Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn đột biến gen germi (o methtrasferase) sinh dẫn xuất kháng sinh demethyl dihydrochalcomycin từ chủng streptomyces SP KCTC 0041BP

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ và tên tác giả luận văn : Nguyễn Thị Phương Thảo Đề tài luận văn: “Nghiên cứu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-Nguyễn Thị Phương Thảo

Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn đột biến gen gerMI (O-methyltransferase) sinh dẫn xuất kháng sinh Demethyl- dihydrochalcomycin từ chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

GS TS Hoàng Đình Hòa

TS Tạ Thị Thu Thủy

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên tác giả luận văn : Nguyễn Thị Phương Thảo

Đề tài luận văn: “Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn đột biến gen gerMI

(O-methyltransferase) sinh dẫn xuất kháng sinh Demethyl-dihydrochalcomycin từ

- Bổ sung tổng quan về gen gerMI

- Bổ sung cơ chế tiếp hợp vi khuẩn, xạ khuẩn

- Chỉnh sửa lại phần phương pháp nghiên cứu

- Bổ sung trình tự DNA các đoạn gen vào phần Phụ lục

- Chỉnh sửa các lỗi chính tả, một số thuật ngữ

Hà Nội, Ngày 30 tháng 11 năm 2017

Giáo viên hướng dẫn

GS TS Hoàng Đình Hòa TS Tạ Thị Thu Thủy

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Phương Thảo CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

PGS TS Lê Thanh Hà

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng em với sự giúp đỡ của tập thể các nhà khoa học Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực

và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Em xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2017

Tập thể giáo viên hướng dẫn Tác giả luận văn

GS.TS Hoàng Đình Hòa TS Tạ Thị Thu Thủy Nguyễn Thị Phương Thảo

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin trân trọng cảm ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo, Viện Đào tạo Sau đại học – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Khoa Công nghệ Sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện cho em hoàn thành luận văn thạc sĩ này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo GS.TS Hoàng Đình Hòa –

Bộ môn Công nghệ Sinh học – Đại học Bách Khoa Hà Nội, cô giáo TS Tạ Thị Thu Thủy – Khoa Công nghệ Sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn các anh chị kỹ thuật viên – Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam đã tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành đề tài này

Qua đây, em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân, cùng toàn thể bạn bè đã động viên, cổ vũ, khích lệ em trong thời gian thực hiện luận văn

Trong quá trình nghiên cứu đề tài, mặc dù bản thân đã có nhiều cố gắng, nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót, hạn chế nên em rất mong nhận được những góp ý của quý thầy – cô

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2017

Học viên cao học

Nguyễn Thị Phương Thảo

dNTPs Deoxyribonucleotides

IPTG Isopropyl-thio-β-galactoside

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1.Cấu trúc của DHC 7

Hình 1.2 Dự đoán con đường sinh tổng hợp gốc đường khử và bước cuối hoàn thành cấu trúc kháng sinh DHC 10

Hình 1.3 Sinh tổng hợp đường khử ở vi sinh vật 13

Hình 1.4 Dự đoán chức năng gen gerMI trong con đường sinh tổng hợp DHC 14

Hình 1.5 F plasmid 18

Hình 1.6 Quá trình tiếp hợp ở vi khuẩn 18

Hình 1.7 Cơ chế của quá trình trao đổi chéo của xạ khuẩn 20

Hình 2.1 plasmid pFDNEO-S 22

Hình 2.2 vector pGEM-T Easy 22

Hình 2.3 Vector pGEM 7+ 23

Hình 2.4 Vector pKC1139 23

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra tách DNA tổng số xạ khuẩn 41

Hình 3.2 PCR nhân đoạn UMI, DMI từ DNA tổng số xạ khuẩn 42

Hình 3.3 Biến nạp vector pGEM-T-UMI và pGEM-T-DMI vào E coli XL1 Blue 43 Hình 3.4 Cắt pGEM-T-UMI bằng EcoRI và KpnI, cắt pGEM-T-DMI bằng HindIII và KpnI 44

Hình 3.5 Quy trình tạo vector tái tổ hợp pGEM 7+-UMI 45

Hình 3.6 Tinh sạch đoạn UMI và pGEM 7+ sau khi cắt bằng EcoRI và KpnI 45

Hình 3.7 PCR kiểm tra biến nạp vector pGEM 7+-UMI vào E coli XL1 Blue bằng cặp mồi UMI-F và UMI-R 46

Hình 3.8 Quy trình tạo vector tái tổ hợp pGEM 7+-UMI-DMI 47

Hình 3.9 PCR kiểm tra biến nạp vector pGEM 7+-UMI-DMI vào E coli XL1 Blue bằng cặp mồi DMI-F và DMI-R 48

Hình 3.10 Quy trình tạo vector tái tổ hợp pGEM 7+-UMI-Neor-DMI 49

Hình 3.11 Tinh sạch đoạn gen Neor 49 Hình 3.12 Cắt kiểm tra pGEM 7+-UMI-Neor-DMI bằng KpnI 50 Hình 3.13 Quy trình tạo vector đột biến gen gerMI 51

Hình 3.14 Kiểm tra biến nạp vector pKC-UMI-Neor-DMI vào tế bào E coli XL1

Blue 52 Hình 3.15 Cắt kiểm tra pKC-UMI-Neor-DMI biến nạp trong E coli XL1 Blue bằng

BamHI 52

Hình 3.16 Kiểm tra biến nạp vector pKC-UMI-Neor-DMI vào E coli

ET12567/pUZ8002 53 Hình 3.17 PCR kiểm tra biến nạp vector pKC-UMI-Neor-DMI vào E coli

ET12567/pUZ8002 54 Hình 3.18 Khuẩn lạc riêng rẽ phát sinh từ chủng M1-5 sau tiếp hợp trên môi

trường R2YE - Apr 100µg/ml (1) và R2YE - Neo 60µg/ml (2) 56 Hình 3.19 Khuẩn lạc riêng rẽ phát sinh từ chủng M1-2 sau tiếp hợp trên môi trường R2YE – Apr 100µg/ml (1) và R2YE – Neo 60µg/ml (2) 56 Hình 3.20 PCR kiểm tra tiếp hợp của chủng M1-2-5 và M1-5-14 57 Hình 3.21 So sánh trình tự DNA từ Genbank và trình tự DNA chèn vào genome của dòng tế bào từ kết quả giải trình tự 59

Hình 3.22 Thử hoạt tính kháng khuẩn của chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP

và chủng đột biến M1-5-14 60

Hình 3.23 Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp TLC với chủng xạ khuẩn

