên liệu thủy sản ở Việt Nam Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuấtkhẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông lạnh giáp xác chiếm từ 70 - 80% công suấtchế biến Hàng năm các nhà máy chế biến đã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xáckhá lớn khoảng 70.000 tấn/năm [3]

Nguồn phế liệu này là nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp sản xuất

chitin 1, chitosan 2, glucosamin 3 và các sản phẩm có giá trị khác Do vậy việc

nghiên cứu và phát triển sản xuất các sản phẩm từ vỏ tôm là rất quan trọng, đểnâng cao giá trị sử dụng phế liệu này và làm sạch môi trường

Sản phẩm chitin - chitosan đã có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụngtrong thực tế Chitin có ứng dụng làm da nhân tạo và là nguyên liệu trung giancho các chất quan trọng như chitosan, glucosamin và các chất có giá trị khác.Chitosan có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp, nông nghiệp, y dược

và bảo vệ môi trường như: sản xuất glucosamin, chỉ khâu phẫu thuật, thuốc kem,vải, sơn, chất bảo vệ hoa quả, bảo vệ môi trường…Với khả năng ứng dụng rộngrãi của chitin – chitosan mà nhiều nước trên thế giới và cả Việt Nam đã nghiêncứu sản xuất các sản phẩm này

Glucosamin là một hoạt chất quý được sản xuất từ vỏ tôm thông quanguyên liệu trung gian là chitin hoặc chitosan Glucosamin chủ yếu được sử dụngtrong y học chữa bệnh thoái hoá khớp

Ở người già, chức năng cũng như cấu tạo của khớp có nhiều thay đổi, các

tế bào của khớp thoái hoá, trở nên kém linh động Gân và dây chằng phân đoạn,đóng vôi, khô cằn, trở nên kém bền bỉ, kém co dãn, không chịu được căng lực và

dễ bị tổn thương Sụn trở nên đục màu, xơ hóa, gai xương, khô nước, rạn nứt vớinhiều tinh thể canxi làm khớp đau Khớp co duỗi khó khăn vì màng hoạt dịchmỏng và khô dần [1]

Trước đây, trong điều trị các bệnh thoái hóa khớp người ta thường dùngcác thuốc thuộc nhóm corticoid hoặc nhóm kháng viêm giảm đau không steroid

nhóm này chỉ điều trị triệu chứng và có nhiều tác dụng phụ Với các thuốc thuộcnhóm corticoid thường gây nên các tác dụng phụ: loãng xương, viêm loét dạ dày,giảm miễn dịch… Đối với các NSAID thì gây viêm loét dạ dày…[12] Từ thập

kỷ 90 người ta đã phát hiện ra glucosamin phục hồi được các sụn khớp, tức làchữa được căn nguyên của bệnh viêm, thoái hoá khớp [2]

Đã có nhiều công trình nghiên cứu với nhiều thử nghiệm lâm sàng đãchứng minh tác dụng điều trị tận gốc bệnh thoái hoá khớp của glucosamin, nhất

là dạng phối hợp với dược liệu thiên nhiên Trên thực tế glucosamin thường được

sử dụng ở các dạng: glucosamin hydroclorua 4, glucosamin sulfat 5, N - Acetyl glucosamin 6 Hiện nay thuốc chứa glucosamin đã được lưu hành trên 70 quốc

gia

Tại Việt Nam, glucosamin và các thành phẩm đi từ glucosamin vẫn chủyếu là nhập khẩu và xu thế sử dụng ngày càng nhiều Trong khi đó nguồn nguyênliệu (vỏ giáp xác) chủ yếu để điều chế ra glucosamin thì dồi dào Để tận dụngnguồn nguyên liệu phế thải, tạo nguồn nguyên liệu cho việc sản xuất thuốc chữabệnh thoái hoá khớp và là nguyên liệu cho việc nghiên cứu các ứng dụng khác

của glucosamin chúng tôi đặt vấn đề tiến hành đề tài “Nghiên cứu điều chế

glucosamin từ vỏ tôm”.

Mục tiêu của đề tài nhằm giải quyết các vấn đề sau :

1 Phân lập chitin – chitosan từ vỏ tôm phế thải.

2 Điều chế glucosamin hydroclorua từ chitin và chitosan

Chương I: TỔNG QUAN

1.1 Nguồn gốc và sự tồn tại chitin - chitosan trong tự nhiên

Chitin - chitosan là một polysacharit tồn tại trong tự nhiên với sản lượngrất lớn (đứng thứ hai sau xellulose) Trong tự nhiên chitin tồn tại trong cả độngvật và thực vật

Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏmột số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giuntròn Trong động vật bậc cao monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong

mô da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da Trong thực vậtchitin có ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một sốloại tảo [13]

Chitin - chitosan là polysacharit có đạm không độc, có khối lượng phân tửlớn Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosacharit (N-acetyl-β-D-glucosamine)liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổchức Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn nốibởi các cầu nối đẳng trị (coralente) với các protein, CaCO3 và các hợp chất hữu

cơ khác

Hình 1 : Chitin và vỏ tôm

Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượngchitin - chitosan chiếm khá cao đao động từ 14 - 35% so với trọng lượng khô [5].

Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin - chitosan

Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1821,trong cặn dịch chiết từ một loại nấm Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” đểghi nhớ nguồn gốc của nó Năm 1823 Odier phân lập được một chất từ bọ cánhcứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưngông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó Cuối cùng cả Odier vàBraconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống với xellulose

O

NHCOCH3OH

CH2OH

O

NHCOCH3OH

CH2OH

O

O

NH2OH

CH2OH

O

NH2OH

CH2OH

O

O

OH OH

CH2OH

O

OH OH

CH2OH

O

2)

3) 1)

H×nh 2 :1) Chitin; 2) Chitosan; 3) Xellulose

1.2 Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá của chitin

1.2.1 Cấu trúc hoá học của chitin

Chitin 1 có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và đều đặn Bằng phương pháp

nhiễu xạ tia X Người ta đã chứng minh được chitin tồn tại ở ba dạng cấu hình :α,

β, γ - chitin [15]

Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi

Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũitên chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γ-chitin được mô tả như sau:

α - chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn,nên ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữacác lớp do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững Do các mắt xích sắpxếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt không gian và năng lượng Đây cũng làdạng phổ biến trong tự nhiên

β, γ - chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β - chitin) vàhai song song một ngược chiều (γ - chitin), giữa các lớp không có loại liên kếthydro Dạng β - chitin cũng có thể chuyển sang dạng α - chitin nhờ quá trìnhaxetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn

Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzym hay axit HCl đậm đặcthì người ta thấy rằng chitin có cấu trúc là một polyme được tạo thành từ các đơn

vị N-Acetyl-β-D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β-(1-4) glucozit

Công thức cấu tạo của chitin:

O O

HO

NHCCH3

O OH

Công thức phân tử: [C8H13O5N]n

Phân tử lượng : Mchitin = (203,09)n

1.2.2 Tính chất lý hoá của chitin [3]

Chitin có màu trắng hay màu trắng phớt hồng, dạng vảy hoặc dạng bột,không mùi, không vị, không tan trong nước, trong môi trường kiềm, axit loãng vàcác dung môi hữu cơ như ete, rượu …Nhưng tan trong dung dịch đặc nóng củamuối thioxianat liti (LiSCN) và thioxianat canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịchkeo, tan được trong hệ dimetylacetamid - LiCl 8% [4], tan trong hexafluoro-isopropyl alcohol (CF3CHOHCF3) và hexafluoracetone sesquihydrate(CF3COCF3.H2O) [16] Chitin có khả năng hấp thu tia hồng ngoại có bước sóng

884 - 890cm-1

Chitin ổn định với các chất oxy hoá mạnh như thuốc tím (KMnO4); oxygià (H2O2); nước javen (NaOCl - NaCl)…, lợi dụng tính chất này mà người ta sửdụng các chất oxy hoá trên để khử màu cho chitin

Khi đun nóng trong dung dịch NaOH đậm đặc (40 - 50%), ở nhiệt độ caothì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan:

Chitn OHCH2OH

NHCOCH3

Chitosan

CH2OH OH

CH2OH OH

NH2Glucosamin

HCl 36%

Chitn

T0cao

Phản ứng este hóa :

- Chitin tác dụng với HNO3 đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat

- Chitin tác dụng với anhydrit sunfuric trong pyridin, dioxan vàN,N-dimetylanilin cho sản phẩm chitin sunfonat

1.3 Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá sinh và độc tính của chitosan

1.3.1 Cấu trúc hoá học của chitosan [3]

Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan 2 là một trong những dẫn

xuất quan trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng trong thựctế

Việc sản xuất chitosan tương đối đơn giản, không cần dung môi, hóa chấtđộc hại, đắt tiền Chitosan thu được bằng phản ứng deacetyl hóa chitin, biến đổinhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2

Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta qui ước nếu

độ deacetyl hóa (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD

HO

NH2

O OH

2

Tên gọi khoa học: Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucose; amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose

poly(1-4)-2-Công thức phân tử: [C6H11O4N]n

Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n

Qua cấu trúc của chitin - chitosan ta thấy chitin chỉ có một nhóm chứchoạt động là -OH (H ở nhóm hydroxyl bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hydroxylbậc 2 trong vòng 6 cạnh) còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là -OH, -NH2,

do đó chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hóa học hơn chitin Trong thực tế cácmạch chitin - chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việctách và phân tích chúng rất phức tạp

1.3.2 Tính chất lý hoá của chitosan [3]

Chitosan có màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, tồn tại dạng bột hoặc dạngvảy, không mùi, không vị, nhiệt độ nóng chảy 309 - 3110C

Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, trong kiềm nhưng hoàtan được trong dung dịch axit hữu cơ loãng như: axit acetic, axit fomic, axitlactic…, tạo thành dung dịch keo nhớt trong suốt Chitosan hoà tan trong dungdịch axit acetic 1 - 1.5% Độ nhớt của chitosan trong dung dịch axit loãng liênquan đến kích thước và khối lượng phân tử trung bình của chitosan (đây cũng làtính chất chung của tất cả các dung dịch polyme) [6] Chitosan kết hợp vớialdehit trong điều kiện thích hợp để hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào,enzym Chitosan phản ứng với axit đậm đặc, tạo muối khó tan Chitosan tác dụngvới iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím

Một số dẫn xuất chitosan [26]:

O O

OH

O O

OH O

O

HO

NH3+OOH

O O

HO

NH3+O OCH2CH2SO3-

O O

HO NHCHO2COOH

OCH2COOH

O O

HO NHAcO

OCH2CH2CN

O O

HO NHAcO

OCS2-Na+

O O

HO N=CHROOH

O O

HO NHROOH

O O

HO NHCHO2COOHOH

O O

HO NHAcOOCH2CHOHR

O O

HO NH2 OOH

O O

- O NHAcO

O-Na+

O O

RH2CO NHAcO

HO NHAcOOCH2COOH

O O

HO NHAcOOH

Na +

Chitosan

Chitin

Crosslinked Chitosan Chitosan salts

Schiff base

Hình 3 : Sơ đồ các dẫn xuất đi từ chitin, chitosan.

