Ứng dụng gen mã vạch (16s rRNA và COI) của DNA ty thể để phân loại một số loài cá rạn san hô tại tỉnh khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÊ THỊ MAI ỨNG DỤNG GEN MÃ VẠCH (16S rRNA COI) CỦA DNA TI THỂ ĐỂ PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI CÁ RẠN SAN HÔ TẠI TỈNH KHÁNH HÒA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA -2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÊ THỊ MAI ỨNG DỤNG GEN MÃ VẠCH (16S rRNA COI) CỦA DNA TI THỂ ĐỂ PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI CÁ RẠN SAN HÔ TẠI TỈNH KHÁNH HÒA LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 Quyết định giao đề tài: 239/QĐ- ĐHNT, ngày 23/03/2016 Quyết định thành lập hội đồng: Ngày bảo vệ: Người hướng dẫn khoa học: TS ĐẶNG THÚY BÌNH Chủ tịch hội đồng: Khoa sau đại học : KHÁNH HÒA - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Ứng dụng gen mã vạch (16S rRNA COI) DNA ti thể để phân loại số loài cá rạn san hô tỉnh khánh hòa ” công trình nghiên cứu cá nhân chưa công bố công trình khoa học khác thời điểm Khánh Hòa, ngày 13 tháng năm 2017 Tác giả luận văn Lê Thị Mai iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp, trước tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đặng Thúy Bình tận tình bảo hướng dẫn em suốt thời gian nghiên cứu thực luận văn Xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học Môi trường giảng dạy, truyền đạt kiến thức chuyên ngành bổ ích cho em suốt trình học tập năm qua Em xin gửi lời cảm ơn đến Trung tâm Thí nghiệm Thực hành, Trường Đại học Nha Trang tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất cho em thời gian thực luận văn Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, người thân anh chị, bạn bè quan tâm, động viên hỗ trợ em hoàn thành luận văn tốt nghiệp Do thời gian kiến thức hạn chế nên luận văn tốt nghiệp em tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận đóng góp ý kiến quý thầy cô giáo để luận văn hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, tháng 01 năm 2017 Học viên thực Lê Thị Mai iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN .iv DANH MỤC BẢNG .ix DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT .x TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1 Tổng quan địa điểm nghiên cứu .4 1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu đa dạng sinh học cá rạn san hô nước 1.3 Ứng dụng kỹ thuật di truyền nghiên cứu đa dạng sinh học cá 1.3.1 Hệ gen ty thể (mitochondrial DNA – mtDNA) .9 1.3.2 Ứng dụng kỹ thuật di truyền mã vạch nghiên cứu đa dạng sinh học cá .12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.1 Đối tượng, địa điểm phương pháp thu mẫu 16 2.3 Phân loại dựa đặc điểm hình thái 17 2.4 Nghiên cứu di truyền cá rạn san hô 19 2.4.1 Tách chiết DNA, nhân gen kỹ thuật PCR giải trình tự 19 2.4.2 Phân tích liệu xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại 22 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27 3.1 Phân loại hình thái 27 3.1.1 Thành phần loài cá rạn san hô phổ biến Khánh Hòa 27 3.1.2 Đặc điểm hình thái loài cá rạn san hô phổ biến thu Khánh Hòa, Việt Nam .29 3.2 Nghiên cứu di truyền loài cá rạn san hô phổ biến thu Khánh Hòa, Việt Nam 58 3.2.1 Tách chiết DNA tổng số 58 3.2.2 Khuếch đại, giải trình tự DNA cá rạn san hô thu Khánh Hòa, Việt Nam .59 3.2.3 So sánh khác biệt trình tự loài cá nghiên cứu 60 3.2.4 So sánh tương đồng trình tự với Genbank 64 v 3.2.5 Xây dựng phát sinh loài cá rạn san hô Khánh Hòa, Việt Nam .68 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 