Nghiên cứu thu nhận hoạt chất sinh học chito oligosaccharit (COS)

Luận văn thạc sỹ khoa học MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .9 1.1 Chitin chitosan 1.1.1 Chitin 1.1.2 Chitosan 12 1.2 Chitosan oligosaccharit (COS) 15 1.2.1 Hoạt tính sinh học Chitosan oligosaccharit 15 1.2.1.1 Hoạt tính kháng khuẩn 16 1.2.1.2 Hoạt tính kháng u bướu 17 1.2.1.3 Hoạt tính chống oxi hóa .18 1.2.1.4 Hoạt tính giảm béo .19 1.2.1.5 Các hoạt tính khác COS 19 1.2.2 Các phương pháp thu nhận COS 20 1.2.2.1 Phương pháp vật lý 21 1.2.2.2 Phương pháp hóa học 21 1.2.2.3 Phương pháp sinh học 21 1.3 Các enzym có khả thủy phân chitosan .22 1.3.1 Chitosanase 22 1.3.2 Cellulase .24 1.3.3 Các enzym khác 28 1.4 Một số quy trình thu nhận COS Việt Nam giới .28 1.4.1 Việt Nam .28 1.4.2 Thế giới .29 1.4.2.1 Phương pháp gián đoạn 29 1.4.2.2 Phương pháp cố định enzym 30 1.4.2.3 Phương pháp sử dụng màng siêu lọc .31 1.4.2.4 Phương pháp sản xuất COS liên tục sử dụng hệ thống bể đôi .31 1.4.3 Các sản phẩm có chứa COS có thị trường 33 Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Vật liệu thiết bị .35 2.1.1 Vật liệu 35 2.1.2 Thiết bị 36 2.2 Phương pháp nghiên cứu 36 2.2.1 Xác định hàm lượng đường khử tạo thành 36 2.2.2 Xác định hoạt độ Chitosanase 37 2.2.3 Xác định protein tổng số theo phương pháp Bradford 37 2.2.4 Phương pháp kiểm tra hiệu suất thủy phân 39 2.2.5 Phương pháp sắc ký mỏng .39 2.2.6 Phương pháp thu hồi COS từ dịch thủy phân .40 2.2.6.1 Thu hồi COS theo phương pháp kết tủa cồn etylic .40 2.2.6.2 Thu nhận sản phẩm COS phương pháp sấy 40 2.2.7 Các phương pháp xác định đặc tính sản phẩm .42 2.2.7.1 Xác định độ ẩm sản phẩm .42 2.2.7.2 Xác định phân tử lượng trung bình sản phẩm 43 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .44 3.1 Lựa chọn chế phẩm enzym thương mại cho trình thủy phân chitosan .44 3.1.1 Xác định hoạt độ chitosanase chế phẩm enzym 44 3.1.2 Xác định khả thủy phân chitosan chế phẩm enzym 45 3.2 Khảo sát đặc tính chế phẩm Celluclast 1.5L .49 3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân chitosan chế phẩm Celluclast 1.5L 50 3.3.1 Ảnh hưởng pH 50 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 52 3.3.3 Ảnh hưởng nồng độ chất 54 3.3.4 Ảnh hưởng điều kiện khuấy 57 3.3.5 Tối ưu thủy phân chitosan điều kiện có khuấy trộn 59 3.4 Xây dựng quy trình thu nhận COS từ chitosan sử dụng enzym Celluclast 1.5L 60 3.5 Xác định kích thước sản phẩm 64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC .76 Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Da Dalton GlcN N-glucozamine GlcNAc N-acetylglucozamine kDa kilo dalton TLC Thin Layer Chromatography DNS Dinitro Salicylic COS Chitosan-oligosaccharit DPPH 1,1-diphenylpicryl-2-hydrazyl Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Bảng 1.1 Tên bảng Khả ức chế COS lên vi sinh vật Trang 16 Ảnh hưởng COS đến khả phát triển khối u chuột Đặc tính Cellulase thu từ nguồn khác dùng để thủy phân chitosan Các sản phẩm COS có bán thị trường tác dụng chúng 27 Bảng 2.1 Các vật liệu sử dụng trình nghiên cứu 35 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trình nghiên cứu 36 Bảng 3.1 So sánh hiệu suất thủy phân 47 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ chất tỷ lệ E/S đến trình thủy phân 56 Bảng 3.3 Đặc tính sản phẩm COS sau sấy 63 Bảng 1.2 Bảng 1.3 Bảng 1.4 Nguyễn Thị Tuyết Mai 18 33 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Cấu tạo phân tử chitin Hình 1.2 