Nghiên cứu tạo rễ tóc cây đậu nành (glycine max l ) bằng vi khuẩn agrobacterium rhizogenes

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -o0o - NGÔ THỊ TÚ TRINH NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TÓC CÂY ĐẬU NÀNH (Glycine max L.) BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, tháng năm 2018 ii Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Cán hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Vũ Phong (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét 1: PGS TS Bùi Văn Lệ (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét 2: PGS TS Lê Thị Thủy Tiên (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP.HCM ngày 21 tháng năm 2018 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: PGS TS Nguyễn Tiến Thắng PGS TS Bùi Văn Lệ PGS TS Lê Thị Thủy Tiên TS Võ Đình Lệ Tâm TS Hồng Anh Hoàng Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC PGS TS NGUYỄN TIẾN THẮNG GS TS PHAN THANH SƠN NAM iii ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự – Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Ngô Thị Tú Trinh MSHV: 1570260 Ngày tháng năm sinh: 04/02/1988 Nơi sinh: Lâm Đồng Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60420201 I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tạo rễ tóc đậu nành (Glycine max L.) vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Nhiệm vụ: Tạo rễ tóc đậu nành cảm ứng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes phục vụ cho nghiên cứu chức gen sinh học vùng rễ đậu nành Nội dung - Xác định số điều kiện thích hợp cho trình lây nhiễm A rhizogenes lên mẫu đậu nành in vitro - Xác định mẫu rễ tóc đậu nành chuyển gen II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 26/2/2018 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 18/6/2018 IV HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN VŨ PHONG Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2018 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO TS NGUYỄN VŨ PHONG PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG TRƯỞNG KHOA GS TS PHAN THANH SƠN NAM iv LỜI CẢM ƠN Chân thành cảm ơn Cô PGS TS Nguyễn Thúy Hương - Chủ nhiệm môn Công nghệ Sinh học, thầy cô giảng viên mơn Cơng nghệ Sinh học, Khoa Kỹ thuật Hóa học, trường Đại học Bách khoa – ĐHQG TP.HCM thời gian qua truyền đạt kiến thức bổ ích cho em Chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Vũ Phong hướng dẫn em trình thực đề tài tốt nghiệp Chân thành cảm ơn cô Tôn Bảo Linh hỗ trợ em việc hoàn thành đề tài nghiên cứu Cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ trẻ tạo điều kiện thời gian cho tơi hồn thành văn thạc sĩ v TÓM TẮT Chuyển gen đậu nành (Glycine max L.) thường thực phương pháp bắn gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Tuy nhiên hiệu việc chuyển gen hai phương pháp phụ thuộc phần lớn vào khả tái sinh thời gian tạo chuyển gen Chuyển gen tạo rễ tóc việc sử dụng Agrobacterium rhizogenes khắc phục hạn chế hỗ trợ đắc lực cho nghiên cứu chức gen vùng rễ Nghiên cứu xác định số điều kiện thích hợp cho việc chuyển gen tạo rễ tóc sử dụng vi khuẩn A rhizogenes đậu nành (Glycine max L.) giống HLĐN29 DT84 Ở hai giống đậu nành sau lây nhiễm với vi khuẩn, mẫu mầm cảm ứng tạo rễ tốt so với mẫu trụ hạ diệp Chủng vi khuẩn ATCC11325 ATCC15834 cho hiệu tạo rễ cao giống đậu nành HLĐN29, tỉ lệ mẫu tạo rễ đạt từ 96% – 100%, với khoảng rễ/mẫu, hình thái rễ tương tự đặc điểm rễ tóc chuyển gen Tương tự, chủng ATCC15834 cho hiệu tạo rễ tốt giống đậu nành