1.3.3 Tính chất sinh học của chitosan [5]

Chitosan không độc, dùng an toàn cho người [18] Chúng có tính hoà hợpsinh học cao với cơ thể [19], có khả năng tự phân huỷ sinh học [20]

Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như: tính kháng nấm, tínhkháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinhcủa tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tácdụng cầm máu, chống sưng u [21]

Ngoài ra, chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu, hạhuyết áp [22], điều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết [23]

Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptit - insulin, kích thích việctiết ra insulin ở tuyến tụy nên chitosan đã được dùng để điều trị bệnh tiểu đường.Nhiều công trình đã công bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường

hệ thống miễn dịch cơ thể, khôi phục bạch cầu, hạn chế sự phát triển các tế bào u,ung thư, HIV/AIDS, chống tia tử ngoại, chống ngứa… của chitosan [24]

1.3.4 Độc tính của chitosan [5]

Vào năm 1968, K Arai và cộng sự đã xác định chitosan hầu như khôngđộc, chỉ số LD50 = 16g/kg cân nặng cơ thể, không gây độc trên súc vật thựcnghiệm và người, không gây độc tính trường diễn [25]

Nghiên cứu tiêm chitosan theo đường tĩnh mạch trên thỏ, các tác giả đã kếtluận: chitosan là vật liệu hoà hợp sinh học cao, nó là chất mang lý tưởng trong hệthống vận tải thuốc, không những sử dụng cho đường uống, tiêm tĩnh mạch, tiêmbắp, tiêm dưới da, mà còn sử dụng an toàn trong ghép mô [25]

Dùng chitosan loại trọng lượng phân tử trung bình thấp để tiêm tĩnh mạch,không thấy có tích luỹ ở gan Loại chitosan có DD ≈ 50%, có khả năng phân huỷsinh học cao, sau khi tiêm vào ổ bụng chuột, nó được thải trừ dễ dàng, nhanhchóng qua thận và nước tiểu, chitosan không phân bố tới gan và lá lách

Nhiều tác giả đã chỉ rõ những lợi điểm của chitosan: tính chất cơ học tốt,không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân hủy sinh học, hòa hợp sinh học khôngnhững đối với động vật mà còn đối với các mô thực vật, là vật liệu y sinh tốt làmmau liền vết thương [27]

1.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng trong thực tế của chitin và chitosan ở Việt Nam và trên Thế giới [3]

Trước đây người ta đã thử chiết tách chitin từ thực vật biển nhưng nguồnnguyên liệu không đủ để đáp ứng nhu cầu sản xuất Trữ lượng chitin phần lớn cónguồn gốc từ vỏ tôm, cua Trong một thời gian, các chất phế thải này không đượcthu hồi mà lại thải ra ngoài gây ô nhiễm môi trường Năm 1977 Viện kỹ thuậtMasachusetts (Mỹ), khi tiến hành xác định giá trị của chitin và protein trong vỏtôm, cua đã cho thấy việc thu hồi các chất này có lợi nếu sử dụng trong côngnghiệp Phần protein thu được sẽ dùng để chế biến thức ăn gia súc, còn phầnchitin sẽ được dùng như một chất khởi đầu để điều chế các dẫn xuất có nhiều ứngdụng trong lĩnh vực công nghiệp [16]

Việc nghiên cứu sản xuất chitin - chitosan và các ứng dụng của chúngtrong sản xuất phuc vụ đời sống là một hướng nghiên cứu tương đối mới mẻ ởnước ta Vào những năm 1978 đến 1980 Trường đại học Thuỷ sản Nha Trang đãcông bố quy trình sản xuất chitin - chitosan của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, nhưngchưa có ứng dụng cụ thể trong sản xuất Gần đây trước yêu cầu xử lý phế liệuthuỷ sản đông lạnh đang ngày càng cấp bách, trước những thông tin kỹ thuật mới

về chitin - chitosan cũng như tiềm năng thị trường của chúng đã thúc đẩy các nhàkhoa học của chúng ta bắt tay vào nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin

- chitosan ở bước cao hơn, đồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng trongcác lĩnh vực sản xuất công nghiệp

Hiện nay ở Việt Nam có nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuấtchitin - chitosan như: Trường Đại Học Nông Lâm - thành phố Hồ Chí Minh;Trung tâm nghiên cứu polyme - Viện Khoa Học Việt Nam; Viện Hoá thuộc phânViện Khoa Học Việt Nam tại thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm công nghệ vàsinh học Thuỷ sản - Viện nghiên cứu nuôi trồng Thuỷ sản 2

Ở miền Bắc, Viện Khoa Học Việt Nam đã kết hợp với Xí nghiệp thuỷ sản

Hà Nội sản xuất chitosan và ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp ở đồng lúaThái Bình và đã thu được một số kết quả đáng khích lệ

Ở miền Nam, Trung tâm công nghệ và sinh học thuỷ sản phối hợp với một

Việt Nam, Viện Khoa Học nông nghiệp miền nam,… đang nghiên cứu sản xuất

và ứng dụng chitin - chitosan trong lĩnh vực: nông nghiệp, y dược và mỹ phẩm

Trong nông nghiệp, chitosan được sử dụng để bảo vệ các hạt giống nhằmmục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng

cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt [7]

Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một

số chỉ tiêu sinh hoá của mạ lúa ở nhiệt độ thấp thì kết quả nghiên cứu cho thấychitosan vi lượng làm tăng hàm lượng diệp lục và hàm lượng nitơ; đồng thời hàmlượng các enzym như amylaza, catalaza hay peroxidaza cũng tăng lên

Ngày nay chitosan còn được dùng làm nguyên liệu bổ xung vào thức ăncho tôm, cá, cua để kích thích sinh trưởng

Những ứng dụng của chitin - chitosan và những dẫn xuất của chúng ngàycàng phát triển Một số đã đưa vào ứng dụng như là: chỉ khâu tự huỷ, da nhân tạo[4], thấu kính chiết xuất, và một số ứng dụng khác còn đang nghiên cứu như: tácđộng kích thích miễn dịch, chống sự phát triển của khối u, đặc tính làm giảmcholesterol máu [10], trị bỏng nhiệt [11]…

Da nhân tạo có nguồn gốc từ chitin, nó giống như một tấm vải và được bọc

ốp lên vết thương chỉ một lần đến khi khỏi Da nhân tạo bị phân huỷ sinh học từ

từ cho đến lúc hình thành lớp biểu bì mới Nó có tác dụng giảm đau, giúp cho cácvết sẹo bỏng phục hồi biểu bì nhanh chóng Trường Đại Học Dược Hà Nội, ĐạiHọc Y Hà Nội, Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ Quốc gia cũng đã chếtạo thành công loại da nhân tạo này và bước đầu ứng dụng có hiệu quả

Chitin - chitosan và các oligome của nó có đặc tính miễn dịch do nó kíchthích các tế bào giữ nhiệm vụ bảo vệ miễn dịch với các tế bào khối u và các tácnhân gây bệnh

Những nghiên cứu gần đây hướng vào các oligome, N-acetyl-glucosamin

và glucosamin, các chất này có một số tính chất của các polyme tương ứngnhưng lại có ưu thế là tan tốt trong nước do đó dễ dàng được hấp thụ

Hiện nay trên thế giới đã thành công việc sử dụng chitosan làm chất mang

để cố định enzym và tế bào Enzym cố định đã cho phép mở ra việc sử dụng rộngrãi enzym trong công nghiệp, y học và khoa học phân tích Enzym cố định được

sử dụng lâu dài, không cần thay đổi chất xúc tác Nhất là trong công nghệ làmsạch nước, làm trong nước hoa quả, sử dụng enzym cố định rất thuận lợi và đạthiệu quả cao Chitosan thoả mãn yêu cầu đối với một chất mang có phân tử lượnglớn, bền vững không tan và ổn định với các yếu tố hoá học.

Do có cấu trúc tương tự như xellulose nên chitosan được nghiên cứu bổsung vào làm nguyên liệu sản xuất giấy Chitosan làm tăng độ bền dai của giấy,đồng thời việc in trên giấy cũng tốt hơn Trong sản xuất giấy qua nghiên cứungười ta thấy nếu bổ sung 1% chitosan thì độ bền của giấy tăng lên khi bị ướt haytăng độ nét khi in [5]

Có thể thay hồ tinh bột bằng chitosan để hồ vải, nó có tác dụng làm tơ sợibền, mịn, bóng đẹp, cố định hình in, chịu được axit và kiềm nhẹ

Chitosan kết hợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt,vải chống thấm, sản xuất vải col…

Chitosan được sử dụng để sản xuất kem chống khô da do tính chất củachitosan là có thể cố định dễ dàng trên biểu bì của da nhờ các nhóm –NH+ Cácnhóm này liên kết với các tế bào sừng hóa của da, nhờ vậy mà các nhà khoa học

đã nghiên cứu sử dụng chitosan làm các loại kem dưỡng da chống nắng

Nhờ khả năng làm đông tụ các thể rắn lơ lửng giàu protein và nhờ khảnăng kết dính tốt các ion kim loại như Pb, Hg… do đó chitin được sử dụng để tẩylọc nguồn nước thải công nghiệp từ các nhà máy chế biến thực phẩm

Chitosan sử dụng để chống hiện tượng mất nước trong quá trình làm lạnh,làm đông thực phẩm

Do chitosan có tính chất diệt khuẩn, do đó nó được tạo thành màng mỏng

để bao gói thực phẩm chống ẩm mốc, chống mất nước

Đặc tính diệt khuẩn của chitosan được thể hiện trên các mặt sau :

• Khi tiếp xúc với thực phẩm chitin - chitosan sẽ lấy đi từ các vi sinhvật này các ion thiết yếu, ví dụ như ion Cu2+ Như vậy vi sinh vật sẽ

bị chết do sự mất cân bằng liên quan đến các ion thiết yếu

• Ngăn chặn phá hoại chức năng màng tế bào

• Gây ra sự rò rỉ các phần bên trong tế bào

Như vậy việc dùng chất chitosan bao bọc quanh bề mặt thực phẩm có thểkéo dài thời gian bảo quản, giảm sự hư hỏng do khả năng kháng nấm, khángkhuẩn của nó.

1.5 Cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa của glucosamin

Khi thủy phân chitin trong môi trường axit HCl đậm đặc, các mối nối amid

và osid đều bị phá hủy do đó thu được glucosamin 3 (là monome của chitosan).

