Ứng dụng gen mã vạch cytochrome oxidase subunit 1 (CO1) của DNA ty thể để phân loại một số loài cá nước ngọt khu vực duyên hải nam trung bộ và tây nguyên

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC ỨNG DỤNG GEN MÃ VẠCH CYTOCHROME OXIDASE SUBUNIT I (COI) CỦA DNA TY THỂ ĐỂ PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI CÁ NƯỚC NGỌT KHU VỰC DUYÊN HẢI NAM TRUNG BỘ VÀ TÂY NGUYÊN GVHD: ThS Vũ Đặng Hạ Quyên SVTH: Huỳnh Thị Hậu MSSV: 54130441 Khánh Hòa, 07/2016 ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, trước tiên em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đặng Thúy Bình Ths Vũ Đặng Hạ Quyên tận tình bảo hướng dẫn em suốt thời gian nghiên cứu thực đồ án Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo thuộc viện Công nghệ sinh học Môi trường giảng dạy, truyền đạt kiến thức bổ ích cho em suốt trình học tập năm qua Em xin gửi lời cảm ơn đến Trung tâm thí nghiệm thực hành, Trường Đại học Nha Trang tạo điều kiện sở vật chất cho em suốt trình thực đồ án Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè anh chị phòng thí nghiệm sinh học phân tử quan tâm, giúp đỡ hỗ trợ em suốt thời gian thực đồ án để em hoàn thành đồ án tốt nghiệp Mặc dù, em cố gắng để hoàn thiện đồ án thời gian, kiến thức hạn chế, nên trình thực đồ án tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận góp ý thầy, cô giáo để đồ án hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 11 tháng năm 2016 Sinh viên Huỳnh Thị Hậu iii TÓM TẮT Vùng Duyên hải Nam Trung Bộ Tây Nguyên biết đến với hệ thống sông ngòi dày đặc nơi có nhiều hồ chứa, đầm lầy, điều kiện thuận lợi cho cá nước phát triển đa dạng phong phú Tuy nhiên, nay, tượng biến đổi khí hậu gây lũ lụt, hạn hán, sạc lở đất việc khai thác mức làm suy giảm độ đa dạng sinh học động vật nước nói chung cá nước nói riêng Nghiên cứu tập trung phân loại hình thái di truyền số loài cá nước phân bố khu vực Dựa vào đặc điểm hình thái, nghiên cứu ghi nhận 25 loài thuộc 22 giống, họ Sử dụng trình tự gen COI mtDNA loài cá nghiên cứu trình tự ngân hàng gen để xây dựng phát sinh loài phương pháp Neighbor Joining Cây phân loại cho thấy có đồng dạng mức (Order), nhiên, chưa thể rõ phân tách di truyền mức họ (Family) giống (Genus) Dữ liệu sử dụng nguồn liệu đầu vào cho nghiên cứu đa dạng sinh học cá nước khu vực Duyên hải Nam Trung Bộ Và Tây Nguyên iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT iii DANH MỤC HÌNH .vi DANH MỤC BẢNG .ix DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT x MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan địa điểm nghiên cứu .4 1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu đa dạng sinh học cá nước nước .8 1.3 Ứng dụng kĩ thuật di truyền nghiên cứu đa dạng sinh học cá 14 1.3.1 Tổng quan hệ gen ty thể 14 1.3.2 Ứng dụng kĩ thuật di truyền mã vạch (DNA barcoding) nghiên cứu đa dạng sinh học cá nước 17 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .22 2.1 Đối tượng, địa điểm phương pháp thu mẫu 22 2.2 Sơ đồ nghiên cứu 23 2.3 Phân loại hình thái 23 2.4 Nghiên cứu di truyền cá nước .26 2.4.1 Tách chiết DNA, nhân gen kĩ thuật PCR giải trình tự 26 2.4.2 Phân tích liệu xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại .28 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31 3.1 Phân loại hình thái 31 3.1.1 Thành phần loài loài cá nước phổ biến thu Duyên hải Nam Trung Bộ Tây Nguyên, Việt Nam 31 3.1.2 Đặc điểm hình thái loài cá nước phổ biến thu Duyên hải Nam Trung Bộ Tây Nguyên, Việt Nam .34 v 3.2 Nghiên cứu di truyền loài cá nước phổ biến Duyên hải Nam Trung Bộ Tây Nguyên 79 3.2.1 Tách chiết DNA tổng số 79 3.2.2 Khuếch đại, giải trình tự DNA cá nước Duyên hải Nam Trung Bộ Tây Nguyên .79 3.2.3 So sánh khác biệt trình tự loài cá nghiên cứu 80 3.2.4 So sánh tương đồng trình tự với Genbank 82 3.2.5 Xây dựng phát sinh loài cá nước thu Duyên hải Nam Trung Bộ Tây Nguyên 83 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 88 4.1 Kết luận 88 4.2 Kiến nghị 89 TÀI LIỆU THAM KHẢO 90 PHỤ LỤC vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Bản đồ mạng lưới sông ngòi khu vực Duyên hải Nam Trung Bộ Hình 1.2: Bản đồ mạng lưới sông ngòi khu vực Tây Nguyên Hình 1.3: DNA ty thể người bao gồm 37 gen mã hóa đặc trưng cho 22tRNA, 2rRNA 13 vùng mã hóa protein Mũi tên vùng gen COI (Cytochrome Oxidase subunits 1) sử dụng nghiên cứu .15 Hình 2.1: Các địa điểm thu mẫu cá số tỉnh thuộc Duyên hải Nam Trung Bộ Tây Nguyên 22 Hình 2.2: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 23 Hình 2.3: Một số phận cá xương 24 Hình 2.4: Các số đo phân loại cá 25 Hình 2.5: Các số đếm phân loại cá 25 Hình 2.6: Chu trình nhiệt phản ứng PCR với đoạn gen COI DNA ty thể 27 Hình 3.1: Tỷ lệ phần trăm họ, giống, loài thành phần cá nước thu Duyên hải Nam Trung Bộ Tây Nguyên 32 Hình 3.2: Bản đồ phân bố số loài cá nghiên cứu 33 Hình 3.3a: Hình thái Barbonymus gonionotus 35 Hình 3.3b: Đặc điểm hình thái Barbonymus gonionotus 36 Hình 3.4a: Hình thái Barbonymus schwanenfeldii 37 Hình 3.4b: Đặc điểm hình thái Barbonymus schwanenfeldii 37 Hình 3.5a: Hình thái Puntius semifasciolatus 38 Hình 3.5b: Đặc điểm hình thái Puntius semifasciolatus 39 Hình 3.6a: Hình thái Puntius brevis 40 Hình 3.6b: Đặc điểm hình thái Puntius brevis 41 Hình 3.7a: Hình thái Poropuntius normani 42 Hình 3.7b: Đặc điểm hình thái Poropuntius normani 42 Hình 3.8a: Hình thái Hemiculter leucisculus 44 Hình 3.8b: Đặc điểm hình thái Hemiculter leucisculus .44 Hình 3.9a: Hình thái Toxabramis houdemeri 45 Hình 3.9b: Đặc điểm hình thái Toxabramis houdemeri 46 Hình 3.10a: Hình thái Osteochilus lini .47 vii Hình 3.10b: Đặc điểm hình thái Osteochilus lini .48 Hình 3.11a: Hình thái Osteochilus hasseltii 49 Hình 3.11b: Đặc điểm hình thái Osteochilus hasselti 50 Hình 3.12a: Hình thái Carassius auratus 50 Hình 3.12b: Đặc điểm hình thái Carrasius auratus 51 Hình 3.13a: Hình thái Cyprinus carpio 52 Hình 3.13b: Đặc điểm hình thái Cyprinus carpio 53 Hình 3.14a: Hình thái Opsarius pulchellus 54 Hình 3.14b: Đặc điểm hình thái Opsarius pulchellus 55 Hình 3.15a: Hình thái Garra cyrano 56 Hình 3.15b: Đặc điểm hình thái Garra cyrano 56 Hình 3.16a: Hình thái Ambastaia nigrolineata 57 Hình 3.16b: Đặc điểm hình thái Ambastaia nigrolineata 58 Hình 3.17a: Hình thái Paramisgurnus dabryanus 59 Hình 3.17b: Đặc điểm hình thái Paramisgurnus dabryanus .60 Hình 3.18a: Hình thái Annamia normani 61 Hình 3.18b: Đặc điểm hình thái Annamia normani 61 Hình 3.19a: Hình thái Glossogobius sp 62 Hình 3.19b: Đặc điểm hình thái Glossogobius sp 63 Hình 3.20a: Hình thái Awaous grammepomus 64 Hình 3.20b: Đặc điểm hình thái Awous grammepomus 65 Hình 3.21a: Hình thái Boleophthalmus boddarti .66 Hình 3.21b: Đặc điểm hình thái Boleophthamus boddarti 67 Hình 3.22a: Hình thái Oxyeleotris mamorata 68 Hình 3.22b: Đặc điểm hình thái Oxyeleotris marmorata 68 Hình 3.23a: Hình thái Channa striata 70 Hình 3.23b: Đặc điểm hình thái Channa striata 70 Hình 3.24a: Hình thái Oreochromis niloticus 72 Hình 3.24b: Đặc điểm hình thái Oreochromis niloticus 72 Hình 3.25a: Hình thái Mystus nigriceps .74 Hình 3.25b: Đặc điểm hình thái Mytus nigriceps 74 Hình 3.26a: Hình thái Pseudomystus siamensis .76 viii Hình 3.26b: Đặc điểm hình thái Pseudomystus siamensis .76 Hình 3.27a: Hình thái Netuma thalassina 77 Hình 3.27b: Đặc điểm hình thái Netuma thalassina 78 Hình 3.28: Kết điện di DNA tổng số số mẫu cá nước 79 Hình 3.29: Kết điện di sản phẩm PCR đoạn gen COI mtDNA số mẫu cá nước 79 Hình 3.30: Cây phát sinh loài từ phương pháp Neighbor – Joining với độ lặp lại 1000 lần dựa gen 16S mtDNA loài cá nước thu Duyên hải Nam Trung Bộ Tây Nguyên, Việt Nam 84 ix DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 2.2: Trình tự gen COI mtDNA loài cá nước 28 Bảng 3.1: Danh sách loài cá nước phổ biến thu Duyên hải Nam Trung Bộ Tây nguyên, Việt Nam 31 Bảng 3.2: Sự khác biệt trình tự COI mtDNA 25 loài cá nước Duyên hải Nam Trung Bộ Tây Nguyên, Việt Nam 81 x DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT Bp Base pairs Ha Hecta Cm Centimeter Km Kilometer Mm Milimeter µL Microliter µM Micromol U Unit TĐTL Thước đo tỷ lệ DNA Deoxyribonucleic acid mtDNA Mitochondrial deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid tRNA Transfer ribonucleic acid COI Cytochrome coxidase subunit I Cyt b Cytochrome b RAG Recombination activating gene PCR Polymerase Chain Reaction GB Ký hiệu cho loài từ Genbank BT Bootstrap Cs Cộng ĐBSCL Đồng sông Cửu Long 95 pp.4541–4550 57 Gill, T.N., 1859 Description of a new generic form of Gobinae from the Amazon River Annals of the Lyceum of Natural History of New York, 7(1), pp.45 – 48 58 Goswami, U.C., Sudip K., Basistha, D.B., Konthoujam S., Bishnupriya S., and Kimneilam