Dạng cấu hình chitin 10 Hình 1.3 Công thức cấu tạo chitin 11 Hình 1.4 Công thức cấu tạo chitosan 13 Hình 1.5 Cơ chế xúc tác chitosanase lên chất chitosan 24 Hình 1.6 Cấu tạo phân tử Cellulose, chitin, chitosan 25 Hình 1.7 Hệ thống bể thủy phân chitosan thu COS sử dụng enzym 30 Hình 1.8 Hệ thống thủy phân chitosan sử dụng enzym cố định 31 Hình 1.9 Hệ thống hai bể phản ứng sản xuất COS theo PP liên tục 32 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 So sánh hoạt độ chitosanase enzym Celluclast, pepsin, papain So sánh khả thủy phân enzym Celluclast, pepsin, papain Phân tích phổ sản phẩm sau thủy phân enzym Celluclast, pepsin, papain 44 46 48 Hình 3.4 Độ bền nhiệt hoạt tính chitosannase Celluclast 49 Hình 3.5 Độ bền nhiệt hoạt tính chitosannase Celluclast 50 Hình 3.6 Ảnh hưởng pH đến hàm lượng đường khử 51 Hình 3.7 Ảnh hưởng pH đến phổ sản phẩm thu 52 Hình 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ đến nồng độ đường khử 53 Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Hình 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phổ sản phẩm thu 54 Hình 3.10 Ảnh hưởng nồng độ chất tỷ lệ E/S 55 Hình 3.11 Ảnh hưởng thời gian thủy phân đến phổ sản phẩm 57 Hình 3.12 Ảnh hưởng điều kiện khuấy đến hiệu suất thủy phân 58 Hình 3.13 Ảnh hưởng thời gian thủy phân đến phổ sản phẩm 59 Hình 3.14 Ảnh hưởng nồng độ chất, tỷ lệ E/S đến hiệu suất 60 Hình 3.15 Quy trình thu nhận COS từ chitosan sử dụng Celluclast 61 Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học LỜI MỞ ĐẦU Chitosan chấp nhận thực phẩm giảm béo Châu Âu 20 năm Tuy nhiên chitosan chitin có số nhược điểm enzym phân hủy chúng ruột, độ nhớt cao nên không hấp thụ thể pH trung tính, sản phẩm thủy phân chúng chito-oligosaccharit COS ý đến sản phẩm thay chitosan chitin Các sản phẩm thương mại hóa thị trường chủ yếu tên chitosan oligosaccharit (COS) sản phẩm thủy phân chitosan Khác với chitosan, sản phẩm thủy phân COS dễ dàng tan nước làm tăng khả ứng dụng chúng so với chitosan chitin Nhiều nghiên cứu gần cho thấy COS có hoạt tính sinh học cao ứng dụng nông nghiệp để kháng nấm, kháng vi khuẩn, kháng ung thư, tăng cường miễn dịch Ngoài ra, COS ứng dụng nhiều công nghệ nano chất vận chuyển gen liệu pháp trị liệu gen, công nghệ trị bệnh đại Trong thực phẩm COS thức ăn lượng hấp thụ chất béo dùng để chữa béo Nếu chitosan vào dày ruột, COS tới ruột kết bị phân huỷ enzym vận chuyển tới khắp thể COS có tác dụng làm giảm lượng đường máu, tăng khả hấp thụ canxi, hạ lượng axit uric máu Ngoài hoạt tính sinh học, chitooligosaccharide trở nên hấp dẫn chúng dễ bị phân huỷ sinh học không tích luỹ làm ô nhiễm môi trường Do đặc tính ưu việt vậy, sản xuất COS quan tâm Chúng đứng danh sách 100 sản phẩm quan tâm (theo tạp chí Ingredients times, 2/2007) Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Nguồn nguyên liệu chitosan có nguồn gốc từ vỏ loài giáp xác loại nguyên liệu phổ biến nước ta từ trước đến chưa tận dụng nhiều Nếu thành công việc nghiên cứu quy trình thủy phân chitosan sử dụng chế phẩm enzym thương mại để tạo chito-oligosaccharit đem lại hiệu kinh tế cao Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu thu nhận hoạt chất sinh học chito-oligosaccharit (COS) sử dụng chế phẩm enzym” Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chitin chitosan 1.1.1 Chitin Chitin polymer hữu phổ biến thứ hai tự nhiên sau cellulose, tạo trung bình 20g/năm/m2 bề mặt trái đất Trong tự nhiên