NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ GLUCOSAMIN TỪ VỎ TÔM

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ GLUCOSAMIN TỪ VỎ TÔM

TỔNG QUAN

Nguồn gốc và sự tồn tại chitin - chitosan trong tự nhiên

Chitin - chitosan là một polysacharit tồn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (đứng thứ hai sau xellulose) Trong tự nhiên chitin tồn tại trong cả động vật và thực vật

Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn Trong động vật bậc cao monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da Trong thực vật chitin có ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo [13]

Chitin - chitosan là polysacharit có đạm không độc, có khối lượng phân tử lớn Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosacharit (N-acetyl-β-D-glucosamine) liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ chức Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn nối bởi các cầu nối đẳng trị (coralente) với các protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác

Hình 1 : Chitin và vỏ tôm http://www.ebook.edu.vn

Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin - chitosan chiếm khá cao đao động từ 14 - 35% so với trọng lượng khô [5]

Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin - chitosan

Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1821, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó Năm 1823 Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống với xellulose

Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá của chitin

Chitin 1 có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và đều đặn Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X Người ta đã chứng minh được chitin tồn tại ở ba dạng cấu hình :α, β, γ - chitin [15]

Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích (N-acetyl-D-glucosamin) trong mạch http://www.ebook.edu.vn

Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũi tên chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γ- chitin được mô tả như sau: α - chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững Do các mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt không gian và năng lượng Đây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên β, γ - chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β - chitin) và hai song song một ngược chiều (γ - chitin), giữa các lớp không có loại liên kết hydro Dạng β - chitin cũng có thể chuyển sang dạng α - chitin nhờ quá trình axetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn

Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzym hay axit HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng chitin có cấu trúc là một polyme được tạo thành từ các đơn vị N-Acetyl-β-D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β-(1-4) glucozit

Công thức cấu tạo của chitin:

Tên gọi : Poly(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose; Poly(1-4)-2- acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranose α - Chitin β - Chitin γ - Chitin http://www.ebook.edu.vn

1.2.2 Tính ch ấ t lý hoá c ủ a chitin [3]

Chitin có màu trắng hay màu trắng phớt hồng, dạng vảy hoặc dạng bột, không mùi, không vị, không tan trong nước, trong môi trường kiềm, axit loãng và các dung môi hữu cơ như ete, rượu …Nhưng tan trong dung dịch đặc nóng của muối thioxianat liti (LiSCN) và thioxianat canxi (Ca(SCN) 2 ) tạo thành dung dịch keo, tan được trong hệ dimetylacetamid - LiCl 8% [4], tan trong hexafluoro- isopropyl alcohol (CF3CHOHCF3) và hexafluoracetone sesquihydrate (CF 3 COCF 3 H 2 O) [16] Chitin có khả năng hấp thu tia hồng ngoại có bước sóng

Chitin ổn định với các chất oxy hoá mạnh như thuốc tím (KMnO4); oxy già (H 2 O 2 ); nước javen (NaOCl - NaCl)…, lợi dụng tính chất này mà người ta sử dụng các chất oxy hoá trên để khử màu cho chitin

Khi đun nóng trong dung dịch NaOH đậm đặc (40 - 50%), ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan:

Khi đun nóng trong axit HCl đậm đặc, ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị cắt mạch thu được glucosamin:

- Chitin tác dụng với HNO 3 đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat

- Chitin tác dụng với anhydrit sunfuric trong pyridin, dioxan và N,N-dimetylanilin cho sản phẩm chitin sunfonat.

Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá sinh và độc tính của chitosan

http://www.ebook.edu.vn

Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan 2 là một trong những dẫn xuất quan trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng trong thực tế

Việc sản xuất chitosan tương đối đơn giản, không cần dung môi, hóa chất độc hại, đắt tiền Chitosan thu được bằng phản ứng deacetyl hóa chitin, biến đổi nhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C 2

Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta qui ước nếu độ deacetyl hóa (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD

Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị 2-amino-2-deoxy-β-D- glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4) glucozit

Công thức cấu tạo của chitosan:

Tên gọi khoa học: Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucose; poly(1-4)-2- amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose

Qua cấu trúc của chitin - chitosan ta thấy chitin chỉ có một nhóm chức hoạt động là -OH (H ở nhóm hydroxyl bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hydroxyl bậc 2 trong vòng 6 cạnh) còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là -OH, -NH 2 , do đó chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hóa học hơn chitin Trong thực tế các mạch chitin - chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức tạp http://www.ebook.edu.vn

1.3.2 Tính ch ấ t lý hoá c ủ a chitosan [3]

Chitosan có màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, tồn tại dạng bột hoặc dạng vảy, không mùi, không vị, nhiệt độ nóng chảy 309 - 311 0 C

Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, trong kiềm nhưng hoà tan được trong dung dịch axit hữu cơ loãng như: axit acetic, axit fomic, axit lactic…, tạo thành dung dịch keo nhớt trong suốt Chitosan hoà tan trong dung dịch axit acetic 1 - 1.5% Độ nhớt của chitosan trong dung dịch axit loãng liên quan đến kích thước và khối lượng phân tử trung bình của chitosan (đây cũng là tính chất chung của tất cả các dung dịch polyme) [6] Chitosan kết hợp với aldehit trong điều kiện thích hợp để hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào, enzym Chitosan phản ứng với axit đậm đặc, tạo muối khó tan Chitosan tác dụng với iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím

Một số dẫn xuất chitosan [26]:

Hình 3 : Sơ đồ các dẫn xuất đi từ chitin, chitosan http://www.ebook.edu.vn

Chitosan không độc, dùng an toàn cho người [18] Chúng có tính hoà hợp sinh học cao với cơ thể [19], có khả năng tự phân huỷ sinh học [20]

Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như: tính kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống sưng u [21]

Ngoài ra, chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu, hạ huyết áp [22], điều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết [23]

Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptit - insulin, kích thích việc tiết ra insulin ở tuyến tụy nên chitosan đã được dùng để điều trị bệnh tiểu đường Nhiều công trình đã công bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường hệ thống miễn dịch cơ thể, khôi phục bạch cầu, hạn chế sự phát triển các tế bào u, ung thư, HIV/AIDS, chống tia tử ngoại, chống ngứa… của chitosan [24]

Vào năm 1968, K Arai và cộng sự đã xác định chitosan hầu như không độc, chỉ số LD 50 = 16g/kg cân nặng cơ thể, không gây độc trên súc vật thực nghiệm và người, không gây độc tính trường diễn [25]

Nghiên cứu tiêm chitosan theo đường tĩnh mạch trên thỏ, các tác giả đã kết luận: chitosan là vật liệu hoà hợp sinh học cao, nó là chất mang lý tưởng trong hệ thống vận tải thuốc, không những sử dụng cho đường uống, tiêm tĩnh mạch, tiêm bắp, tiêm dưới da, mà còn sử dụng an toàn trong ghép mô [25]

