Nghiên cứu tạo chủng vắc xin salmonella choleraesuis nhược độc làm chủng vi khuẩn biến nạ

LÂM THỊ HUẾ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI -*** - LÂM THỊ HUẾ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VẮCXIN Salmonella choleraesuis NHƯỢC ĐỘC LÀM CHỦNG VI KHUẨN BIẾN NẠP LUẬN VĂN THẠC SĨ KĨ THUẬT CHUYÊN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA: 2010B Hà Nội – 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI -*** - LÂM THỊ HUẾ NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VẮCXIN Salmonella choleraesuis NHƯỢC ĐỘC LÀM CHỦNG VI KHUẨN BIẾN NẠP LUẬN VĂN THẠC SĨ KĨ THUẬT CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS VŨ KHẮC HÙNG PGS TS NGUYỄN THỊ XUÂN SÂM Hà Nội – 2012 LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình làm luận án, ngồi cố gắng nỗ lực thân, nhận giúp đỡ tận tình Ban lãnh đạo Viện đào tạo sau đại học, Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm – Đại học Bách Khoa Hà Nội, Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung, thầy cô giáo Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm trường, cán - Bộ môn công nghệ sinh học tập thể cán công nhân viên Phân viện Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện đào tạo sau đại học, Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm – Đại học Bách Khoa Hà Nội Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung Tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Khắc Hùng, người trực tiếp hướng dẫn thực hồn thành luận văn Bộ mơn cơng nghệ sinh học – Phân viện Thú y miền Trung Đồng thời gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể cô chú, anh chị môn cơng nghệ sinh học tận tình giúp đỡ, bảo thời gian thực luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, người hướng dẫn thầy cô giáo Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến người thân gia đình động viên, tạo điều kiện cho tơi suốt trình học tập làm luận án Hà Nội, ngày 20 tháng 03 năm 2012 Tác giả luận văn MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ii DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 BỆNH PHÓ THƯƠNG HÀN VÀ PHÙ ĐẦU LỢN 1.1.1 Bệnh phó thương hàn 1.1.1.1 Nguyên nhân gây bệnh 1.1.1.2 Triệu chứng – Bệnh tích 1.1.1.3 Chẩn đoán 1.1.1.4 Phòng trị bệnh 1.1.2 Bệnh phù đầu (Edema Disease) 1.1.2.1 Nguyên nhân gây bệnh 1.1.2.2 Triệu chứng – Bệnh tích 1.1.2.3 Chẩn đoán 1.1.2.4 Phòng trị bệnh 1.2 VẮCXIN THÚ Y VÀ MỘT SỐ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮCXIN TỪ VI KHUẨN Salmonella NHƯỢC ĐỘC 1.2.1 Vắcxin thú y 1.2.2 Một số nghiên cứu sản xuất vắcxin từ vi khuẩn Salmonella nhược độc 11 1.2.3 Vắcxin phòng bệnh phó thương hàn phù đầu lợn 13 1.3 VI KHUẨN Salmonella choleraesuis (S choleraesuis) 14 1.3.1 Đặc điểm hình thái 14 1.3.2 Đặc tính ni cấy 15 1.3.3 Đặc tính sinh hóa 15 1.3.4 Sức đề kháng 15 1.3.5 Cấu trúc kháng nguyên 16 1.3.6 Tính gây bệnh 16 1.4 GEN CRP (cAMP RECEPTOR) VÀ ASD (β-ASPARTIC SEMIALDEHYDE DEHYDROGENASE) 17 1.4.1 Gen crp (cAMP receptor) 17 1.4.2 Gen asd (β-aspartic semialdehyde dehydrogenase) 19 1.5 PLASMID SỬ DỤNG TRONG KỸ THUẬT TẠO DÒNG 19 1.5.1 Plasmid pBluescript II SK+ (pBSIIK+) 20 1.5.2 Plasmis pRE112 21 1.6 TẾ BÀO CHỦ ĐỂ KHUẾCH ĐẠI GEN 21 Chương ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 23 2.2 VẬT LIỆU DÙNG CHO NGHIÊN CỨU 23 2.2.1 Chủng vi sinh vật 23 2.2.2 Hóa chất môi trường 23 2.2.3 Dụng cụ, thiết bị 25 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.3.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 25 2.3.2 Phương pháp tách chiết ADN plasmid 26 2.3.3 Phương pháp tinh sản phẩm PCR sau điện di 27 2.3.4 Phương pháp PCR 27 2.3.5 Phản ứng phân cắt sản phẩm PCR, plasmid lai Vu-Khac H Kurt Miller 30 2.3.6 Phương pháp biến nạp Kang cs 31 2.3.7 Phương pháp tạo tế bào E coli khả biến 32 2.3.8 Phương pháp tiếp hợp Kang cộng 33 2.3.9 Phương pháp lên men loại đường 33 2.3.10 Phương pháp ngưng kết kháng huyết O H 33 2.3.11 Kiểm tra tính ổn định gen đột biến 33 2.3.12 Phương pháp xử lý số liệu 33 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 TẠO DÒNG PLASMID TÁI TỔ HỢP pRE112/∆crp 34 3.1.1 Khuếch đại đoạn gen