PHỤ LỤC vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 DNA ty thể .10 Hình 2.1 Các địa điểm thu mẫu cá địa bàn tỉnh Khánh Hòa .16 Hình 2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 17 Hình 2.3 Một số phận cá xương .18 Hình 2.4 Các số đo phân loại cá 18 Hình 2.5 Các số đếm phân loại cá 19 Hình 2.6 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với gen 16S rRNA 21 Hình 2.7 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với gen COI mtDNA mồi FishF1-FishR1 .21 Hình 3.1 Hình thái Stethojulis bandanensis 29 Hình 3.2 Hình thái Stethojulis trilineata 30 Hình 3.3 Hình thái Macropharyngodon meleagris 31 Hình 3.4 Hình thái Hemigymnus fasciatus 32 Hình 3.5 Hình thái Cheilinus chlororus .33 Hình 3.6 Hình thái Anampses caeruleopunctatus 34 Hình 3.7 Hình thái Monocanthus chinensis 36 Hình 3.8 Hình thái Pseudomonacanthus peroni 37 Hình 3.9 Hình thái Odonus niger 38 Hình 3.10 Hình thái Takifugu niphobles 40 Hình 3.11 Hình thái Takifugu obscurus .41 Hình 3.12 Hình thái Lagocephalus wheeleri 42 Hình 3.13 Hình thái Lagocephalus inermis 43 Hình 3.14 Hình thái Aronthron hispidus 44 Hình 3.15 Hình thái Aronthron immaculatus .45 Hình 3.16 Hình thái Diodon holocanthus 46 Hình 3.17 Hình thái Lactoria cornuta 47 Hình 3.18 Hình thái Ostracion cubicus 48 Hình 3.19 Hình thái Dendrochirus zebra .50 Hình 3.20 Hình thái Dendrochirus brachypterus 51 Hình 3.21 Hình thái Sebastapistes strongia 52 Hình 3.22 Hình thái Inimicus didactylus 53 vii Hình 3.23 Hình thái Minous trachycephalus .55 Hình 3.24 Hình thái Dactyloptena orientalis .56 Hình 3.25 Hình thái Platycephalus cultellatus 57 Hình 3.26 Kết điện di DNA tổng số số mẫu cá rạn san hô 59 Hình 3.27 Kết điện di sản phẩm PCR đoạn gen 16S rRNA COI mtDNA .59 viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 20 Bảng 2.2 Trình tự mồi gen 16S rRNA COI mtDNA .20 Bảng 2.3 Trình tự gen gen 16S rRNA COI DNA ty thể số loài cá rạn san hô phân tích mối quan hệ phát sinh loài 24 Bảng 3.1 Danh sách loài cá rạn san hô phổ biến Khánh Hòa 27 Bảng 3.2 Sự khác biệt trình tự 16S rRNA loài cá rạn san hô thu Khánh Hòa, Việt Nam 61 Bảng 3.3 Sự khác biệt trình tự COI mt DNA cácloài cá rạn san hô thu Khánh Hòa, Việt Nam 63 Bảng 3.4 Kết độ tương đồng trình tự 16S rRNA từ loài cá rạn san hô thu Khánh Hòa với liệu từ Genbank 65 Bảng 3.5 Kết độ tương đồng trình tự COI mtDNA từ loài cá rạn san hô thu Khánh Hòa với liệu từ Genbank 67 ix DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT bp Base pairs cm Centimeter m Meter µL Microliter µM Micromol km Kilometer g Gam U Unit TĐTL Thước đo tỉ lệ DNA Deoxyribonucleic acid mt DNA Mitochondrial deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid tRNA Transfer ribonucleic acid COI Cytochrome coxidase subunit I Cyt b Cytochrome b PCR Polymerase Chain Reaction GB Ký hiệu cho loài từ Genbank BT Bootstrap ctv Cộng tác viên x Cây phát sinh loài từ phương pháp Neighbor – Joining với độ lặp lại 1000 lần dựa trình tự gen COI mt DNA loài cá rạn san hô thu Khánh Hòa (Hình 3.29) cho thấy loài cá nghiên cứu thể đồng dạng phân loại mức độ giống, họ Cây phát sinh loài chia làm nhóm chính: Nhóm I gồm 13 loài thuộc Sorpaeniformes Perciformes Nhóm I phân làm nhóm phụ: Nhóm I.1 gồm loài thuộc Sorpaeniformes; Nhóm I.2 gồm loài thuộc họ Labridae Nhóm II gồm 12 loài thuộc Tetraodontiformes Nhóm II phân làm nhóm phụ: Nhóm II.1 gồm loài thuộc họ Monacanthidae loài thuộc họ Balistidae, Nhóm II.2 gồm loài thuộc họ Ostraciidae, Nhóm II gồm loài thuộc họ Diodontidae loài thuộc họ Tetraodontidae