Dùng chitosan loại trọng lượng phân tử trung bình thấp để tiêm tĩnh mạch, không thấy có tích luỹ ở gan Loại chitosan có DD ≈ 50%, có khả năng phân huỷ sinh học cao, sau khi tiêm vào ổ bụng chuột, nó được thải trừ dễ dàng, nhanh chóng qua thận và nước tiểu, chitosan không phân bố tới gan và lá lách

Nhiều tác giả đã chỉ rõ những lợi điểm của chitosan: tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân hủy sinh học, hòa hợp sinh học không những đối với động vật mà còn đối với các mô thực vật, là vật liệu y sinh tốt làm mau liền vết thương [27] http://www.ebook.edu.vn

Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng trong thực tế của chitin và

Trước đây người ta đã thử chiết tách chitin từ thực vật biển nhưng nguồn nguyên liệu không đủ để đáp ứng nhu cầu sản xuất Trữ lượng chitin phần lớn có nguồn gốc từ vỏ tôm, cua Trong một thời gian, các chất phế thải này không được thu hồi mà lại thải ra ngoài gây ô nhiễm môi trường Năm 1977 Viện kỹ thuật Masachusetts (Mỹ), khi tiến hành xác định giá trị của chitin và protein trong vỏ tôm, cua đã cho thấy việc thu hồi các chất này có lợi nếu sử dụng trong công nghiệp Phần protein thu được sẽ dùng để chế biến thức ăn gia súc, còn phần chitin sẽ được dùng như một chất khởi đầu để điều chế các dẫn xuất có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp [16]

Việc nghiên cứu sản xuất chitin - chitosan và các ứng dụng của chúng trong sản xuất phuc vụ đời sống là một hướng nghiên cứu tương đối mới mẻ ở nước ta Vào những năm 1978 đến 1980 Trường đại học Thuỷ sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitin - chitosan của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, nhưng chưa có ứng dụng cụ thể trong sản xuất Gần đây trước yêu cầu xử lý phế liệu thuỷ sản đông lạnh đang ngày càng cấp bách, trước những thông tin kỹ thuật mới về chitin - chitosan cũng như tiềm năng thị trường của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học của chúng ta bắt tay vào nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin

- chitosan ở bước cao hơn, đồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực sản xuất công nghiệp

Hiện nay ở Việt Nam có nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuất chitin - chitosan như: Trường Đại Học Nông Lâm - thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm nghiên cứu polyme - Viện Khoa Học Việt Nam; Viện Hoá thuộc phân Viện Khoa Học Việt Nam tại thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm công nghệ và sinh học Thuỷ sản - Viện nghiên cứu nuôi trồng Thuỷ sản 2 Ở miền Bắc, Viện Khoa Học Việt Nam đã kết hợp với Xí nghiệp thuỷ sản

Hà Nội sản xuất chitosan và ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp ở đồng lúa Thái Bình và đã thu được một số kết quả đáng khích lệ Ở miền Nam, Trung tâm công nghệ và sinh học thuỷ sản phối hợp với một số cơ quan khác: Đại Học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, phân Viện Khoa Học http://www.ebook.edu.vn

Việt Nam, Viện Khoa Học nông nghiệp miền nam,… đang nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chitin - chitosan trong lĩnh vực: nông nghiệp, y dược và mỹ phẩm Trong nông nghiệp, chitosan được sử dụng để bảo vệ các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt [7] Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một số chỉ tiêu sinh hoá của mạ lúa ở nhiệt độ thấp thì kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan vi lượng làm tăng hàm lượng diệp lục và hàm lượng nitơ; đồng thời hàm lượng các enzym như amylaza, catalaza hay peroxidaza cũng tăng lên

Ngày nay chitosan còn được dùng làm nguyên liệu bổ xung vào thức ăn cho tôm, cá, cua để kích thích sinh trưởng

Những ứng dụng của chitin - chitosan và những dẫn xuất của chúng ngày càng phát triển Một số đã đưa vào ứng dụng như là: chỉ khâu tự huỷ, da nhân tạo

[4], thấu kính chiết xuất, và một số ứng dụng khác còn đang nghiên cứu như: tác động kích thích miễn dịch, chống sự phát triển của khối u, đặc tính làm giảm cholesterol máu [10], trị bỏng nhiệt [11]…

Da nhân tạo có nguồn gốc từ chitin, nó giống như một tấm vải và được bọc ốp lên vết thương chỉ một lần đến khi khỏi Da nhân tạo bị phân huỷ sinh học từ từ cho đến lúc hình thành lớp biểu bì mới Nó có tác dụng giảm đau, giúp cho các vết sẹo bỏng phục hồi biểu bì nhanh chóng Trường Đại Học Dược Hà Nội, Đại Học Y Hà Nội, Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ Quốc gia cũng đã chế tạo thành công loại da nhân tạo này và bước đầu ứng dụng có hiệu quả

Chitin - chitosan và các oligome của nó có đặc tính miễn dịch do nó kích thích các tế bào giữ nhiệm vụ bảo vệ miễn dịch với các tế bào khối u và các tác nhân gây bệnh

Những nghiên cứu gần đây hướng vào các oligome, N-acetyl-glucosamin và glucosamin, các chất này có một số tính chất của các polyme tương ứng nhưng lại có ưu thế là tan tốt trong nước do đó dễ dàng được hấp thụ

Hiện nay trên thế giới đã thành công việc sử dụng chitosan làm chất mang để cố định enzym và tế bào Enzym cố định đã cho phép mở ra việc sử dụng rộng rãi enzym trong công nghiệp, y học và khoa học phân tích Enzym cố định được http://www.ebook.edu.vn sử dụng lâu dài, không cần thay đổi chất xúc tác Nhất là trong công nghệ làm sạch nước, làm trong nước hoa quả, sử dụng enzym cố định rất thuận lợi và đạt hiệu quả cao Chitosan thoả mãn yêu cầu đối với một chất mang có phân tử lượng lớn, bền vững không tan và ổn định với các yếu tố hoá học

Do có cấu trúc tương tự như xellulose nên chitosan được nghiên cứu bổ sung vào làm nguyên liệu sản xuất giấy Chitosan làm tăng độ bền dai của giấy, đồng thời việc in trên giấy cũng tốt hơn Trong sản xuất giấy qua nghiên cứu người ta thấy nếu bổ sung 1% chitosan thì độ bền của giấy tăng lên khi bị ướt hay tăng độ nét khi in [5]

Có thể thay hồ tinh bột bằng chitosan để hồ vải, nó có tác dụng làm tơ sợi bền, mịn, bóng đẹp, cố định hình in, chịu được axit và kiềm nhẹ

Chitosan kết hợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt, vải chống thấm, sản xuất vải col…

Chitosan được sử dụng để sản xuất kem chống khô da do tính chất của chitosan là có thể cố định dễ dàng trên biểu bì của da nhờ các nhóm –NH + 4 Các nhóm này liên kết với các tế bào sừng hóa của da, nhờ vậy mà các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng chitosan làm các loại kem dưỡng da chống nắng