Pr12, Pr34 với enzyme Pwo - polymerase 34 3.1.2 Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/Pr12 35 3.1.3 Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/∆crp 36 3.1.3 Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pRE112/∆crp 36 3.2 TẠO CHỦNG S choleraesuis Smith MANG GEN CRP ĐỘT BIẾN 38 3.3 KIỂM TRA ĐẶC TÍNH CỦA S choleraesuis 539 40 3.3.1 Đặc điểm hình thái 40 3.3.2 Tốc độ sinh trưởng 40 3.3.3 Khả lên men đường 41 3.3.4 Giám định kháng nguyên H, O 42 3.3.5 Kết giải trình tự 42 3.3.6 Kiểm tra tính ổn định gen ∆crp chủng S choleraesuis 539 43 3.4 TẠO DÒNG PLASMID TÁI TỔ HỢP pRE112/∆asd 45 3.4.1 Khuếch đại đoạn gen Pa12, Pa34 với enzyme Pwo - polymerase 45 3.4.2 Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/∆asd 46 3.4.3 Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pRE112/∆asd 47 3.5 TẠO CHỦNG S choleraesuis 539 MANG GEN ASD ĐỘT BIẾN 48 3.6 KIỂM TRA CÁC ĐẶC TÍNH CỦA CHỦNG S choleraesuis 179 50 3.6.1 Tốc độ sinh trưởng S choleraesuis 179 50 3.6.2 Khả lên men đường S choleraesuis 179 50 3.6.3 Xác định dạng kháng nguyên O H 51 3.6.4 Tính ổn định gen ∆asd hệ gen S choleraesuis 179 51 3.6.5 Kết giải trình tự gen asd S choleraesuis 179 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 KẾT LUẬN 55 KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 LỜI CAM ĐOAN Tôi người trực tiếp tham gia thực nội dung đề tài Các kết quả, số liệu, hình ảnh trình bày luận văn hồn tồn trung thực, khách quan Tôi chịu trách nhiệm lời cam đoan Tác giả luận văn Lâm Thị Huế i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu ADN asd Tên đầy đủ Desoxyribonucleic acid bp Aspartic semialdehyde dehydrogenase Base pair CIP Alkaline phosphate CIRAD Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement (French Agricultural Research Centre for International Development) Cm Chloramphenicol crp cAMP receptor protein DAP E coli Diaminopimelic acid Escherichia coli F Forward Kb Kilobase Km Kanamycin LB MR Luria Bertani Methyl rouge NA Nutrient agar NB Nutrient broth PBS Phosphate buffer saline PCR Polymeration Chain Reaction R SPI-1 S choleraesuis Reverse Salmonella pathogenicity island Salmonella choleraesuis TBE Tris-Borate-EDTA T3SS Type III secretion system Voges prosskauer VP Uasd, Ucrp Đột biến gen asd, crp ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng Bảng 2.1: Các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR 24 Bảng 2.2 Thành phần cho mẫu phản ứng PCR 27 Bảng 2.3 Bảng chu trình nhiệt 28 Bảng 2.4 Thành phần cho mẫu phản ứng PCR 28 Bảng 2.5 Bảng chu trình nhiệt 28 Bảng 2.6 Thành phần cho mẫu phản ứng PCR 29 Bảng 2.7 Bảng chu trình nhiệt 29 Bảng 2.8 Thành phần cho mẫu phản ứng colony PCR 30 Bảng 2.9 Bảng chu trình nhiệt 30 Bảng 3.1 So sánh khả lên men đường S choleraesuis 539 S choleraesuis Smith 42 Bảng 3.2 So sánh khả lên men đường S choleraesuis 179 S choleraesuis Smith 51 iii với chủng E coli χ7213/pRE112/∆asd-1 môi trường chọn lọc Chọn lọc ngẫu nhiên 20 khuẩn lạc mọc mơi trường LB có chứa Cm, cấy tinh môi trường LB chứa Cm Chọn khuẩn lạc riêng rẽ từ đĩa cấy tinh sạch, cấy vào mơi trường lỏng NB khơng kháng sinh có bổ sung DAP để diễn trình trao đổi chéo gen asd đột biến gen asd gốc, nuôi giờ, pha loãng đến 10-5 cấy trải lên mơi trường NA chứa DAP, khơng kháng sinh có chứa không chứa sucrose 5% để chọn lọc khuẩn lạc có khả sinh trưởng mơi trường có chứa sucrose Sàng lọc dịng kháng sucrose môi trường LB chứa DAP chứa không chứa Cm, sau sàng lọc mơi trường LB có chứa khơng chứa DAP để loại bỏ dịng kháng Sucrose gen sacB1 bị đột biến Do đột biến gen asd nên môi trường nuôi cấy bắt buộc phải bổ sung DAP [28] Cuối chủng chọn lọc kiểm tra phản ứng PCR với cặp mồi Pa5F-Pa6R Pa6R-Pa7F M Uasd 539 M 10 539 Uasd 1500bp 1500bp 500bp 500bp B A Ghi chú: M: marker 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10: dịng chọn lọc Hình 3.16: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ genome chủng S choleraesuis với cặp mồi Pa5F-Pa6R (A) Pa6R-Pa7F (B) Kết kiểm tra sản phẩm PCR cho thấy gen asd chủng S choleraesuis chọn lọc bị đoạn gen khoảng 1500 bp so với chủng S choleraesuis Smith, phù