Streptomyces sp KCTC 0041BP ban đầu và chủng đột biến M1-5-14 61

Hình 3.24 Các mẫu kháng sinh sau khi chạy cột sắc ký với tỷ lệ

Methanol:Chloroform từ 1:99 đến 10:90 62 Hình 3.25 Kết quả TLC 10 mẫu sắc ký cột tương ứng 10 tỷ lệ dung môi khảo sát Methanol:Chloroform (1:99) → (10:90) 63

Hình 3.26 Kết quả TLC phủ thạch mẫu sắc ký với tỷ lệ Methanol:Chloroform (5:95) 63 Hình 3.27 Phân tích HPLC và MS sản phẩm DHC từ chủng wild type 64 Hình 3.28 Phân tích HPLC và MS sản phẩm kháng sinh từ chủng đột biến

S.sp.ΔM1-5 65

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Dự đoán chức năng của các gen ORFs trong nhóm gen sinh tổng hợp DHC 8 Bảng 2.1 Dụng cụ, thiết bị dùng trong đề tài 28

Bảng 3.1 Thử hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP ban

đầu và chủng đột biến M1-5-14 60 Bảng 3.2 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp TLC với chủng đột biến M1-5-14 và chủng wild type 61

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Xạ khuẩn 4

1.1.1 Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên 4

1.1.2 Xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP 5

1.2 Kháng sinh DHC 6

1.2.1 Cấu trúc của DHC 6

1.2.2 Vai trò và hoạt tính sinh học 7

1.2.3 Các nghiên cứu về DHC 7

1.3 Gốc đường khử trong cấu trúc kháng sinh 12

1.3.1 Vai trò và hoạt tính sinh học 12

1.3.2 Con đường sinh tổng hợp đường khử ở vi sinh vật 12

1.3.3 Một số nghiên cứu về gốc đường khử 13

1.4 Gen gerMI (O-methyltransferase) 13

1.5 Vector tách dòng và vector đột biến 14

1.5.1 Vector tách dòng 15

1.5.2 Vector đột biến 15

1.6 Tiếp hợp và đột biến gen ở xạ khuẩn 17

1.6.1 Cơ chế quá trình tiếp hợp gen 17

1.6.2 Cơ chế đột biến gen của xạ khuẩn 19

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Thiết bị, hóa chất, vật liệu 21

2.1.1 Vật liệu 21

2.1.2 Môi trường 24

2.1.3 Hóa chất 25

2.1.4 Thiết bị 28

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 29

2.2.1 Phương pháp thiết kế mồi 29

2.2.2 Phương pháp PCR 30

2.2.3 Phương pháp tạo tế bào khả biến 30

2.2.4 Phương pháp chuyển gen vào tế bào vi khuẩn 31

2.2.5 Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn 31

2.2.6 Phương pháp điện di trên gel agarose 32

2.2.7 Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose 33

2.2.8 Phương pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn 33

2.2.9 Phương pháp nối DNA 33

2.2.10.Phương pháp tiếp hợp 34

2.2.11.Phương pháp sàng lọc khuẩn lạc sau tiếp hợp 35

2.2.12.Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ xạ khuẩn 36

2.2.13.Phương pháp tách chiết kháng sinh thô 37

2.2.14.Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh 37

2.2.15.Phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC 38

2.2.16.Phương pháp sắc ký cột 39

2.2.17.Phương pháp LC-MS 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41

3.1 Tách dòng đoạn UMI, DMI 41

3.1.1 Tách chiết DNA tổng số xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP 41

3.1.2 PCR nhân đoạn UMI, DMI 41

3.1.3 Tạo vector tái tổ hợp mang đoạn UMI, DMI trong vector pGEM-T Easy 42

3.2 Tạo vector tái tổ hợp mang đoạn UMI và DMI trong vector pGEM 7+ 45

3.2.1 Ghép nối đoạn UMI vào vector pGEM 7 + 45

3.2.2 Ghép nối đoạn DMI vào vector pGEM 7 + -UMI 47

3.3 Tạo vector tái tổ hợp chứa đoạn UMI, DMI và gen Neor trong vector pGEM 7+ 49

3.4 Tạo vector đột biến gen gerMI trong vector pKC1139 51

3.4.1 Ghép nối đoạn gen UMI-Neo r -DMI vào vector pKC1139, biến nạp vào tế bào E coli XL1 Blue 51

3.4.2 Biến nạp vector đột biến gen gerMI vào E coli ET 12567/pUZ8002 53

3.5 Lựa chọn dòng tế bào xạ khuẩn đã tiếp hợp trao đổi vật chất di truyền 54

3.5.1 PCR lựa chọn dòng tế bào có trao đổi chéo sau tiếp hợp 56

3.5.2 Giải trình tự gen của dòng tế bào trao đổi chéo DNA 58

3.6 Đánh giá hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP đột biến 59

3.6.1 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc 59

3.6.2 Phân tích hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp TLC và phủ thạch 60

3.7 Thu nhận và phân tích dẫn xuất kháng sinh bằng sắc ký 62

3.7.1 Điều kiện thích hợp thu nhận dẫn xuất kháng sinh 62

3.7.2 Phân tích dẫn xuất bằng sắc ký HPLC và Mass 63

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 66

4.1 Kết luận 66

4.2 Đề xuất 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

MỞ ĐẦU

Từ xa xưa, các bệnh nhiễm khuẩn đã là một trong những nỗi kinh hoàng đối với con người Những trận đại dịch đã từng làm thay đổi sức mạnh của cả một đoàn quân thiện chiến, thậm chí dẫn đến sự diệt vong của một đế chế hùng mạng Chính điều đó đã thôi thúc các nhà khoa học trên thế giới phải tìm ra được một chất có khả năng phòng chống và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện ra penicillin – chất kháng sinh (CKS) có nguồn gốc từ nấm

Penicillium nhưng phải hơn 10 năm sau, năm 1941- penicillin mới chính thức được

sử dụng trong y học và đã cứu sống được bệnh nhân nhiễm trùng máu đầu tiên, cũng từ đó kỷ nguyên CKS bắt đầu Đây là một trong những thành tựu vĩ đại nhất của nhân loại trong thế kỷ XX

Hiện nay cùng với sự phát triển của công nghệ thông tin thì công nghệ sinh học cũng được coi là một trong những ngành công nghệ hàng đầu của thế giới Trong đó phải kể đến công nghệ sinh học vi sinh vật sản xuất kháng sinh, vitamin

và các hoạt chất ứng dụng trong y học cũng như các lĩnh vực khác phục vụ đời sống con người đang có những phát triển vượt bậc