Nhờ khả năng làm đông tụ các thể rắn lơ lửng giàu protein và nhờ khả năng kết dính tốt các ion kim loại như Pb, Hg… do đó chitin được sử dụng để tẩy lọc nguồn nước thải công nghiệp từ các nhà máy chế biến thực phẩm

Chitosan sử dụng để chống hiện tượng mất nước trong quá trình làm lạnh, làm đông thực phẩm

Cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa của glucosamin

Khi thủy phân chitin trong môi trường axit HCl đậm đặc, các mối nối amid và osid đều bị phá hủy do đó thu được glucosamin 3 (là monome của chitosan) Yếu tố nồng độ axit và nhiệt độ thủy phân rất quan trọng, nếu nồng độ của axit không thích hợp thì quá trình deacetyl hóa và deosid chỉ dừng lại giới hạn nhất định, nếu nhiệt độ không thích hợp thì sản phẩm cuối cùng là glucosamin có thể bị giáng hóa thành những phân tử đơn giản hơn

Công thúc cấu tạo của glucosamin:

Tên UIPAC: (3R,4R,5S,6R)-3-amino-6-(hydroxymethyl)oxane-2,4,5-triol Tên gọi khác: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose; 2-amino-2-deoxy-β-D- glucopyranose; chitosamine; D-glucosamine; D-(+)- glucosamine

Phân tử lượng: Mglucosamin = 179,17 http://www.ebook.edu.vn

Hình 4 : Cấu trúc không gian của glucosamin

Glucosamin là chất rắn dạng tinh thể, không màu, không mùi, điểm nóng chảy 88 0 C, điểm phân hủy 110 0 C, tan được trong nước và trong methanol sôi, hơi tan trong methanol hoặc ethanol, không tan trong ether và chloroform

Một số phản ứng của glucosamin [14]:

Giống như glucose, glucosamin cho phản ứng tráng bạc khá rõ ràng:

• Phản ứng với Cu(OH) 2

Sản phẩm có màu xanh nhạt

CHO CHNH 2 CHO CHO CHOH

Phản ứng xác nhận có mặt của NH 2 Bazơ Shiff tạo ra dưới dạng keo sánh màu nâu:

Cấu trúc hóa học, tính chất vật lý một số muối của glucosamin

CHO CHN CHOH CHOH CHOH

1.6 Cấu trúc hóa học và tính chất vật lý một số muối của glucosamin

Trong thực tế, một số dẫn xuất của glucosamin được sử dụng làm nguyên liệu làm thuốc

Tên gọi khoa học: 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose hydrochloride; Chitosamine hydrochloride; D-glucosamine hydrochloride; D-(+)-glucosamine hydrochloride

Công thức phân tử: C6H13O5N.HCl

Phân tử lượng: Mglucosamin.HCl = 215.63

Glucosamin hydroclorua là chất rắn dạng tinh thể màu trắng, không mùi Điểm nóng chảy 190-194 0 C hoặc 300 0 C

Tan được trong nước 0,1g/ml

5 http://www.ebook.edu.vn

Tên gọi khoa học: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose sulfate; D-glucosamine sulfate

Công thức phân tử: C 6 H 13 O 5 N.H 2 SO 4

Phân tử lượng: Mglucosamin.H2SO4 = 277,24

Tên gọi khoa học: 2-Acetoamido-2-deoxy-D-glucopyranose; N-acetyl-D- (+)-glucosamine; N-acetyl-β-D-glucosaminide; N-acetylchitosamine

Phân tử lượng: Macetylglucosamin = 221,21 Điểm nóng chảy: 201 - 210 0 C

Tan được trong nước, 0,1g/ml

Dược lý và dược động học của glucosamin và muối của nó

Glucosamine là một aminomonosacharit được thấy trong tự nhiên, nguyên liệu để tổng hợp proteoglycan Glucosamin kích thích tế bào sụn khớp tăng tổng hợp và trùng hợp nên cấu trúc proteoglycan bình thường Kết quả của quá trình trùng hợp là tạo ra mucopolysaccharit, thành phần cơ bản tạo nên sụn khớp Bình thường sụn khớp được cấu tạo chủ yếu bởi nước, collagen và proteoplycan

Glucosamin đồng thời ức chế các enzym phá hủy sụn khớp như collagenase, phospholipase A2 và giảm các gốc tự do superoxid phá hủy các tế bào sụn Glucosamin còn có tác dụng kích thích sinh sản

Hình 5 : Đau xương cột sống

Hình 6 : Khớp nối http://www.ebook.edu.vn mô liên kết của xương, giảm quá trình mất canxi của xương [9]

Khi thiếu glucosamin thì sụn đặc biệt là sụn khớp háng, đầu gối bị hỏng, cứng, tạo gai xương gây biến dạng khớp làm hạn chế vận động, dẫn đến bệnh viêm xương khớp phát triển

Do glucosamin làm tăng sản xuất chất nhầy dịch khớp nên tăng độ nhớt, khả năng bôi trơn của dịch khớp, vì thế không những làm giảm triệu chứng của thoái hóa khớp (đau, khó vận động) mà còn ngăn chặn quá trình thoái hóa khớp, ngăn chặn bệnh tiến triển [9].

Thuốc tác động vào cơ chế sinh bệnh của thoái hóa khớp, điều trị các bệnh thoái hóa xương khớp cả cấp và mãn tính, cải thiện chức năng khớp và ngăn chặn bệnh tiến triển, phục hồi cấu trúc sụn khớp

Từ tuổi 45 - 50 trở lên, bệnh có chiều hướng tăng (27% ở tuổi 60 - 70%, 45% ở tuổi 80) Đối tượng nguy cơ dễ mắc bệnh khớp nhất là người già, người béo phì, người bị chấn thương khớp, có dị tật bẩm sinh, bệnh về chuyển hoá, di truyền hoặc bị xáo trộn về kích tố [1]

Các muối của glucosamin có khả năng giải phóng và sản sinh mucopolysacharit khuếch tán tốt vào dịch khớp, phát huy tốt tác dụng chống viêm khớp

Các dẫn xuất glucosamin thông dụng được dùng phổ biến ngày nay là:

Trong thực nghiệm trên thỏ con, người ta thấy glucosamin chỉ làm tăng thành phần các proteoglycan trong các vị trí mô sụn hư cần phải sửa chữa mà không có tác dụng tương tự trên phần sụn khớp bình thường

Những năm gần đây, glucosamin được dùng rộng rãi trong điều trị viêm khớp, thoái hóa khớp Tuy nhiên, theo một nghiên cứu mới của tiến sĩ Ronald

Hình 7 :Các vị trí khớp nối http://www.ebook.edu.vn

Tallarida thuộc trường Đại Học Y khoa Temple, Philadelphia (Mỹ) cho thấy nếu sử dụng glucosamin đơn độc sẽ không có hiệu quả chống đau Nhưng nếu kết hợp với một loại thuốc nhóm kháng viêm không steroid (NSAID) thì tác dụng chống đau, chống viêm tăng lên rất nhiều