Cả phát sinh loài thể thể đồng dạng mức độ giống, họ bộ, nhiên phát sinh loài dựa gen COI mtDNA, Perciformes Scorpaeniformes có thay đổi vị trí so với gen 16S rRNA Ở Nhóm I kết cho thấy gồm 13 loài Scorpaeniformes Perciformes có tương đồng mức độ giống họ tương tự gen 16S rRNA Họ Labridae thuộc Perciformes nằm phía thay Scorpaeniformes Ở nhóm II, kết cho thấy bao gồm 12 loài thuộc Tetraodontiformes có đồng dạng mức độ giống loài tương tự gen 16S rRNA Kết cho thấy phù hợp mặt hình thái di truyền 74 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết đưa kết luận sau: Thu thập phân loại hình thái di truyền 25 loài cá rạn san hô thuộc 20 giống, 10 họ, thuộc địa bàn tỉnh Khánh Hòa, Việt Nam Trong đó, cá – Tetraodontiformes với 12 loài, cá mú – Scorpaeniformes với loài Bộ cá vược - Perciformes với loài thuộc họ Labridae Sự khác biệt di truyền 25 loài cá rạn san hô thu Khánh Hòa: gen 16S rRNA khác biệt di truyền nhỏ 1,4% gữa loài Takifugu niphobles với loài Takifugu bimaculatus khác biệt lớn 16,3% loài Stethojulis bandenensis với loài Monacanthus chinensis Ở gen COI mtDNA khác biệt di truyền nhỏ 2,3% (giữa loài Takifugu niphobles với loài Takifugu obscurus khác biệt lớn 22,3% loài Takifugu obscurus với loài Sebastapistes strongia Cây phát sinh loài dựa thị phân tử 16S rRNA COI mtDNA loài cá rạn san hô nghiên cứu chia thành nhóm lớn, Cả hai phát sinh loài thể thể đồng dạng mức độ giống họ bộ, nhiên, phát sinh loài dựa gen COI mtDNA cho thấy Perciformes Scorpaeniformes có thay đổi vị trí so với phát sinh loài dựa gen 16S rRNA Kiến nghị Khảo sát chi tiết phân bố, đặc điểm hình thái đa dạng sinh học loài cá rạn san hô Khánh Hòa nói riêng vùng rạn san hô khác Việt Nam nói chung Mở rộng hướng khảo sát đa dạng khu hệ cá rạn san hô Khánh Hòa nói riêng Việt Nam nói chung dựa đặc điểm hình thái di truyền, ứng dụng kỹ thuật di truyền mã vạch (DNA barcoding) vào công tác phân loại định danh cá nhằm mang lại kết nhanh chóng xác; đồng thời xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại loài cá nghiên cứu 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Nguyễn Hữu Hồ, Bùi Hồng Long, Nguyễn Tấn Hương, Trương Thị Phương Thảo, Nguyễn Văn Thắng, Thiệu Quang Tân Nguyễn Đình Thanh 2003, Báo cáo tổng kết nghiên cứu khoa học đề tài: Đặc điểm khí hậu thủy văn Khánh Hòa Nguyễn Khắc Hường Trương Sỹ Kỳ 2007, Động vật chí Việt Nam: Cá biển Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Đỗ Văn Khương, Lại Duy Phương Nguyễn Văn Quân 2005, Kết nghiên cứu đa dạng sinh học nguồn lợi cá rạn san hô khu vực Cát Bà Cô Tô Tạp chí Thủy sản, 5, 16 – 19 Krempf, I 1930, Những công trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật biển năm 1928-1929, 1929-1930 (bản dịch tiếng Việt) Sinh vật biển nghề cá biển Việt Nam Tổng cục Thủy sản Nguyễn Văn Long 2009, Cá rạn san hô vùng biển ven bờ Nam Trung Bộ Tạp chí Khoa học Công nghệ biển, (3), 38 – 66 Nguyễn Hữu Phụng (1991) Tuyển tập báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc biển lần thứ Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, 217 – 223 Nguyễn Hữu Phụng 2002,Thành phần loài cá rạn san hô biển Việt Nam, Trong tuyển tập báo cáo khoa học hội nghị khoa học “Biển Đông – 2002”, 274 – 307 Nguyễn Hữu Phụng Bùi Thế Phiệt 1987, Sơ nghiên cứu thành phần cá rạn san hô Trường Sa Tạp Chí Sinh Học, (3), 42 – 45 Nguyễn Hữu Phụng, Nguyễn Văn Long Trần Thị Hồng Hoa 2001, Nguồn lợi cá rạn san hô vịnh Nha Trang Tạp chí Khoa học Công nghệ biển, (2), 16 – 26 10 Lại Duy Phương 2011, Nghiên cứu số đặc