Từ những phương pháp sinh tổng hợp và bán tổng hợp thì công nghệ vi sinh sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò của mình Trong số hơn 10.000 CKS được tìm ra thì có khoảng 2.000 chất do thực vật tạo ra, khoảng 8.000 chất là kháng sinh do vi sinh vật tổng hợp, trong đó xạ khuẩn tổng hợp trên 80% [13]

Tuy nhiên, do việc sử dụng các CKS không hợp lý đã làm cho hiện tượng kháng kháng sinh xuất hiện, phát triển và ngày càng lan rộng Việc sử dụng một số chất kháng sinh để chữa trị một số loại bệnh đã không còn mang lại hiệu quả như mong muốn Số lượng các vi khuẩn đề kháng với kháng sinh ngày càng gia tăng Chính vì vậy, việc tìm kiếm ra những CKS mới luôn thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học

Dihydrochalcomycin (DHC) là kháng sinh thuộc nhóm macrolide 16C, được

sử dụng trong điều trị nhiễm trùng đường hô hấp Nhiều nhà khoa học đã và đang quan tâm nghiên cứu về loại kháng sinh này bởi nhiều ưu điểm vượt trội của nó như

ít độc, dung nạp tốt, thải trừ nhanh, đặc biệt có hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh và chưa xuất hiện hiện tượng kháng thuốc

DHC là sản phẩm trao đổi chất bậc 2 của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp

KCTC 0041BP, có tác dụng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Gr- (Gram âm) và Gr+

(Gram dương) bằng cách liên kết vào tiểu phần 50S của ribosome, ngăn cản quá trình sinh tổng hợp protein của vi khuẩn Trong 31 gen tham gia vào quá trình sinh

tổng hợp kháng sinh DHC, gen gerMI được dự đoán có chức năng mã hóa cho

enzyme O-methyltransferase xúc tác phản ứng methyl hóa nhóm OH tại vị trí C3

của đường dTDP-4,6-dideoxyglucose tạo gốc đường D-chalcose trong cấu trúc kháng sinh DHC

Tuy gen gerMI có vai trò quan trọng như vậy nhưng chưa có những nghiên

cứu cụ thể Trên cơ sở đó, nhằm tìm ra con đường sinh tổng hợp kháng sinh dihydrochalcomycin, làm tiền đề cho nghiên cứu sản xuất kháng sinh này ứng dụng trong chữa bệnh, em đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn

đột biến gen gerMI (O-methyltransferase) sinh dẫn xuất kháng sinh dihydrochalcomycin từ chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP”

Demethyl-Mục tiêu của đề tài:

- Tạo chủng đột biến gen gerMI từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC

0041BP bằng phương pháp tiếp hợp, chủng đột biến có khả năng sinh tổng hợp dẫn xuất của Dihydrochalcomycin

- Tách chiết dẫn xuất kháng sinh Demethyl-dihydrochalcomycin từ chủng

xạ khuẩn đột biến

- Chứng minh chức năng gen gerMI tham gia vào con đường sinh tổng hợp

kháng sinh DHC

Nội dung thực hiện:

- Tách dòng đoạn UMI (upstream MI), DMI (downstream MI) từ DNA tổng

số xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP

- Tạo vector tái tổ hợp mang đoạn UMI, DMI và gen Neor

- Tạo vector đột biến gen gerMI trong vi khuẩn Escherichia coli ET12567/

pUZ8002

- Lựa chọn dòng tế bào xạ khuẩn đã tiếp hợp trao đổi vật chất di truyền

- Đánh giá hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn đột biến

- Thu nhận và phân tích dẫn xuất kháng sinh từ chủng đột biến bằng sắc ký

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xạ khuẩn

1.1.1 Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí

cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật

Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 – 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9 ÷ 45% tổng số vi sinh vật [20]

Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh, 60 ÷ 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh CKS

Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [2] Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các

loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora actinomadura, Actinoplanes,

Streptoverticillium, Streptosporangium…Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã

cung cấp nhiều CKS có giá trị đang dùng trong y học như gentamycine, tobramycine, vancomycine, rovamycine Nhiều xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh

Ngoài ra, xạ khuẩn còn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa và phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp và bền vững trong đất như cenlulose, tinh bột, chất mùn kitin, keratin…góp phần khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên Trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn còn có thể sinh ra các chất hữu cơ như các loại vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12); một số axit hữu cơ như lactic acid, acetic acid; amino acid như glutamic acid, methionine, tryptophan, lysine Một số khác có khả năng tạo thành các chất kích thích sinh trưởng thực vật

Xạ khuẩn được dùng rộng rãi trong các ngành công nghiệp lên men, chế tạo các sản phẩm lên men hoặc ứng dụng các men do xạ khuẩn sinh ra nhiều như

proteinase, amylase, cellulase, kitinase…

Tuy nhiên bên cạnh những xạ khuẩn có ích, một số xạ khuẩn lại sinh ra các chất độc kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng cũng như sự phát triển của hệ vi sinh vật có ích trong đất, một số khác lại là nguyên nhân gây ra một số bệnh khó chữa ở người và gia súc [6] Hai nhóm xạ khuẩn quan trọng là tác nhân

gây bệnh ở người là Mycobacterium tuberculosis gây bệnh lao và Corynebacterium

diphtheria gây bệnh bạch hầu

1.1.2 Xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP

Chi xạ khuẩn được biết đến nhiều nhất là Streptomyces, với khoảng 500 loài,

có tỷ lệ G, C cao (69 ÷ 73%) trong DNA Một phần rất lớn các chất kháng sinh được sử dụng hiệu quả trong điều trị có nguồn gốc từ các loài thuộc chi

Streptomyces trong đó được biết đến nhiều nhất là streptomycin, erythromycin và

tetracyclin [15]

Streptomyces là chi xạ khuẩn bậc cao được Waksman và Henrici đặt tên năm

1943 [20] Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất Các đại diện chi này có

hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất phát triển phân nhánh

Xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP thuộc chi Streptomyces, là chủng

sản sinh ra kháng sinh DHC Chủng được phân lập từ mẫu đất tại Hàn Quốc, đồng thời cấu trúc hóa học của DHC cũng được xác định bởi nhóm nghiên cứu Kim và

cs, 1996

Khi sinh trưởng trên môi trường ISP2 cho khuẩn lạc không lớn, có kích thước từ 1-5 mm Khuẩn lạc rắn chắc và đâm sâu vào trong bề mặt cơ chất, bề mặt khuẩn lạc thường được bao phủ bởi một lớp các khuẩn ty khí sinh dạng nhung dày

Đặc điểm nổi bật của loài xạ khuẩn này là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không hình thành vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử)

Hệ sợi mảnh, đường kính sợi dao động trong khoảng từ 0,2-2 µm

Xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP sinh sản vô tính bằng bào tử