Thực tế lâm sàng cho thấy nó mang lại nhiều ưu điểm trong điều trị hơn hẳn các thuốc NSAID Nhược điểm của thuốc

NSAID là có nhiều tác dụng phụ, còn khi sử dụng glucosamin thì lại rất ít tác dụng phụ Một vài dị ứng không đáng kể đối với người có cơ địa quá mẫn cảm với thuốc

Trước đây glucosamin được xếp vào nhóm thuốc bảo vệ sụn (gồm có glucosamin, chondroitin và diacerin) hay thuốc tác dụng chậm với các bệnh viêm khớp Hiện nay cơ quan Dược phẩm Châu Âu (EMEA) chấp nhận xếp glucosamin vào danh mục thuốc giúp cải thiện cấu trúc trong bệnh viêm khớp Các loại khác chưa được chấp nhận vì không đáp ứng được các yếu cầu trên lâm sàng Ở Việt Nam hiện nay cũng đang sử dụng một số loại thuốc có chứa glucosamin như :

Nhưng các thuốc này chủ yếu vẫn nhập khẩu từ nước ngoài Đã có rất nhiều nghiên cứu thử nghiệm so sánh glucosamin với các loại thuốc NSAID, cho kết quả như sau [8]:

1 Cải thiện triệu chứng viêm khớp tương đương với NSAID trong thời gian ngắn và vượt trội hơn hẳn nếu uống thuốc thời gian dài

Hình 8 : Một số thuốc glucosamin hiện đang lưu bày trên thị trường Việt

Nam http://www.ebook.edu.vn

2 Tính an toàn hơn hẳn với các loại đi từ NSAID

3 Người ta dùng phối hợp glucosamine và NSAID cho kết quả tốt hơn khi dùng đơn độc NSAID trong thời gian ngắn Sau đó ngưng sử dụng NSAID, tiếp tục sử dụng glucosamin thì tình trạng cải thiện vẫn tiếp tục được duy trì theo kiểu tuyến tính

4 Người ta thấy nếu dùng NSAID, những ích lợi giảm triệu chứng cho bệnh nhân sẽ nhanh chóng mất đi ngay sau khi ngưng thuốc Ngược lại, ngưng uống glucosamin tác dụng vẫn tiếp tục kéo dài trong nhiều tháng sau đó

5 Với những bệnh nhân tuân thủ phác đồ điều trị dùng glucosamin càng dài thì lợi ích kinh tế càng lớn vì tính an toàn và hiệu quả của nó càng được phát huy

Theo các nhà nghiên cứu khi bị hấp thu vào dạ dày, muối glucosamin sulfat bị ion hóa hoàn toàn do nồng độ tương đối lớn axit HCl (pH = 1 - 3) sẵn có trong dạ dày Như một tất yếu, các ion glucosamin và các ion sulfate bị trộn lẫn với một lượng lớn ion Cl - và ion H + Nếu khảo sát hỗn hợp này và tách loại muối glucosamin ra thì lại nhận được 99% muối glucosamin hydroclorua do muối dạng sulfate đã bị mất đáng kể do nồng độ rất thấp so với nồng độ rất lớn axit HCl có mặt trong dạ dày.

Một số quy trình sản xuất chitin, chitosan trên thế giới và ở tại Việt Nam

1.8.1.1 Quy trình thủy nhiệt Yamasaki và Nacamichi (Nhật bản) [3]

Nguyên liệu là vỏ cua đã khô, sạch được đem khử khoáng bằng HCl 2N trong thời gian là 1 giờ (tác giả cho rằng hiệu quả khử khoáng có thể đạt được 100%)

Sau đó đem rửa sạch và đem làm khô Tiếp theo là tiến hành kết hợp hai công đoạn khử protein và deacetyl đồng thời trong dung dịch NaOH 15N ở nhiệt độ 150 0 C trong 1 giờ, kết quả cho thấy protein được tách ra triệt để và độ deacetyl đạt trên 70% Sau thời gian 1 giờ đem rửa sạch và làm khô sẽ thu được chitosan thành phẩm http://www.ebook.edu.vn

Phương pháp này có ưu điểm là quy trình đơn giản công đoạn, rút ngắn đáng kể thời gian sản xuất so với các quy trình khác Hóa chất sử dụng ít (HCl và NaOH), chitosan thu được có độ tinh khiết cao Tuy nhiên cũng có nhược điểm là sản phẩm chitosan thu được có độ nhớt thấp, tiêu tốn nhiều năng lượng cho các khâu sản xuất

1.8.1.2 Quy trình sản xuất chitin của Hackman [3]

Vỏ tôm hùm được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 100 0 C; tiếp theo được khử khoáng bằng HCl 2N với tỷ lệ w/v=1/10 ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 5 giờ đem rửa trung tính và sấy khô ở 100 0 C, và đem xay nhỏ

Ngâm tiếp trong dung dịch HCl 2N với tỷ lệ w/v=1/2,5 ở nhiệt độ phòng Sau 48 giờ đem ly tâm thu phần bã và đem rửa trung tính Ngâm bã bột đã rửa trong dung dịch NaOH 1N với tỷ lệ w/v= 1/2,5 ở nhiệt độ 100 0 C, sau 42 giờ đem ly tâm thu phần bã Sau đó lại tiếp tục ngâm trong NaOH 1N với tỷ lệ và nhiệt độ trên, sau 12 giờ đem ly tâm thu phần bã Tiếp theo đó rửa trung tính và đem làm sạch bằng cách ly tâm với các chất theo thứ tự: nước, etanol và ete Sau đó làm khô ta được sản phẩm dạng bột màu kem

Với quy trình này thì có nhiều công đoạn tăng khả năng khử khoáng, khử protein song do cồng kềnh, chỉ thích hợp cho đối tượng là vỏ tôm hùm, tôm mũ ni và vỏ cua, thời gian thực các công đoạn kéo dài, do đó quy trình Hackman chỉ mang tính nghiên cứu thí nghiệm, không có tính khả thi nếu sản xuất đại trà, quy trình mới chỉ dừng lại đến sản phẩm là chitin

1.8.1.3 Quy trình sản xuất chitosan của Pháp [3]

Nguyên liệu (vỏ tôm) sạch được đem đi hấp chín, phơi khô, ta đem đi xay nhỏ Khử proteinn bằng NaOH 3,5% với tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ 65 0 C, sau 2 giờ vớt ra rửa trung tính, tiếp đó ngâm trong HCl 1N với tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ phòng sau 2 giờ vớt ra tiến hành tẩy các chất màu hữu cơ bằng aceton với tỷ lệ w/v=1/5, ở nhiệt độ phòng sau 30 phút vớt ra rửa sạch và tẩy màu lại bằng nước javen (NaOCl + NaCl) 0,135%, tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ phòng sau 6 phút với ra rửa trung tính, thu được chitin sạch đẹp Sau đó tiến hành deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v=1/4, ở nhiệt độ 85 0 C sau thời gian 4 giờ đem rửa trung tính, thu được chitosan http://www.ebook.edu.vn

