TẠO PHÔI BÒ (HOẶC PHÔI HEO) TỪ NGUỒN TRỨNG ĐÔNG LẠNH BẰNG KỸ THUẬT HỖ TRỢ SINH SẢN

Header Page of 50 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM KHOA SINH HỌC [”\ BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG TẠO PHÔI BÒ (HOẶC PHÔI HEO) TỪ NGUỒN TRỨNG ĐÔNG LẠNH BẰNG KỸ THUẬT HỖ TRỢ SINH SẢN Mã số: CS.2010.19.89 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS NGUYỄN THỊ THƯƠNG HUYỀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 07/2010 Footer Page of 50 Header Page of 50 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM KHOA SINH HỌC [”\ BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG TẠO PHÔI BÒ (HOẶC PHÔI HEO) TỪ NGUỒN TRỨNG ĐÔNG LẠNH BẰNG KỸ THUẬT HỖ TRỢ SINH SẢN Mã số: CS.2010.19.89 NHỮNG NGƯỜI THAM GIA: CN Võ Thị Tuyết Nga CN Nguyễn Thành Trung ThS Ngô Thị Mai Hương SV Đỗ Hoàng Hùng THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 07/2011 Footer Page of 50 Header Page of 50 i TÓM TẮT Đề tài tiến hành nhằm nghiên cứu việc bảo quản trứng bò trưởng thành phương pháp thủy tinh hóa, đồng thời tạo phôi từ nguồn giao tử kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm (In Vitro Fertilization_IVF) kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (Intracytoplasmic Sperm Injection _ICSI) Thu nhận trứng từ buồng trứng bò bị giết mổ phương pháp chọc hút Những trứng có từ lớp cumulus đồng tế bào chất chọn để nuôi chín môi trường C3 (TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + hCG + EGF) 38,5oC 5% CO2, nước bão hòa Nội dung 1: Sau 22 - 24 h nuôi cấy, chọn tế bào trứng chín theo quan sát hình thái đem bảo quản phương pháp thủy tinh hóa cọng rạ qua bước: trứng cho vào dung dịch cân VS1 (TCM-199 + 10% FBS + 10% DMSO + 10% EG) để 45 giây, cho vào dung dịch thủy tinh hóa VS2 (TCM-199 + 10% FBS + 20% DMSO + 20% EG + M sucrose) để 25 giây, sau nạp từ - tế bào trứng vào cọng rạ (0,25 ml) nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng (khoảng 45 giây kể từ trứng tiếp xúc với dung dịch bảo quản) Giải đông tế bào trứng sau: (i) lấy cọng rạ chứa tế bào trứng khỏi bình nitơ lỏng để không khí giây, nhúng vào nước ấm 37oC 10 giây, sau chuyển tế bào trứng vào đĩa nhựa trống (Φ35); (ii) Các tế bào trứng chuyển qua môi trường rã đông thứ (RĐ1: TCM-199 + 10% FBS + 0,25 M sucrose) 1,5 phút, RĐ2 (TCM-199 + 10% FBS + 0,15 M sucrose) khoảng 1,5 phút RĐ3 (TCM199 + 10% FBS) phút; (iii) Tiếp tục chuyển tế bào trứng qua môi trường C3 khoảng phút Quá trình giải đông tiến hành nhiệt độ phòng (25oC) Chọn trứng nguyên vẹn hình thái đem IVF (nội dung 2) ICSI (nội dung 3) Kết nội dung 1: Đông lạnh 3154 trứng dùng cho IVF, thu 80,07 ± 2,72% trứng nguyên vẹn sau giải đông (theo quan sát hình thái); Đông lạnh 837 trứng dùng cho ICSI, thu 79,89 ± 5,28% trứng nguyên vẹn sau giải đông (theo quan sát hình thái) Kết nội dung 2: Tiến hành thụ tinh cho 1970 trứng sống tốt sau giải đông, có 306 trứng thụ tinhgiai đoạn phôi tế bào, đạt tỷ lệ 15,21 ± 3,48% Trong lô đối chứng, tỷ Footer Page of 50 Header Page of 50 ii lệ thụ tinh đạt 58,5 ± 4,89% (234 phôi tế bào) Có 82 (4,14%) phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang lô đối chứng có 93 phôi (23,25%) Kết nội dung 3: Tiến hành ICSI cho 595 trứng sống tốt sau giải đông 375 trứng tươi chưa qua đông lạnh Tỷ lệ thụ tinh lô thí nghiệm đạt 8,95% (23/240 trứng) so với 30,82% (89/288 trứng) lô đối chứng; có phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang so với 16 phôi (5,44%) lô đối chứng Footer Page of 50 Header Page of 50 iii SUMMARY This research aimed at bovine embryo production, using cryopreserved mature bovine oocytes by vitrification, and cryopreserved