Yếu tố nồng độ axit và nhiệt độ thủy phân rất quan trọng, nếu nồng độ của axitkhông thích hợp thì quá trình deacetyl hóa và deosid chỉ dừng lại giới hạn nhấtđịnh, nếu nhiệt độ không thích hợp thì sản phẩm cuối cùng là glucosamin có thể

bị giáng hóa thành những phân tử đơn giản hơn

Công thúc cấu tạo của glucosamin:

C C C C C

CH2OH

O

O OH

OH

NH2OH

CH2OH

H OH

NH2H

H HO

OH H

H

O HO

HO

NH2

OH OH

Tên UIPAC: (3R,4R,5S,6R)-3-amino-6-(hydroxymethyl)oxane-2,4,5-triol

Tên gọi khác: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose; glucopyranose; chitosamine; D-glucosamine; D-(+)- glucosamine

2-amino-2-deoxy-β-D-Công thức phân tử: C6H13O5N

Phân tử lượng: Mglucosamin = 179,17

Hình 4 : Cấu trúc không gian của glucosamin

Glucosamin là chất rắn dạng tinh thể, không màu, không mùi, điểm nóngchảy 880C, điểm phân hủy 1100C, tan được trong nước và trong methanol sôi, hơitan trong methanol hoặc ethanol, không tan trong ether và chloroform

Một số phản ứng của glucosamin [14]:

• Phản ứng tráng bạc:

Giống như glucose, glucosamin cho phản ứng tráng bạc khá rõ ràng:

C5H12O4NCHO + 2[Ag(NH3)]OH

CHO CHNH2CHO CHO CHOH

CH2OH

CHO CHNH2

+ 2 H2O

• Phản ứng với C6H5CH=O

Phản ứng xác nhận có mặt của NH2 Bazơ Shiff tạo ra dưới dạng keosánh màu nâu:

1.6 Cấu trúc hóa học và tính chất vật lý một số muối của glucosamin

Trong thực tế, một số dẫn xuất của glucosamin được sử dụng làm nguyênliệu làm thuốc

4

Tên gọi khoa học: 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose hydrochloride;Chitosamine hydrochloride; D-glucosamine hydrochloride; D-(+)-glucosaminehydrochloride

Công thức phân tử: C6H13O5N.HCl

Phân tử lượng: Mglucosamin.HCl = 215.63

Glucosamin hydroclorua là chất rắn dạng tinh thể màu trắng, không mùi Điểm nóng chảy 190-1940C hoặc 3000C

Tan được trong nước 0,1g/ml

Tên gọi khoa học: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose sulfate; D-glucosaminesulfate.

Tan được trong nước, 0,1g/ml

1.7 Dược lý và dược động học của glucosamin và muối của nó [9]

Glucosamine là một aminomonosacharit đượcthấy trong tự nhiên, nguyên liệu để tổng hợpproteoglycan Glucosamin kích thích tế bào sụn khớptăng tổng hợp và trùng hợp nên cấu trúc proteoglycanbình thường Kết quả của quá trình trùng hợp là tạo ramucopolysaccharit, thành phần cơ bản tạo nên sụn khớp.Bình thường sụn khớp được cấu tạo chủ yếu bởi nước,collagen và proteoplycan

Glucosamin đồng thời ức chế các enzym phá

hủy sụn khớp như collagenase, phospholipase A2 và

giảm các gốc tự do superoxid phá hủy các tế bào

Hình 5 : Đau

xương cột sống

sụn Glucosamin còn có tác dụng kích thích sinh sản mô liên kết của xương, giảmquá trình mất canxi của xương [ 9].

Khi thiếu glucosamin thì sụn đặc biệt là sụn khớp háng, đầu gối bị hỏng,cứng, tạo gai xương gây biến dạng khớp làm hạn chế vận động, dẫn đến bệnhviêm xương khớp phát triển

Do glucosamin làm tăng sản xuất chất nhầy

dịch khớp nên tăng độ nhớt, khả năng bôi trơn của

dịch khớp, vì thế không những làm giảm triệu

chứng của thoái hóa khớp (đau, khó vận động) mà

còn ngăn chặn quá trình thoái hóa khớp, ngăn chặn

bệnh tiến triển [9]

Thuốc tác động vào cơ chế sinh bệnh của

thoái hóa khớp, điều trị các bệnh thoái hóa xương

khớp cả cấp và mãn tính, cải thiện chức năng khớp

và ngăn chặn bệnh tiến triển, phục hồi cấu trúc sụn

khớp

Từ tuổi 45 - 50 trở lên, bệnh có chiều hướng tăng (27% ở tuổi 60 - 70%,45% ở tuổi 80) Đối tượng nguy cơ dễ mắc bệnh khớp nhất là người già, ngườibéo phì, người bị chấn thương khớp, có dị tật bẩm sinh, bệnh về chuyển hoá, ditruyền hoặc bị xáo trộn về kích tố [1]

Các muối của glucosamin có khả năng giải phóng và sản sinhmucopolysacharit khuếch tán tốt vào dịch khớp, phát huy tốt tác dụng chốngviêm khớp

Các dẫn xuất glucosamin thông dụng được dùng phổ biến ngày nay là:

Hình 7 :Các vị trí khớp nối

Những năm gần đây, glucosamin được dùng rộng rãi trong điều trị viêmkhớp, thoái hóa khớp Tuy nhiên, theo một nghiên cứu mới của tiến sĩ RonaldTallarida thuộc trường Đại Học Y khoa Temple, Philadelphia (Mỹ) cho thấy nếu

sử dụng glucosamin đơn độc sẽ không có hiệu quả chống đau Nhưng nếu kếthợp với một loại thuốc nhóm kháng viêm không steroid (NSAID) thì tác dụngchống đau, chống viêm tăng lên rất nhiều