DT84 Mẫu sau giai đoạn đồng nuôi cấy loại bỏ khuẩn hiệu với cefotaxime 500 mg/L carbenicillin 400 mg/L trì môi trường bổ sung cefotaxime 500 mg/L Lá mầm đậu nành 6-8 ngày sau gieo cảm ứng tạo rễ tốt Hai cách lây nhiễm trực tiếp đồng nuôi cấy vi khuẩn cho số mẫu tạo rễ số rễ trung bình tương đương hai giống đậu nành thí nghiệm Tỉ lệ mẫu tạo rễ giống DT84 không khác biệt đáng kể sử dụng dịch khuẩn OD600nm từ 0,5 đến 1,3 Trong đó, số rễ trung bình cao (~ rễ/mẫu) sử dụng dịch khuẩn có giá trị OD600nm từ 0,5 đến 1,0 Ba mẫu rễ chuyển gen xác định thông qua phân tích PCR hình thái rễ trì mẫu mơi trường ni khơng bổ sung chất điều hòa tăng trưởng vi ABSTRACT Soybean (Glycine max L.) gene transformation has been performed via particle bombardment and the Agrobacterium tumefaciens system However, the success and efficiency of these methods relies mainly on the ability and time to regenerate transgenic plants In advantage of those traditional transformation methods, transformation using Agrobacterium rhizogenes is an useful tool for functional research on plant root systems This study determines some conditions for soybean (G max L.) transformation via A rhizogenes for hairy root induction on soybean cultivars HLDN29 and DT84 Cotyledonary explants were more efficient in hairy root production in both cultivars HLDN29 and DT84 The highest root induction rate and average root number was observed in HLDN29 explants infected with strain ATCC11325 and ATCC15834 (96% – 100% and roots/explant) and in DT84 explants infected with ATCC15834 Morphology of these roots were similar with description for transgenic roots Bacterial removal after co-culture stage were effective with rinsing the samples in culture media supplemented with 500 mg/L cefotaxime and 400 mg/L carbenicillin before placing them on plates with 500 mg/L cefotaxime Cotyledonary leaves after sowing 6-8 days were optimal for hairy root induction Infection methods (direct inoculation and immersion) showed no significant difference in root induction rate and average root number in both HLDN29 and DT84 There was no difference in root formation rates of soybean DT84 infected with bacterial suspension from OD600nm = 0.5 to 1.3, while the highest average root number (~7 roots/explant) was obtained with the suspension OD600nm = 0.5 to OD600nm = 1.3 Three transgenic root lines were identified based on morphology when sub-culturing on hormone – free media and PCR analysis vii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thực hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Vũ Phong hỗ trợ ThS Tơn Bảo Linh Các số liệu, bảng biểu, hình ảnh kết nghiên cứu nhóm thực đề tài Tác giả Ngô Thị Tú Trinh viii MỤC LỤC Nội dung Trang NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ iii LỜI CẢM ƠN iv TÓM TẮT v ABSTRACT vi LỜI CAM ĐOAN vii MỤC LỤC viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xi DANH MỤC CÁC BẢNG xii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ xiii Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Lý chọn đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài .1 1.2.1 Mục tiêu tổng quát .1 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Đối tượng nghiên cứu 1.4 Nội dung nghiên cứu 1.5 Ý nghĩa đề tài 1.5.1 Ý nghĩa khoa học .2 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn Chương 2: TỔNG QUAN 2.1 Cây đậu nành (Glycine max L.) 2.2 Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 2.2.1 Giới thiệu vi khuẩn A rhizogenes .4 2.2.2 Plasmid Ri A rhizogenes 2.2.3 Các gen rol 2.2.4 Cơ chế chuyển T-DNA từ vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào thực vật 2.2.6 Cơ sở phân tử sinh lý hình thành rễ tóc 10 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình chuyển gen 11 2.3.1 Sự phù hợp kiểu gen thực vật chủng vi khuẩn Agrobacterium 11 ix 2.3.2 Môi trường 11 2.3.3 Mật độ vi khuẩn A rhizogenes lây nhiễm 12 2.4 Lây nhiễm A rhizogenes lên mẫu thực vật 12 2.5 Chuyển gen vi khuẩn A rhizogenes đậu nành 13 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Địa điểm – Thời gian nghiên cứu 17 3.2 Vật liệu nghiên cứu 17 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 3.2.2 Hóa chất môi trường 17 3.3 Phương pháp nghiên cứu 19 3.3.1 Tạo nguồn mẫu đậu nành in vitro chuẩn bị A rhizogenes 19 3.3.1.1 Tạo nguồn mẫu đậu nành 19 3.3.1.2 Chuẩn bị vi khuẩn A rhizogenes 20 3.3.2 Xác định số điều kiện phù hợp lây nhiễm A rhizogenes lên mẫu đậu nành in vitro 22 3.3.2.1 Xác định chủng vi khuẩn A rhizogenes mẫu đậu nành phù hợp cảm ứng tạo rễ tóc 22 3.3.2.2 Xác định hiệu diệt khuẩn A rhizogenes loại kháng sinh 23 3.3.2.3 Ảnh hưởng tuổi mẫu đậu nành đến cảm ứng tạo rễ tóc 24 3.3.2.4 Ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes đến trình cảm ứng tạo rễ tóc mẫu đậu nành 25 3.3.2.5 Xác định mật độ vi khuẩn phù hợp cho trình cảm ứng tạo rễ tóc 25 3.3.3 Duy trì dịng rễ giả định chuyển gen 26 3.3.4 Khẳng định mẫu chuyển gen phương pháp PCR 26 3.3.5 Đánh giá hình thái, tăng trưởng rễ cảm ứng A rhizogenes 27 3.3.6 Phương pháp xử lý thống kê 28 Chương 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 29 4.1 Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm 29 4.1.1 Chuẩn bị mẫu đậu nành in vitro 29 4.1.2 Chuẩn bị vi khuẩn 29 4.2 Xác định chủng A rhizogenes loại mẫu phù hợp với cảm ứng tạo rễ tóc đậu nành 31 4.3 Hiệu diệt khuẩn loại kháng sinh 35 x 4.4 Khả cảm ứng tạo rễ tơ mẫu độ tuổi khác 36 4.5 Hiệu cảm ứng tạo rễ cách thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes 38 4.6 Xác định mật độ A rhizogenes phù hợp cho trình cảm ứng tạo rễ tơ 39 4.7 Duy trì dịng rễ giả định chuyển gen 40 4.8 Xác định mẫu chuyển gen phương pháp PCR 42 4.9 Đánh giá hình thái, tăng trưởng rễ cảm ứng A rhizogenes 43 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 5.1 Kết luận 44 5.2 Đề nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC 51 52 Bảng Số rễ tạo thành giống HLĐN 29 xác định chủng vi khuẩn A rhizogenes mẫu đậu nành phù hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tóc trước xử lý thống kê Lá mầm Loại mẫu Chủng vi khuẩn Trụ hạ diệp Trung bình 3 ATCC 11325 8.95 8.32 7.55 4.00 2.50 3.00 5.72 ATCC 15834 8.70 7.05 8.95 2.75 3.25 4.00 5.78 ICPB TR7 6.05 6.05 4.07 1.29 2.67 3.00 3.85 Đối chứng 4.70 4.74 5.30 3.00 1.50 2.00 3.54 Trung bình 6.79 6.24 6.19 2.80 2.64 3.00 Bảng Bảng ANOVA số rễ tạo thành giống HLĐN 29 xác định chủng vi khuẩn A rhizogenes mẫu đậu nành phù hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tóc A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob A: loại mẫu 93.892 93.892 140.0794** 0.0000 B: chủng vi khuẩn 25.627 8.542 12.7447** 0.0002 AB 6.694 2.231 3.3290* 0.0463 -7 Error 16 10.724 0.670 Total 23 136.937 Coefficient of Variation: 17.33% Bảng Trắc nghiệm phân hạng yếu tố chủng vi khuẩn (B) dựa số rễ tạo thành giống HLĐN 29 Error Mean Square = 0.6700 Error Degrees of Freedom = 16 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 1.952 at alpha = 0.010 Original Order Mean Mean