hợp với nghiên cứu trước [28, 66] Điều chứng 49 tỏ, gây đột biến thành công gen asd chủng S choleraesuis 539 Chúng chọn lựa chủng số chủng gây đột biến thành cơng kí hiệu S choleraesuis 179 để kiểm tra đặc tính sinh vật hóa học giải trình tự gen 3.6 KIỂM TRA CÁC ĐẶC TÍNH CỦA CHỦNG S choleraesuis 179 3.6.1 Tốc độ sinh trưởng S choleraesuis 179 Tốc độ sinh trưởng S choleraesuis 179 xác định môi trường LB agar, LB dịch, tiến hành so sánh với S choleraesuis Smith Kết thu cho thấy, tương tự S choleraesuis 539, S choleraesuis 179 có kích thước khuẩn lạc nhỏ sinh trưởng chậm nhiều so với chủng Smith Đường cong sinh trưởng S choleraesuis S choleraesuis đột biến gen asd crp OD (600nm ) 2.5 S cholerasuis nhựơc độc 1.5 S cholerasuis (∆asd, ∆crp) 0.5 0h 2h 4h 6h 8h 10h thời gian Hình 3.17: Đường cong sinh trưởng S choleraesuis 179 S choleraesuis Smith 3.6.2 Khả lên men đường S choleraesuis 179 Chúng tiến hành lên men S choleraesuis 179 môi trường dinh dưỡng lỏng có bổ sung 10% đường, chất thị pH phenol red cho phép phát lên men đường diễn làm giảm pH môi trường Chủng S choleraesuis Smith tiến hành lên men đồng thời để so sánh 50 Bảng 3.2 So sánh khả lên men đường S choleraesuis 179 S choleraesuis Smith Đường lên men Chủng Glucose Maltose S choleraesuis Smith + + S choleraesuis 179 + - Sucrose Lactose Xylose - Manitol Rhamnose - + + + - - - - Sau 24h nuôi cấy lắc 370C, nhận thấy giống S choleraesuis 539, S choleraesuis 179 khả lên men hầu hết đường, trừ glucose 3.6.3 Xác định dạng kháng nguyên O H Tương tự S choleraesuis 539, S choleraesuis Smith kháng nguyên bề mặt tế bào S choleraesuis 179 xác định O6,7 H1,5 3.6.4 Tính ổn định gen ∆asd hệ gen S choleraesuis 179 Chủng S choleraesuis 179 cấy chuyển liên tiếp môi trường LB dịch qua 20 đời Genome chủng S choleraesuis 179 đời 1, 5, 10, 15, 20 tiến hành tách chiết, PCR với cặp mồi Pa5F-Pa6R để kiểm tra tính ổn định gen asd đột biến cài vào trước M 10 15 20 1500bp 500bp 10 15 20 Hình 3.18: Sản phẩm PCR từ genome S choleraesuis 179 đời 1, 5, 10, 15, 20 với cặp mồi Pa5F-Pa6R (trắng) Pa7F-Pa6R (trắng) 51 Kết cho thấy sản phẩm PCR thu từ genome chủng S choleraesuis 179 tất đời với cặp mồi Pa5F-Pa6R có kích thước khoảng 315 bp, với cặp mồi Pa6R-Pa7F có kích thước khoảng 2200bp Điều chứng tỏ gen ∆asd ổn định genome chủng S choleraesuis 179 chọn lọc 3.6.5 Kết giải trình tự gen asd S choleraesuis 179 Chúng tiến hành khuếch đại đoạn gen asd chủng S choleraesuis 179 cặp mồi Pa5F-Pa6R, Pa6R-Pa7F, tinh sản phẩm thu được, gửi giải trình tự cơng ty Macrogen, Hàn Quốc Trình tự thu được tiến hành xử lý, so sánh với trình tự gen asd S choleraesuis ngân hàng Genbank, từ xác định gen asd S choleraesuis 179 bị đoạn khoảng 1485 bp, từ nucleotide 424 đến nucleotide 1909, so với gen asd chủng S choleraesuis S choleraesuis ∆crp/∆asd 3663650 GCGCTCTCTATCTGTATCGCCGGCGGTTCAATTGTGGTTTCTCATGTTAACGACGCTGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGCTCTCTATCTGTATCGCCGGCGGTTCAATTGTGGTTTCTCATGTTAACGACGCTGGC 61 TTCTGGCTGTTCGGTAAATTTACCGGCGCGACCGAAGCGCAGACGCTGAAGACCTGGACG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 3663590 TTCTGGCTGTTCGGTAAATTTACCGGCGCGACCGAAGCGCAGACGCTGAAGACCTGGACG 60 3663591 S choleraesuis 120 ∆crp/∆asd 3663531 S choleraesuis 121 ATGATGGAAACTATCCTCGGCACGGTCGGCGCGATTGTTGGGATGATTGCTTTCCAACTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3663530 ATGATGGAAACTATCCTCGGCACGGTCGGCGCGATTGTTGGGATGATTGCTTTCCAACTG S choleraesuis 181 CTGAGCTGAGTCTTGTTGCCCGGTGGCGCTGTGCTTACCGGGCCTGGAAACGGGCACATA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3663470 CTGAGCTGAGTCTTGTTGCCCGGTGGCGCTGTGCTTACCGGGCCTGGAAACGGGCACATA S choleraesuis 241 TCGACACCGTAAGCCGGGTAAGGCGTAATCGCTACCCGGtttttttATTGAGGTGTGCAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3663410 TCGACACCGTAAGCCGGGTAAGGCGTAATCGCTACCCGGTTTTTTTATTGAGGTGTGCAT S choleraesuis 301 GGCAATCGCCCAACGACGTTTTGCCTCGCCATGTTTCAGTACGCGCATAAAAACAGGCAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3663350 GGCAATCGCCCAACGACGTTTTGCCTCGCCATGTTTCAGTACGCGCATAAAAACAGGCAA S choleraesuis 361 ATTTCTACGCTGATCCATAATTAGGATCAATAAAACAGCGACGGAAATGATTCCCTTCCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3663290 