Quy trình có ưu điểm là thời gian sản xuất ngắn, sản phẩm có màu sắc đẹp, sạch do có hai bước khử sắc tố Tuy nhiên NaOCl là một chất oxy hóa mạnh, ảnh hưởng đến mạch polyme, do đó độ nhớt sản phẩm giảm rõ rệt Mặt khác aceton có giá trị đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm sẽ cao Chưa kể các yếu tố trong an toàn sản xuất, công nghệ này khó áp dụng trong điều kiện sản xuất ở nước ta hiện nay

1.8.1.4 Phương pháp điều chế chitin của Capozza [17]

Cân 149g nguyên liệu vỏ tôm sạch cho vào bình khuấy với một máy khuấy, thêm từ từ 825ml axit HCl 2N vào bình, thực hiện phản ứng ở 4 0 C trong thời gian 48 giờ Sản phẩm sau quá trình khử khoáng được rửa sạch bằng nước đến pH = 7 Xác định hàm lượng tro 0,4 - 0,5% Sau đó sản phẩm được khuấy ở nhiệt độ phòng với 1500ml axit fomic HCOOH 90%, để qua đêm Hỗn hợp được lọc ly tâm lấy phần bã và rửa lại với nước nhiều lần cho đến khi pH = 7 Sản phẩm sạch sau đó được ngâm ngập trong 2 lít dung dịch NaOH 10% và đun nóng ở 90 - 100 0 C trong 2,5 giờ Dung dịch được lọc và rửa sạch với nước đến pH = 7, sau đó sản phẩm được tráng rửa lại trong ethanol 96 0 và ether Sấy khô ở 40 0 C dưới áp suất giảm Khối lượng chitin khô sạch thu được là 66g Hiệu suất 44,3%

1.8.2.1 Quy trình sản xuất chitosan của Đỗ Minh Phụng [3]

Nguyên liệu là vỏ tôm khô được khử khoáng bằng HCl 6N với tỷ lệ w/v=1/2,5, ở nhiệt độ phòng, sau 48 giờ đem rửa trung tính, tiếp theo đun trong NaOH 8% với tỷ lệ w/v=1/1,5, ở nhiệt độ 100 0 C, sau 2 giờ khử protein rồi đem rửa trung tính

Tiến hành tẩy màu bằng KMnO 4 1% trong môi trường H 2 SO 4 10%, sau 1 giờ đem rửa sạch và khử màu phụ bằng Na2S2O3 1,5% trong 15 phút, vớt ra rửa sạch thu được chitin

Deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v=1/1, ở nhiệt độ 80 0 C sau 24 giờ đem rửa sạch và cuối cùng thu được chitosan

Sản phẩm có chất lượng khá tốt, chitin có màu trắng đẹp Song thời gian còn dài, sử dụng nhiều chất oxy hóa dễ làm ảnh hưởng tới độ nhớt của sản phẩm http://www.ebook.edu.vn

1.8.2.2 Quy trình sản xuất chitosan ở Trung tâm cao phân tử Viện Khoa Học Việt Nam [3]

Nguyên liệu là vỏ ghẹ hay vỏ tôm sạch được khử khoáng lần 1 bằng HCl 4% ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 24 giờ đem rửa trung tính để làm giảm lượng NaOH tiêu hao ở công đoạn sau

Nấu trong NaOH 3% ở nhiệt độ 90 - 95 0 C, sau 3 giờ đem rửa trung tính, tiếp tục khử khoáng lần 2 bằng HCl ở nhiệt độ phòng, sau 24 giờ đem di rửa trung tính và đem nấu lần 2 trong NaOH ở nhiệt độ 90 - 95 0 C, sau 3 giờ đem rửa trung tính Cuối cùng nấu trong NaOH 40%, rửa trung tính và sấy khô thu được chitosan

Sản phẩm chitosan sản xuất theo quy trình này có màu sắc không đẹp bằng sản phẩm theo quy trình của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, thời gian thực hiện quy trình kéo dài, nhiều công đoạn

1.8.2.3 Quy trình sản xuất chitin của Xí nghiệp thủy sản Hà Nội [3]

Quy trình sản xuất glucosamin hydroclorua (glu.HCl)

1.9.1 Quy trình s ả n xu ấ t glu.HCl c ủ a Tr ầ n Th ị Luy ế n [3] Để khử khoáng, vỏ tôm được ngâm trong HCl 10%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 giờ, sau đó vớt ra rửa sạch đến pH=7 Sau đó khử protein kết hợp deacetyl hóa trong NaOH 40%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ

95 - 100 0 C trong thời gian 6,5 giờ Tẩy màu rửa sạch, sấy khô Chitosan được đun trong HCl 35%, tỷ lệ w/v = 1/4, ở nhiệt độ 95 - 100 0 C trong thời gian 4 giờ Sau đó lọc bỏ cặn, làm lạnh 0 - 2 0 C trong thời gian 2 giờ khi đó kết tinh sẽ xuất hiện Lọc tách kết tinh, hòa tan trong nước cất, khử màu qua than hoạt tính, cô cạn và lại thực hiện kết tinh Sau khi kết tinh lần cuối (khoảng 3 lần), tinh thể trắng, lọc lấy tinh thể đem rửa lại bằng cồn, sau đó sấy khô ở 50 - 60 0 C

1.9.2 Quy trình s ả n xu ấ t glu.HCl c ủ a Đỗ Đ ình Rãng [14]

Vỏ tôm khô, sạch, nghiền thành bột, sau đó đun sôi nguyên liệu với nước trong 2 giờ và gạn bỏ protein, sấy khô Nguyên liêu khô đun trong HCl 5% tách khoáng, rửa sạch đến pH=7 và sấy khô Khử hoàn toàn protein trong NaOH 5%, đun sôi Sản phẩm rửa sạch đến pH=7, sấy khô Chitin thu được có màu trắng http://www.ebook.edu.vn phớt hồng Từ chitin để chuyển hóa thành glucosamin bằng cách thủy phân trong dung dịch axit HCl đậm đặc 36%, ở nhiệt độ 100 0 C, tẩy màu băng than hoạt tính, để kết tinh và lọc Sấy khô, thu được tinh thể glucosamin hydroclorua trắng Hiệu suất quá trình 51,4% http://www.ebook.edu.vn

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết như axit hydroclorua (HCl), natri hydroxit (NaOH), kali permanganat (KMnO 4 ), axit oxalic (C 2 H 2 O 4 ), oxi già (H2O2), axit acetic CH3COOH, ngoài ra còn có các dung môi khác như nước cất, methanol, ethanol…

Bình tam giác, bình cầu cổ nhám, cốc thủy tinh, cân phân tích, nhiệt kế, thiết bị đo điểm nóng chảy, tủ sấy, bình hút ẩm, thiết bị gia nhiệt, khuấy từ, sinh hàn hồi lưu, dụng cụ lọc…

Phương pháp nghiên cứu

1 Sử dụng các phương pháp chiết tách hóa học để tách chiết vỏ tôm thu được chitin và deacetyl hóa chitin trong dung dịch NaOH đậm đặc thu được chitosan