Trên đầu sợi khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử Cuống sinh bào

tử có hình thẳng hoặc lượn sóng Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 μm Bề mặt bào tử trơn nhẵn Màng bào tử có nếp nhăn trên môi trường ISP2

Khi nuôi chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP trên môi

trường lỏng dịch nuôi có màu đen và có mùi đặc trưng của đất do chủng được phân lập từ đất

Chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP có thể sinh trưởng trong dải nhiệt độ

25 ÷ 32°C, thích hợp nhất ở 28 ÷ 30°C

Độ pH thích hợp cho sự phát triển của chủng là khoảng 6 ÷ 9 Ở pH thấp hơn

6 hoặc cao hơn 9 thì chủng phát triển kém hoặc không phát triển Chủng

Streptomyces sp KCTC 0041BP hình thành sắc tố melanin trên môi trường thạch

tyrosine [4] Có khả năng đồng hóa tốt với một số loại đường như cellobiose, D- glucose, D- mannose, maltose…

Xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP sinh kháng sinh có khả năng ức

chế vi khuẩn Gr+ và vi khuẩn Gr- Tuy nhiên, kháng sinh này có khả năng ức chế cao hơn đối với vi khuẩn Gr+ Điều này được giải thích bởi vi khuẩn Gr- có lớp thành tế bào dày và nhiều lớp hơn so với vi khuẩn Gr+, vì vậy chúng ít chịu ảnh hưởng bởi kháng sinh hơn Trong các vi khuẩn Gr+ được nghiên cứu, khả năng ức chế vi sinh

vật của xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP lên vi khuẩn Bacillus cereus là lớn nhất (D = 21,33 mm), tiếp theo là vi khuẩn Bacillus subtilis (D = 19,50 mm) [4]

1.2 Kháng sinh DHC

1.2.1 Cấu trúc của DHC

DHC thuộc nhóm kháng sinh macrolide 16C, là sản phẩm trao đổi chất bậc 2

của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP, được tách chiết lần đầu tiên

và xác định cấu trúc năm 1996

Về cấu trúc, kháng sinh DHC cấu tạo gồm nhân lactone nối với 2 gốc đường là mycinose và chalcose thông qua liên kết O-glucosid tại vị trí C5 và C20 [17] (hình 1.1)

Hình 1.1.Cấu trúc của DHC

1.2.2 Vai trò và hoạt tính sinh học

Qua nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng, kháng sinh DHC đã biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh có thể ức chế và tiêu diệt cả vi khuẩn Gr- và Gr+ Chủng

xạ khuẩn tạo ra DHC đã được phân lập, đồng thời cấu trúc hóa học của chúng cũng được xác định bởi nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc, kháng sinh này được xác định là chất dẫn xuất của kháng sinh chalcomycin đã được xác định trước đó bởi nhóm nghiên cứu khác [8], [13] Mặc dù toàn bộ cơ chế tác dụng của DHC chưa được nghiên cứu hoàn toàn đầy đủ nhưng một số nghiên cứu đã khẳng định hoạt tính sinh học của DHC hoàn toàn tương tự như hoạt tính của kháng sinh chalcomycin và

mycinamycin [11]

Nghiên cứu về cấu trúc tinh thể phóng xạ để xác định cơ chế hoạt động của kháng sinh, nhóm của Hansen đã chứng minh được cấu trúc nhân macrocyclic lacton của kháng sinh này hình thành phức hệ và gắn với tiểu phần lớn của ribosome vi khuẩn tại điểm tách chuỗi polypeptide ra khỏi tâm hoạt động của enzyme peptidyltransferase Từ đó kháng sinh này có hoạt tính ức chế sinh tổng hợp

protein của vi khuẩn [12], [14]

1.2.3 Các nghiên cứu về DHC

1.2.3.1 Lập thư viện gen và giải trình tự nhóm gen sinh tổng hợp DHC

Qua thời gian nghiên cứu cấu trúc DHC, kháng sinh này được xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR – Nuclear Magnetic Resonance) và được phân loại thuộc nhóm kháng sinh PKS loại I Nhóm nghiên

cứu Jaishi và cs, 2006 đã tách và lập được thư viện gen, tách được nhóm gen tham

gia vào con đường sinh tổng hợp DHC từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC

0041BP Toàn bộ nhóm gen tham gia sinh tổng hợp có chuỗi trình tự là 75,5kb đã

được xác định trong đó có chứa 23 ORFs chứa thông tin di truyền, mã hóa cho các

gen tham gia con đường sinh tổng hợp DHC Đồng thời các gen này cũng được dự

đoán cấu trúc (Bảng 1.1) Trình tự các gen này đã được đăng bản quyền trên

GenBank với mã số AY118081 [10]

Bảng 1.1 Dự đoán chức năng của các gen ORFs trong nhóm gen sinh tổng hợp DHC

3,4-dehydratase like protein O-methyltransferase

NDP-4,6- dideoxyhexose 3,4-enoyl reductase Beta glucosidase

Cytochrome P450 hydroxylase Cytochrome P450 hydroxylase Type II thioesterase

dTDP-glucose 4,6- dehydratase Alpha-D-glucose-1-phosphate thymidyltransferase NDP-hexose 3-epimerase

3-O-methyltransferase Cytochrome P450 Ferredoxin

dTDP-hexose 4-ketoreductase 2-O-methyltransferase

Glycosyltransferase rRNA methyltransferase PKS[LM(KSQ,AT,ACP)M1(KS,AT,KR,ACP), M2(KS,AT,DH,KR,ACP)]

Post-PKS reductase Putative transcriptional regulator

1.2.3.2 Tách và dự đoán chức năng nhóm gen tham gia sinh tổng hợp đường

Trong con đường sinh tổng hợp, dTDP-4-keto-6-deoxyglucose là gốc đường trung gian cho quá trình tổng hợp cả 2 gốc đường chalcose và mycinose, được tổng

hợp từ glucose-1-phosphate với hoạt tính xúc tác của các enzyme GerD có chức năng là dTDP-glucose synthase và GerE có chức năng là dTDP-glucose 4,6-

dehydartase

- Quá trình sinh tổng hợp đường D-chalcose bắt đầu từ gốc đường trung gian

4-keto-6-deoxyglucose với hoạt tính xúc tác của các enzyme 3,4-isomerase (GerY)