điểm sinh thái quần xã cá rạn vùng biển Phú Quý – Bình Thuận Luận văn Thạc sĩ, Đại học Nha Trang 11 Thái Thị Lan Phương 2014, Định danh phân loại số loài cá nước phổ biến đồng sông Cửu Long dựa đặc điểm hình thái di truyền Đồ án Đại học, Đại học Nha Trang 12 Nguyễn Văn Quân 2005, Nguồn lợi cá rạn san hô vùng biển vịnh Hạ Long, tỉnh Quảng Ninh Tạp chí Khoa học Công nghệ biển, (2), 39 – 51 76 13 Nguyễn Văn Quân 2009, Góp phần nghiên cứu khu hệ cá rạn san hô khu bảo tồn biển vịnh Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa Tạp chí Khoa học Công nghệ biển, (1), 46 – 54 14 Vũ Đặng Hạ Quyên, Đặng Thúy Bình, Trương Thị Oanh Thái Thị Lan Phương 2014, DNA barcoding số loài cá nước Đồng sông Cửu Long Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 1, 123 – 131 15 Tống Phước Hoàng Sơn 2008, Điều tra trạng phân bố hệ sinh thái rạn san hô vùng biển ven bờ tỉnh Khánh Hòa làm sở quy hoạch bảo vệ, phục hồi sử dụng bền vững, Đề tài nghiên cứu khoa học Công nghệ tỉnh Khánh Hoà năm 2005 16 Vũ Trung Tạng Nguyễn Đình Mão 2005, Giáo trình ngư loại học Nhà xuất Nông nghiệp 17 Nguyễn Nhật Thi 1998,Thành phần loài phân bố cá rạn san hô ven bờ Hải Phòng - Quảng Ninh Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Khoa học - Công nghệ biển toàn quốc lần thứ IV Nhà xuất Thống kê, 1086 – 1101 18 Nguyễn Nhật Thi 2008, Cá biển Việt Nam Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật 19 Nguyễn Nhật Thi Nguyễn Văn Quân 2004, Đa dạng sinh học tiềm nguồn lợi cá rạn san hô vùng biển quần đảo Trường Sa Tạp chí Khoa học Công nghệ biển, (4), 47 – 64 20 Nguyễn Nhật Thi Nguyễn Văn Quân 2005, Đa dạng sinh học giá trị nguồn lợi cá rạn san hô biển Việt Nam Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật 21 Nguyễn Tuấn 2007, Điều tra kết kinh tế nghề lưới rê thu ngừ thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa, Luận văn thạc sĩ, Đại học Nha Trang 22 Võ Sĩ Tuấn, Nguyễn Văn Long, Hoàng Xuân Bền, Phan Kim Hoàng Hứa Thái Tuyến 2008, Giám sát rạn san hô vùng biển ven bờ Việt Nam: 1994-2007 Nhà xuất Nông nghiệp 23 Viện Kinh tế Quy hoạch thủy sản 2005, Tổng quan nghề cá Khánh Hòa Nhà xuất Hải Phòng 24 Trần Thị Việt Thanh, Vũ Thị Thu Hiền, Trần Thị Liễu, Phan Kế Long 2014, Sử dụng mã vạch DNA việc định loại cá biển bảo tàng thiên nhiên Việt Nam Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 6, 855- 864 77 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI Allen, GR and Talbot, J H 1985, Review of the snappers of the genus Lutjanus (Pisces Lutjanidae) from the Indo-Pacific with the description of a new species, IndoPac Fish, 11 Allen, G Steene, R Humann, P & DeLoach, N 2005, Reef Fish Identification: Tropical Pacific, New World Publications Allen, GR & Erdmann, MV 2012, Reef fishes of the East Indies, Tropical Reef Research, Volume III Alfaro, ME Santini, F& Brock, CD 2007, Do reefs drive diversification in marine teleosts? Evidence from the pufferfish and their allies (Order Tetraodontiformes) Evolution 61 (9), 2104–2126 Bartlett, S E & Davidson, WS 1991, Identification of Thunnus tuna species by the polymerase chain reaction and direct sequence analysis of their mitochondrial cytochrome b genes, Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Science, 48, 309 – 317 Booth, D & Beretta, G 2002, Changes in a fish assemblages after a coral bleaching event, Marine Ecology Progress Series, 245, 205 – 212 Carcasson, R H 1977, A Field Guide to the Coral Reef Fishes of the Indian and Western Pacific Oceans Hardcover – July, 1982 Charlene