C., 2012 Fish diversity of North East India, inclusive of the Himalayan and Indo Burma biodiversity hotspots zones: A checklist on their taxonomic status, economic importance, geographical distribution, present status and prevailing threats International Journal of Biodiversity and Conservation, 4(15), pp.592–613 59 Grande, C., Templado, J and Zardoya, R., 2008 Evolution of gastropod mitochondrial genome arrangements BMC Evolutionary Biology, 8, p.61 60 Habeeb, S.K.M and Sanjayan, K.P 2011 Sequencing and phylogenetic analysis of the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit i of oxycarenus laetus (hemiptera: Lygaeidae) Sanjayan Department of Zoology & Bioinformatics, Guru Nanak College, Velachery Ma International Journal of Plant, Animal and Environmental Sciences, 1(3), pp.85–92 61 Hajibabaei, M., DeWaard, J.R., Ivanova, N.V., Ratnasingham, S.D., Robert, T., Kirk, S.L., Mackie, P.M., Hebert, P.N.D., 2005 Critical factors for assembling a high volume of DNA barcodes Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 360(1462), pp.1959–1967 62 Hall, T.A., 1999 BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT Nucleic Acids Symposium Series, 41, pp.95–98 63 Hebert, P D N., Penton, E H., Burns, J M., Janzen, D.H and and Hallwachs, W., 2004 Ten species in one: DNA barcodingreveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astrapes fulgerator Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of American, pp.14812 – 14817 64 Hebert, P.D.N., Cywinska, A., Alina, C., Shelley L., Ball, L., Jeremy, R., 2003a Biological identifications through DNA barcodes Proceedings Biological sciences The Royal Society, 270(1512), pp.313–21 65 Hebert, P.D.N., Ratnasingham, S and DeWaard, J.R., 2003b Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit divergences among closely related species Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 270(Suppl 1), pp.S96–S99 96 66 Hubert, N., Hanner, R., Holm, E., Mandrak, N.E., Taylor, E., Burridge, M., Watkinson, D., Dumont, P., Curry, A., Bentzen, P., Zhang, J., April, J., Barnatchez, L., 2008 Identifying Canadian Freshwater Fishes through DNA Barcodes Plos, 3(6), pp.1– 67 Ingman, M and Gyllensten, U., 2003 Mitochondrial Genome Variation and Evolutionary History of Australian and New Guinean Aborigines Genome Research, 13(7), pp.1600–1606 68 Inoue, J.G., Miya, M., Lam, K Tay, B.H, Danks, J.A., Bell, J., Walker, T.I., Venkatesh, B., 2010 Evolutionary origin and phylogeny of the modern holocephalans (Chondrichthyes: Chimaeriformes), a mitogenomic perspective Molecular Biology and Evolution , 27 (11 ), pp.2576–2586 69 Jang, L.N.H., Chang, C.H., and Tsai, C.L., 2013 Complete mitogenomes of two Puntius in Taiwan: P semifasciolatus and P snyderi (Cypriniformes: Cyprinidae) Mitochondrial DNA: The Journal of DNA Mapping, Sequencing, and Analysis, 24(3), pp.228–230 70 Jayaram, K.C., 1968 Contributions to the study of bagrid fishes (Siluroidea: Bagridae) A systematic account of the Japanese, Chinese, Malayan and Indonesian genera Treubia, Buitenzorg, pp.287–386 71 Jin, X.X., Sun, Y.N., Wang, R.X., Tang, D., Zhao, S.L., Xu, T.J., 2013 Characteristics and phylogenetic analysis of mitochondrial genome in the gobies Zhongguo yi chuan xue hui bian ji, 35(12), pp.1391–1402 72 Johnston, D.A., 2006 Genomes and genomics of parasitic flatworms Parastic flatworms: Molecular biology, Biochemistry, Immunology and Physiology, pp.37–80 73 June F.F., Ordoñez, M.F., Ventolero, H., Mudjekeewis, D.S., 2016 Maternal mismatches in farmed tilapia strains ( Oreochromis spp.) in the Philippines as revealed by mitochondrial COI gene Mitochondrial DNA, (April), pp.1–10 74 Jutagate, T., Chaiwut K., Praneet N., Kanjana P., and Thanatip L., 2003 Fisheries in the Mun river: A one-year trial of opening the sluice gates of the Pak Mun dam, Thailand Kasetart Journal: Natural Science, 116(1), pp.101–116 75 Kandil, O.M., Mahmoud, M.S., Allam, N.T., Namaky, A.H., 2010 Mitochonderial Cytochrome C Oxidase Subunit ( cox ) Gene Sequence of the 97 Hymenolepis Species Journal of American Science, 6(12), pp.640–647 76 Karim, A., Iqbal A., Akhtar, R., Rizwan, M., Amar, A., Qamar, U., Jahan, S., 2015 Barcoding of fresh water fishes from Pakistan Barcoding of fresh water fishes from Pakistan Mitochondrial DNA, 1736 (December), pp.1–4 