để tạo đồng phân, tiếp theo là phản ứng loại nhóm OH bởi 3,4-dehydratase (GerB)

và phản ứng khử của enzyme 3,4-enoylreductase (GerN) để tạo ra

3-keto-4,6-dideoxyglucose Sản phẩm tại vị trí 3-keto sẽ được chuyển thành 3'-OH nhờ

enzyme 3-ketoreductase (GerKII) tạo dTDP-4,6-dideoxyglucose Tiếp đó, gốc

đường này được chuyển đến nối với nhân macrolide tại vị trí C5 nhờ hoạt tính xúc

tác của chalcosylglycosyltransferase (GerTII) và cuối cùng methyl hóa nhóm -OH

tại vị trí C3 nhờ hoạt động của enzyme O-methyltransferase (GerMI) tạo gốc đường

dTDP-4-keto-6-(GerF) và 4-ketoreductase (GerKI) Tiếp theo là phản ứng gắn gốc đường allose

vào nhân macrolacton tại vị trí C20 nhờ hoạt tính xúc tác của glycosyltransferase

(GerTI).Cuối cùng hai enzyme 2-O-methyltransferase (GerMIII) và methyltransferase (GerMII) xúc tác phản ứng methyl hóa nhóm OH tại vị trí C2, C3

3-O-tạo gốc đường D-mycinose

Bước cuối cùng hoàn thành cấu trúc kháng sinh DHC với hoạt động của

enzyme hydroxylase (GerPI) xúc tác gắn nhóm OH vào vị trí C8, và enzyme

epoxidase (GerPII) với chức năng tạo vòng lacton tại vị trí C12-C13 của vòng dihydromacrolacton [17]

Hình 1.2 Dự đoán con đường sinh tổng hợp gốc đường khử và bước cuối hoàn thành

cấu trúc kháng sinh DHC

1.2.3.3 Sinh tổng hợp dTDP-6-deoxy-β-D-allose, chứng minh chức năng của

dTDP-4-keto-6-deoxyglucose reductase (GerKI)

Trong nghiên cứu này nhóm nghiên cứu Thuy và cs, 2007 đã chứng minh

vai trò của gen GerKI trong sinh tổng hợp D-mycinose GerKI mã hóa cho enzyme

4-ketoreductase, tham gia phản ứng xúc tác chuyển gốc đường deoxyglucose thành 6-deoxy-D-allose Cùng với kết quả này sản phẩm được tạo thành đó là dTDP-6-deoxy-D-allose đã được xác định cấu trúc bằng phân tích NMR

4-keto-6-và HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) Kết quả nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học

rất quan trọng bởi vì đây là đường khử hoàn toàn mới lần đầu tiên được tổng hợp nhờ phản ứng enzyme invitro và nhờ đó đã tìm ra phương pháp sinh tổng hợp một gốc đường quan trọng [17]

1.2.3.4 Chứng minh chức năng của gen GerTI và GerTII (glycosyltransferases )

bằng phương pháp gây đột biến gen

Theo kết quả nghiên cứu của Thuy và cs, 2010 chức năng của gen GerTI và

GerTII đã được sáng tỏ bằng phương pháp đột biến gen để tạo chủng đột biến

không có chứa GerTI và GerTII Chức năng của gen này là mã hóa cho sinh tổng

hợp enzyme glycosyltransferase Các enzyme này tham gia vận chuyển và gắn gốc đường mycinose và chalcose vào nhân macrolacton Phân tích đánh giá sản phẩm trung gian từ chủng đột biến, nhóm nghiên cứu còn chứng minh được bước cuối cùng của quá trình hình thành kháng sinh và thu được hợp chất có hoạt tính sinh học mới [17]

1.2.3.5 Nghiên cứu biểu hiện gen GerF trong nhóm gen sinh tổng hợp gốc đường

khử dTDP-6-deoxy-D-allose

Kết quả nghiên cứu biểu hiện gen GerF trong tế bào vi khuẩn E coli BL21(DE3) đã chứng minh chức năng của gen GerF mã hóa cho enzyme dTDP-4-

keto6deoxyglucose 3epimerase, xúc tác tạo đồng phân quang học chuyển vị trí

-OH ở vị trí C3 của đường dTDP-4-keto-6-deoxyglucose, tham gia vào chuyển hóa đường dTDP-4-keto-6-deoxyglucose thành đường dTDP-6-deoxy-D-allose trong quá trình sinh tổng hợp đường khử D-mycinose trong cấu trúc kháng sinh DHC Kết quả

enzyme GerF được biểu hiện thành công trên E coli BL21 (DE3) có khối lượng phân

tử là 38kDa, đồng thời xác định được điều kiện thích hợp để biểu hiện gen GerF và

enzyme này được sinh ra ở dạng tan là ở 26oC, trong 8h, nồng độ IPTG 10mmol [5]

1.3 Gốc đường khử trong cấu trúc kháng sinh

1.3.1 Vai trò và hoạt tính sinh học

Đường khử là gốc đường được tìm thấy rất nhiều trong cấu trúc của tế bào vi khuẩn, tế bào nấm, các chất có hoạt tính sinh học và trong thành phần cấu trúc của rất nhiều thuốc kháng sinh hay các chất chống ung thư [16]

Về cấu tạo, đường khử là các chất mà trong phân tử chúng có một hay nhiều hơn một nhóm hydroxyl (-OH) được thay thế bởi nguyên tử hydro (H) hay các nhóm chức khác như amino, methyl, alkyl Các loại đường khử này có thể tồn tại ở dạng đường đơn hay đường đa hoặc phân nhánh và là dẫn xuất của các sản phẩm trao đổi chất bậc 2 trong các hợp chất tự nhiên [17]

Trong các hợp chất có hoạt tính sinh học đường khử đóng vai trò quan trọng đối với việc xác định hoạt tính của các chất này Có rất nhiều các nghiên cứu đã chứng minh rằng các chất có hoạt tính sinh học sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính nếu như gốc đường trong cấu trúc bị loại bỏ

Trong cấu trúc tế bào vi sinh vật, đường khử tham gia cấu tạo lớp peptidoglycan là thành phần cấu trúc nên thành tế bào của nhiều loại vi sinh vật, đặc biệt là một số vi khuẩn Gr+ hoặc hình thành lớp lipopolysaccharide trong cấu trúc màng tế bào của nhóm vi khuẩn Gr-

1.3.2 Con đường sinh tổng hợp đường khử ở vi sinh vật

Đa số đường khử thuộc nhóm 6-deoxyhexose Cho đến nay, có hơn 70 chất đường khử có cấu tạo khác nhau đã được xác định, và số lượng nhóm gen tham gia vào sinh tổng hợp 6-deoxyhexose ngày càng tăng Trong đó, 6-deoxyhexose được tổng hợp chủ yếu từ D-glucose, qua 4-keto-6-deoxyglucose như một tiền chất trung gian Dưới chức năng sinh học của hai enzyme NDP-D-hexose synthase và NDP-D-hexose-4,6-dehydratase, xúc tác chuyển hóa glucose-1-phosphate thành NDP-4-keto-6-deoxyglucose Đường trung gian này sẽ có thể trải qua một vài biến đổi nữa