L, McCord & Mark W Westneat 2016, Phylogenetic relationships and the evolution of BMP4 in triggerfishes and filefishes (Balistoidea) Molecular Phylogenetics and Evolution 94, 397–409 Chen, X, Liu, M, Xiang, D & Ai, W 2013, Complete mitochondrial genome of the Japanese wobbegong Orectolobus japonicus (Orectolobiformes: Orectolobidae) Mitochondrial DNA, 26(1), 153 – 154 10 Chou, LM, Tuan, VS, PhilReefs, Yeemin, T Cabanban, A Suharsono, & Kessna, I 2002, Status of Southeast Asia coral reefs, In C Wilkinson (Ed.), Status of Coral Reefs of the World: 2002 (pp 123-152): Australian Institute of Marine Science 11 Connell, J 1978, Diversity in tropical rain forests and coral reefs Science, 199, 1302 – 1310 78 12 Dianne J, Bray 2011, Puffer-fishes , TETRAODONTIFORMES, in Fishes of Australia, accessed 20 Sep 2016, 13 Grande, C, Templado, J & Zardoya, R 2008, Evolution of gastropod mitochondrial genome arrangements, BMC Evolutionary Biology, 8, 61 – 76 14 Hajibabaei, M, Waard, J R, Ivanova, N V, Ratnasingham, S, Dooh, R T, Kirk, S L, Mackie, P M, &Hebert, PDN 2005, Critical factors for assembling a high volume of DNA barcodes, Philosophical Transactions of the Royal Society Part B: Biological Sciences, 360 (1462), 1959 – 1967 15 Hanel, R, Westneat, MW & Sturmbauer, C 2002, Phylogenetic relationships, evolution of broodcare behavior, and geographic speciation in the wrasse tribe Labrini Journal of Molecular Evolution, 55 (6), 776 – 789 16 Hebert, P D N, Penton, E H, Burns, J M, Janzen, D H & Hallwachs, W 2004, Ten species in one: DNA barcodingreveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astrapes fulgerator, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of American, 101 (41), 14812 – 14817 17 Hebert, PDN, Cywinska, A, Ball, SL & Waard, JR 2003, Biological identifications through DNA barcodes, In Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 270 (1512), 313 – 321 18 19 Hubert, N, Meyer, CP, Bruggemann, HJ, Guerin, F, Komeno, RJ, Espiau, B, Causse, R, Williams, JT & Planes, S 2012, Cryptic Diversity in Indo-Pacific CoralReef Fishes Revealed by DNA-Barcoding Provides New Support to the Centre-ofOverlap Hypothesis, PLoS ONE ,7 (3) 20 Holcroft NI: A molecular analysis of the interrelationships of tetraodontiform fishes (Acanthomorpha: Tetraodontiformes) Mol Phylogenet Evol 2005, 34: 525-544 21 Humann, P & Deloach, N 1993, Reef fish identification Galapagos, New World Publications 22 Hourigan, TF, Tricas, TC& Reese, ES 1988,Coral reef fishes as indicator of environmental stress in coral reefs In Soule, DF& Kleppel, GS, Marine organisms as indicators, chapter 6, 107 – 135 Springer – Verlag 79 23 Krishnamurthy, P K & Francis, R A 2012, A critical review on the utility of DNA barcoding in biodiversity conservation, Biodiversity and Conservation, 21 (8), 1901 – 1919 24 Kuiter, RH & Tonozuka, T 2001, Pictorial guide to Indonesian reef fishes Part Eels - Snappers, Muraenidae - Lutjanidae, Zoonetics, - 302 25 Lefebure, T, Douady, CJ, Gouy, M & Gibert, J 2006, Relationship between morphological taxonomy and molecular divergence within Crustacea: Proposal of a molecular threshold to help species delimitation Molecular Phylogenetics and Evolution, 40 (2), 435 – 447 26 Lieske, E & Myers, R 2001, Coral reef fishes Indo-pacific and Caribbean (pocket guide, revised edition), Princeton University press 27 Leis JM: Tetraodontiformes: relationships Ontogeny and Systematics of Fishes Lawrence KS: Am Soc Ichthyol Herpetol, Edited by: Moser HG, Richards