sperms The cumulusoocyte complexes (COCs) were obtained from cow ovaries by aspiration COCs with three or more layers of cumulus cells and homogeneous cytoplasm were selected to be cultured in C3 medium (TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + hCG + EGF) under the condition at 38.5oC with humidified atmosphere of 5% CO2 in air Experiment 1: After 22 - 24 h incubation, matured oocytes were cryopreserved by vitrification method in straws in two steps: (i) oocytes were first equilibrated in the VS1 solution (TCM-199 + 10% FBS + 10% DMSO + 10% EG) for 45 seconds; (ii) The oocytes were then transferred in the VS2 solution (TCM-199 + 10% FBS + 20% DMSO + 20% EG + M sucrose) for 25 seconds Each straws were loaded with 5-7 oocytes Straws were plunged directly into liquid nitrogen within 45 seconds at the beginning of the exposure to second step After storage in liquid nitrogen, thrawing was performed by exposing the straw to air for seconds, and plunged into warm water (37oC) for 10 seconds, and then transfered were oocytes into clean dish (Φ35); Oocytes were directly expelled into RD1 medium (TCM-199 + 10% FBS + 0.25 M sucrose) 1.5 minutes, RD2 medium (TCM-199 + 10% FBS + 0.15 M sucrose) 1.5 minutes and RD3 (TCM-199 + 10% FBS) medium minutes; This oocytes were tranferred to C3 medium and holding for minutes The thrawing was performed in a room at 25oC Survival oocytes by morphology used for IVF (Experiment 2) and ICSI (Experiment 3) In experiment 1: 3154 oocytes were vitrificatin which used for IVF, morphological intact recovered rate was 80,07 ± 2,72%; 837 oocytes were vitrification which used for ICSI, morphological intact recovered rate was 79,89 ± 5,28% In experiment 2: After 22-24h incubated with sperm, 306/1970 (15,21 ± 3,48%) vitrified oocytes were fertilized while the rate of fertilized oocytes in the control samples is 234/400 (58,5 ± 4,89%); the rate embryo developed into blastocyst stage in experiment and control was 4,14% (82 embryos) and 23,25% (93 embryos), respectively In experiment 3: After 22-24h incubated with sperm, Footer Page of 50 Header Page of 50 iv 23/240 (8,95%) vitrified oocytes were fertilized while the rate of fertilized oocytes in the control samples is 234/400 (58,5 ± 4,89%); embryos developed into blastocyst stage in experiment and control was 16 embryos Footer Page of 50 Header Page of 50 v MỤC LỤC Tóm tắt đề tài (tiếng Việt tiếng Anh) .i Mục lục v Danh mục bảng .vi Danh mục hình vi Danh mục từ viết tắt iv PHẦN MỞ ĐẦU viii Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Cách tiếp cận đề tài Phương pháp nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Sản phẩm đề tài CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .6 1.1 KHÁI QUÁT VỀ ĐÔNG LẠNH TRỨNG 1.1.1 Khái niệm đông lạnh trứng 1.1.2 Mục tiêu đông lạnh trứng 1.2.3 Những nét bảo quản trứng đông lạnh phương pháp thủy tinh hóa (Vitrification) 1.2.4 Đông lạnh trứng trưởng thành phương pháp thủy tinh hóa 1.2 KHÁI QUÁT VỀ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM 10 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu 10 1.2.2 Cơ sở khoa học kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm 11 1.3 KHÁI QUÁT VỀ KỸ THUẬT TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG NOÃN 16 1.3.1 Lịch sử nghiên cứu 16 1.3.2 Cơ sở khoa học kỹ thuật ICSI .17 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới kết ICSI 21 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24 2.1 NỘI DUNG 1: ĐÔNG LẠNH TRỨNG BÒ TRƯỞNG THÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HÓA TRONG CỌNG RẠ .24 2.1.1 Thu nhận nuôi trứng .24 2.1.2 Đông lạnh