chitin tồn động vật thực vật [59, 69] Trong giới động vật, chitin thành phần cấu trúc quan trọng vỏ số động vật không xương sống như: Côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác giun tròn Trong giới thực vật chitin có thành tế bào nấm Zygemycethers số tảo Chlorophiceae Trong động vật thủy sản đặc biệt vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực, hàm lượng chitin cao từ 14 - 35% so với trọng lượng khô Vì vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực nguồn nguyên liệu để sản xuất chitin-chitosan dẫn xuất chúng Hình 1.1 Chitin vỏ tôm Chitin polysaccharite có đạm không độc hại, có khối lượng phân tử lớn Cấu trúc chitin tập hợp phân tử liên kết với cầu nối glucozit hình thành mạng sợi có tổ chức Hơn chitin tồn trạng thái tự Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học 10 luôn nối với cầu nối đẳng trị với protein, CaCO3 hợp chất hữu khác Chitin có cấu trúc tinh thể chặt chẽ đặn Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X Người ta chứng minh chitin tồn ba dạng cấu hình :α, β, γ - chitin [22] Các dạng chitin xếp khác hướng mắt xích (N-acetyl-D-glucozamin) mạch Có thể biểu diễn mắt xích mũi tên cho phần đầu mũi tên nhóm –CH2OH, phần đuôi nhóm – NHCOCH3, cấu trúc α, β, γ- chitin mô tả sau: Hình 1.2 Dạng cấu hình :α, β, γ - chitin α - chitin có cấu trúc mạch xếp ngược chiều đặn, nên liên kết hydro lớp hệ chuỗi, có liên kết hydro lớp chuỗi thuộc lớp kề nên bền vững Do mắt xích xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi mặt không gian lượng Đây dạng phổ biến tự nhiên β, γ - chitin mắt xích ghép với theo kiểu song song (β - chitin) hai song song ngược chiều (γ - chitin), lớp loại liên kết hydro Dạng β - chitin chuyển sang dạng α - chitin nhờ trình acetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 66 Luận văn thạc sỹ khoa học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thị Huệ, Bùi Thị Huyền, (2005), Nghiên cứu phản ứng thuỷ phân chitosan axit hữu cơ, Tuyển tập công trình hội nghị khoa học công nghệ hoá hữu toàn quốc lần thứ 3, tr 210-221 Bùi Phước Phúc, Nguyễn Triệu, Đặng Văn Phú, Nguyễn Quốc Hiến, Nguyễn Ngọc Duy, Hà Thúc Huy, (2006), Nghiên cứu chế tạo oligochitosan phương pháp chiếu xạ dung dịch chitosan, Hóa học ứng dụng, 9, tr 38-41 PGS, TS Đặng Thị Thu, PGS Lê Ngọc Tú, TS Tô Kim Anh, TS Nguyễn Xuân Sâm (2004) Công nghệ enzym Nhà xuất khoa học kỹ thuật PGS, TS Đặng Thị Thu, TS.Nguyễn Thị Xuân Sâm, TS.Tô Kim Anh (2002) Thí nghiệm hoá sinh công nghiệp Lưu Thị Lệ Thủy, Trần Thị Tuyết (2004) Nghiên cứu tận dụng chế phẩm nguyên liệu thủy sản (vỏ tôm,cua,…) để chiết rút chitin-chitosan sử dụng công nghiệp Báo cáo đề tài Phân Viện công nghiệp thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh trang 11-16 Tiếng Anh Bough, W.A (1976) Chitosan-A polymer from seafood waste, for use in treatment of food processing wastes and activated sludge Proc Biochem, pp 11-13 Chae S Y., Jang M.K and Nah J.W (2005) Influence of molecular weight on oral absorption of water soluble chitosans Journal of Controlled Release 102, pp 383-394 Chen Y.M., Chung Y.C., Wang L W., Chen K.T and Li S.Y (2002) Antibacterial of chitosan in waterborne phathogen Journal of Environmental Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học 67 Science and Health, Part A: Toxic/Hazardous Substances and Environmental Engineering 37, pp 1379 - 1390 Chen X., Xia, W., and Yu X (2005) Purification and characterization