2 Tổng hợp glucosamin hydroclorua từ chitin và chitosan

3 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng như: thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng và nồng độ tác nhân tác nhân phản ứng

4 Kiểm tra cấu trúc của sản phẩm điều ra thông qua các loại phổ như : IR,

1H-NMR, 13 C-NMR tại Viện Hóa Học – Viện Khoa Học Việt Nam So sánh với các số liệu phổ đã công bố để xác định cấu trúc sản phẩm

- Đo phổ IR trên máy FTR – IMPACT 410 của hãng Nicolet

- Đo phổ 1 H – NMR và 13 C – NMR trên máy Bruker AC- 500MHz trong dung môi D 2 O http://www.ebook.edu.vn

5 Kiểm tra, đo một số thông số như nhiệt độ nóng chảy trên máy Boetius –

6 Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi

7 Phưong pháp xác định hàm lượng chất không tan a) Nguyên lý: Chitosan tan được trong axit acetic loãng, còn chitin và các tạp chất khác thi không tan b) Tiến hành : Cân chính xác a gam chitosan hoà tan trong dung dịch axit acetic 1%, khuấy đảo 60 phút cho chitosan tan hết rồi lọc, rửa cặn bằng axit acetic loãng, sau đó rửa lại bằng nước cất và đem sấy khô đến khối lượng không đổi

Hàm lượng chất không tan được tính theo công thức:

A : khối lượng phễu lọc + giấy + tạp chất sau khi sấy (g)

B : khối lượng phễu lọc + giấy lọc trước khi sấy (g) a : khối lượng chitosan sử dụng (g)

X : Hàm lượng chất không tan (%)

8 Phương pháp xác định hiệu suất quá trình bằng phương pháp trọng lượng http://www.ebook.edu.vn

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

Quy trình điều chế chitin, chitosan và glucosamin hydroclorua

Sơ đồ 3.1: Quy trình điều chế chitin, chitosan và glu.HCl từ vỏ tôm

Ngâm trong HCl 10%, Ts = 12 giờ, T 0 = t 0 phòng

Rửa trung tính Đun trong NaOH 3%, Ts = 3,5 - 4 giờ, T 0 = 90 - 95 0 C

1.Ngâm trong hỗn hợp KMnO 4 + C 2 H 2 O 4 Hoặc

Rửa sạch, sấy khô ở T 0 = 60 0 C Đun trong NaOH 50%,

Chitosan Đun trong HCl 36%, T s = 4 giờ,

Glucosamin hydroclorua Rửa trung tính, sấy khô

Tẩy màu, lọc, sấy khô http://www.ebook.edu.vn

Điều chế chitin từ vỏ tôm

Cân 40g vỏ tôm khô cho vào cốc 1lít, sau đó cho từ từ 200ml HCl 10% vào và để ngập toàn bộ vỏ tôm, nhận thấy có hiện tượng sủi bọt mạnh chứng tỏ có phản ứng xẩy ra, kiểm tra pH=1 - 2 là được, ngâm trong khoảng 12 giờ (để qua đêm) và để ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lại khuấy để cho phản ứng xảy ra nhanh hơn (đến khi không thấy bọt, khí thoát ra, thử pH vẫn còn axit)

Sau 12 giờ, vớt vỏ tôm ra và rửa lại bằng nước thường đến pH=7, sau đó rửa bằng nước cất Lúc này vỏ tôm có màu hồng nhạt và mềm do đã được loại hết các tạp chất vô cơ

Vỏ tôm thu được để ráo bớt nước sau đó cho vào bình cầu 500ml, đồng thời cho NaOH 3% vào cho đến khi ngập hoàn toàn vỏ tôm và kiểm tra pH= 11-

12 là đạt yêu cầu Đun ở nhiệt độ 90 - 95 0 C trong khoảng 3,5 - 4 giờ, lúc đun có lắp sinh hàn để tránh hiện tượng trào bọt ra ngoài và mùi khó chịu Sau khi phản ứng kết thúc đem sản phẩm đi rửa bằng nước thường đến pH=7, sau đó tráng lại bằng nước cất Sản phẩm thu được có màu trắng phớt hồng

Chất màu (astaxanthin) có trong chitin được loại bỏ theo 2 phương pháp:

1 Cho 10ml dung dịch KMnO4 1% vào trong bình đựng chitin ở trên, sau đó trộn đều với nhau, để trong thời gian 1 giờ ở nhiệt độ phòng Sau 1 giờ, rửa sạch sản phẩm, nhận thấy sản phẩm có màu tím đen chứng tỏ vẫn còn nhiều KMnO4 chưa được rửa sạch Để loại hết KMnO 4 ta dùng 50ml axit Oxalic HOOC-COOH 1%, nhận thấy nếu để ở nhiệt độ phòng thì khó loại hết màu tím, ta đem đun nóng ở nhiệt độ 50 - 60 0 C thì màu mất hoàn toàn, rửa sạch thu được sản phẩm có màu trắng đẹp

2 Ngâm ngập chitin bằng 60ml H2O2 1%, để qua đêm ở nhiệt độ phòng Sản phẩm sau khi ngâm tuy màu đã bớt nhiều nhưng vẫn còn thấy hơi phớt hồng, rửa sạch bằng nước, tráng lại bằng nước cất

Sấy khô sản phẩm ở nhiệt độ 60 0 C, thu được chitin trắng sạch

Hiệu suất quá trình điều chế chitin được tính theo công thức sau: http://www.ebook.edu.vn

Trong đó : m 1 : số gam của vỏ tôm ban đầu (g) m 2: số gam chitin thu được (g)

H 1(%) : hiệu suất của quá trình (%)

Kết quả thu được như bảng 3.1:

Bảng 3.1 Hàm lượng chitin trong vỏ tôm

STT Vỏ tôm (g) Chitin (g) Hiệu suất (%)

Điều chế chitosan bằng cách deacetyl chitin

Từ chitin điều chế trên, cân lượng chính xác 10g chitin cho vào bình cầu 500ml, sau đó cho 350ml dung dịch NaOH 50% cho đến ngập hoàn toàn chitin Đun ở nhiệt độ 110 - 120 0 C, có hồi lưu tránh bay hơi dung môi, bay mùi khó chịu, thỉnh thoảng có khuấy cho phản ứng xảy ra nhanh, thời gian đun là 4 giờ Sản phẩm sau phản ứng được rửa sạch đến pH=7, rửa lại bằng nước cất, sấy khô Sản phẩm thu được là chitosan có màu trắng

Hiệu suất quá trình điều chế chitosan được tính theo công thức:

Trong đó: m 3: khối lượng chitin tham gia phản ứng (g) m 4 : khối lượng sản phẩm chitosan thu được(g)

H 2 (%) : hiệu suất của quá trình (%)

Kết quả thu được ở bảng 3.2: http://www.ebook.edu.vn

Bảng 3.2 Hiệu suất điều chế chitosan từ chitin STT Chitin (g) Chitosan (g) Hiệu suất (%)

Cân 5g chitosan cho vào cốc thủy tinh 1lít, sau đó cho 300ml axit acetic

CH 3 COOH 1%, khuấy ở nhiệt độ thường trong thời gian 30 phút thu được dung dịch trong suốt Dung dịch được đem đi lọc bỏ cặn bẩn

Sau đó cho 30 ml NaOH 10% vào, khuấy đều trong 10 phút thu được dung dịch keo Lọc lấy kết tủa keo và rửa 3 lần bằng methanol (5ml/lần)

Cho kết tủa keo bào bình cầu 250ml, thêm 140ml CH3OH và đun ở nhiệt độ 60 - 65 0 C trong thời gian 5 giờ Lọc và rửa bằng aceton 2 lần, sau đó sấy khô ở 40 0 C Thu được 4,2g chitosan tinh khiết Hiệu suất 84%.