Mean Mean = = = = 5.720 5.780 3.860 3.540 Ranked Order A A AB B Mean Mean Mean Mean = = = = 5.780 5.720 3.860 3.540 A A AB B 53 Bảng Trắc nghiệm phân hạng số rễ tạo thành tương tác hai yếu tố chủng vi khuẩn A rhizogenes mẫu đậu nành phù hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tóc giống HLĐN 29 Error Mean Square = 0.6700 Error Degrees of Freedom = 16 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 1.417 s_ = 0.4726 at alpha = 0.050 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = = 8.270 8.230 5.390 4.910 3.170 3.330 2.320 2.170 A A B B C C C C Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order = = = = = = = = 8.270 8.230 5.390 4.910 3.330 3.170 2.320 2.170 A A B B C C C C Bảng Tỉ lệ mẫu rễ tương tác hai yếu tố chủng vi khuẩn A rhizogenes mẫu đậu nành phù hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tóc giống HLĐN 29 trước chuyển đổi Lá mầm Trụ hạ diệp Chủng vi khuẩn Trung Loại mẫu tb bình ATCC 11325 95 95 100 96.67 10.00 20.00 30.00 20.00 ATCC 15834 100 100 100 100.00 40.00 40.00 40.00 40.00 ICPB TR7 100 100 75 91.67 70.00 60.00 50.00 60.00 Đối chứng 100 95 100 98.33 10.00 40.00 20.00 23.33 Bảng Tỉ lệ mẫu rễ tương tác hai yếu tố chủng vi khuẩn A rhizogenes mẫu đậu nành phù hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tóc giống HLĐN 29 sau chuyển đổi Lá mầm Trụ hạ diệp Chủng vi khuẩn Loại mẫu TB TB ATCC 11325 77.08 77.08 89.36 81.17 18.43 26.57 33.21 26.07 ATCC 15834 89.36 89.36 89.36 89.36 39.23 39.23 39.23 39.23 ICPB TR7 89.36 89.36 60.00 79.57 56.79 50.77 45.00 50.85 Đối chứng 89.36 77.08 89.36 85.27 18.43 39.23 26.57 28.08 54 Bảng Bảng ANOVA tỉ lệ mẫu rễ tương tác hai yếu tố chủng vi khuẩn A rhizogenes mẫu đậu nành phù hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tóc giống HLĐN 29 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob A: loại mẫu 13700.916 13700.916 186.6333** 0.0000 B: chủng vi khuẩn 584.262 194.754 2.6529ns 0.0839 AB 766.478 255.493 3.4803* 0.0407 -7 Error 16 1174.574 73.411 -Total 23 16226.230 -Coefficient of Variation: 14.29% Bảng 10 Số rễ tạo thành giống DT84 xác định chủng vi khuẩn A rhizogenes mẫu đậu nành phù hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tóc trước xử lý thống kê Loại mẫu Lá mầm Trụ hạ diệp Chủng vi khuẩn 3 ATCC 11325 4.20 4.65 4.95 1.60 1.10 2.00 ATCC 15834 6.35 6.40 6.20 2.2 2.00 1.70 ICPB TR7 5.30 4.40 4.40 0.70 0.70 0.40 Đối chứng 4.80 5.40 5.40 1.80 1.70 1.70 Bảng 11 Bảng ANOVA số rễ trung bình giống DT84 xác định chủng vi khuẩn A rhizogenes mẫu đậu nành phù hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tóc A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob -2 A: Loại mẫu 83.813 83.813 795.0681** 0.0000 B: chủng vi khuẩn 7.204 2.401 22.7783** 0.0000 AB 1.614 0.538 5.1024* 0.0115 -7 Error 16 1.687 0.105 -Total 23 94.317 -Coefficient of Variation: 9.73% 55 Bảng 12 Trắc nghiệm phân hạng yếu tố B chủng vi khuẩn dựa số rễ tạo thành giống DT84 Error Mean Square = 0.1050 Error Degrees of Freedom = 16 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 0.7728 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean Mean = = = = 3.080 4.140 2.650 3.470 BC A C AB Mean Mean Mean Mean = = = = 4.140 3.470 3.080 2.650 A AB BC C Bảng 13 Trắc nghiệm phân hạng số rễ tạo thành tương tác hai yếu tố chủng vi khuẩn A rhizogenes mẫu đậu nành phù hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tóc giống DT84 Error Mean Square = 0.1050 Error Degrees of Freedom = 16 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.5609 