77 Kim, S 2011 DNA chip for species identification of Korean freshwater fish: A case study Biochip Journal, 5(1), pp.72–77 78 Klausewitz, W., 1959 Botia sidthimunki, eine neue Schmerle aus Thailand (Pisces, Cobitidae) Senckenbergiana Biologica, 40, pp.51–53 79 Ko, H.L., Wang, Y.T., Chiu, T.S., Lee, M.A., Leu, M.Y., Chang, K.Z., Chen, W.Y., Shao, K.T., 2013 Evaluating the Accuracy of Morphological Identification of Larval Fishes by Applying DNA Barcoding PLoS ONE, 8(1), p.e53451 80 Kottelat, M., Whitten, A.J., Kartikasari, S.N., and Wirjoatmodjo, S., 1993 Freshwater fishes of Western Indonesia and Sulawesi Periplus Editions, Hong Kong, p.221p 81 Kottelat, M., 2000 Diagnoses of a new genus and 64 new species of fish from Laos (Teleostei: Cyprinid, Balitoridae, Bagridae, Syngnathidae, Chaudhuriidae and Tetraodontidae) South Asian Natural History, 5, pp.37 – 82 82 Kottelat, M., 2001a Fish of Laos WHT Publications (Pte) Ltd Sri Lanka, p.198 pp 83 Kottelat, M., 1998 Fishes of the Nam Theun and Xe Bangfia basins, Laos, with diagnoses of twenty-two news species (Teleostei: Cyprinid, Cobitidae, Coiidae and Odontobutidae) Ichthyological Exploration of Freshwater 1, 9, pp.1–128 84 Kottelat, M., 2011 Fishes of the Xe Kong drainage in Laos, especially from the Xe Kaman Co-Management of freshwater biodiversity in the Sekong Basin, (October), pp.1–29 85 Kottelat, M., 2001b Freshwater fishes of Northern Vietnam Worldbank, Washington, (June), pp.50–73 86 Kottelat, M., 2012 The survey focused on Dakchung district Eleven species were collected on Dakchung plateau and are apparently new to science (and thus 27 % of the fish fauna of the plateau is endemic there) The raffles bulletin of zoology 2012, Supplement no 26, pp.1 – 199 87 Kottelat, M and Freyhof, J., 2007 Handbook of European freshwater fishes 98 Copeia, (3), p.646 88 Krishna K.P., and Francis, R.A., 2012 A critical review on the utility of DNA barcoding in biodiversity conservation Biodiversity and Conservation, 21(8), pp.1901– 1919 89 Kumar, S., Stecher, G & Tamura, K., 2016 MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets Molecular biology and evolution, 33(7), pp.1870–1874 90 Lefébure, T., Douady, C.J., Gouy, M., Gibert, J., 2006 Relationship between morphological taxonomy and molecular divergence within Crustacea: Proposal of a molecular threshold to help species delimitation Molecular Phylogenetics and Evolution, 40(2), pp.435–447 91 Liu, S.Q., Mayden, R.L., Zhang, J.B., Yu, D., Tang, Q.Y., Deng, X., Liu, H.Z., 2012 Phylogenetic relationships of the Cobitoidea (Teleostei: Cypriniformes) inferred from mitochondrial and nuclear genes with analyses of gene evolution Gene, 508(1), pp.60–72 92 Lu, K., 1991 The freshwater fishes of Guangdong Province Guangdong Science and Technology Press, Guangzhou, p.589 93 Mandal, S.D., Chhakchhuak, L., Gurusubramanian, G., Kumar, N.S., 2014 Mitochondrial markers for identification and phylogenetic studies in insects – A Review DNA Barcodes, 2(1), pp.1–9 94 Maranan, J.B.D., Basiao, Z.U and Quilang, J.P., 2015 DNA barcoding of feral tilapias in Philippine lakes Mitochondrial DNA, 1736(October), pp.1–12 95 Mas, C.S., Valero, M.A and Bargues, M.D., 2009 Fasciola, Lymnaedis and human fasciolasis, with a global overview on disease transmission, epidemiology, evolutionary genetics, molecular epidemiology and control Advances in Parasitology, no 69, (2), pp.41–146 96 Mayden, R.L., Tang, K.L., Wood, R.M., Mary, W.C., Conway, K.W., Yang, L., Simons, A.M., Bart, H.L., Harris, P.M., 2008 Inferring the Tree of Life of the order Cypriniformes, the earth’s most diverse clade of freshwater fishes: Implications of varied taxon and character sampling Journal of Systematics and Evolution, 46(April), pp.424–438 97 Moghaddam, F.Y., Aliabadian, M., Daud, S.K., Seifali, M., 2012 Molecular 99 phylogeny ofthe Puntius (Hamilton, 1822) based on nuclear gene RAG2 Sciences-New York, (January) 98 Muchlisin, Z.A., Thomy, Z., Fadli, N., Sarong, M.A., Siti, A.M.N., 2013 DNA barcoding of freshwater fishes from Lake Laut Tawar, Aceh Province, Indonesia Acta Ichthyologica et Piscatoria, 43(1), pp.21–29 99 Murdy, E.O., Birdsong, R.S and Musick, J.A., 1997 Fishes of Chesapeake Bay Smithsonian Institution Press Washington and London, pp.1–324 100 Mustafajev, N.J., Ibragimov, S.R and