Điều chế glucosamin hydroclorua (glu.HCl)

Cân 5g chitin khô (đã cắt nhỏ) cho vào bình cầu 250ml, sau đó thêm 40ml HCl 36% Đun cách thủy có lắp sinh hàn hồi lưu, khuấy đều và duy trì ở nhiệt độ khoảng 90 - 95 0 C Khi nhiệt độ hỗn hợp trong bình phản ứng đạt 65 - 70 0 C thì chitin bắt đầu tan rất nhanh tạo thành dung dịch màu nâu đen Đun trong thời gian 4giờ

Kết thúc thời gian phản ứng, sản phẩm được lọc nóng để loại bỏ cặn bẩn, sau đó dịch lọc được tẩy màu bằng 1g than hoạt tính, giai đoạn này được hỗn hợp được đun nóng đến 90 0 C, sau đó duy trì ở nhiệt độ 50 - 60 0 C trong thời gian 30 phút http://www.ebook.edu.vn

Lọc bỏ than hoạt tính thu được dung dịch có màu xanh nhạt trong suốt, để nguội thu được dung dịch có màu vàng rơm Dung dịch để nguội lạnh ở nhiệt độ

0 - 4 0 C, thời gian để kết tinh là 12 giờ (để qua đêm)

Tinh thể glu.HCl được tách ra bằng phương pháp lọc, sau đó rửa lại sản phẩm thu được bằng cồn 96 0 Sản phẩm được sấy khô ở nhiệt độ 60 0 C thì thu được tinh thể glu.HCl khô trắng đẹp

Dịch lọc còn lại sau khi lọc kết tinh được cô bớt dung môi bằng cất chân không ở nhiệt độ 60 - 65 0 C, đến khi thể tích bằng 1/3 thể tích đem cô ban đầu, để kết tinh và lọc lấy kết tinh, rửa bằng cồn 96 0 , sấy khô

Hiệu suất của quá trình điều chế glu.HCl từ chitin được tính theo công thức sau:

Trong đó : m 5 : khối lượng chitin ban đầu (g) m 6 : khối lượng glu.HCl kết tinh lần thứ nhất (g) m 7: khối lượng glu.HCl kết tinh lần thứ hai (g)

H 3 (%): hiệu suất của quá trình (%)

Kết quả thu được ở bảng 3.3:

Bảng 3.3 Hiệu suất điều chế glucosamin hydroclorua từ chitin STT Chitin (g) Glu.HCl (g) Hiệu suất (%)

Cân 5 gam chitosan cho vào bình cầu 250ml, thêm từ từ 40ml axit HCl 36% vào bình, sau đó thực hiện các thao tác tương tự như phần 3.4.1 trên

Tính thời gian phản ứng khi chitosan bắt đầu tan vào dung dịch Đun được

1 giờ thì nhận thấy dung dịch có độ nhớt cao, đun tiếp đến 3 giờ thì thu được dung dịch đặc quánh Kết thúc thời gian phản ứng, cho thêm 20ml nước cất vào http://www.ebook.edu.vn để pha loãng dung dịch rồi đem lọc lấy dung dịch nước cái Dung dịch có màu nâu đen được tẩy màu bằng than hoạt tính Do có pha loãng dung dịch, lượng nước đưa vào tương đối nhiều nên để có kết tinh cần phải cô bớt dung môi đến thể tích 1/5 thể tích dung dịch ban đầu Sau khi cô, dung dịch được để nguội lạnh ở nhiệt độ 0 - 4 0 C qua đêm Nhận thấy có rất ít tinh thể glu.HCl được tạo thành, hầu như là không đáng kể Lọc lấy kết tinh, rửa lại bằng cồn, sấy khô

Hiệu suất của quá trình điều chế glu.HCl từ chitin được tính theo công thức sau:

Trong đó : m8 : khối lượng chitosan ban đầu (g) m9 : khối lượng glucosamin thu được (g)

Kết quả thu được ở bảng 3.4:

Bảng 3.4 Hiệu suất điều chế glucosamin hydroclorua từ chitosan

STT Chitosan (g) Glu.HCl (g) Hiệu suất (%)

Cân 2g glu.HCl cho vào bình cầu 100ml, thêm dần 25ml cồn 96 0 , đun sôi, có khuấy ở nhiệt độ 75 - 80 0 C

Sau khi hỗn hợp sôi, cho từ từ nước cất tối thiểu vào, cho đến khi glu.HCl tan hết (vẫn duy trì ở nhiệt độ sôi), lượng nước cất tối thiểu là 5,5 - 6ml cho 2g glu.HCl Đun tiếp 60 phút, lọc nóng Để kết tinh lại ở nhiệt độ 0 - 4 0 C trong thời gian 4 giờ

Tinh thể được lọc và rửa bằng cồn 96 0 (2 lần x 3ml), sấy khô ở nhiệt độ

60 0 C thu được glu.HCl tinh khiết Dung dịch nước cái đem cô bớt dung môi và http://www.ebook.edu.vn kết tinh lại để thu thêm glu.HCl Sản phẩm thu được có nhiệt độ nóng chảy 192 -

Cấu trúc của glu.HCl điều chế ra đã được đo các loại phổ IR, 1 H-NMR,

Phổ IR có các vạch đặc trưng sau: ν (OH…O) 3354,44(cm -1 ); ν (N-H)

3289.88(cm -1 ); ν (C-H) 2852,33-2945,58(cm -1 ); δ (OH phẳng) 1422,37(cm -1 ); δ (OH không phẳng) 1248,95(cm -1 ); ν (C-O) 1185,36(cm -1 ); ν (C-N) 1029,28(cm -1 )

93,1 (C 1 ); 57,2 (C 2 ); 72,5 (C 3 ); 76,6 (C 4 ); 70,2 (C 5 ); 60,9 (C 6 ) http://www.ebook.edu.vn