s_ = 0.1871 at alpha = 0.050 Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = = 4.600 6.320 4.700 5.200 1.570 1.970 0.6000 1.730 Ranked Order C Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean A BC B D D E D = = = = = = = = 6.320 5.200 4.700 4.600 1.970 1.730 1.570 0.6000 A B BC C D D D E Bảng 14 Tỉ lệ mẫu rễ tương tác hai yếu tố chủng vi khuẩn A rhizogenes mẫu đậu nành phù hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tóc giống DT84 trước chuyển đổi Lá mầm Trụ hạ diệp Chủng vi khuẩn 3 ATCC 11325 90 85 95 20 30 10 ATCC 15834 95 100 100 30 40 50 ICPB TR7 100 90 95 30 20 20 Đối chứng 70 80 90 10 20 10 56 Bảng 15 Tỉ lệ mẫu rễ tương tác hai yếu tố chủng vi khuẩn A rhizogenes mẫu đậu nành phù hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tóc giống DT84 sau chuyển đổi Loại mẫu Lá mầm Chủng vi khuẩn Trụ hạ diệp 3 ATCC 11325 71.57 67.21 77.08 26.57 33.21 18.43 ATCC 15834 77.08 89.36 89.36 33.21 39.23 45.00 ICPB TR7 89.36 71.57 77.08 33.21 26.57 26.57 Đối chứng 56.79 63.43 71.57 18.43 26.57 18.43 Bảng 16 Bảng ANOVA Tỉ lệ mẫu rễ tương tác hai yếu tố chủng vi khuẩn A rhizogenes mẫu đậu nành phù hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tóc giống DT84 sau chuyển đổi A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob -2 A: Loại mẫu 12882.057 12882.057 304.1723** 0.0000 B: chủng vi khuẩn 1241.375 413.792 9.7705** 0.0007 AB 45.953 15.318 0.3617 ns -7 Error 16 677.619 42.351 -Total 23 14847.004 - Bảng 17 Bảng ANOVA Tỉ lệ mẫu rễ tương tác hai yếu tố chủng vi khuẩn A rhizogenes mẫu đậu nành phù hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tóc giống DT84 sau chuyển đổi Coefficient of Variation: 12.53% Error Mean Square = 42.35 Error Degrees of Freedom = 16 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 15.52 s_ = 3.757 at alpha = 0.010 x Original Order Mean Mean Mean Mean = = = = 49.01 62.21 54.06 42.54 Ranked Order AB A AB B Mean Mean Mean Mean = = = = 62.21 54.06 49.01 42.54 A AB AB B 57 Bảng 18 Số liệu dùng xử lý thống kê nhằm xác định ảnh hưởng tuổi mẫu đậu nành đến khả cảm ứng tạo rễ tơ giống HLĐN 29 Số rễ Tỉ lệ mẫu rễ Nghiệm thức Ngày tuổi Tb Tb 4.25 5.15 6.55 5.32 100 100 100 100.00 5.50 7.06 4.39 5.65 100 90 90 93.33 5.42 7.00 7.69 6.70 95 100 80 91.67 6.83 7.94 10.39 8.39 90 90 90 90.00 10 5.67 5.41 90 85 90 88.33 6.72 5.93 Bảng 19 Số liệu sau chuyển đổi tỉ lệ tạo rễ xác định ảnh hưởng tuổi mẫu đậu nành đến khả cảm ứng tạo rễ tơ giống HLĐN 29 Tỉ lệ mẫu rễ Nghiệm thức Ngày tuổi 10.00 10.00 10.00 10.00 9.49 9.49 9.75 10.00 8.94 9.49 9.49 9.49 10 9.49 9.22 9.49 Bảng 20 Bảng ANOVA số rễ tạo thành giống đậu HLĐN 29 xác định ảnh hưởng tuổi mẫu đậu nành đến khả cảm ứng tạo rễ tơ A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Source Freedom Squares Mean Square F-value Prob -lll 6.61 3.305 2.65 0.1310 nt 17.98 4.495 3.60ns 0.0580 Error 9.98 1.248 Non-additivity 2.33 2.331 2.13 0.1875 Residual 7.65 1.093 -Total 14 34,57 -Grand Mean= 6.398 Grand Sum= 95.970 Total Count= 15 Coefficient of Variation= 17.46% 58 Bảng 21 Bảng ANOVA tỉ lệ tạo rễ giống HLĐN 29 xác định ảnh hưởng tuổi mẫu đậu nành đến khả cảm ứng tạo rễ tơ A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Source Freedom Squares Mean Square F-value Prob -lll 0.18 0.088 1.07 0.3873 nt 0.64 0.161 1.95ns 0.1953 Error 0.66 0.082 Non-additivity 0.00 0.002 0.02 Residual 0.66 0.094 -Total 14 1.48 -Grand Mean= 9.623 Grand Sum= 144.340 Total Count= 15 Coefficient of Variation= 