WJ, Cohen DM, Fahay MP, Kendall AW Jr, Richardson SL 1984, 459-463 28 Lydia, L, Smith, Jennifer, L, Fessler, Michael E Alfaro, J Todd Streelman, Mark W& Westneat 2008, Phylogenetic relationships and the evolution of regulatory gene sequences in the parrotfishes, Molecular Phylogenetics and Evolution, Volume 49, Issue 1, Pages 136-152 29 Mark W, Westneat, Michael E& Alfaro 2005, Phylogenetic relationships and evolutionary history of the reef fish family Labridae, Molecular Phylogenetics and Evolution, Volume 36, Issue 2, 370-390 30 Michael, S 1998, Reef fishes: A guide to their identification, behavior and captive care, Microcosm Ltd 31 Myers, RF 1991, Micronesian reef fishes: A Practical Guide to the Identification of the Coral Reef Fishes of the Tropical Central and Western Pacific Coral Graphics 32 Nakabo, T 2002, Fishes of Japan with pictorial key to the species, Tokai University Press 33 Neigel, J, Domingo, A & Stake, J 2007, DNA barcoding as a tool coral reef conservation, Coral Reefs, 26, 487 – 499 34 Orsi, J 1974, Check list of the marine and freshwater fishes of Vietnam, Publications of the Seto Marine Biological Laboratory, 21 (3/4), 153 – 177 80 35 Palumbi SR, Martin AP, Romano SL, McMillan WO, Stice L, Grabowski G (1991), The Simple Fool’s Guide to PCR, Dept, of Zoology, University of Hawaii, Honolulu 36 Paul H Barber, David, R &Bellwood 2005, Biodiversity hotspots: evolutionary origins of biodiversity in wrasses (Halichoeres: Labridae) in the IndoPacific and new world tropics Original Research Article Molecular Phylogenetics and Evolution, Volume 35, Issue 1, 235-253 37 Parenti, Paolo, John E & Randall 2011, "Checklist of the species of the families Labridae and Scaridae: an update", Smithiana Bulletin, 13: 29–44 38 Rainboth, WJ 1996, Fishes of the Cambodian Mekong, FAO Species Identification Field Guide for Fishery Purposes 39 Randall, JE, Allen, GR & Steene, RC 1997, Fishes of the Great Barrier Reef and Coral Sea, University of Hawaii Press 40 Rubinnoff, D2006, Utility of mitochondrial DNA barcodes in species conservation, Conservation Biology, 20 (4), 1026 – 1033 41 Sachithanandam, V, Mohan, PM, Muruganandam, N, Chaaithanya, IK & Baskaran, R 2014, Chapter 21: Molecular taxonomy of Serranidae, subfamily Epinephelinae, genus Plectropomus (Oken, 1817) of Andaman waters by DNA barcoding using COI gene sequence Marine Faunal Diversity in India: Taxonomy, Ecology and Conservation, Academic Press Inc, 373 – 394 42 Saccone, C, De Giorgi, C, Gissi, C, Pesole, G & Reyes, A 1999, Evolutionary genomics in the Metazoa: the mitochondrial DNA as a model system Gene, 238(1), 195 – 210 43 Sale, P 1997, Coral Reef Fishes, Academic Press 44 Santini F& Tyler JC 2003, A phylogeny of the families of fossil and extant tetraodontiform fishes (Acanthomorpha, Tetraodontiformes), Upper Cretaceous to recent Zool J Linn Soc, 139: 565-617 45 Santini, F, Tyler, JC 2004, The importance of even highly incomplete fossil taxa in reconstructing the phylogenetic relationships of the Tetraodontiformes (Acanthomorpha: Pisces), Integr Comp Biol 44 (5), 349–357 81 46 Santini, F, Sorenson, L&Alfaro, ME 2013, A new phylogeny of tetraodontiform fishes (Tetraodontiformes, Acanthomorpha) based on 22 loci Mol Phylogenet Evol 69 (1), 177–187 47 Santini, F, Sorenson, L&Alfaro, ME 2013, A new multi-locus timescale reveals the evolutionary basis of diversity patterns in triggerfishes and filefishes (Balistidae, Monacanthidae; Tetraodontiformes) Mol Phylogenet Evol 69 (1), 