ATTTCTACGCTGATCCATAATTAGGATCAATAAAACAGCGACGGAAATGATTCCCTTCCT 180 3663471 240 3663411 300 3663351 360 3663291 420 3663231 S choleraesuis 421 AACGCAAATTCCCTGATAATCGCCACTGGACTTTCTGCTTGCGCGGTAAGGCAGGATAAG 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3663230 AAC - 3663171 S choleraesuis 481 TCGCATTACTGATGGCTTCGCTATCATTGATTAATTTCACTTGCGACTTTGGCTGCTTTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3663170 -S choleraesuis 541 TGTATGGTGAAGGATGCGCCACAGGATACTGGCGCGCATACACAGCACATCTCTTTGCAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3663110 52 540 3663111 600 3663051 S choleraesuis 601 GAAAAAAACGCTATGAAAAATGTTGGTTTTATCGGCTGGCGCGGAATGGTCGGCTCTGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3663050 -S choleraesuis 661 CTCATGCAACGCATGGTAGAGGAGCGCGATTTCGACGCTATTCGCCCTGTTTTCTTTTCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3662990 -S choleraesuis 721 ACCTCCCAGTTTGGACAGGCGGCGCCCACCTTCGGCGACACCTCCACCGGCACGCTACAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3662930 -S choleraesuis 781 GACGCTTTTGATCTGGATGCGCTAAAAGCGCTCGATATCATCGTGACCTGCCAGGGCGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3662870 -S choleraesuis 841 GATTATACCAACGAAATTTATCCAAAGCTGCGCGAAAGCGGATGGCAGGGTTACTGGATT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3662810 -S choleraesuis 901 GACGCGGCTTCTACGCTGCGCATGAAAGATGATGCCATTATTATTCTCGACCCGGTTAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3662750 -S choleraesuis 961 CAGGACGTGATTACCGACGGCCTGAACAATGGCGTGAAGACCTTTGTGGGCGGTAACTGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3662690 -S choleraesuis 1021 ACCGTTAGCCTGATGTTGATGTCGCTGGGCGGTCTCTTTGCCCATAATCTCGTTGACTGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3662630 -S choleraesuis 1081 GTATCCGTCGCGACCTATCAGGCCGCCTCCGGCGGCGGCGCGCGCCATATGCGCGAGCTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3662570 -S choleraesuis 1141 TTAACCCAAATGGGGCAGTTGTATGGCCATGTCGCCGATGAACTGGCGACGCCGTCTTCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3662510 -S choleraesuis 1201 GCAATTCTTGATATTGAACGCAAAGTTACGGCATTGACCCGCAGCGGAGAGCTGCCGGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3662450 -S choleraesuis 1261 GATAACTTTGGCGTACCGCTGGCGGGAAGCCTGATCCCCTGGATCGACAAACAGCTTGAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3662390 -S choleraesuis 1321 AACGGCCAAAGCCGCGAAGAGTGGAAAGGCCAGGCGGAAACCAACAAGATCCTCAATACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 366233 -S choleraesuis 1381 GCCTCTGTGATCCCGGTTGATGGTTTGTGCGTGCGCGTCGGCGCGCTGCGCTGTCACAGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3662270 -S choleraesuis 1441 CAGGCGTTCACCATCAAGCTGAAAAAAGAGGTATCCATTCCGACGGTGGAAGAACTGCTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3662210 -S choleraesuis 1501 GCGGCACATAATCCGTGGGCGAAAGTGGTGCCGAACGATCGTGATATCACTATGCGCGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3662150 -S choleraesuis 1561 TTAACCCCGGCGGCGGTGACCGGCACGTTGACTACGCCGGTTGGTCGTCTGCGTAAGCTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3662090 -S choleraesuis 1621 AACATGGGGCCAGAGTTCTTATCGGCGTTTACCGTAGGCGACCAGTTGTTATGGGGCGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3662030 53 660 3662991 720 3662931 780 3662871 840 3662811 900 3662751 960 3662691 1020 3662631 1080 3662571 1140 3662511 1200 3662451 1260 3662391 1320 3662331 1380 3662271 1440 3662211 1500 3662151 1560 3662091 1620 3662031 1680 3661971 S choleraesuis 1681 GCCGAGCCGCTGCGTCGAATGCTGCGCCAGTTGGCGTAGTGGCTATTGCAGCGCTTATCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3661970 -S choleraesuis 1741 GGCCTGCGTGTGGTTCTGTAGGCCGGATAAGGCGCGTCAGCGCCGCCATCCGGCGGGGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3661910 -S choleraesuis 1801 ATTTGTGTTAAACCAGGGGTGCATCGTCACCCtttttttGCGTAATACAGGAGTAAACGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3661850 -S choleraesuis 1861 AGATGTTTCATTTTTATCAGGAGTTAAGCAGAGCATTGGCTATTCTTTAAGGGTAGCTTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3661790 -AGGGTAGCTTA 1740 3661911 1800 3661851 1860 3661791 1920 3661731 S choleraesuis 1921 ATCCCGCGGGTATTAAGCCTAACCTGAAGGTAGGACGACGCAGATAGGATGCACAGTGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3661730 