trứng 25 2.1.3 Đánh giá tỷ lệ sống chết trứng 27 2.2 NỘI DUNG 2: TẠO PHÔI BÒ BẰNG KỸ THUẬT THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF) 27 2.2.1 Chuẩn bị tinh trùng 27 2.2.2 Thụ tinh ống nghiệm 28 2.2.3 Nuôi phôi đánh giá phôi 29 Footer Page of 50 Header Page of 50 vi 2.2.4 Phương pháp thụ tinh ống nghiệm từ trứng tươi 29 2.3 NỘI DUNG 3: TẠO PHÔI BẰNG KỸ THUẬT TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG TRỨNG (ICSI) 30 2.3.1 Chuẩn bị hóa chất 30 2.3.2 Chuẩn bị trứng 30 2.3.3 Chuẩn bị hệ thống thao tác 31 2.3.4 Tiến hành ICSI 31 2.3.5 ICSI trứng tươi 32 2.4 XỬ LÝ SỐ LIỆU 32 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 33 3.1 KẾT QUẢ NỘI DUNG .33 3.2 KẾT QUẢ NỘI DUNG 35 3.3 KẾT QUẢ NỘI DUNG .40 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ .44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 Phụ lục DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết đông lạnh trứng dùng cho IVF .33 Bảng 3.2 Kết đông lạnh trứng dùng cho ICSI 34 Bảng 3.3 Kết IVF từ trứng đông lạnh 35 Bảng 3.4 Các giai đoạn phát triển phôi 37 Bảng 3.5 Sự chuyển tiếp phôi lên giai đoạn trứng đông lạnh .38 Bảng 3.6 Kết ICSI từ trứng đông lạnh 40 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các giai đoạn phát triển phôi 14 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí toàn thí nghiệm đề tài 24 Hình 2.2 Cọng rạ chứa trứng 26 Hình 2.3 Lấy cọng rạ chứa tinh trùng khỏi bình nitơ lỏng .28 Hình 2.4 Giải đông tinh trùng nước ấm 28 Hình 2.5 Đĩa bố trí vi giọt cho ICSI .30 Hình 3.1 Trứng chín 33 Hình 3.2 Biểu đồ kết đông lạnh trứng 34 Hình 3.3 Biểu đồ kết thụ tinh từ nguồn trứng đông lạnh 36 Hình 3.4 Phôi tế bào từ trứng đông lạnh (X10) .37 Hình 3.5 Biểu đồ giai đoạn phát triển phôi từ trứng đông lạnh 38 Hình 3.6 Các giai đoạn phôi tạo từ trứng đông lạnh 39 Hình 3.7 Biểu đồ kết ICSI từ trứng đông lạnh 43 Footer Page of 50 Header Page of 50 vii Hình 3.8 Trứng trước vi tiêm 43 Hình 3.9 Tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (ICSI) .43 Hình 3.10 Trứng sau vi tiêm thành công 43 Footer Page of 50 viii Header Page 10 of 50 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT IVF ICSI PCR LAMP In Vitro Fertilization Intracytoplasmic Thụ tinh ống nghiệm Sperm Injection Polymerase Tiêm tinh trùng vào bào tương trứng Chain Reaction Loop-Mediated Isothermal Amplification IVM In Vitro Maturation Nuôi trưởng thành ống nghiệm ICM Inner Mass Cell Khối tế bào bên TE Trophectoderm Cell Tế bào nuôi phôi ZP Zona Pellucidas Màng suốt, màng thụ tinh CPA Cryoprotectant additive Chất bảo quản lạnh PVP Polyvinylpyrolidone FBS Fetal Bovine Serum FCS Fetal Calf Serum DMSO Dimethylsulphoxide EG Ethylene glycol BO Brackett and Oliphant Môi trường BO RĐ Rã đông cs Cộng TN Thí nghiệm ĐC Đối chứng Footer Page 10 of 50 53 Header Page 63 of 50 Phụ lục 1: Thu nhận trứng Thu nhận buồng trứng Nước muối sinh lý (0,9%), kéo, kẹp hấp vô trùng Làm ấm dung dịch bình ổn nhiệt 39oC, riêng nước cất làm ấm 60oC Bổ sung penicillin (100IU/ml ) streptomycin (0,1mg/ml ) vào nước muối Tất để bình giữ ấm Dùng kéo thu nhận buồng trứng phía hai bên tử cung bò vừa mổ, loại bỏ mỡ, rửa máu nước muối sinh lý bổ sung kháng sinh, Sau đưa buồng trứng vào lọ chứa nước muối sinh lý 0,9% bình giữ ấm Chuyển mẫu buồng trứng phòng thí nghiệm thời gian nhanh Thu TBT từ buồng trứng TBT thu nhận phương pháp chọc hút nang trứng Dùng đầu kim 18G gắn vào syringe 5ml hút khoảng 1ml dung dịch D – PBS có kháng sinh làm ấm becher, tiến hành chọc hút nang trứng có đường kính từ - 8mm khoảng 3ml chuyển dịch vào đĩa petri thủy tinh Φ60 petri nhựa Φ35, Để lắng từ -10 phút Dùng ống mao quản soi tìm TBT