để tạo một số lượng lớn các chất 6-deoxyhexose khác nhau

Hình 1.3 Sinh tổng hợp đường khử ở vi sinh vật

Trong đó: Nhóm OH tại vị trí cacbon số 2, 3, 4 và 5 của chuỗi cacbon hexose

có thể bị thay thế bởi nguyên tử H, nhóm -CH3, nhóm -CHO, nhóm -CO tạo các cấu trúc đường khử khác nhau

1.3.3 Một số nghiên cứu về gốc đường khử

- Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng gốc đường khử trong nhóm kháng sinh macrolide như: erythromycin, tylosin, pikromycin đóng vai trò gắn các kháng sinh này với các enzyme tham gia tổng hợp protein của vi khuẩn [12]

- Việc nghiên cứu vai trò của gốc đường đã chỉ ra rằng: nếu mất đi gốc đường khử trong cấu trúc tế bào của một số vi sinh vật sẽ gây ức chế sự sinh trưởng của tế bào hoặc tiêu diệt vi sinh vật [19]

- Theo Binod và cộng sự năm 2009, xu hướng nghiên cứu hóa dược hiện nay trên thế giới đó là nghiên cứu tạo ra được các thế hệ kháng sinh mới bằng cách thay gốc đường cũ của một nhóm kháng sinh bằng gốc đường mới Kháng sinh thế hệ mới sẽ có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn, tránh được hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn, đồng thời khả năng thải trừ thuốc trong cơ thể sẽ nhanh hơn

1.4 Gen gerMI (O-methyltransferase)

sinh DHC từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP Toàn bộ nhóm gen

sinh tổng hợp có chuỗi trình tự là 75.5kb , trong đó có 23 ORFs chứa thông tin di truyền mã hóa các gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp kháng sinh DHC đã được đăng bản quyền trên Genbank với mã số AY118081

Trong 31 gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp, gen gerMI được dự

đoán gồm có 271 amino acid, độ dài là 816 bp (Phụ lục) với chức năng là mã hóa tổng hợp enzyme O-methyltransferase, xúc tác phản ứng methyl hóa nhóm -OH tại

vị trí C3 của đường dTDP-4,6-dideoxyglucose tạo gốc đường D-chalcose trong cấu trúc kháng sinh DHC (hình 1.4)

Hình 1.4 Dự đoán chức năng gen gerMI trong con đường sinh tổng hợp DHC

 Trình tự axit amin tương ứng của gen gerMI từ ngân hàng Genbank

1 mtvqtrelyv dlikrvvtnt vygdhptfpv gmnvldkdla

41 dsmrpdapgs avdhgrfdag hraegldvpt vahtmiglhr

81 ldniqkcveq vlrdgvpgdf ietgvwrgga cilmrallka

121 hgvedrnvwl adsfagvpvt sedshpldqa mefhnlnwvl

161 scseeqvrqn varygllddq vkflpgmfad tlpnapidql

201 avlrldgdly estmdalvnl ypkvsvggfv ivddylipac

241 kqavhdyrne hgidepietv dvtgvywrra h

1.5 Vector tách dòng và vector đột biến

Công nghệ DNA tái tổ hợp được ra đời trên cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử và hiện nay đang đóng vai trò cách mạng đối với sự phát triển của sinh học cũng như cải tạo sinh giới Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã cho phép các nhà công nghệ sinh học phân lập và khuếch đại một gen đơn từ genome của một sinh vật để

có thể nghiên cứu, biến đổi và chuyển nó vào trong một cơ thể sinh vật khác Các

kỹ thuật này còn được gọi là tạo dòng gen do nó có thể sản xuất ra một số lượng lớn các gen xác định

Vào những năm 70, bằng những phương pháp khác nhau, người ta đã tạo được những phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên DNA tái tổ hợp là phân tử DNA được tạo thành từ hai hay nhiều trình tự DNA của các loài sinh vật khác nhau

1.5.1 Vector tách dòng

Vector tách dòng (cloning vector) là một phân tử DNA thường là dạng vòng,

có kích thước nhỏ cho phép cài gắn các đoạn DNA ngoại lai cần thiết và khi xâm nhập vào tế bào vật chủ thì có khả năng tự tái bản không phụ thuộc vào sự sao chép của tế bào chủ, tồn tại độc lập qua nhiều thế hệ và không gây biến đổi bộ gene của

tế bào chủ [32]

Các đặc điểm cần có của một vector tách dòng:

- Phải có điểm khởi đầu sao chép (origin) để có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ

- Phải có trình tự điều hòa tạo thuận lợi cho sự phiên mã gen lạ

- Có gen chỉ thị, chọn lọc (gen kháng kháng sinh, gen chỉ thị màu…) cho phép

dễ dàng phát hiện nhận biết chúng trong tế bào chủ nhận

- Mang những vị trí nhận biết duy nhất của một số enzyme giới hạn Các vị trí cắt giới hạn này có tác dụng mở rộng khả năng xây dựng vector tái tổ hợp từ vector ban đầu

- Có kích thước càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lượng DNA tối đa, đồng thời dễ xâm nhập vào tế bào chủ, sao chép nhanh và hiệu quả

Các loại vector tách dòng thường dùng: plasmid, cosmid, phage, BAC (Bacterium artificial chromosomes), YAC (yeast artificial chromosomes)

1.5.2 Vector đột biến

Những phát hiện về gen di truyền và các nghiên cứu về gen đã tạo nên những thành tựu lớn trong lịch sử nhân loại và mở ra nhiều ứng dụng trên mọi lĩnh vực của

cuộc sống Bắt đầu từ những nghiên cứu đầu tiên cho tới sự phát triển mau chóng của công nghệ gen, các thành tựu về gen di truyền đã và đang tiếp tục mang lại những bước tiến lớn cho khoa học và cả thế giới Chức năng của gen có ý nghĩa quan trọng trong các nghiên cứu sinh học cũng như y học Năm 1934 George Beadle đã phát hiện ra rằng mỗi một gen đều quyết định đến sự hình thành của các enzyme riêng biệt, enzyme giúp các tế bào hoạt động Ông đã liên hệ thông qua các thí ngiệm, chứng minh rằng khi gen phát sinh đột biến sẽ không có khả năng tạo ra

những enzyme Trên cơ sở như vậy, em đã tiến hành tạo vector đột biến gen gerMI

bằng phương pháp gene knock-out, từ đó giúp chứng minh chức năng của gen

gerMI trong con đường sinh tổng hợp kháng sinh DHC Gene knock-out là một

phương pháp được sử dụng làm mất chức năng (hay bất hoạt) một gene đã biết rõ trình tự Để thực hiện, một đoạn DNA được chèn vào thay thế vị trí của gene đó và làm gene đó bị bất hoạt