Hình 9: Phổ IR – glucosamin hydroclorua http://www.ebook.edu.vn

Hình 10 : Phổ 1 H-NMR – glucosamin hydroclorua http://www.ebook.edu.vn

Hình 11 : Phổ 13 C-NMR – glucosamin hydroclorua http://www.ebook.edu.vn

3.6 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin

Tiến hành phản ứng như mục 3.4.1 làm trong bình cầu 250ml (5 lần) với mỗi lần 5g chitin, 40ml HCl 36%, nhiệt độ phản ứng 90 - 95 0 C nhưng thực hiện với điều kiện thời gian khác nhau:

• Lần 1: thời gian phản ứng 1giờ

• Lần 2: thời gian phản ứng 2 giờ

• Lần 3: thời gian phản ứng 3 giờ

• Lần 4: thời gian phản ứng 4 giờ

• Lần 5: thời gian phản ứng 5 giờ

Kết quả thu được được trình bày trong bảng 3.5:

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất của phản ứng:

3.7 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin

Tiến hành phản ứng như mục 3.4.1 làm trong bình cầu 250ml (3 lần) với mỗi lần 5g chitin, 40ml HCl 36%, thời gian phản ứng 4 giờ nhưng thực hiện với điều kiện ở những khoảng nhiệt độ khác nhau

• Lần 1: khoảng nhiệt độ 25 - 30 0 C (nhiệt độ phòng)

Kết quả thu được được trình bày trong bảng 3.6: http://www.ebook.edu.vn

Bảng 3.6 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng:

3.8 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ axit HCl đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin

Tiến hành phản ứng như mục 3.4.1 làm trong bình cầu 250ml (3 lần) với lần 5g chitin, thời gian phản ứng 4giờ, nhiệt độ phản ứng 90 - 95 0 C nhưng thực hiện trong điều kiện nồng độ axit hydrocloric khác nhau:

• Lần 1: Nồng độ axit HCl 10%.

• Lần 2: Nồng độ axit HCl 20%.

• Lần 3: Nồng độ axit HCl 36%.

Kết quả thu được được trình bày trong bảng 3.7:

Bảng 3.7.Ảnh hưởng của nồng độ axit HCl đến hiệu suất phản ứng

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Điều chế chitin từ vỏ tôm

Trong vỏ tôm, thành phần khoáng chủ yếu là muối CaCO3, MgCO3 và rất ít Ca3(PO4)2 Nên người ta thường dùng các loại axit như HCl, H2SO4… để khử khoáng Khi khử khoáng, nếu dùng HCl thì cho hiệu quả cao hơn Nếu dùng

H2SO4 sẽ tạo muối khó tan nên ít sử dụng Phản ứng của HCl để khử khoáng như sau:

Ca3(PO4)2 + 6HCl = 3CaCl2 + 2H3PO4 Trong quá trình rửa thì muối Cl - tạo thành được rửa trôi, nồng độ axit HCl có ảnh hưởng lớn đến chất lượng của chitosan thành phẩm, đồng thời nó ảnh hưởng lớn tới thời gian và hiệu quả khử khoáng Nếu nồng độ HCl cao sẽ rút ngắn được thời gian khử khoáng nhưng sẽ làm cắt mạch do có hiện tượng thủy phân các liên kết β-(1-4) glucozit để tạo ra các polyme có trọng lượng phân tử trung bình thấp, có khi bị thủy phân triệt để đến glucosamin Ngược lại nếu nồng độ HCl quá thấp thì quá trình khử khoáng sẽ không triệt để và thời gian xử lý kéo dài ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm

Tỷ lệ nguyên liệu và dung dịch axit HCl cũng ảnh hưởng tới hiệu quả khử khoáng Vì vậy, ở đây chúng tôi chọn dung dịch HCl 10% với tỷ lệ chitin/HCl là w/v = 1/5 và thời gian khử khoáng là 12 giờ (qua đêm) để đảm bảo quá trình khử khoáng xảy ra hoàn toàn

Sau khi khử khoáng chúng tôi tiến hành rửa trung tính, công đoạn này có tác dụng rửa trôi hết các muối, axit dư tan trong nước Quá trình rửa kết thúc khi dịch rửa cho pH=7

Sau khi có vỏ tôm đã loại khoáng, chúng tôi tiến hành loại bỏ hoàn toàn protein bằng dung dịch NaOH 3%, protein bị kiềm thủy phân thành các amin tự http://www.ebook.edu.vn do tan và được loại ra theo quy trình rửa trôi Lượng NaOH 3% cho vào đến khi ngập toàn bộ vỏ tôm và kiểm tra pH = 11 - 12 là được để đảm bảo việc loại bỏ protein được hoàn toàn Đun ở nhiệt độ 90 - 95 0 C trong khoảng 3,5 - 4 giờ (trong quá trình đun lưu ý vấn đề trào dung môi do tạo bọt nhiều và mùi bay ra khó chịu) Sản phẩm sau khi đun được rửa sạch bằng nước thường và nước cất đến pH = 7

Tiếp đó chúng tôi tiến hành rửa trung tính, nhằm mục đích rửa trôi hết các muối natri, các amin tự do và NaOH dư Sấy khô ở 60 0 C, thu được chitin thô

4.1.3 Quá trình t ẩ y màu (lo ạ i b ỏ astaxanthin)

Chitin thô thu được có màu hồng nhạt do còn sắc tố astaxanthin Do chitin ổn định với các chất oxy hoá như thuốc tím (KMnO4), oxy già (H2O2), nước javen (NaOCl+NaCl), Na2S2O3, CH3COCH3,…lợi dụng tính chất này chúng tôi đã sử dụng KMnO 4 , H 2 O 2 để khử màu cho chitin

Dùng hỗn hợp KMnO4 1% + C2H2O4 1% để tẩy màu Trước tiên chúng tôi cho chitin thô (phân lập từ 40g vỏ tôm) vào cốc thuỷ tinh, sau đó cho dung dịch KMnO 4 1% (10ml) vào, khuấy đảo sao cho toàn bộ chitin đều ngấm dung dịch KMnO4 1%, để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 1 giờ Hỗn hợp được rửa sạch, sản phẩm chitin lúc này có màu tím của KMnO 4 Để loại màu tím chúng tôi sử dụng 50ml axit oxalic 1% ((COOH) 2 ), để tăng nhanh khả năng tẩy màu chúng tôi đun nóng hỗn hợp dung dịch ở nhiệt độ 50 - 60 0 C đến khi chitin có màu trắng hoàn toàn

Theo cách này một số tác giả rằng sản phẩm của phản ứng có tạo ra Mn 2+ , mà trong chitin - chitosan có nhóm –NHCOCH3 và nhóm –NH2, do đó các nhóm này có thể tạo phức với Mn 2+ gây ra hiện tượng khâu mạch làm ảnh hưởng đến phản ứng chuyển hoá tiếp theo

Dùng H2O2 1% để tẩy màu Chitin thô (phân lập từ 40g vỏ tôm) cho vào cốc thuỷ tinh, sau đó cho 60ml dung dịch H 2 O 2 1% vào ngập toàn bộ chitin, để qua đêm ở nhiệt độ phòng Chitin thu được có màu trắng phớt hồng Chúng tôi dùng H2O2 với nồng độ