of two types of chitosanase from Aspergillus sp CJ22-326 Food Research International 38, pp 315-322 10 Chiang M.T., Yao H.T and Chen H.C (2000) Effect of Dietary Chitosans with Different Viscosity on Plasma Lipids and Lipid Peroxidation in Rats Fed on A Diet Enriched with Cholesterol Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 64, pp 965-971 11 Choi B.K., Kim K.Y., Yoo Y.J., Oh S.J., Choi J.H and Kim C.Y (2001) In vitro antimicrobial activity of a chitooligosaccharide mixture against Actinobacillus actinomycetemcomitans and Streptococcus mutans International journal of antimicrobial agents 18, pp 553-557 12 ChoongSoo Yun, Daiki Amakata, Yasuhiro Matsuo, Hideyuki Matsuda, and Makoto Kawamukai (2005) New Chitosan-Degrading Strains That Produce Chitosanase Similar to ChoA of Mitsuaria chitosanitabida Applied and Enviromental microbiology, pp 5138-5144 13 Chui-Liang Chiang, Chen- Tien Chang, Hsien- Yi Sung (2003) Purification and properties of chitosanase from a mutant of Bacillus subtilisIMR-NK Enzym and Microbial Technology 32, pp 260-267 14 Duff, S.J.B and Murray, W.D (1996) Bioconversion of forest products industry waste cellulosics to fuel ethanol: a review Bioresour Technol 55, pp 1-33 15 Farooqahamed S Kittur, Acharya B Vishu Kumar, Rudrapatnam N Tharanathan (2003) Low molecular weight chitosans – preparation by Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 68 Luận văn thạc sỹ khoa học depolymerization with Aspergillus niger pectinase, and characterization Carbonhydrate Research 338, pp 1283-1290 16 Fernandes J C., Tavaria F K., Soares J C., Ramos Ó S., João Monteiro M., Pintado M E and Xavier Malcata F (2008) Antimicrobial effects of chitosans and chitooligosaccharides, upon Staphylococcus aureus and Escherichia coli, in food model systems Food Microbiology 25, pp.922-928 17 Hasegawa M., Isogai A and Onabe F (1993) Preparation of low-molecularweight chitosan using phosphoric axit Carbohydrate Polymers 20, pp.279-283 18 Hasegawa M., Isogai A and Onabe F.(1993) Preparation of low-molecularweight chitosan using phosphoric axit Carbohydrate Polymers 20, pp.279-283 19 Helander I M., Nurmiaho-Lassila E L., Ahvenainen R., Rhoades J and Roller S (2001) Chitosan disrupts the barrier properties of the outer membrane of Gram-negative bacteria International Journal of Food Microbiology 71, pp 235-244 20 Horowitz, S T., Roseman, S., Blumenthal, H J (1957) The preparation of glucozamine oligosaccharides, Separation Journal of the American Chemical Society 79, pp 5046-5049 21 Ike M., Ko Y., Yokoyama K., Sumitani J.I., Kawaguchi T., Ogasawara W., Okada H and Morikawa Y (2007) Cellobiohydrolase I (Cel7A) from Trichoderma reesei has chitosanase activity Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 47, pp 159-163 22 Inmaculada Aranaz, Marian Mengibar, Ruth Harris, Beatriz Miralles (2009) Functional characterization of chitin and chitosan Current Chemical Biology 3, pp 203-230 Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 69 Luận văn thạc sỹ khoa học 23 Izume, M., & Ohtakara, A.(1987) Preparation of D-glucozamine oligosaccharides by the enzymatic hydrolysis of chitosan Agricultural and Biological Chemistry, 51, pp 1189-1191 24 Je J.-Y., Park P.-J and Kim S.