chuyển sang môi trường mDPBS TCM để rửa TBT kính hiển vi soi kính hiển vi đảo ngược Chọn lọc TBT đạt yêu cầu trước tiến hành IVM, Thao tác cần tiến hành nhanh, không làm ảnh hưởng đến TBT đặc biệt lớp tế bào cumulus Chọn lọc phân loại TBT Phân loại TBT dựa vào lớp tế bào cumulus phức hợp COC : TBT loại A TBT bao quanh từ lớp tế bào cumulus trở lên, tế bào chất đồng nhất; TBT loại B TBT khoảng lớp tế bào cumulus bao quanh, thiếu liên kết chặt phía cùng, tế bào chất có hạt; TBT loại C TBT lớp cumulus bao quanh bao quanh không hoàn toàn TBT chọn lọc phân loại đánh giá thông qua quan sát hình thái, chọn TBT có tế bào chất đều, đậm màu Nuôi trưởng thành TBT Môi trường nuôi (môi trường IVM) chuẩn bị trước đĩa giếng Mỗi giếng tạo vi giọt với thể tích 120µl, phủ 900µl dầu khoáng lên bề mặt, sau đặt đĩa giếng tủ nuôi Ống mao quản kéo lửa đèn cồn tạo đường kính thích hợp để thu phức hợp TBT cumulus Dùng ống mao quản chuyển 15-20 phức hợp TBT cumulus tuyển chọn vào vi giọt môi trường, nhanh chóng chuyển vào tủ nuôi Chú ý, hạn chế tối đa môi trường rửa kèm chuyển TBT qua môi trường nuô Phụ lục 2: Số liệu thô xử lý số liệu Giải đông dùng cho IVF Số đợt TN Footer Page 63 of 50 số trứng đông lạnh 129 136 108 126 133 134 147 số trứng thu hồi 105 114 88 103 113 112 123 số trứng sống 83 88 67 82 91 85 97 54 Header Page 64 of 50 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 170 164 142 133 175 173 185 166 153 188 193 196 203 114 112 96 87 120 126 131 122 115 134 142 152 153 Tỳ lệ sống/đông lạnh Tỳ lệ sống/thu hồi Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 146 142 124 111 148 160 162 144 136 163 174 180 184 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95,0%) 80,07091 0,607333 79,32963 #N/A 2,716076 7,377072 -0,81491 0,358923 8,829365 75,89286 84,72222 1601,418 20 1,271163 Tỷ lệ thu hồi Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95,0%) Footer Page 64 of 50 86,17549 0,749677 86,23386 #N/A 3,352659 11,24032 -0,74235 0,368811 11,0902 81,39535 92,48555 1723,51 20 1,569093 69,05093 0,999435 68,35687 #N/A 4,46961 19,97741 -0,99517 0,317965 15,51398 62,03704 77,55102 1381,019 20 2,091842 55 Header Page 65 of 50 Giải đông dùng cho ICSI số đợt TN số cọng rạ 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 6 8 8 8 9 9 8 tổng sô trứng cọng số trứng thu sô trứng rạ hồi sống 31 27 30 28 42 37 40 38 46 40 40 38 40 37 42 39 47 41 41 36 40 37 40 35 46 42 48 36 47 41 47 40 48 41 42 38 40 37 40 37 Tỷ lệ thu hồi Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) Tỷ lệ sống/thu hồi 89,27077807 Mean 1,030087881 Standard Error 89,28571429 Median 92,5 Mode 4,606693048 Standard Deviation 21,22162084 Sample Variance 3,702324172 Kurtosis Skewness 1,466473003 Range 20 Minimum 75 Maximum 95 Sum 1785,415561 Count 20 Confidence Level(95.0%) 2,155999382 Tỷ lệ sống/đông lạnh Mean Standard Error Median Footer Page 65 of 50 22 22 29 28 32 29 29 29 29 29 28 28 33 34 35 34 36 30 30 29 71,13525 0,644034 71,19816 79,88625 1,180686 78,7594 78,37838 5,280188 27,88038 2,072204 1,023251 23,71274 70,73171 94,44444 1597,725 20 2,471205 56 Header Page 66 of 50 Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 70 2,880208 8,295599 5,459889 -1,69673 13,29787 61,70213 75 1422,705 20 1,347979 So sánh giải đông dùng cho thí nghiệm t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances t-Test: Two-Sample Assuming E Tỷ lệ thu tỷ lệ thu hồi hồi Mean 89,270778 86,17548922 Mean Variance 21,221621 11,24032089 Variance Observations 20 20 Observations Pooled Variance 16,230971 Pooled Variance Hypothesized Mean Difference Hypothesized Mean Difference df 38 df t Stat 2,4295673 t Stat P(T