Cấu trúc một vector đột biến bao gồm:

- Đoạn DNA có trình tự tương đồng với trình tự đoạn gen cần làm thay đổi cấu trúc

- Đoạn DNA được chèn sẽ làm thay đổi cấu trúc gen cần biến đổi (gen mục tiêu) Đoạn này mang thêm DNA đánh dấu (marker DNA)

Marker được sử dụng trong trường hợp này là đoạn DNA mã hóa cho enzyme có khả năng kháng kháng sinh Neo Gen kháng Neo được ký hiệu là

“Neor” Nếu tế bào đã thu nhận đoạn gen ngoại lai nó sẽ đồng thời thu nhận đoạn Neor và người ta kiểm tra được sự hiện diện của nó trong môi trường có mặt Neo

Dùng kháng sinh trong môi trường nuôi cấy phát triển chọn lọc là phương pháp thông dụng để kiểm tra xem gen đánh dấu (marker) có “nhiễm” được vào tế bào hay không

1.6 Tiếp hợp và đột biến gen ở xạ khuẩn

1.6.1 Cơ chế quá trình tiếp hợp gen

Tiếp hợp là hiện tượng truyền vật liệu di truyền DNA theo một chiều từ vi khuẩn cho (vi khuẩn đực) sang vi khuẩn nhận (vi khuẩn cái) bằng sự tiếp xúc trực tiếp giữa hai vi khuẩn, để tạo ra một loài lai mang đặc tính của vi khuẩn nhận và một phần đặc tính của vi khuẩn cho Sự tiếp hợp giữa hai vi khuẩn dẫn đến sự hình thành một hợp tử chứa hệ gen của vi khuẩn nhận và một đoạn gen của vi khuẩn cho Hai phần này kết hợp thành một nhiễm sắc thể duy nhất Những vi khuẩn sinh ra do tiếp hợp được gọi là vi khuẩn tái tổ hợp

Khả năng truyền DNA của vi khuẩn cho có liên quan đến sự có mặt trong tế bào một plasmid được gọi là yếu tố giới tính F Yếu tố F là một plasmid cấu tạo bởi một DNA vòng, xoắn kép có kích thước trung bình dài bằng 2% chiều dài nhiễm sắc thể của vi khuẩn (hình 1.5) Yếu tố F mang các gen mã hóa cho đặc tính “đực” của tế bào F+, bao gồm khả năng tạo cầu tiếp hợp giữa các tế bào cho với tế bào nhận, cũng như khả năng tạo pili sinh dục và cho DNA Các vi khuẩn không mang yếu tố F là vi khuẩn cái hay tế bào F-, chỉ có khả năng nhận DNA

Yếu tố F có thể tồn tại trong tế bào dưới hai trạng thái khác nhau: hoặc ở trạng thái độc lập trong tế bào chất của vi khuẩn, nó có khả năng nhân lên một cách độc lập; hoặc ghép vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn như một prophage và chỉ được nhân lên đồng thời với nhiễm sắc thể của vi khuẩn Trong quá trình tiếp hợp, yếu tố

F có khả năng tự tái tạo trong tế bào F+, nghĩa là sau khi truyền yếu tố F qua tế bào nhận F-, trong tế bào F+ vẫn tồn tại yếu tố F [1]

Hình 1.5 F plasmid

Cách truyền vật chất di truyền từ vi khuẩn đực sang vi khuẩn cái được làm sáng

tỏ do những công trình của F Jacob và E Wollman (1958 – 1960) Quá trình truyền vật chất di truyền trong tiếp hợp xảy ra theo các giai đoạn thể hiện trên hình 1.6

Hình 1.6 Quá trình tiếp hợp ở vi khuẩn

- Giai đoạn 1: sự tiếp xúc ngẫu nhiên xuất hiện vài phút sau khi trộn vi khuẩn với nhau Xác suất của sự tiếp xúc phụ thuộc vào nồng độ của hai loài vi khuẩn

- Giai đoạn 2: là sự bắt cặp giữa tế bào nhận và tế bào cho Tế bào nhận đóng vai trò thụ động, màng tê bào của nó bị hòa tan tại chỗ tiếp xúc với pili sinh dục của

vi khuẩn đực, tạo thành những cầu nguyên sinh chất có đường kính từ 10 – 30 µm Quá trình này phụ thuộc vào pH, điều kiện dinh dưỡng trong môi trường

- Giai đoạn 3: là giai đoạn mà các DNA của tế bào cho chuyển sang tế bào nhận theo cấu trúc thẳng Số lượng gen chuyển sang phụ thuộc vào thời gian tiếp hợp

- Giai đoạn 4: là quá trình tái tổ hợp giữa các nhiễm sắc thể của thể nhận và đoạn vật chất di truyền của thể cho

Cuối cùng là sự tái tạo nhiễm sắc thể trong những thế hệ sau, thể lai được hình thành

1.6.2 Cơ chế đột biến gen của xạ khuẩn

Sau khi tiếp hợp gen, trong hệ gen của xạ khuẩn xảy ra quá trình trao đổi chéo tại vị trí có trình tự tương đồng giữa genome và vector đột biến Trao đổi chéo xảy ra tại một vị trí tương đồng được gọi là trao đổi chéo đơn, trao đổi chéo xảy ra tại hai vị trí tương đồng được gọi là trao đổi chéo kép Quá trình trao đổi chéo dẫn đến sự tái tổ hợp các gen trong hệ gen xạ khuẩn, làm đột biến gen ở xạ khuẩn [17] Cơ chế của hai quá trình trao đổi chéo đơn và trao đổi chéo kép được thể hiện trên hình 1.7

A B

Hình 1.7 Cơ chế của quá trình trao đổi chéo của xạ khuẩn

A: Trao đổi chéo đơn B: Trao đổi chéo kép

Nếu xảy ra quá trình trao đổi chéo đơn, hệ gen của xạ khuẩn sẽ được chèn thêm đoạn gen Aprr-UMI-Neor-DMI và vẫn giữ nguyên gen gerMI Nếu xảy ra quá trình trao đổi chéo kép, gen gerMI sẽ bị xóa bỏ và thay thế bằng gen Neor Như vậy, dựa vào cơ chế trao đổi chéo, tái tổ hợp lại vật chất di truyền của xạ khuẩn, các nhà khoa học có thể thực hiện đột biến gen đích theo mong muốn mà không gây ảnh hưởng tới các gen khác