-K (2004) Radical scavenging activity of heterochitooligosaccharides European Food Research and Technology 219, pp.60-65 25 Jeon Y.J., Park P.J., Byun, H G., Song, B.K., and Kim S.K (1998) Production of chitosan oligosaccharides using chitin-immobilized enzym Korean Journal Biotechnology and Bioengineering, 13, pp 147-154 26 Jeon Y., Park P and Kim S (2001) Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by bioreactor Carbohydrate Polymers 44, pp.71-76 27 Jeon, Y.J and Kim S.K (2000) Continuous production of chitooligosaccharides using a dual reactor system Process Biochem 35, pp 623-632 28 Jeon, Y.J and Kim, S.K (2002) Antitumor activity of chisan oligosaccharides produced in an ultra filtration membrane reactor system J Microbiol Biotechnol 12, pp 503 – 507 29 Jeon, Y.J., & Kim, S.K (2000) Production of chitooligosaccharides using ultrafiltration membrance reactor and their antibacterial activity Carbohydrete Polymers, 41, pp 133-141 30 Jin Li, Yumin Du, Jianhong Yang, Tao Feng, Aihua Li, Ping Chen (2005) Preparation and characterization of low molecular weight chitosan and chito-oligomers by a commercial enzym Polymer Degradation and Stability 87, pp 441-448 Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học 70 31 Jone, Y.J., and Kim, S.K (2001) Effect of antimicrobial activity by chitosan oligosaccharides N- conjugated with asparagines Journal of Microbiology and biotechnology, 11, 281-286 32 Kittur F S., Vishu Kumar A B and Tharanathan R N (2003) Low molecular weight chitosans preparation by depolymerization with Aspergillus niger pectinase, and characterization Carbohydrate Research 338, pp 1283-1290 33 Knorr, D (1986) Nutritional quality, food processing, and biotechnology aspects of chitosan and Chitosan oligsaccharides A review Process Biochem 21, pp 90-92 34 Kumar, A.B.V., Gowda, L R., & Tharanathan, R N (2004) Non-specific depolymerization of chitosan by pronase and characterization of the resultant products Eur.J.Biochem 271,713–723 35 Kurita K.(1998) Polymer Degradation and Stability, 59 p.117-120 36 Lee D.-X., Xia W.-S and Zhang J.L (2008) Enzymatic preparation of chitooligosaccharides by commercial lipase Food Chemistry 111, pp 291-295 37 Lee H.-W., Park Y.-S., Jung J.-S and Shin W.-S (2002) Chitosan oligosaccharides, dp 2-8, have prebiotic effect on the Bifidobacterium bifidium and Lactobacillus sp Anaerobe 8, pp 319-324 38 Li, Q., Dunn, E.T., Grandmaison, E.W and Goosen, M.F.A.(1992) Applications and properties of chitosan J Bioactive and Compatible Polym 7: pp 370-397 39 Lin H., Wang H., Xue C and Ye M (2002) Preparation of chitosan oligomers by immobilized papain Enzym and Microbial Technology 31, pp 588-592 40 Macchi, G (1996) A new approach to the treatment of obesity Chitosan’s effects on body weight reduction and plasma cholesterol levels Acta Toxicological Therapeutics 27,pp 303-320 Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 71 Luận văn thạc sỹ khoa học 41 Marcotte, E.M., Monzingo, A.F., Ernst, S.R., Brzezinski, R and Robertus, J.D (1996) X-ray structure of an anti-fungal chitosanase from Streptomyces N174 Nat Struct Biol 3, pp.155-162 42 Miller, G L (1959).Use of dinitrosalicylic axit reagent for determination of reducing sugar Anal Chem 31: pp 426–428 43 Molloy C., Cheah L.-H and Koolaard J P (2004) Induced resistance against Sclerotinia sclerotiorum in carrots treated with enzymatically hydrolysed chitosan Postharvest Biology and Technology 33, pp 61-65 44 Montenecourt B.1983 Trichoderma reesei cellulases Tibtech 1, pp.156-161 45 Moon J.-S., Kim H.-K., Koo H., Joo Y.