ATCCCGCGGGTATTAAGCCTAACCTGAAGGTAGGACGACGCAGATAGGATGCACAGTGTG 1980 S choleraesuis 1981 CTGCGCCGTTCAGGTCAAAGAAGTGTCACTACCTGATGTTGAATTCAGTGAGATGGAGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3661670 CTGCGCCGTTCAGGTCAAAGAAGTGTCACTACCTGATGTTGAATTCAGTGAGATGGAGTG 2040 S choleraesuis 2041 ACGCCACAAAACAGGATGACAAACCATGTCCAGTCGTATCGATAGAGACGTGATTAATGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3661610 ACGCCACAAAACAGGATGACAAACCATGTCCAGTCGTATCGATAGAGACGTGATTAATGC S choleraesuis 2101 GCTAATTGCAGGACATTTTGCGGACCCTTTTTCCGTACTCGGAATGCACCAGACCCAAGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3661550 GCTAATTGCAGGACATTTTGCGGACCCTTTTTCCGTACTCGGAATGCACCAGACCCAAGC S choleraesuis 2161 CGGACTAGAAGTCCGCGCCCTATTACCTGACGCCACCGACGTATGGGTGATTGAACCCAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3661490 CGGACTAGAAGTCCGCGCCCTATTACCTGACGCCACCGACGTATGGGTGATTGAACCCAA S choleraesuis 2221 GACCGGACGTAAAGTCGGCAAACTGGAATGTCTCGACGCTCGCGGTTTTTTCTGCGGCGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3661430 GACCGGACGTAAAGTCGGCAAACTGGAATGTCTCGACGCTCGCGGTTTTTTCTGCGGCGT S choleraesuis 2281 TTTACCCCGACGTAAAAATTTCTTTCGCTATCAGCTCGCCGTGACCTGGCACGGACAGCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ∆crp/∆asd 3661370 TTTACCCCGACGTAAAAATTTCTTTCGCTATCAGCTCGCCGTGACCTGGCACGGACAGCA 3661671 3661611 2100 3661551 2160 3661491 2220 3661431 2280 3661371 2340 3661311 Hình 3.19: Trình tự đoạn gen khuếch đại gen asd S choleraesuis 179 từ cặp mồi Pa5F- Pa6R đoạn gen 1485 bp (434-1902) so với gen asd chủng S choleraesuis Từ kết thu được, tin tưởng gen asd gây đột biến thành công S choleraesuis 179 Như vậy, tạo thành công chủng vắcxin S choleraesuis Smith mang gen crp asd đột biến an toàn Từ đây, chủng S choleraesuis 179 tiếp tục làm nghiên cứu làm tế bào chủ mang plasmid ngoại lai vi khuẩn E coli để phòng hai bệnh phù đầu phó thương hàn lợn 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Trong nghiên cứu trên, đạt kết sau: ™ Tạo chủng E coli χ7213 mang plasmid tái tổ hợp pRE112/∆crp ™ Tạo thành công chủng S choleraesuis 539 mang gen crp đột biến ™ Tạo chủng E coli χ7213 mang plasmid tái tổ hợp pRE112/∆asd ™ Tạo thành công chủng S choleraesuis 179 mang đồng thời gen crp, asd đột biến Chủng S choleraesuis 179 giữ nguyên hình thái khuẩn lạc kiểu kháng nguyên O, H ổn định di truyền KIẾN NGHỊ Từ kết trên, chủng S choleraesuis 539 S choleraesuis 179 thử độc lực chuột lợn để khẳng định chắn độ an toàn chủng Chủng S choleraesuis 179 sau sử dụng làm tế bào chủ mang plasmid tái tổ hợp dịng hóa hai kháng ngun vi khuẩn E coli để tạo chủng vắcxin Salmonella choleraesuis tái tổ hợp phịng hai bệnh phù đầu phó thương hàn lợn Nghiên cứu quy trình sản xuất vắcxin tái tổ hợp phịng hai bệnh phù đầu phó thương hàn lợn, hiệu giá cao, an toàn, giá thành rẻ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bùi Xuân Đồng, (2001), “Bệnh phù đầu Escherichia coli gây lợn Hải Phòng biện pháp phịng trị”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, IX (3), 98-99 Nguyễn Viết Không, Nguyễn Đình Đảng, Nguyễn Ngọc Kiên, Trần Phương Thảo, Nguyễn Thị Hồng Thắm, Trương Văn Dung, (2008), “ Biến động kháng thể E coli phù đầu lợn chăn nuôi công nghiệp”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, XV (3), 21-25 Nguyễn Kim Lan, (2005), “Một số đặc điểm vi khuẩn E coli gây bệnh phù đầu lợn Thái Nguyên Bắc Giang”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, XV (3), 21-25 Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Thị Sở, Cù Hữu Phú, Trương Văn Dung, (1979), “Vắcxin E coli phòng bệnh cho lợn con”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 98-103 Nguyễn Khả Ngự, Lê Văn Tạo, (1996), “Tình hình bệnh trực khuẩn E coli lợn trước sau cai sữa số tỉnh đồng sông Cửu Long”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, VII (4), 50-55 Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Đỗ Ngọc Thúy, Âu Xuân Tuấn, Văn Thị Hường, Nguyễn Xuân Huyên, Nguyễn Bích Thủy, Đào Thị Hảo, Phạm Bảo Ngọc, Vũ Ngọc Quý, Nguyễn Thị Vui, (2004), “Bệnh phù đầu E coli dung huyết gây Bình Định Hà Tây, sử dụng autovaccine