Thực tế lâm sàng cho thấy nó mang lại nhiều ưu điểm trong điều trị hơnhẳn các thuốc NSAID Nhược điểm của thuốc NSAID là có nhiều tác dụng phụ,còn khi sử dụng glucosamin thì lại rất ít tác

dụng phụ Một vài dị ứng không đáng kể đối với

người có cơ địa quá mẫn cảm với thuốc

Trước đây glucosamin được xếp vào

nhóm thuốc bảo vệ sụn (gồm có glucosamin,

chondroitin và diacerin) hay thuốc tác dụng

chậm với các bệnh viêm khớp Hiện nay cơ

quan Dược phẩm Châu Âu (EMEA) chấp nhận

xếp glucosamin vào danh mục thuốc giúp cải

thiện cấu trúc trong bệnh viêm khớp Các loại

khác chưa được chấp nhận vì không đáp ứng

được các yếu cầu trên lâm sàng

Ở Việt Nam hiện nay cũng đang sử dụng

một số loại thuốc có chứa glucosamin như :

Lubrex, Lubrex-F, Glucosamin, Glusivac,…[9]

Nhưng các thuốc này chủ yếu vẫn nhập khẩu từ

nước ngoài

Đã có rất nhiều nghiên cứu thử nghiệm

so sánh glucosamin với các loại thuốc NSAID,

cho kết quả như sau [8]:

Hình 8 : Một số thuốc glucosamin hiện đang lưu bày

1 Cải thiện triệu chứng viêm khớp tương đương với NSAID trong thời gianngắn và vượt trội hơn hẳn nếu uống thuốc thời gian dài.

2 Tính an toàn hơn hẳn với các loại đi từ NSAID

3 Người ta dùng phối hợp glucosamine và NSAID cho kết quả tốt hơn khidùng đơn độc NSAID trong thời gian ngắn Sau đó ngưng sử dụngNSAID, tiếp tục sử dụng glucosamin thì tình trạng cải thiện vẫn tiếp tụcđược duy trì theo kiểu tuyến tính

4 Người ta thấy nếu dùng NSAID, những ích lợi giảm triệu chứng cho bệnhnhân sẽ nhanh chóng mất đi ngay sau khi ngưng thuốc Ngược lại, ngưnguống glucosamin tác dụng vẫn tiếp tục kéo dài trong nhiều tháng sau đó

5 Với những bệnh nhân tuân thủ phác đồ điều trị dùng glucosamin càng dàithì lợi ích kinh tế càng lớn vì tính an toàn và hiệu quả của nó càng đượcphát huy

Theo các nhà nghiên cứu khi bị hấp thu vào dạ dày, muối glucosaminsulfat bị ion hóa hoàn toàn do nồng độ tương đối lớn axit HCl (pH = 1 - 3) sẵn cótrong dạ dày Như một tất yếu, các ion glucosamin và các ion sulfate bị trộn lẫnvới một lượng lớn ion Cl- và ion H+ Nếu khảo sát hỗn hợp này và tách loại muốiglucosamin ra thì lại nhận được 99% muối glucosamin hydroclorua do muốidạng sulfate đã bị mất đáng kể do nồng độ rất thấp so với nồng độ rất lớn axitHCl có mặt trong dạ dày

1.8 Một số quy trình sản xuất chitin, chitosan trên thế giới và tại Việt Nam

1.8.1 Trên thế giới

1.8.1.1 Quy trình thủy nhiệt Yamasaki và Nacamichi (Nhật bản) [3]

Nguyên liệu là vỏ cua đã khô, sạch được đem khử khoáng bằng HCl 2Ntrong thời gian là 1 giờ (tác giả cho rằng hiệu quả khử khoáng có thể đạt được100%)

Sau đó đem rửa sạch và đem làm khô Tiếp theo là tiến hành kết hợp haicông đoạn khử protein và deacetyl đồng thời trong dung dịch NaOH 15N ở nhiệt

deacetyl đạt trên 70% Sau thời gian 1 giờ đem rửa sạch và làm khô sẽ thu đượcchitosan thành phẩm.

Phương pháp này có ưu điểm là quy trình đơn giản công đoạn, rút ngắnđáng kể thời gian sản xuất so với các quy trình khác Hóa chất sử dụng ít (HCl vàNaOH), chitosan thu được có độ tinh khiết cao Tuy nhiên cũng có nhược điểm làsản phẩm chitosan thu được có độ nhớt thấp, tiêu tốn nhiều năng lượng cho cáckhâu sản xuất

1.8.1.2 Quy trình sản xuất chitin của Hackman [3]

Vỏ tôm hùm được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 1000C; tiếp theo đượckhử khoáng bằng HCl 2N với tỷ lệ w/v=1/10 ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 5giờ đem rửa trung tính và sấy khô ở 1000C, và đem xay nhỏ

Ngâm tiếp trong dung dịch HCl 2N với tỷ lệ w/v=1/2,5 ở nhiệt độ phòng.Sau 48 giờ đem ly tâm thu phần bã và đem rửa trung tính Ngâm bã bột đã rửatrong dung dịch NaOH 1N với tỷ lệ w/v= 1/2,5 ở nhiệt độ 1000C, sau 42 giờ đem

ly tâm thu phần bã Sau đó lại tiếp tục ngâm trong NaOH 1N với tỷ lệ và nhiệt độtrên, sau 12 giờ đem ly tâm thu phần bã Tiếp theo đó rửa trung tính và đem làmsạch bằng cách ly tâm với các chất theo thứ tự: nước, etanol và ete Sau đó làmkhô ta được sản phẩm dạng bột màu kem