165– 176 48 Schander, C& Willassen, E 2005, What can biological barcoding for marine biology, Marine Biology Research, 1, 79 – 83 49 Smith, M A, Fisher, B L & Hebert, PDN 2005, DNA barcoding for effective biodiversity assessment of a hyperdiverse arthropod group: the ants of Madagascar Philosophical Transactions of the Royal Society Part B: Biological Sciences, 360 (1462), 1825 – 1834 50 Smith, WL& Wheeler, WC 2004, Polyphyly of the mail-cheeked fishes (Teleostei: Scorpaeniformes): evidence from mitochondrial and nuclear sequence data Molecular Phylogenetics and Evolution, 32 (2), 627 – 646 51 Smith & Wheeler 2006,Grouper Taxonomy Scorpionfishes & Lionfishes Groupers Stonefishes & Waspfishes Smith & Wheeler, journal of heredity 2006:97(3), 206–217 52 Spalding, M , Ravillious, C& Gree, E 2001, World Atlas of Coral Reefs, Berkeley: University of California Press 53 Steinke D, Zemlak TS&Hebert PDN (2009) Barcoding Nemo: DNA-Based Identifications for the Ornamental Fish Trade PLoS ONE 4(7): e6300 doi:10.1371/ journal.pone.0006300 54 Swartz, ER, Mwale, M & Hanner, R 2008, A role for barcoding in the study of African fish diversity and conservation, South African Journal of Science, 104 (4), 293 – 298 55 Tautz, D, Arctander, P, Minelli, A, Thomas, RH & Vogler, AP 2003, A plea for DNA taxonomy, Trends in Ecology and Evolution, 18 (2), 70 – 74 56 Taylor, RW & Turnbull, DM 2005, Mitochondrial DNA mutations in human disease Nature Reviews Genetics, 6, 389 – 402 82 57 Tyler JC&Sorbini L 1996, New superfamily and three new families of tetraodontiform fishes from the Upper Cretaceous: the earliest and most morphologically primitive plectognaths Smiths Contrib Paleobiol, 82: 1-59 58 Vences, M, Thomas, M, Bonett, R M & Vieites, DR 2005, Deciphering amphibian diversity through DNA barcoding: chances and challenges, Philosophical Transactions of the Royal Society Part B: Biological Sciences, 360 (1462), 1859 – 1868 59 Ward RD, Zemlak TS, Innes BH, Last PR, Hebert PDN (2005) DNA barcoding Australia’s fish species, Philosophical Transactions of the Royal Society of London, Series B, Biological Sciences, 360, 1847– 1857 60 Vikram B, Baliga & Chris J Law 2016, Cleaners among wrasses: Phylogenetics and evolutionary patterns of cleaning behavior within Labridae Molecular Phylogenetics and Evolution 94, 424–435 61 Wang, YW, Ding, SD & Su, YS 2006, Molecular phylogenetic relationships of 30 grouper species in China Seas groupers based on 16S rDNA fragment sequences Dong Wu Xue Bao, 52, 514 – 521 62 Waugh, J 2007, DNA barcoding in animal species: progress, potential and pitfalls BioEssays, 29 (2), 188 – 197 63 Wilkinson, I & Clive, R 2000, Status of coral reefs of the world, Global Coral Reef Monitoring Network 64 Winterbottom, R 1974, The familial phylogeny of the Tetraodontiformes (Acanthopterygii: Pisces) as evidenced by their comparative myology Smiths Contrib Zool, 155: 1-201 65 Wolstenholme, DR 1992, Animal mitochondrial genome: structure and evolution, International Review of Cytology, 141, 172 – 216 66 Wong, LL 2011, DNA Barcoding and Related Molecular Markers for Fish Species Authentication, Phylogenetic Assessment and Population Studies, A dissertation submitted to the Graduate Faculty of Auburn University in partial fulfillment of the requirements for the Degree of Doctor of Philosophy, Auburn, Alabama 67 Zhang, J 2011, Species Identification of Marine Fishes in China with DNA barcoding, Evidence – Based Complementary and Alternative Medicine Hindawi