-S., Nam H.-m., Park Y and Kang M.-I (2007) The antibacterial and immunostimulative effect of chitosanoligosaccharides against infection by Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis Applied Microbiology and Biotechnology 75, pp 989-998 46 Muzzarelli R A A (1996) Chitosan-based dietary foods Carbohydrate Polymers 29, pp 309-316 47 Ngo D.-N., Kim M.-M and Kim S.-K (2008) Chitin oligosaccharides inhibit oxidative stress in live cells Carbohydrate Polymers 74, pp 228-234 48 Ngo D.-N., Lee S.-H., Kim M.-M and Kim S.-K (2009) Production of chitin oligosaccharides with different molecular weights and their antioxidant effect in RAW 264.7 cells Journal of Functional Foods 1, pp 188-198 49 Nishimura, S., Nishi, N., Tokura, S., Nishimura, K and Azuma, I (1986) Bioactive macrophages chitin derivatives Activation of mouse-peritoneal by O-(carboxymethyl) chitins Carbohydr Res 146, pp 251– 258 Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học 72 50 No, H.K., Hur, E.Y (1998) Control of Foam Formation by Antifoam during Demineralization of Crustacean Shell in Preparation of Chitin Journal of Agricultural and Food Chemistry 46(9) pp.3844-3846 51 No, H.K., Park, N.Y., Lee, S.H., Hwang, H.J., Meyers, S.P.(2002) Antibacterial Activities of Chitosans and Chitosan Oligomers with Different Molecular Weights on Spoilage Bacteria Isolated from Tofu Journal of Food Science 67(4) pp.1511-1514 52 Osswald W F, Shapiro J P, Doostdar H, McDonald R E, Niedz R P, Narin C J, Hearn C J, Mayer R T (1994) Identification and characterization of axitic hydrolases with chitinase and chitosanase activities from sweet orange callus tissue Plant Cell Physiol 35, pp 811–820 53 Park P.J., Je J.Y and Kim S.K (2003) Free Radical Scavenging Activity of Chitooligosaccharides by Electron Spin Resonance Spectrometry journal of Agricultural and Food Chemistry 51, pp 4624-4627 54 Park P.J., Je J.Y., Jung W.K., Ahn C.B and Kim S.K (2004) Anticoagulant activity of heterochitosans and their oligosaccharide sulfates European Food Research and Technology 219, pp 529-533 55 Pelletier A, Sygusch J (1990) Purification and characterization of three chitosanase activities from Bacillus megaterium P1 Appl Environ Microbiol 56, pp 844–848 56 Qiao Y., Bai X.-F and Du Y.-G (2011) Chitosan oligosaccharides protect mice from LPS challenge by attenuation of inflammation and oxidative stress International Immunopharmacology 11, pp 121-127 Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 73 Luận văn thạc sỹ khoa học 57 Qin, C., Du, Y., Xiao, L., Li, Z and Gao, X (2002) Enzymic preparation of water- soluble chitosan and their antitumor activity Int J Biol Macromol 31, pp.111 – 117 58 Roncal T., Oviedo A., de Armentia I L., Fernández L and Villarán M C (2007) High yield production of monomer-free chitosan oligosaccharides by pepsin catalyzed hydrolysis of a high deacetylation degree chitosan Carbohydrate Research 342, pp 2750-2756 59 Rout, S K (2001), Physicochemical, Functional, and Spectroscopic analysis of crawfish chitin and chitosan as affected by process modification Dissertation 60 Se-Kwon Kim, Niranjan Rajapakse (2005) biological activities of Enzymatic production and chitosanoligosaccharides (COS) : A review Cacbohydrate Polymer 62, pp 357 – 368 61 Shimosaka M, Nogawa M, Ohno Y, Okazaki M Chitosanase from the plant pathogenic fungus, Fusarium solani f sp phaseoli: purification and some