Levin, B.A., 2013 Discovery of the common sawbelly Hemiculter leucisculus in Azerbaijan Laboratory of Fish Ecology, Institute of Biology of Inland Waters, Russian Academy of Sciences, Borok, Yaroslavl 101 Neigel, J., Domingo, A and Stake, J., 2007 DNA barcoding as a tool for coral reef conservation Coral Reefs, 26(3), pp.487–499 102 Nguyen T.N.T., and Duong, T.Y., 2014 DNA barcoding gene cytochrome c oxidase subunit of channa speices in the Mekong delta A thesis submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Bachelor of aquaculture science, p.15 103 Nicolè, S., Negrisolo, E., Eccher, G., Mantovani, R., Patarnello, T., 2012 Use of DNA barcoding for the genetic traceability of commercial seafood products Original scientific paper 50, pp.387 – 398 104 Nwani, C.D., Becker, S., Braid, H.E., Ude, E.F., Okogwu, O.I., Hanner, R., 2011 DNA barcoding discriminates freshwater fishes from southeastern Nigeria and provides river system-level phylogeographic resolution within some species Mitochondrial DNA, 22(S1), pp.43–51 105 Pallavi, W., Goswami, M., Nautiyal, P., Malakar, A.K and Lakra, W.S., 2012 Molecular identification of Puntius spp inferred from cytochrome c oxidase subunit I (COI) gene National Bureau of Fish Genetic Resources, Canal Ring Road, Post Office Dilkusha, Telibagh, Lucknow, Uttar Pradesh, India 106 Panprommin, D., Dangsing, M and Panprommin, N., 2013 DNA Barcoding for Species Identification of 14 loaches School of Agriculture and Natural Resources, University of Phayao, Thailand, Phaholyothin, Muang, Phayao, Thailand, pp.20 – 30 107 Pasco, V.E., Veran, M &and Viriot, L., 2012 Bleeker was right: Revision of the genus cyclocheilichthys (bleeker 1859) and resurrection of the genus anematichthys (bleeker 1859), based on morphological and molecular data of southeast 100 asian Cyprininae (teleostei, Cypriniformes) Zootaxa, 54(3586), pp.41–54 108 Pereira, L.H.G., Hanner, R., Foresti1, F., and Oliveira, C., 2013 Can DNA barcoding accurately discriminate megadiverse Neotropical freshwater fish fauna? BMC Genetics, pp.14 – 20 109 Rainboth, W.J., 1996 Fishes of the Cambodian Mekong FAO species identification field guide for fishery purposes, p.265 110 Robert T.R., 1998 Review of the tropical Asian Cyprinid fish genus Poropuntius, with description of new species and trophic morphs Nat Hist Bull Siam 46, pp.105–135 111 Roberts, T.R., 1990 The freshwater fishes of Western Borneo (Kalimantan Barat, Indonesia) Raffles bulletin of zoology, 38 (1),pp.87 – 88 112 Rubinnoff, 2006 Utility of mitochondrial DNA barcodes in species conservation Conservation Biology, 20(4), pp.1026–1033 113 Saraste M, 1999 Oxidative Phosphorylation at the fin de siècle Science 283(5407), pp.1488–1493 114 Schander, C and Willassen, E., 2005 What can biological barcoding for marine biology? Marine Biology Research, 1(1), pp.79–83 115 Schori, M and Showalter, A.M., 2011 Dna barcoding as a means for identifying medicinal plants of Pakistan Pakistan Journal of Botany, 43 (spec issue), pp.1–4 116 Smith, H.M., 1945 The Freshwater fishes of Siam or Thailand United States government printing office Washington, pp 593 117 Smith, M.A., Fisher, B.L and Hebert, P.D.N., 2005 DNA barcoding for effective biodiversity assessment of a hyperdiverse arthropod group: the ants of Madagascar Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 360(1462), pp.1825–1834 118 Sullivan, J.P., Peng, Z., Peng, J., He, S and Lundberg, J., 2008 Molecular evidence for a non-monophyletic Asian catfish family Amblycipitidae and an all-Asian Sisoroidea (Siluriformes: Teleostei) Dept of Ichthyology, The Academy of Natural Sciences, Benjamin Franklin Parkway, Philadelphia, PA, USA 119 Swartz, E.R., Mwale, M., Hanner, R., Swartz, E.R., 2008 A role for barcoding in the study of African fish diversity and conservation A role for barcoding 101 in the study of African fish diversity and conservation South African Journal of Science, 104 (March 2016), pp.293 –298 120 Sylvia E., Bartlett, W.S.D., 1991 Identification of Thunnus Tuna Species by the Polymerase Chain Reaction and Direct Sequence Analysis of their Mitochondrial Cytochrome b Genes Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 48(2), pp.309–317 121 