Với quy trình này thì có nhiều công đoạn tăng khả năng khử khoáng, khửprotein song do cồng kềnh, chỉ thích hợp cho đối tượng là vỏ tôm hùm, tôm mũ

ni và vỏ cua, thời gian thực các công đoạn kéo dài, do đó quy trình Hackman chỉmang tính nghiên cứu thí nghiệm, không có tính khả thi nếu sản xuất đại trà, quytrình mới chỉ dừng lại đến sản phẩm là chitin

1.8.1.3 Quy trình sản xuất chitosan của Pháp [3]

Nguyên liệu (vỏ tôm) sạch được đem đi hấp chín, phơi khô, ta đem đi xaynhỏ Khử proteinn bằng NaOH 3,5% với tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ 650C, sau 2giờ vớt ra rửa trung tính, tiếp đó ngâm trong HCl 1N với tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt

độ phòng sau 2 giờ vớt ra tiến hành tẩy các chất màu hữu cơ bằng aceton với tỷ

lệ w/v=1/5, ở nhiệt độ phòng sau 30 phút vớt ra rửa sạch và tẩy màu lại bằngnước javen (NaOCl + NaCl) 0,135%, tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ phòng sau 6 phút

bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v=1/4, ở nhiệt độ 850C sau thời gian 4 giờ đem rửatrung tính, thu được chitosan.

Quy trình có ưu điểm là thời gian sản xuất ngắn, sản phẩm có màu sắc đẹp,sạch do có hai bước khử sắc tố Tuy nhiên NaOCl là một chất oxy hóa mạnh, ảnhhưởng đến mạch polyme, do đó độ nhớt sản phẩm giảm rõ rệt Mặt khác aceton

có giá trị đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm sẽ cao Chưa kể các yếu tốtrong an toàn sản xuất, công nghệ này khó áp dụng trong điều kiện sản xuất ởnước ta hiện nay

1.8.1.4 Phương pháp điều chế chitin của Capozza [17]

Cân 149g nguyên liệu vỏ tôm sạch cho vào bình khuấy với một máykhuấy, thêm từ từ 825ml axit HCl 2N vào bình, thực hiện phản ứng ở 40C trongthời gian 48 giờ Sản phẩm sau quá trình khử khoáng được rửa sạch bằng nướcđến pH = 7 Xác định hàm lượng tro 0,4 - 0,5% Sau đó sản phẩm được khuấy ởnhiệt độ phòng với 1500ml axit fomic HCOOH 90%, để qua đêm Hỗn hợp đượclọc ly tâm lấy phần bã và rửa lại với nước nhiều lần cho đến khi pH = 7 Sảnphẩm sạch sau đó được ngâm ngập trong 2 lít dung dịch NaOH 10% và đun nóng

ở 90 - 1000C trong 2,5 giờ Dung dịch được lọc và rửa sạch với nước đến pH = 7,sau đó sản phẩm được tráng rửa lại trong ethanol 960 và ether Sấy khô ở 400Cdưới áp suất giảm Khối lượng chitin khô sạch thu được là 66g Hiệu suất 44,3%

1.8.2 Tại Việt Nam

1.8.2.1 Quy trình sản xuất chitosan của Đỗ Minh Phụng [3]

Nguyên liệu là vỏ tôm khô được khử khoáng bằng HCl 6N với tỷ lệw/v=1/2,5, ở nhiệt độ phòng, sau 48 giờ đem rửa trung tính, tiếp theo đun trongNaOH 8% với tỷ lệ w/v=1/1,5, ở nhiệt độ 1000C, sau 2 giờ khử protein rồi đemrửa trung tính

Tiến hành tẩy màu bằng KMnO4 1% trong môi trường H2SO4 10%, sau 1giờ đem rửa sạch và khử màu phụ bằng Na2S2O3 1,5% trong 15 phút, vớt ra rửasạch thu được chitin

Deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v=1/1, ở nhiệt độ 800C sau 24giờ đem rửa sạch và cuối cùng thu được chitosan

Sản phẩm có chất lượng khá tốt, chitin có màu trắng đẹp Song thời giancòn dài, sử dụng nhiều chất oxy hóa dễ làm ảnh hưởng tới độ nhớt của sản phẩm.

1.8.2.2 Quy trình sản xuất chitosan ở Trung tâm cao phân tử Viện Khoa Học Việt Nam [3]

Nguyên liệu là vỏ ghẹ hay vỏ tôm sạch được khử khoáng lần 1 bằng HCl4% ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 24 giờ đem rửa trung tính để làm giảm lượngNaOH tiêu hao ở công đoạn sau

Nấu trong NaOH 3% ở nhiệt độ 90 - 950C, sau 3 giờ đem rửa trung tính,tiếp tục khử khoáng lần 2 bằng HCl ở nhiệt độ phòng, sau 24 giờ đem di rửatrung tính và đem nấu lần 2 trong NaOH ở nhiệt độ 90 - 950C, sau 3 giờ đem rửatrung tính Cuối cùng nấu trong NaOH 40%, rửa trung tính và sấy khô thu đượcchitosan

Sản phẩm chitosan sản xuất theo quy trình này có màu sắc không đẹp bằngsản phẩm theo quy trình của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, thời gian thực hiện quy trìnhkéo dài, nhiều công đoạn