properties Biosci Biotechnol Biochem 1993;57:231–235 62 Sugano M., Fujikawa T., Hiratsuji Y., Nakashima K., Fukuda N and Hasegawa Y (1980) A novel use of chitosan as a hypocholesterolemic agent in rats The American Journal of Clinical Nutrition 33, pp 787-793 63 Tokoro, A., Takewaki, N., Suzuki, K., Mikami, T., Suzuki, S and Suzuki, M (1988) Growth-inhibitory effect of hexa-N-acetylchitohexaose and chitohexaose and Meth-A solid tumor Chem Pharm Bull 36, pp 784–790 64 Tomas Roncal, Alberto Oviedo, Iratxe Lopez de Armentia, Laura Fernandez, M.Carmen Villaran (2007) High yield production of monomer-free chitosan oligosaccharides by pepsin catalyzed hydrolysis of a high deacetylation degree chitosan Carbohydrate Research 342, pp 2750-2756 Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học 74 65 Tommeraas K., Koping-Hoggard M., Varum K M., Christensen B E., Artursson P and Smidsrøda O (2002) Preparation and characterisation of chitosans with oligosaccharide branches Carbohydrate Research 337, pp.24552462 66 Tsukada, K., Matsumoto, T., Aizawa, K., Tokoro, A., Naruse, R., Suzuki, S and Suzuki, M (1990) Antimetastatic and growth inhibitory effects of Nacetyl chito- hexaose in mice bearing Lewis lung carcinoma Jpn J Cancer Res 81, pp 259–265 67 Varum, K.M., Holme, H.K., Izume (1996) Determination of enzymatic hydrolysis specificity of partially N-acetylated chitosans Biochemica et Biophysica Acta, 1291, pp 5-15 68 Vishu Kumar A B., Varadaraj M C., Gowda L R and Tharanathan R N (2005) Characterization of chito-oligosaccharides prepared by chitosanolysis with the aid of papain and Pronase, and their bactericidal action against Bacillus cereus and Escherichia coli Biochemical Journal 391, pp 167-175 69 Wen-Teish Chang, Ye-Chung Chen, Chia-Ling Jao (2007) Antifungal activity and enhancement of plant growth on shellfish chitin wastes Bioresource technology 98, pp 1224-1230 70 Wu S -Preparation of water soluble chitosan by hydrolysis with commercial [alpha]-amylase containing chitosanase activity Food Chemistry In Press, Accepted Manuscript 71 Xia W., Liu P., Zhang J and Chen J (2011) Biological activities of chitosan and chitooligosaccharides Food Hydrocolloids 25, pp.170-179 72 Xiao’e chen, wenshui Xia, Xiaobin Yu (2005) Purification and characterzation of two types chitosanase from Aspergillus sp CJ22-326 Food Research International 38, pp 315-322 Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học 75 73 Xu J., Zhao X., Han X and Du Y (2007) Antifungal activity of oligochitosan against Phytophthora capsici and other plant pathogenic fungi in vitro Pesticide Biochemistry and Physiology 87, pp 220-228 74 Yeon Jin Choi, Eun Jung Kim, Zhe Piao, Young Chul Yun, and Yong Chul Shin (2004) Purification and Characterization of Chitosanase from Bacillus sp Strain KCTC 0377BP and its application for the production of chitosan oligosaccharides Applied and enviromental microbiology, pp 4522- 4531 75 You-Young JO, Kyu-Jong JO, Yu-Lan JIN, Kil-Yong KIM, Jae-Han SHIM, Yong-Woong KIM and Ro-Dong PARK (2003) Characterization and Kinetics of 45 kDa Chitosanase from Bacillus sp P16 Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 67, pp.1875-1882 76 Zhang, H., Du, Y., Yu, X., Mitsutomi, M., & Aiba, S (1999) Preparation of chitooligosaccharides from chitosan by a complex enzym Carbohydrate Resaearch, 320, pp 257-260 Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 