Publishing Corporation 83 68 Zheng, Dewang Liu, Weiguang Ren, Juan Fu, Linfang Huang, &Shilin Chen 2014, Integrated Analysis for Identifying Radix Astragali and Its Adulterants Based on DNA Barcoding, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 69 Yusuke Yamanoue, Masaki Miya, Keiichi Matsuura, Harumi Sakai, Masaya Katoh& Mutsumi Nishida 2009, Unique patterns of pelvic fin evolution: A case study of balistoid fishes (Pisces: Tetraodontiformes) based on whole mitochondrial genome sequences, Molecular Phylogenetics and Evolution, Volume 50, Issue 1, Pages 179189 TÀI LIỆU INTERNET Sở Kế Hoạch Đầu Tư Tỉnh Khánh Hòa 2016, Thông tin tỉnh Khánh Hòa http://www.khanhhoainvest.gov.vn/tintuc/user/tintuc_ct.aspx?matt=20141795657887530 http://www.molecularfisherieslaboratory.com.au/next-generation-sequencing-aidsgemfish-fishery/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi http://fishbase.us/ 84 PHỤ LỤC Phụ lục A: Quy trình tách chiết DNA tổng số kit Thermo Scientific Dream Taq DNA Polymerase (Thermo Scientific): - Cắt 20 mg mô cá, cho vào tube 1,5mL nghiền nhỏ - Thêm 180µL Digestion Solution, mix - Thêm 20 µL Proteinase K Solution, mix - Ủ 560C mô tan hoàn toàn - Thêm 20 µL Rnase A Solution, vortex ủ 10 phút nhiệt độ phòng - Thêm 200 µL Lysis Solution, vortex 15s cho đồng - Thêm 400 µL ethanol 50%, mix - Chuyển toàn thể tích tube 1,5mL sang cột GeneJET Genomic DNA Purification Column, tiến hành: + Ly tâm phút 8000 vòng/phút + Loại bỏ dịch + Đặt GeneJET vào tube mL - Thêm 500 µL Wash Buffer I vào GeneJET, ly tâm phút 10.000 vòng/phút , tiếp tục loại bỏ dịch đặt cột trở lại - Thêm 500 µL Wash Buffer II vào GeneJET, ly tâm phút 16.000 vòng/phút, tiếp tục loại bỏ dịch chuyển cột GeneJET sang tube 1,5mL - Thêm 100 µL Elution Buffer, đặt nhiệt độ phòng phút, sau ly tâm phút 8000 vòng/phút - Loại bỏ cột GeneJET  Thu DNA tổng số tube 1,5mL Bảo quản DNA tổng số -200C đến -400C Phụ lục B: Hình vẽ loài cá rạn san hô thu Khánh Hòa Stethojulis bandenensis - Cá bàng chài Stethojulis trilineata - Cá bàng chài cầu vồng ba vạch Hemigymnus fasciatus- Cá bàng chài năm Anampses caeruleopunctatus - Cá vạch bàng chài chấm xanh Macropharyngodon meleagris - Cá bàng Cheilinus chlorourus- Cá bàng chài chài da báo hoa Monacanthus chinensis - Cá bò gai móc Pseudomonacanthus peroni - Cá bò da túi bụng Odonus niger - Cá bò đỏ Takifugu niphobles - Cá Takifugu obscurus- Cá obscurus Lagocephalus wheeleri – cá vàng Lagocephalus inermis –cá mỏ Arothron manilensis- Cá chuột chim vân ngang Arothron hispidus- Cá chuột vân Diodon holocanthus –cá nhím bụng Lactoria cornuta- Cá bò hòm hai sừng Ostracion cubicus - Cá hộp vàng Dendrochirus zebra - Cá mao tiên Dendrochirus brachypterus- Cá mao tiên râu ngắn Sebastapistes strongia- Cá mú quỷ Minous trachycephalus - Cá mặt quỷ sọc Inimicus didactylus- Cá mao quỷ Platycephalus cultellatus - Cá chai Ấn Độ Dactyloptena orientalis- Cá tắc kè ... danh, phân loại, thu thập bổ sung tư liệu đối tượng cá rạn san hô cần thiết, đề tài Ứng dụng gen mã vạch (16S rRNA COI mtDNA) DNA ti thể để phân loại số loài cá rạn san hô tỉnh Khánh Hòa sử dụng. .. hải sản cá rạn san hô tỉnh Khánh Hòa Mục tiêu đề tài Ứng dụng gen mã vạch (16S rRNA COI DNA ty thể) để phân loại số loài cá rạn san hô thuộc họ Labridae thuộc cá vược (Perciformes), cá mú (Scorpaeniformes)... tài Ứng dụng gen mã vạch (16S rRNA COI mtDNA) DNA ti thể để phân loại số loài cá rạn san hô tỉnh Khánh Hòa sử dụng trình tự gen 16S rRNA Cytochrome oxidase subunit I mitochondrial DNA ty thể