Tang, K.L., Agnew, M.K., Hirt, M.V., Sado, T., Schneider, L.M., Jörg, F., Sulaiman, Z., Swartz, E., Vidthayanon, C., Miya, M., Saitoh, K., Simons, A.M., Wood, R.M., Mayden, R.L., 2010 Systematics of the subfamily Danioninae (Teleostei: Cypriniformes: Cyprinidae) Molecular Phylogenetics and Evolution, 57(1), pp.189– 214 122 Tautz, D Arctander, P., Minelli, A., Thomas, R.H., Vogler, A.P., 2003 A plea for DNA taxonomy Trends in Ecology & Evolution, 18(2), pp.70–74 123 Taylor, R.W., 2005 Mitochondrial DNA mutations in human Nature Reviews Genetics 6, p.390 124 Tchang, T.L., 1962 A list of the fishes and a new species from Hsi-ShuanPan-Na, Yunnan Acta Zoologica Sinica, 14(1), pp.95–98 125 Thai, P.T.L., and Dang, T.B., 2015 Goby species diversity in Vietnam based on morphological and genetic characteristics Journal of Fisheries Science and Technology, 2015 (Special issue), pp.141 – 148 126 Thai, B.T., Sy, V.N., Phuc, P.D., Austin, C.M., 2007 Phylogenetic evaluation of subfamily classification of the Cyprinidae focusing on Vietnamese species Aquatic Living Resources, 20, pp.143–153 127 Tuppen, H.A.L Blakely, E.L., Turnbull, D.M., Taylor, R.W., 2010 Mitochondrial DNA mutations and human disease Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics, 1797(2), pp.113–128 128 Vences, M Thomas, M., Bonett, R.M., Vieites, D.R., 2005 Deciphering amphibian diversity through DNA barcoding: chances and challenges Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 360(1462), pp.1859–1868 129 Vidthayanon, C and Premcharoen, S., 2002 The status of estuarine fish diversity in Thailand Marine and Freshwater Research, 53(2), pp.471–478 130 Vu, D.H.Q., Thai, T.L.P, Truong, T.O., Tran, L.T., Dang, T.B., 2015 102 Phylogenetic Relationships of Freshwater Fish in Vietnamese Mekong International Conference on Biological, Environment and Food Engineering (BEFE-2015) May 1516, 2015 Singapore caudal, pp.58 – 61 131 Wainwright, P.C., Smith W.L., Price, S.A., Tang, K.L., Sparks, J.S., Ferry, L.A., Kuhn, K.L., Eytan, R.I., Near, T.J., 2012 The Evolution of Pharyngognathy: A Phylogenetic and Functional Appraisal of the Pharyngeal Jaw Key Innovation in Labroid Fishes and beyond Systematic Biology, 61(6), pp.1001–1027 132 Wang, H.Y., Tsai, M.P., Dean, J., Lee, S.C., 2001 Molecular phylogeny of gobioid fishes (Perciformes: Gobioidei) based on mitochondrial 12S rRNA sequences Molecular phylogenetics and evolution, 20(3), pp.390–408 133 Wang, J Wu, X.Y., Chen, Z., Yue, Z., Ma, W., Chen, S., Xiao, H., Murphy, R.W., Zhang, Y., 2013 Molecular phylogeny of European and African Barbus and their West Asian relatives in the Cyprininae (Teleostei: Cypriniformes) and orogenesis of the Qinghai-Tibetan Plateau Chinese Science Bulletin, 58(31), pp.3738–3746 134 Wang, P., Chen, S., Ou, Y., Wen, J., Li, J., 2015 Complete mitochondrial genome of Toxabramis houdemeri (Cypriniformes; Cyprinidae) and its phylogenetic analysis Mitochondrial DNA, pp.1–2 135 Ward, R.D., Zemlak, T.S., Innes, B.H., Last, P.R., Hebert, P.D.N., 2005 DNA barcoding Australia’s fish species Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 360(1462), pp.1847–1857 136 Waugh, J., 2007 DNA barcoding in animal species: progress, potential and pitfalls BioEssays, 29(2), pp.188 – 197 137 Yang, L., Arunachalam, A., Sado, T Levin, B.A., Alexander, S., Freyhof, J., Friel, J.P., Chen, W.J., Vincent, H.M., Manickam, R., Manickam, M.K., Simons, A.M., Saitoh, K., Miya, M., Mayden, R.L., He, S., 2012 Molecular phylogeny of the cyprinid tribe Labeonini (Teleostei: Cypriniformes) Molecular phylogenetics and evolution, 65 (2), pp.362 – 379 138 Yang, L., Hirt, M.V., Sado, T., Arunachalam, M., Manickam, R., Tang, K.L., Simons, A.M., Wu, H.H., Mayden, R.L and Miya, M., 2012 Phylogenetic placements of the barbin genera Discherodontus, Chagunius, and Hypselobarbus in the subfamily Cyprininae (Teleostei: Cypriniformes) and their relationships with other barbins Zootaxa 3586, pp.26–40 103 139 Yang, L., Mayden, R.L., Sado, T., He, S., Saitoh, K and Miya, M., 2010 Molecular phylogeny of the fishes traditionally referred to Cyprinini sensu stricto (Teleostei: Cypriniformes) Zool Sci 39 (6), pp.527 – 550 140 Zhang, J., 2011 Species Identification of Marine Fishes in China with DNA Barcoding Evidence-based Complementary and Alternative Medicine : eCAM, 2011, 978253, p.11 Tài liệu internet http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ http://www.fishbase.org/ (Hệ thống liệu cá giới) http://www.genecodes.com/ Genetics Home Reference (2014) Mitochondrial DNA http://ghr.nlm.nih.gov/chromosome/MT Tổng cục du lịch (2012) http://www.vietnamtourism.com/ Trung tâm khí tượng thủy văn quốc gia http://www.nchmf.gov.vn/web/viVN/43/Default.aspx PHỤ LỤC Phụ lục 1: Quy trình tách chiết DNA tổng số kit GenJET Genomic DNA purification kit (Thermo Scientific): - Cắt 20 mg mô cá, cho vào tube 1,5mL nghiền nhỏ - Thêm 180µL Digestion Solution, mix - Thêm 20µL Proteinase K Solution, mix - Ủ 580C mô tan hoàn toàn - Thêm 5µL Rnase A Solution, vortex ủ 10 phút nhiệt độ phòng - Thêm 200µL Lysis Solution, vortex 15s cho đồng - Thêm 400µL ethanol 50%, mix - Chuyển toàn thể tích tube 1,5mL sang cột GeneJET Genomic DNA Purification Column, tiến hành: + Ly tâm phút 8000 vòng/phút + Loại bỏ dịch + Đặt GeneJET vào tube mL - Thêm 500 µL Wash Buffer I vào GeneJET, ly tâm phút 10.000 vòng/phút, tiếp tục loại bỏ dịch đặt cột trở lại - Thêm 500 µL Wash Buffer II vào GeneJET, ly tâm phút 13.000 vòng/phút, tiếp tục loại bỏ dịch chuyển cột GeneJET sang tube 1,5mL - Thêm 200 µL Elution Buffer, đặt nhiệt độ phòng phút, sau ly tâm phút 8000 vòng/phút - Loại bỏ cột GeneJET - Thu DNA tổng số tube 1,5mL Bảo quản DNA tổng số -200C đến -400C Phụ lục 2: Chỉ tiêu hình thái loài cá nước thu Duyên hải Nam Trung Bộ Tây Nguyên, Việt Nam Tên khoa học Bộ Cypriniformes Barbonymus gonionotus Barbonymus schwanenfeldii Puntius semifasciolatus N D A P V C L (cm) Lo(cm) H (cm) T (cm) lD (cm) lA(cm) lP(cm) lV (cm) III, I, - I, 11 12 I, II, 20 17,05 ± 1,04 13,1,3 ± 0,94 5,63 ± 0,47 3,53 ± 0,26 1,85 ± 0,05 1,85 ± 0,09 3,15± 0,14 1,6 ± 0,12 III, III, I, 13 I, IV, 14 15,5 11,9 5,3 2,9 2,3 1,8 2,5 1,8 III, I, I, I, I, 12 6,7 4,5 1,3 1,2 0,7 0,5 0,9 0,8 Puntius brevis III, I, I, I, II, 20 9,7 ± 0,64 7,7 ± 0,49 3,4 ± 0,29 2,35 ± 0,48 1,53± 0,29 0,85 ± 0,11 Poropuntius normani III, I, I, 13 I, III, 18 12,7±2,77 9,5 ± 2,16 2,95 ± 1,44 2,25 ± 0,25 1,8 ± 0,12 1,4 ± 0,1 1,3 ± 0,24 2,35 ± 0,15 1,28 ± 0,19 0,85 ± 0,15 I, I, 15 I, 14 I, I, 17 15 12 2,2 2,4 0,9 0,5 2,3 1,5 I, I, I, I, 16 11,75 ± 0,25 9,75 ± 0,25 2,7 ± 0,1 2,2 ± 0,2 0,65 ± 0,05 I, 15 I, -7 I, 12 I, I, I, 12 I, 4,25 ± 1,75 2,7 ± 0,5 3,65 ± 1,05 I, 12 - 13 1,7 ± 0,2 2,25 ± 0,25 III, 14 I, I, 14 I, II, 16 14 ± 1,0 4,05 ±0,15 2,9 ± 0,1 3,8 ± 0,1 Cyprinus carpio III, 18 II, I, 13 I, 26,93 ± 7,66 5,78 ± 1,12 4,85 ± 0,92 7,63 ± 2,11 Opsarius pulchellus Garra cyrano Ambastaia nigrolineata Paramisgurmus dabryanus I, I, I, 13 I, I, 8,5 ± 0,5 6,75 ± 0,25 2,15 ± 0,15 1,85 ± 0,05 1,1 ± 0,1 I, I, I, IV, 20 III, 19 II, 10 13,55 ± 2,45 8,2 ± 0,9 10,85 ±0,65 19,73 ± 5,31 2,4 ± 0,6 II, 18 - 20 I, 19 7,6 5,8 1,8 I,7 - I, I, I, II, 12 ± 0,35 4,1 ± 0,25 1,2 0,73 ± 0,08 0,85 ± 0,11 0,5 ± 0,07 I, - I, - I, I, 17,27 ± 0,7 15,17 ±0,47 3,07 ± 0,05 2,73 ± 0,25 1,27 ± 0,05 1,3 ± 0,29 I, I, I, 15 I, 16 18 IV, 16 10 1,1 1,2 0,4 1,2 1,3 D1: VI, D2: I, 10 I, 15 I, 9,8 8,2 1,5 D1 = 0,6, D2 = 1,7 1,5 1,3 Hemiculter leucisculus Toxabramis houdemeri Osteochilus hasseltii Osteochilus lini Carrasius auratus Annamia normani Bộ Perciformes Glossogobius sp 12 15,25 ± 3,1 11 ± 1,0 2,15 ± 0,05 1,15 ± 0,15 0,8 ± 0,1 0,65 ± 0,15 1,98 ±0,54 0,55 ± 0,05 0,5 0,25 ± 0,05 2,1 2,5 ± 0,5 2,1 ± 0,1 2,3 ±0,2 3,78 ±0,86 1,4 ± 0,1 1,3 0,83 ± 0,08 1,97 ± 0,29 1,25 ± 0,05 1,85 ± 0,15 1,9 ±0,1 1,55 ± 0,15 3,7 ± 1,22 1,05 ± 0,05 0,3 0,6 ± 0,07 1,43 ± 0,09 Awaous grammepomus Boleophthalmus boddarti Oxyeleotris marmorata Oreochromis niloticus Bộ Siluriformes D1: VI, D2: I, 10 D1: V D2: I, 24 D1: VI, D2: I, I, - 10 I, 12 I, 14 12,75 ±0,25 I, 23 18 I, II, 15 13 10 3,9 II, 11 II, I, 14 ± 1,22 5,63 ± 0,78 1,6 ± 0,54 2,27 ± 0,41 D1 = 0,75 ± 0,05, D2 = 1,85 ±0,05 D1 = 1, D2 =6 D1 = 0,5, D2 = 9,75 ±0,25 3,3 ± 0,1 1,8 ± 0,15 2,7 ± 0,1 1,85 ±0,05 5,7 1,8 1,3 0,2 ± 0,14 0,7 ± 0,37 1,57 XVI, 11 III, I, 12 I, IV, 19 13,8 ± 1,5 9,55 ± 0,55 2,5 ± 0,55 ± 0,2 3,5 ± 0,5 1,5 ± 0,6 2,1 ± 0,1 1,25 ± 0,15 Channa striata 43 28 14 I, II, 14 17,5 ± 2,68 14,83 ± 1,70 2,5 ± 0,41 4,47 ± 1,03 8,17 ± 1,03 6,4 ± 0,78 2,5 ± 0,41 1,3 ± 0,24 Mystus nigriceps I, I, I, I, 12 10 3,8 1,1 1,2 Pseudomystus siamensis I, 12 I, I, 7,2 1,5 1,5 0,8 1,4 1,2 I, I, I,6 I, 15,5 ± 0,5 12,75 ± 0,75 3,35 ± 0,15 1,3 ± 0,2 1,65 ± 0,15 2,35 ± 0,15 1,1 ± 0,1 Arius