76 Luận văn thạc sỹ khoa học PHỤ LỤC Bảng Quan hệ độ hấp thụ quang bước sóng 575nm nồng độ đường khử dịch thủy phân Nồng độ D-glucozamin OD 575 nm C, mg/ml 0.2 0.034 0.3 0.118 0.4 0.191 0.5 0.271 0.6 0.349 0.7 0.42 0.8 0.484 0.6 0.5 OD 575 nm 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 C (mg/ml) Đường chuẩn D-glucozamin Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 77 Luận văn thạc sỹ khoa học Bảng Quan hệ độ hấp thụ quang bước sóng 575nm nồng độ đường khử dịch thủy phân Nồng độ BSA, mg/ml OD 595nm 0.1 0.015 0.2 0.054 0.4 0.160 0.6 0.258 0.8 0.403 1.0 0.512 0.6 OD 595 nm 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 BSA (mg/ml) Đường chuẩn protein BSA Bảng So sánh hoạt độ chitosanase ba enzym thương mại Enzym Hoạt độ chitosanase Hoạt độ chitosanase (U/ml) (U/mg) Cellulase 0.267 0.615 Pepsin 0.160 0.212 Papain 0.046 0.030 Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 78 Luận văn thạc sỹ khoa học Bảng So sánh khả thủy phân chitosan ba enzym dựa vào lượng đường khử tạo thành Đường khử (mg/ml) Thời gian (phút) Cellulase Pepsin Papain 30 0.626 0.411 0.249 60 0.846 0.472 0.257 120 1.125 0.544 0.338 180 1.675 0.608 0.449 480 2.617 1.008 0.602 Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền chế phẩm Celluclast 1.5 L Hoạt độ tương đối (%) Thời gian (giờ) 300C 400C 500C 600C 100 100 100 100 96.94 95.85 94.02 83.28 93.04 92.31 90.96 73.51 12 86.69 87.18 84.98 58.01 Bảng Ảnh hưởng pH đến độ bền chế phẩm Celluclast 1.5 L Hoạt độ tương đối (%) Thời gian (giờ) pH=4.0 pH=5.0 pH=6.0 pH=7.0 100 100 100 100 95.88 96.28 97.98 96.91 89.16 94.72 94.29 91.36 12 62.77 90.28 86.56 84.69 Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học 79 Bảng Ảnh hưởng pH đến trình thủy phân chitosan chế phẩm Celluclast 1.5L pH Hàm lượng đường khử tạo thành (mg/ml) 5.0 2.031 5.5 2.050 6.0 2.594 6.5 1.620 7.0 0.756 8.0 0.448 Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân chitosan chế phẩm Celluclast 1.5L Nhiệt độ (0C) Nguyễn Thị Tuyết Mai Hàm lượng đường khử tạo thành (mg/ml) 30 0.972 35 1.079 40 1.604 45 1.998 50 2.316 55 2.320 60 2.436 65 0.666 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 80 Luận văn thạc sỹ khoa học Bảng Ảnh hưởng điều kiện khuấy đến hiệu suất thủy phân Thời gian thủy phân Hiệu suất thủy phân (%) (giờ) Điều kiện có khuấy Điều kiện khuấy 30.04 23.41 42.06 36.22 51.16 40.82 58.85 43.65 59.33 47.31 60.09 48.33 60.79 50.32 62.03 51.65 Bảng 10 Ảnh hưởng nồng độ chất, tỷ lệ E:S đến hiệu suất thủy phân điều kiện có khuấy Thời gian Hiệu suất thủy phân (%) Cơ chất 0.5%, Cơ chất 1.5%, Cơ chất 1.5%, E:S=1.0 E:S=0.7 E:S=1.0 31.87 29.93 30.15 49.42 42.19 52.44 54.46 51.47 56.77 59.23 58.54 61.54 61.35 59.25 66.32 66.65 60.04 69.23 70.10 60.66 70.29 72.22 61.81 72.50 (giờ) Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội ... cứu đề tài: “ Nghiên cứu thu nhận hoạt chất sinh học chito-oligosaccharit (COS) sử dụng chế phẩm enzym” Nguyễn Thị Tuyết Mai Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học CHƯƠNG TỔNG... nhiều đặc tính sinh học chúng Thêm vào đó, chitosan COS không độc, có khả phân hủy sinh học tương thích sinh học (không gây hại cho hệ sinh học) nên hứa hẹn nhiều ứng dụng sinh học tương lai Không... Trichoderma thường bị thiếu hụt hoạt động không hiệu Các nghiên cứu cellulase tiến hành theo hai hướng: nghiên cứu theo hướng kinh điển nghiên cứu cải tạo enzym Các nghiên cứu tập trung vào biểu tinh