phòng bệnh”, Báo cáo khoa học chăn nuôi thú y, 123-137 Quyết định Thủ tướng phủ số 10/2008/QĐ-TTg, (2008), Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 Nguyễn Như Thanh, (2001), Vi sinh vật thú y, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Võ Thành Thìn, Lê Lập, Đặng Thanh Hiền, Đặng Văn Tuấn, Nguyễn Đức Tân, Heri De Greve, Bruno Goddeeris, Nguyễn Viết Không, (2008), “ Khảo sát kháng thể kháng nguyên bám dính F4 F18 huyết lợn Nam Trung Tây Nguyên”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát Triển Nơng Thơn, (8), 44-47 56 Tài liệu tiếng Anh 10 Andre, FE, (2003), Vaccinology: past achievements, present roadblocks and future promises, Vaccine, (21), 593-595 11 Benitez AJ, McNair N, Mead JR, (2009), Oral immunization with attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium encoding Cryptosporidium parvum Cp23 and Cp40 antigen induces a specific immune response in mice, Clinical and vaccine immunology, (27), 53635370 12 Botsford JL, Harman JG, (1992), Cyclic AMP in prokaryotes, Microbiol Rev, (56), 100–122 13 Buckley AM, Wang J, Hudson DL, Grant AJ, Jones MA, Maskell DJ, Stevens MP, (2009), Evaluation of live attenuated Salmonella vaccines expressing Campylobacter antigens for control of C.jejuni in poultry, Vaccine Oct 22 14 Burns-Keliher LL, Portteus A, Curtiss R, (1997), Specific detection of Salmonella typhimurium proteins synthesized intracellularly, J Bacteriol, (179), 3604–3612 15 Busby S, Ebright RH, (1999), Transcription activation by catabolite activator protein (CAP), J Mol Biol, (293), 199–213 16 Branger CG, Torres-Escobar A, Sun W, Perry R, Fetherston J, Roland KL, Curtiss, (2009), Oral vaccination with LcrV from Yersinia pestis KIM delivered by live attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium elicits a protective immune response against challenge with Yersinia psuedotuberculosis and Yersinia enterocolitica, Vaccine, (27), 5363-5370 17 Cersini A, Salvia AM, Bernardini ML, (1998), Intracellular multiplication and virulence of Shigella flexneri auxotrophic mutants, Infect Immun, (66), 549–557 18 Chang CC, Lin YH, Chang CF, Yeh KS, Chiu CH, Chu C, et al, (2005), 57 Epidemiologic relationship between fluoroquinolone-resistant Salmonella enterica serovar Choleraesuis strains isolated from humans and pigs in Taiwan (1997 to 2002), J Clin Microbiol, (43), 2798–2804 19 Chappuis, G., (1998), Neonatal immunity and immmunisation in early age: lessons from veterinary medicine, Vaccine, (16), 1468-1472 20 Chen ZW, Hsuan SL, Liao JW, Chen TH, Wu CM, Lee WC, Lin CC, Liao CM, Yeh KS, Winton JR, Huang C, Chien MS, (2010), Mutations in the Salmonella enterica serovar Choleraesuis cAMP-receptor protein gene lead to functional defects in the SPI-1 Type III secretion system, Vet Res, (41), 1-5 21 Chiu CH, Wu TL, Su LH, Chu C, Chia JH, Kuo AJ, et al, (2002), The emergence in Taiwan of fluoroquinolone resistance in Salmonella enterica serotype Choleraesuis, N Engl J Med, (346), 413–419 22 Chiu CH, Chuang CH, Chiu S, Su LH, Lin TY, (2006), Salmonella enterica serotype Choleraesuis infections in pediatric patients, Pediatrics (117), 1193–1196 23 Chu CY, Wang SY, Chen ZW, Chien MS, Huang JP, Chen JJ, et al, (2007), Heterologous protection in pigs induced by a plasmid-cured and crp gene-deleted S choleraesuis live vaccine, Vaccine, (25), 7031–7040 24 Chuan YU et al, (2010), Construction and Characterization of a S choleraesuis C78-1 Ucrp Deletion Mutant, Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 41 (5), 587-593 25 CIRAD, (2006), “Training Course Salmonella”, 23 – 37 26 Curtiss RI, Zhang X, Wanda SY, Kang HY, Konjufca V, et al, (2007), Induction of host immune responses using Salmonella-plasmided vaccines, In: Brogden KA, Cornick N, Stanton TB, Zhang Q, Nolan LK, Wannemuehler MJ, editors, Washington, D.C: ASM Press 27 Edwards RA et al, (1998) Improved allelic exchange plasmids and their 58 use to analyze 987P fimbria gene expression Gene, 207, 149-157 28 Galan JE, Nakayama K, Curtiss R, (1990), Cloning and characterization of the asd gene of Salmonella typhimurium: use in stable