1.8.2.3 Quy trình sản xuất chitin của Xí nghiệp thủy sản Hà Nội [3]

Nguyên liệu là vỏ tôm khô hoặc tươi được loại bỏ hết tạp chất, xử lý táchkhoáng lần 1 trong HCl 4%, tỷ lệ w/v=1/2, ở nhiệt độ phòng sau 24giờ vớt ra rửatrung tính Sau đó dùng NaOH 2% để tách protein lần 1 với tỷ lệ w/v=1/2,8 ởnhiệt độ 90=950C, sau 3 giờ rửa và tiến hành khử khoáng lần 2 cũng dùng HCl4%, tỷ lệ w/v=1/2, ở nhiệt độ phòng sau 24 giờ đem rửa trung tính Để táchprotein lần 2 cũng dùng NaOH 2%, w/v=1/2,8, ở nhiệt độ 90=950C, sau 3 giờ rửatrung tính và tiến hành khử khoáng lần 3 cũng giống như lần khử khoáng trên.Sản phẩm đem làm khô thu được chitin

Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy màu.Nhưng nhược điểm là thời gian sản xuất của quy trình kéo dài, nồng độ hóa chất

xử lý cao kết hợp với thời gian xử lý dài (công đoạn khử khoáng) làm cắt mạchpolyme trong môi trường axit dẫn đến độ nhớt giảm

1.8.2.4 Quy trình sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học [3]

Việc sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học cũngthực hiện theo các bước : khử khoáng, khử protein và deacetyl.

Công đoạn khử khoáng hiệu quả nhất và duy nhất chỉ thực hiện bằngphương pháp hóa học

Công đoạn khử protein và deacetyl có thể thay thế bằng phương pháp sinhhọc, đó là khử protein bằng proteaza và deacetyl bằng enzym deacetylaza

Vỏ tôm được ngâm trong HCl 10% tỷ lệ w/v = 1/10, để ở nhiệt độ phòngtrong thời gian 5giờ Rửa sạch đến pH= 7 Sau đó khử protein bằng papain 13%,

tỷ lệ w/v = 1/5, pH = 5 - 5,5, ở nhiệt độ 70 - 800C trong thời gian 4 giờ Rửa sạch,tẩy màu và sấy khô ở 600C thu được chitin khô, trắng Deacetyl chitin bằngNaOH 35%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở 900C trong thời gian 5,5 giờ Rửa sạch và sấykhô thu được chitosan sạch

Chitosan thu được có màu sắc trắng, đẹp, trong và mềm mại Quy trìnhpapain cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các quy trình khác Tuy nhiên điều kiệnkhó khăn do việc tìm mua hoặc sản xuất enzym deacetylaza nên công đoạndeacetyl được thực hiện bằng việc nấu NaOH đậm đặc

1.9 Quy trình sản xuất glucosamin hydroclorua (glu.HCl)

1.9.1 Quy trình sản xuất glu.HCl của Trần Thị Luyến [3]

Để khử khoáng, vỏ tôm được ngâm trong HCl 10%, tỷ lệ w/v = 1/10, ởnhiệt độ phòng trong thời gian 5 giờ, sau đó vớt ra rửa sạch đến pH=7 Sau đókhử protein kết hợp deacetyl hóa trong NaOH 40%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ

95 - 1000C trong thời gian 6,5 giờ Tẩy màu rửa sạch, sấy khô Chitosan đượcđun trong HCl 35%, tỷ lệ w/v = 1/4, ở nhiệt độ 95 - 1000C trong thời gian 4 giờ.Sau đó lọc bỏ cặn, làm lạnh 0 - 20C trong thời gian 2 giờ khi đó kết tinh sẽ xuấthiện Lọc tách kết tinh, hòa tan trong nước cất, khử màu qua than hoạt tính, côcạn và lại thực hiện kết tinh Sau khi kết tinh lần cuối (khoảng 3 lần), tinh thểtrắng, lọc lấy tinh thể đem rửa lại bằng cồn, sau đó sấy khô ở 50 - 600C

1.9.2 Quy trình sản xuất glu.HCl của Đỗ Đình Rãng [14]

Vỏ tôm khô, sạch, nghiền thành bột, sau đó đun sôi nguyên liệu với nước

khoáng, rửa sạch đến pH=7 và sấy khô Khử hoàn toàn protein trong NaOH 5%,đun sôi Sản phẩm rửa sạch đến pH=7, sấy khô Chitin thu được có màu trắngphớt hồng Từ chitin để chuyển hóa thành glucosamin bằng cách thủy phân trongdung dịch axit HCl đậm đặc 36%, ở nhiệt độ 1000C, tẩy màu băng than hoạt tính,

để kết tinh và lọc Sấy khô, thu được tinh thể glucosamin hydroclorua trắng Hiệusuất quá trình 51,4%

Chương II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

*Dụng cụ thí nghiệm:

Bình tam giác, bình cầu cổ nhám, cốc thủy tinh, cân phân tích, nhiệt kế,thiết bị đo điểm nóng chảy, tủ sấy, bình hút ẩm, thiết bị gia nhiệt, khuấy từ, sinhhàn hồi lưu, dụng cụ lọc…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

1 Sử dụng các phương pháp chiết tách hóa học để tách chiết vỏ tôm thuđược chitin và deacetyl hóa chitin trong dung dịch NaOH đậm đặc thuđược chitosan

2 Tổng hợp glucosamin hydroclorua từ chitin và chitosan

3 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng như: thời gian phản ứng,nhiệt độ phản ứng và nồng độ tác nhân tác nhân phản ứng

4 Kiểm tra cấu trúc của sản phẩm điều ra thông qua các loại phổ như : IR,

1H-NMR, 13C-NMR tại Viện Hóa Học – Viện Khoa Học Việt Nam Sosánh với các số liệu phổ đã công bố để xác định cấu trúc sản phẩm

- Đo phổ IR trên máy FTR – IMPACT 410 của hãngNicolet

- Đo phổ 1H – NMR và 13C – NMR trên máy Bruker 500MHz trong dung môi D O