2.98% Bảng 22 Số liệu dùng xử lý thống kê nhằm xác định ảnh hưởng tuổi mẫu đậu nành đến khả cảm ứng tạo rễ tơ giống DT84 Nghiệm Ngày thức tuổi Số rễ Tỉ lệ mẫu rễ Tb Tb 2.50 2.33 5.15 3.33 90 90 100 93.33 3.68 3.55 7.06 4.76 95 100 90 95.00 5.44 5.32 7.00 5.92 80 95 100 91.67 8.83 8.21 7.94 8.33 90 95 90 91.67 10 5.56 5.22 5.41 5.40 90 90 85 88.33 Bảng 23 Bảng ANOVA số rễ tạo thành nhằm xác định ảnh hưởng tuổi mẫu đậu nành đến khả cảm ứng tạo rễ tơ giống DT84 A N A L Y S I S Degrees of Freedom O F Sum of Squares V A R I A N C E T A B L E Mean Square F-value Prob -Between Within 40.297 10.074 10 15.153 1.515 6.648** 0.0071 -Total 14 55.450 59 Bảng 24 Trắc nghiệm phân hạng số rễ tạo thành nhằm xác định ảnh hưởng tuổi mẫu đậu nành đến khả cảm ứng tạo rễ tơ giống DT84 Coefficient of Variation = 22.19% Error Mean Square = 1.515 Error Degrees of Freedom = 10 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 3.185 at alpha = 0.010 _ Original Order Ranked Order Mean = 3.330 B Mean = 8.330 Mean = 4.760 B Mean = 5.920 Mean = 5.920 AB Mean = 5.400 Mean = 8.330 A Mean = 4.760 Mean = 5.400 AB Mean = 3.330 A AB AB B B Bảng 25 Tỉ lệ rễ tạo thành ngày tuổi khác mẫu đậu nành DT84 sau chuyển đổi Tỉ lệ mẫu rễ Nghiệm Ngày thức tuổi 1 Tb 9.49 9.49 10.00 9.66 9.75 10.00 9.49 9.74 8.94 9.75 10.00 9.56 9.49 9.75 9.49 9.57 10 9.49 9.49 9.22 9.40 Bảng 26 Bảng ANOVA tỉ lệ rễ tạo thành nhằm xác định ảnh hưởng tuổi mẫu đậu nành đến khả cảm ứng tạo rễ tơ giống DT84 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 0.199 0.050 0.493ns Within 10 1.011 0.101 Total 14 1.210 Coefficient of Variation = 3.32% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE 3.00 28.980 9.660 0.29 0.18 3.00 29.240 9.747 0.26 0.18 3.00 28.690 9.563 0.55 0.18 3.00 28.730 9.577 0.15 0.18 3.00 28.200 9.400 0.16 0.18 Total 15.00 143.840 9.589 0.29 0.08 Within 0.32 60 Bảng 27 Số liệu thơ thí nghiệm ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes đến trình cảm ứng tạo rễ tóc mẫu đậu nành HLĐN 29 Số rễ Tỉ lệ mẫu tạo rễ Cách lây nhiễm 3 Trực tiếp DC1 Đồng lây nhiễm DC2 7.05 4.07 5.71 3.93 9.50 3.15 6.40 4.17 9.68 4.13 7.94 4.35 100 70 85 70 100 65 100 60 95 75 90 85 Bảng 28 Bảng ANOVA số rễ tạo thành ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes đến q trình cảm ứng tạo rễ tóc mẫu đậu nành HLĐN 29 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Source Freedom Squares Mean Square F-value Prob lll 3.57 1.786 2.65 0.1498 nt 48.68 16.227 24.07** 0.0010 Error 4.04 0.674 Non-additivity 2.18 2.185 5.87 0.0598 Residual 1.86 0.372 Total 11 56.30 Grand Mean= 5.840 Grand Sum= 70.080 Total Count= 12 Coefficient of Variation= 14.06% Bảng 29 Trắc nghiệm phân hạng số rễ tạo thành ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes đến trình cảm ứng tạo rễ tóc mẫu đậu nành HLĐN 29 Error Mean Square = 0.6740 Error Degrees of Freedom = No, of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 2.485 s_ = 0.4740 at alpha = 0.010 x Original Order Ranked Order Mean Mean Mean Mean = = = = 8.743 3.783 6.683 4.150 A B A B Mean Mean Mean Mean = = = = 8.743 6.683 4.150 3.783 A A B B 61 Bảng 30 Số liệu sau chuyển đổi tỉ lệ tạo rễ nhằm xác định ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes đến trình cảm ứng tạo rễ tóc mẫu đậu nành HLĐN 29 Tỉ lệ mẫu tạo rễ Cách lây nhiễm Trung bình Trực tiếp 89.36 89.36 77.08 85.27 DC1 56.79 53.73 60.00 56.84 Đồng lây nhiễm 67.21 89.36 71.57 76.05 DC2 56.79 50.77 67.21 58.26 Bảng 31 Bảng ANOVA tỉ lệ tạo rễ xác định ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes đến q trình cảm ứng tạo rễ tóc mẫu đậu nành HLĐN 29 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Source Freedom Squares Mean Square F-value Prob lll 21.47 10.733 0.13 0.8842 nt 1732.51 577.503 6.76* 0.0237 Error 512.46 85.410 Non-additivity 74.65 74.648 0.85 Residual 437.81 87.563 Total 11 2266.44 - Grand Mean= 69.103 Grand Sum= Coefficient of Variation= 13.37% 829.230 Total Count= 12 Bảng 32 Trắc nghiệm phân hạng tỉ lệ tạo rễ xác định ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes đến trình cảm ứng tạo rễ tóc mẫu đậu nành HLĐN 29 Error Mean Square = 85.41 Error Degrees of Freedom = No, of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 18.46 s_ = 5.336 at alpha = 0.050 x Original Order Ranked Order Mean Mean Mean Mean = = = = 85.27 56.84 76.05 58.26 A C AB BC Mean Mean Mean Mean = = = = 85.27 76.05 58.26 56.84 A AB BC C 62 Bảng 33 Số liệu thô tỉ lệ rễ nhằm xác định ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes đến trình cảm ứng tạo rễ tóc mẫu đậu nành DT84 Số rễ Tỉ lệ rễ NT Cách lây nhiễm L1 L2 L3 L1 L2 L3 Trực tiếp 7.15 6.95 7.11 100 95 90 DC1 5.31 5.27 5.25 80 75 80 Đồng lây nhiễm 7.06 7.15 7.56 85 100 90 DC2 4.71 4.33 4.59 70 75 85 Bảng 34 Bảng ANOVA số rễ tạo thành ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes đến q trình cảm ứng tạo rễ tóc mẫu đậu nành DT84 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 16.091 5.364 177.463** 0.0000 Within 0.242 0.030 Total 11 16.333 Coefficient of Variation = 2.88% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE 3.00 21.210 7.070 0.11 0.10 3.00 15.830 5.277 0.03 0.10 3.00 21.770 7.257 0.27 0.10 3.00 13.630 4.543 0.19 0.10 Total 12.00 72.440 6.037 1.22 0.35 Within 0.17 Bảng 35 Trắc nghiệm phân hạng số rễ tạo thành ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes đến q trình cảm ứng tạo rễ tóc mẫu đậu nành DT84 Error Mean Square = 0.03000 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.4745 s_ = 0.1000 at alpha = 0.010 x _ Original Order Mean Mean Mean Mean = = = = 7.070 5.277 7.257 4.543 A B A C Mean Mean Mean Mean Ranked Order = = = = 7.257 7.070 5.277 4.543 A A B C 63 Bảng 36 Trắc nghiệm phân hạng số rễ tạo thành ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes đến q trình cảm ứng tạo rễ tóc mẫu đậu nành DT84 Error Mean Square = 0.03000 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.4745 s_ = 0.1000 at alpha = 0.010 x _ Original Order Mean = 7.070 A Mean Mean = 5.277 B Mean Mean = 7.257 A Mean Mean = 4.543 C Mean Ranked Order = 7.257 = 7.070 = 5.277 = 4.543 A A B C Bảng 37 Số liệu chuyển đổi tỉ lệ tạo rễ trước xử lý thống kê ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes đến q trình cảm ứng tạo rễ tóc mẫu đậu nành DT84 Tỉ lệ rễ chuyển đổi NT Cách lây nhiễm L1 L2 L3 Cắt 10.00 9.75 9.49 ĐC1 8.94 8.66 8.94 Ngâm 9.22 10.00 9.49 ĐC2 8.37 8.66 9.22 Bảng 38 Bảng ANOVA tỉ lệ tạo rễ ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes đến trình cảm ứng tạo rễ tóc mẫu đậu nành DT84 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 2.280 0.760 6.991* 0.0126 Within 0.870 0.109 Total 11 3.149 Coefficient of Variation = 3.57% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE 3.00 29.240 9.747 0.26 0.19 3.00 26.540 8.847 0.16 0.19 3.00 28.710 9.570 0.40 0.19 3.00 26.250 8.750 0.43 0.19 Total 12.00 110.740 9.228 0.54 0.15 Within 0.33 64 Bảng 39 Trắc nghiệm phân hạng tỉ lệ tạo rễ ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes đến q trình cảm ứng tạo rễ tóc mẫu đậu nành DT84 Error Mean Square = 0.1090 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.6216 s_ = 0.1906 at alpha = 0.050 x Original Order Mean Mean Mean Mean = = = = 9.747 8.847 9.570 8.750 Ranked Order A B A B Mean Mean Mean Mean = = = = 9.747 9.570 8.847 8.750 A A B B Bảng 40 Số liệu thô xác định mật độ A rhizogenes phù hợp cho trình cảm ứng tạo rễ tơ giống DT84 Số rễ TB Tỉ lệ tạo rễ Nồng độ vi khuẩn (OD600) L1 L2 L3 L1 L2 L3 0.2 6.43 6.29 5.88 70 70 80 0.5 6.89 7.40 7.90 90 100 100 0.7 7.44 6.7 7.2 90 100 100 7.8 7.5 6.6 100 100 100 1.5 6.78 5.89 90 80 90 Bảng 41 Bảng ANOVA số rễ tạo thành xác định mật độ A rhizogenes phù hợp cho trình cảm ứng tạo rễ tơ giống DT84 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 4.158 1.039 4.704* 0.0215 Within 10 2.209 0.221 Total 14 6.367 Coefficient of Variation = 6.87% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE 3.00 18.600 6.200 0.29 0.27 3.00 22.190 7.397 0.51 0.27 3.00 21.340 7.113 0.38 0.27 3.00 21.900 7.300 0.62 0.27 3.00 18.670 6.223 0.49 0.27 Total 15.00 102.700 6.847 0.67 0.17 Within 0.47 65 Bảng 42 Trắc nghiệm phân hạng số rễ tạo thành xác định mật độ A rhizogenes phù hợp cho trình cảm ứng tạo rễ tơ giống DT84 Error Mean Square = 0.2210 Error Degrees of Freedom = 10 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 0.8552 at alpha = 0.050 _ Original Order Ranked Order Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = 6.200 7.400 7.110 7.300 6.220 B A A A B Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = 7.400 7.300 7.110 6.220 6.200 A A A B B Bảng 43 Số liệu tỉ lệ tạo rễ chuyển đổi trước xử lý thống kê xác định mật độ A rhizogenes phù hợp cho trình cảm ứng tạo rễ tơ giống DT84 Tỉ lệ tạo rễ Nồng độ vi khuẩn (OD600) L1 L2 L3 0.2 8.37 8.37 8.94 0.5 9.49 10.00 10.00 0.7 9.49 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 1.5 9.49 8.94 9.49 Bảng 44 Bảng AVOVA số liệu tỉ lệ tạo rễ xác định mật độ A rhizogenes phù hợp cho trình cảm ứng tạo rễ tơ giống DT84 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 4.166 1.041 13.613** 0.0005 Within 10 0.765 0.077 Total 14 4.931 Coefficient of Variation = 2.91% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 25.680 8.560 0.33 0.16 3.00 29.490 9.830 0.29 0.16 3.00 29.490 9.830 0.29 0.16 3.00 30.000 10.000 0.00 0.16 3.00 27.920 9.307 0.32 0.16 -Total 15.00 142.580 9.505 0.59 0.15 Within 0.28 66 Bảng 45 Trắc nghiệm phân hạng tỉ lệ tạo rễ xác định mật độ A rhizogenes phù hợp cho trình cảm ứng tạo rễ tơ giống DT84 Error Mean Square = 0.07700 Error Degrees of Freedom = 10 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 0.7181 at alpha = 0.010 _ Original Order Ranked Order Mean = 8.560 B Mean = 10.00 Mean = 9.830 A Mean = 9.830 Mean = 9.830 A Mean = 9.830 Mean = 10.00 A Mean = 9.310 Mean = 9.310 A Mean = 8.560 A A A A B ... TÀI: Nghiên cứu tạo rễ tóc đậu nành (Glycine max L. ) vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Nhiệm vụ: Tạo rễ tóc đậu nành cảm ứng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes phục vụ cho nghiên. .. nghiên cứu tạo rễ tóc từ mẫu đậu nành in vitro hạn chế Do đó, nghiên cứu giúp thiết l? ??p qui trình tạo rễ tóc đối tượng đậu nành in vitro, l? ?m sở cho nghiên cứu chức gen sinh học vùng rễ đậu nành. .. 2.1 Cây đậu nành (Glycine max L. ) Đậu nành hay đậu tương (Glycine max L. ) trồng quan trọng số loại họ đậu (Fabaceae) Đậu nành có hàm l? ?ợng protein cao dùng chế biến thực phẩm cho người gia súc Đậu