oetik IV, 18 VIII, 14 II, 16 Ghi chú: N – Số lượng mẫu cá D – Số lượng tia gai vây lưng A – Số lượng tia gai vây hậu môn P – Số lượng tia gai vây ngực V – Số lượng tia gai vây bụng C – Số lượng tia gai vây đuôi Số tia gai cứng ký hiệu chữ số La Mã, số lượng tia vây mềm ký hiệu chữ số thường, cách dấu phẩy (VD: tia gai cứng, tia mềm ký hiệu: II,9) Nếu cá có vây lưng kí hiệu D1, D2 L – Chiều dài cá Lo – Chiều dài cá bỏ đuôi H – Chiều cao thân cá T – Chiều dài đầu lD – Chiều dài gốc vây lưng lA – Chiều dài gốc vây hậu môn lP – Chiều dài gốc vây ngực lV – Chiều dài gốc vây bụng m – Khối lượng Phụ lục 3: Bảng sai khác di truyền loài cá thuộc họ Cyprinidae 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 ID ID 6.5 6.5 ID 6.5 6.5 0.6 ID 6.2 6.2 7.7 7.7 ID 6.2 6.2 7.7 7.7 ID 9.5 9.5 8.7 8.7 7.1 7.1 ID 9.5 9.5 8.7 8.7 7.1 7.1 ID 8.8 8.8 8.4 8.4 8.7 8.7 6.6 6.6 ID 10 8.8 8.8 8.4 8.4 8.7 8.7 6.6 6.6 0.5 ID 11 9.3 9.3 9.8 9.8 8.7 8.7 9.1 9.1 7.3 7.3 ID 12 9.3 9.3 9.8 9.8 8.7 8.7 9.1 9.1 7.3 7.3 ID 13 11 11 11.2 11.2 10.2 10.2 9.3 9.3 10.6 10.6 8 ID 14 11 11 11.2 11.2 10.2 10.2 9.3 9.3 10.6 10.6 8 ID 15 11.8 11.8 11.8 11.8 10.9 10.9 10.6 10.6 11 11 9.1 9.1 8 ID 16 11.8 11.8 11.8 11.8 10.9 10.9 10.6 10.6 11 11 9.1 9.1 8 ID 17 9.3 9.3 8.8 8.8 9.1 9.1 9.6 9.6 9.9 9.9 9.5 9.5 11.6 11.6 10.9 10.9 ID 18 9.3 9.3 8.8 8.8 9.1 9.1 9.6 9.6 9.9 9.9 9.5 9.5 11.6 11.6 10.9 10.9 ID 19 11.8 11.8 12.4 12.4 11.8 11.8 13.2 13.2 11.6 11.6 11.2 11.2 12.7 12.7 12.4 12.4 10.1 10.1 ID 20 11.8 11.8 12.4 12.4 11.8 11.8 13.2 13.2 11.6 11.6 11.2 11.2 12.7 12.7 12.4 12.4 10.1 10.1 ID 21 14.6 14.6 14.6 14.6 15.1 15.1 14.3 14.3 13.1 13.1 13.4 13.4 14.3 14.3 15.1 15.1 12.4 12.4 14.2 14.2 ID 22 14.6 14.6 14.6 14.6 15.1 15.1 14.3 14.3 13.1 13.1 13.4 13.4 14.3 14.3 15.1 15.1 12.4 12.4 14.2 14.2 ID 23 14 14 13.8 13.8 13.5 13.5 14 14 13.7 13.7 12.9 12.9 14.3 14.3 14.6 14.6 12.4 12.4 12.1 12.1 4.9 4.9 ID 24 14 14 13.8 13.8 13.5 13.5 14 14 13.7 13.7 12.9 12.9 14.3 14.3 14.6 14.6 12.4 12.4 12.1 12.1 4.9 4.9 ID 25 17.3 17.3 17.1 17.1 17 17 16.4 16.4 16.2 16.2 15.1 15.1 16.4 16.4 16.7 16.7 15.3 15.3 15.4 15.4 14.5 14.5 13.7 13.7 ID 26 17.3 17.3 17.1 17.1 17 17 16.4 16.4 16.2 16.2 15.1 15.1 16.4 16.4 16.7 16.7 15.3 15.3 15.4 15.4 14.5 14.5 13.7 13.7 ID Chú thích: – Barbonymus gonionotus, – Barbonymus gonionotus GB, – Barbonymus schwanenfeldii, – Barbonymus schwanenfeldii GB, – Poropuntius normani, – Poropuntius normani GB, – Cyprinus carpio, – Cyprinus carpio, – Carassius auratus, 10 – Carassius auratus GB, 11 – Garra cyrano, 12 – Garra cyrano GB, 13 – Osteochilus lini, 14 – Osteochilus lini GB, 15 – Osteochilus hasselti, 16 – Osteochilus hasselti GB, 17 – Puntius semifasciolatus, 18 – Puntius semifasciolatus GB, 19 – Puntius brevis, 20 – Puntius brevis GB, 21 – Toxabramis houdemeri, 22 – Toxabramis houdemeri GB, 23 – Hemiculter leucisculus, 24 – Hemiculter leucisculus GB, 25 – Opsarius pulchellus, 26 – Opsarius pulchellus GB (GB: kí hiệu trình tự từ Genbank) Phụ lục 4: Bảng sai khác di truyền loài cá thuộc họ Cobitidae Balitoridae Ambastaia nigrolineata (1) Ambastaia nigrolineata GB (2) Paramisgurnus dabryanus (3) Paramisgurnus dabryanus GB (4) Annamia normani (5) Beaufortia szechuanensis GB (6) ID ID 11.3 11.3 ID 11.3 11.3 ID 15.7 15.7 12 12 ID 15.9 15.9 14 14 6.9 ID (GB: Kí hiệu trình tự từ Genbank) Phụ lục 5: Bảng sai khác di truyền loài cá thuộc Siluriformes Mytus nigriceps (1) Mystus nigriceps GB (2) Pseudomystus siamensis (3) Leiocassis poecilopterus GB (4) Netuma thalassina (5) Netuma thalassina GB (6) ID 0,2 ID 14.6 14.6 ID 12.7 12.7 7.3 ID 18.1 18.1 16.4 16 ID 18.1 18.1 16.4 16 ID (GB: Kí hiệu trình tự từ Genbank) Phụ lục 6: Bảng sai khác di truyền loài cá thuộc Perciformes Glossogobius sp (1) Awaous grammepomus (2) Awaous grammepomus GB (3) Boleophthamus boddarti (4) Boleophthamus boddartiGB(5) Oxyeleotris marmorata (6) Oxyeleotris marmorata GB(7) Oreochromis niloticus (8) Oreochrmis niloticus GB (9) Channa striata (10) Channa striata GB (11) ID 11.6 ID 11.6 0,3 ID 15.7 14.6 14.6 ID 15.6 14.8 14.8 0.2 ID 17.6 16.5 16.5 18.4 18.2 ID 17.6 16.5 16.5 18.4 18.2 ID 17.9 15.6 15.6 17.3 17.1 15.6 15.6 ID 18.2 15.4 15.4 17.3 17.4 15.7 15.7 0.4 ID 10 19.3 17.9 17.9 17.1 17.3 16.8 16.8 12.6 12.3 ID 11 19.3 17.9 17.9 17.1 17.3 16.8 16.8 12.6 12.3 ID (GB: Kí hiệu trình tự từ Genbank)