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thiết bị, hóa chất, vật liệu

2.1.1 Vật liệu

2.1.1.1 Chủng vi sinh vật

 Vi khuẩn E coli

Hai chủng E coli được sử dụng trong đề tài:

- Chủng E coli XL1 Blue được sử dụng làm vật chủ trong tách dòng gen, sống

trong môi trường LB

- Chủng E coli ET12567 mang plasmid pUZ8002 được dùng làm tế bào thể

cho trong tiếp hợp gen, sống chọn lọc trong môi trường LB có chứa 3 loại kháng

sinh: Km, Tet, Cm Plasmid pUZ8002 chứa tổ hợp gen tra, có vai trò quan trọng

trong sự tạo thành lông giới tính để làm cầu tiếp hợp, mã hóa cho protein vận

chuyển tra tham gia vào quá trình chuyển giao DNA

 Xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP

Chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP được phân lập tại Hàn

Quốc do khoa Hóa học trường Đại học Sun Moon – Hàn Quốc cung cấp Đây là chủng hoang dại sản sinh ra kháng sinh DHC, được dùng làm tế bào thể nhận trong tiếp hợp gen

 Vi khuẩn Bacillus subtilis

Chủng Bacillus subtilis ATCC 11778 được sử dụng làm vi sinh vật kiểm

định trong phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn, cung cấp bởi Khoa vi sinh - Viện kiểm nghiệm thuốc TW

2.1.1.2 Vector và plasmid sử dụng trong đề tài

 pFDNEO-S modified

Plasmid pFDNEO-S có kích thước 3634 bp, được cung cấp bởi trường Đại học Sun Moon (Hàn Quốc), mang gen kháng Neo được sử dụng như là gen chỉ thị trong việc chèn để khử hoạt tính hay đột biến gen chức năng Plasmid sử dụng trong

đề tài đã được sửa đổi chèn thêm đoạn trình tự, giúp tạo ra đoạn gen kháng Neo với

độ dài 1012 bp giới hạn bởi trình tự cắt của enzyme KpnI (GGTACC) ở hai đầu

(Phụ lục)

Hình 2.1 plasmid pFDNEO-S

 Vector pGEM-T Easy

Vector pGEM-T Easy (Promega) có kích thước 3015bp, là vectơ tách dòng được thiết kế với nhiều đặc điểm của một vectơ đa chức năng, sử dụng để nhân dòng sản phẩm PCR Vector đã được mở vòng và gắn thêm Thymidine (T) tại 2 đầu mút của vòng mở giúp tăng hiệu quả nối gen chèn sản phẩm PCR, do sản phẩm PCR tạo thành nhờ enzyme Taq polymerase luôn có gắn thêm base Adenine (A) ở 2 đầu pGEM-T Easy mang gen kháng Amp và trình tự khởi đầu sao chép ori, f1-ori Vector mang gen lacZ mã hóa cho β-galactosidase, có vị trí cắt của enzyme giới hạn trên lacZ giúp chọn lọc những khuẩn lạc có gen chèn dựa vào màu sắc trắng xanh của khuẩn lạc trên môi trường X-gal và IPTG

Hình 2.2 vector pGEM-T Easy

 Vector pGEM-7Zf(+) (Promega)

- Là vector tách dòng, có kích thước 2997 bp, bắt nguồn từ vector pGEM 3+

và mang trình tự khởi đầu sao chép ori và ori của phage f1

- Mang trình tự khởi đầu phiên mã (promoter) SP6 và T7 RNA polymerase

- Mang gen kháng Amp, điểm cắt của các enzyme giới hạn nằm trên gen lacZ giúp cho việc chọn lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp

Hình 2.3 Vector pGEM 7 +

 Vector pKC1139

- Vector được cung cấp từ trường Đại học Sun Moon (Hàn Quốc), có kích thước 6500 bp, mang gen kháng Apr, trình tự cắt của các enzyme giới hạn nằm trên gen lacZ

- Mang trình tự OriT, đóng vai trò khởi điểm của đoạn truyền, nơi bắt đầu cho sợi dương DNA của plasmid trồi ra, để thực hiện chuyển giao sợi dương qua cầu tiếp hợp

Hình 2.4 Vector pKC1139

 Môi trường R2YE:

đậu tương…của VWR Prolabo (Pháp), SIGMA (Nhật Bản), FLUKA (Mỹ), MERCK (Đức), INC (Canada), Việt Nam

 Hóa chất dùng để tách chiết plasmid từ tế bào vi khuẩn

- Solution I: Hòa tan tế bào

Tris-HCl 2M(pH=7,5) : 2,5 ml EDTA 0,5M : 2 ml Nước cất : 95,5 ml Hấp tiệt trùng và bảo quản ở 4oC

- Solution II: phá vỡ màng tế bào

NaOH 5M : 4 ml SDS 10% : 10 ml Nước cất : 86 ml Bảo quản ở 4oC

- Solution III: Kết tủa protein

Potassium acetate (CH3COOK) : 12,96 g Điều chỉnh pH=4,8 bằng acid acetic

Bổ sung nước để thể tích đạt 100 ml Bảo quản ở 4oC

- Dung dịch resin

Bột resin : 2g

Guanidine hydrochloride 7M : 200 ml

- Cồn lạnh 70o

- Dung dịch đệm TE:100mM Tris-HCl (pH 8,0), 10mM EDTA (pH 8,0)

 Hóa chất chạy điện di DNA

- Dung dịch TAE 1X dùng pha gel agarose và chạy điện di có thành phần như sau:

Tris : 4,84 g Glacial acetic acid (CH3COOH) : 1,14 ml

EDTA 0,5 M (pH=8) : 2 ml Nước cất đủ : 1lít

- Đệm nạp mẫu (DNA loading buffer 6X) có thành phần như sau:

Sucrose : 40 g Bromophenol blue : 0,25 g Xylene cyanol FF : 0,25 g Nước cất đủ : 100 ml

- Dung dịch nhuộm DNA trên gel : Ethidium bromide (10mg/ml)

- Gel agarose tùy theo mục đích phân tích DNA qua điện di hay tinh chế DNA mà sử dụng những loại agarose phù hợp Gel sử dụng có nồng độ 1% agarose

 Hóa chất dùng để tách chiết DNA từ gel agarose

Bao gồm: Guanidine thiocynate 6M, dung dịch resin, cồn 70o, đệm TE

 Hóa chất dùng để tách chiết DNA của xạ khuẩn

- TE25S (Lysis buffer):

2.1.4 Thiết bị

Bảng 2.1 Dụng cụ, thiết bị dùng trong đề tài

STT Tên dụng cụ, thiết bị Hãng sản xuất