matainance of recombinant plasmid in Salmonella vaccine strain, Gene, (94), 29-35 29 Garmory HS, Leckenby MW, Griffin KF, Elvin SJ, Taylor RR, Hartley MG, Hanak JAJ, Wiliamson ED, Cranenburgh RM, (2005), Antibioticfree plasmid stabilization by operator-Repressor titration for vaccine delivery by using live Salmonella enterica serovar Typhimurium, Infection and Immunity, (73), 2005-2011 30 Hackett J., (1990), Salmonella-based vaccines, Vaccine (8), 5–11 31 Harb OS, Abu Kwaik Y, (1998), Identification of the aspartate-betasemialdehyde dehydrogenase gene of Legionella pneumophila and characterization of a null mutant, Infect Immun, (66), 1898–1903 32 Hersh D, Monack DM, Smith MR, Ghori N, Falkow S, Zychlinsky A, (1999), The Salmonella invasin SipB induces macrophage apoptosis by binding to caspase-1, Proc Natl Acad Sci USA, (96), 2396–2401 33 Hudson AO, Bless C, Macedo P, Chatterjee SP, Singh BK, et al, (2005), Biosynthesis of lysine in plants: evidence for a variant of the known bacterial pathways, Biochim Biophys Acta, (1721), 27–36 34 Kang HY, Dozois CM, Tinge SA, Lee TH, Curtiss R, (2002), Trasduction-mediated transfer of unmarked delection and point mutations through use of counterselectable suicide plasmid, Journal of Bacterioly, (184), 307–312 35 Kelly SM, Bosecker BA, Curtiss R III, (1992), Characterization and protective properties of attenuated mutants of S choleraesuis, Infect Immun, (60), 4881–4890 36 Kennedy MJ, Yancey RJ Jr, Sanchez MS, Rzepkowski RA, Kelly SM, Curtiss R III, (1999), Attenuation and immunogenicity of cya derivatives of S choleraesuis in pigs, Infect Immun, (67), 4628-4636 59 crp 37 Ku YW, McDonough SP, Palaniappan RU, Chang CF, Chang YF, (2005), Novel attenuated Salmonella enterica serovar Choleraesuis strains as live vaccine candidates generated by signature-tagged mutagenesis, Infect Immun, (73), 8194–8203 38 Lawson CL, Swigon D, Murakami KS, Darst SA, Berman HM, Ebright RH, (2004), Catabolite activator protein: ADN binding and transcription activation, Curr Opin Struct Biol, (14), 10–20 39 Li MH, Robinson EH, (1998), Effects of supplemental lysine and methionine in low protein diets on weight gain and body composition of young channel catfish Ictalurus punctatus, Aquaculture, (163), 297–307 40 Ministry of Agriculture of the People’s Republic of China, (2000), The People’s Republic of China veterinary biological product regulation, Chemical Industry Publishing Company, Beijing, China, p164 – 166 41 Monack DM, Hersh D, Ghori N, Bouley D, Zychlinsky A, Falkow S, (2000), Salmonella exploits caspase-1 to colonize Peyer’s patches in a murine typhoid model, J Exp Med, (192), 249–258 42 Monack DM, Raupach B, Hromockyj AE, Falkow S, (1996), Salmonella typhimurium invasion induces apoptosis in infected macrophages, Proc Natl Acad Sci USA, (93), 9833–9838 43 Moos M, (1995), Models of risk assessments for biologicals or related products in the European Union, Revue Scientifique et Technique, (14), 1009-1020 44 Ning JF, Zhu W, Xu JP, Zheng CY, Meng XL, (2009), Oral delivery of ADN vaccine encoding VP28 against white spot syndrome virus in crayfish by attenuated Salmonella typhimurium, Vaccine, (27), 11271135 45 Oanh TK, Nguyen VK, Do TN, Goddeeris BM, De Greve H, (2010), Escherichia coli strains causing edema disease in northern Vietnam share an identical verotoxin 2e, Trop Anim Health Prod, 42(8), 1797-804 60 46 Paidhungat M, Setlow B, Driks A, Setlow P, (2000), Characterization of spores of Bacillus subtilis which lack dipicolinic acid, J Bacteriol, (82), 5505–5512 47 Pastoret PP, (1999), Veterinary vaccinology, Comptes Rendus del Acade’mie des Sciences-Series III-Sciences de la Vie, (322), 967-972 48 Pavelka MS Jr, Jacobs WR Jr, (1996), Biosynthesis of diaminopimelate, the precursor of lysine and a component of peptidoglycan, is an essential function of Mycobacterium smegmatis, J Bacteriol, (178), 6496–6507 49 Petersen S, Young GM, (2002), Essential role for cyclic AMP and its receptor protein in Yersinia enterocolitica virulence, Infect Immun, (70), 3665–3672 50 Philippe N et al, (2004), Improvement of pCVD442, a suicide plasmid for gene allele exchange in bacteria, Plasmid, (51), 246-255 51 Roland K et al, (1998), Construction and Evaluation of a ∆cya∆crp Salmonella typhimurium strain expressing avian pathogenic Escherichia coli O78 as a vaccine to prevent airsacculitis in chickens, Avian Disease, (43), 429-441 52 Schlumberger MC, Hardt WD, (2006), Salmonella type III secretion effectors: pulling the host cell’s strings, Curr Opin Microbiol, (9), 46–54 53 Schwartz KJ, Straw BE, D’Allaire S, Mengeling W, Taylor DJ (Eds), (1999), Disease of swine, Iowa State University Press, Ames, 535–551 54 Shryock TR, (2004), The future of anti-effective products in animal health, Nature reviews Microbiology, (2), 425-430 55 Teplitski M, Goodier RI, Ahmer BM, (2006), Catabolite repression of the SirA regulatory cascade in Salmonella enterica, Int J Med Microbiol, (296), 449-466 56 Terpstra C, Kroese AH, (1996)ab, Potency control of modified live viral vaccines for veterinary use, Vaccine, (14), 13-18, 570-575 57 Xin W, Li Y, Mo H, Roland KL, Curtiss R, (2009), PspA family fusion 61 proteins delivered by attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium extend and enhance protection against Streptococus pneumoniae, Infection and Imumunity, (77), 4518-4528 58 Xu YD et al, (2006), Construction and characterization of delta crp delta asd mutant host-plasmid balanced lethal system of S choleraesuis C500 strain, Chin J Biotechnol, 22(3), 366-672 59 Viola RE, (2001), The central enzymes of the aspartate family of amino acid biosynthesis, Acc Chem Res, (34), 339–349 60 Vu KH, Miller KW, (2009), Regulation of mannose phosphotransferase system permease monocytogenes by and the virulence EII(t) gene Man expression transporter, in Listeria Applied and environmental microbiology, 75 (21), 6671-6678 61 Walker, PD, (1992), Bacterial vaccines: old and new, veterinary and medical, Vaccine, (10), 977-990 62 Wegener M, Bruckner L, Cubetaler K, (1998), The astablishment of endotoxin limits which satisfy animal welfare considerations in the testing of provine vaccine, ALTEX: Alternativen zu Tierexperimenten, (15), 65-67 63 Zekarias B, Mo H, Curtiss, (2009), Recombinant attenuated Salmonella enterica serovar typhimurium expressing the carboxy-terminal domain of alpha toxin from Clostridium perfringens induces protective responses against necrotic enteritis in checkens, Clinical and vaccine immunology, (15), 805-816 64 Zhang S, Kingsley RA, Santos RL, Andrews-Polymenis H, Raffatellu M, Figueiredo J, et al, (2003), Molecular pathogenesis of Salmonella enterica serotype Typhimurium-induced diarrhea, Infect Immun, (71), 1–12 65 Zhao Z, Li M et al, (2009), Protection of mice from Brucella infection by immunization with attenuated Salmonella enterica serovar typhimurium expressing A L7/L12 and BLS fusion antigen of Brucella, Vaccine, (27), 5214-5219 62 66 Zhao ZQ et al, (2008), Subcutaneous vaccination attenuated Salmonella enterica Serovar Choleraesuis C500 expressing recombinant filamentous hemagglutinin and pertactin antigens protects mice against fatal infections with both S.enterica serovar choleraesuis and Bordetella bronchiseptica, Infect Immun, 76 (5), 2157-2163 Trang web 67 http://agriviet.com/nd/2766-benh-pho-thuong-han-tren-heo/ 68 http://agriviet.com/nd/2830-benh-phu-o-heo-con-%28edema-disease%29/ 69 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/58063 70 http://www.spiegel.de/wissenschaft/mensch/0,1518,295445,00.html 63 ... VẮCXIN THÚ Y VÀ MỘT SỐ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮCXIN TỪ VI KHUẨN Salmonella NHƯỢC ĐỘC 1.2.1 Vắcxin thú y 1.2.2 Một số nghiên cứu sản xuất vắcxin từ vi khuẩn Salmonella nhược độc. .. Các chủng vi khuẩn Salmonella nhược độc sử dụng làm vắcxin phòng bệnh vi khuẩn Salmonella gây người động vật Hiện nay, vi? ??c sử dụng chủng Salmonella nhược độc mang số gen đột biến làm chủng vi khuẩn. .. văn thực nghiên cứu công đoạn đầu với nội dung: ? ?Nghiên cứu tạo chủng vắcxin S choleraesuis nhược độc làm chủng vi khuẩn biến nạp” Mục tiêu: + Tạo dòng plasmid pRE112 mang gen crp đột biến (pRE112/∆crp)