nghiên cứu y học Nghiên cứu DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ bằng kỹ thuật Realtime PCR nhằm dự báo sớm tiền sản giật

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tiền sản giật lˆ t“nh trạng bệnh lý thai nghŽn g‰y ra, đ‰y lˆ rối loạn nghi•m trọng thường biểu sau tuần thứ 20 thai kỳ, x‡c định lˆ c— tăng huyết ‡p, protein niệu k•m theo ph• vˆ c— thể k•m theo c‡c triệu chứng l‰m sˆng vˆ cận l‰m sˆng kh‡c [1],[2],[3] Tiền sản giật xảy tất c‡c nước tr•n giới, c‡c nước ph‡t triển vˆ ph‡t triển, tỷ lệ mắc tiền sản giật c‡c thai phụ khoảng - 8% Tiền sản giật t‡c động nhiều đến mẹ vˆ thai nhi, hậu c— thể g‰y biến chứng nặng cho mẹ: sản giật, rau bong non, rối loạn đ™ng m‡u, suy gan, suy thận,É., tiền sản giật lˆ nguy•n nh‰n hˆng đầu g‰y tử vong cho mẹ; thai nhi c— thể g‰y hậu quả: thai chậm ph‡t triển, suy thai, É Hiện nay, c•ng với tiến khoa học kỹ thuật th“ c‡c kỹ thuật sinh học ph‰n tử kh™ng ngừng ứng dụng rộng r‹i lĩnh vực y học Việc ph‡t DNA ph™i thai tự lưu hˆnh tuần hoˆn thai phụ đ‹ mở hướng đ— lˆ chẩn đo‡n trước sinh c‡c kỹ thuật kh™ng x‰m lấn [4] Nhiều nghi•n cứu cho thấy nồng độ DNA ph™i thai tự huyết tương, huyết thai phụ tăng tương ứng với tuổi thai, tăng cao bất thường li•n quan đến c‡c biến chứng thai kỳ (tiền sản giật, đẻ non, thai lệch bội nhiễm sắc thể 21, ) vˆ thải trừ nhanh ch—ng sau sinh [5],[6] Nồng độ DNA ph™i thai tự huyết tương thai phụ tăng cao c— ý nghĩa lần đầu ti•n từ tuần thai thứ 17 vˆ lần thứ vˆo thời điểm tuần trước c— triệu chứng l‰m sˆng tiền sản giật [7] Điều nˆy gợi ý khả ứng dụng kỹ thuật định lượng DNA ph™i thai tự để sˆng lọc vˆ ph‡t sớm c‡c thai phụ c— nguy tiền sản giật Một số nghi•n cứu đ‹ sử dụng kỹ thuật Realtime PCR để định lượng DNA thai từ tuần thứ vˆ thai kỳ vˆ tr•n sở kỹ thuật nˆy đ‹ ‡p dụng vˆo chẩn đo‡n trước sinh kh™ng x‰m lấn c‡ch ch’nh x‡c vˆ hiệu việc theo d›i, dự đo‡n c‡c nguy mẹ vˆ thai nhi qu‡ tr“nh thai nghŽn [8],[9],[10] Ở Việt Nam, chẩn đo‡n tiền sản giật dựa vˆo triệu chứng bệnh: huyết ‡p cao, protein niệu, b•n cạnh đ— việc theo d›i ph‡t tiền sản giật dựa vˆo c‡c triệu chứng bệnh nh‰n ph‡t vˆ tự đến kh‡m: ph•, nhức đầu,É C‡c xŽt nghiệm sˆng lọc định lượng c‡c dấu ấn αFP, HCG, uE3 t’nh đặc hiệu, chẩn đo‡n vˆ theo d›i dọc kh™ng cao [11] Với mục đ’ch nghi•n cứu vai tr˜ DNA ph™i thai tự tiền sản giật để giœp thầy thuốc l‰m sˆng c— th•m dấu ấn sinh học dự b‡o sớm, theo d›i vˆ ti•n lượng tiền sản giật nhằm n‰ng cao chất lượng sống, chœng t™i tiến hˆnh nghi•n cứu đề tˆi "Nghi•n cứu DNA ph™i thai tự huyết tương thai phụ kỹ thuật Realtime PCR nhằm dự b‡o sớm tiền sản giật" với c‡c mục ti•u sau: 1.! Hoˆn chỉnh vˆ x‰y dựng đường chuẩn kỹ thuật Realtime PCR để định lượng DNA ph™i thai tự lưu hˆnh huyết tương thai phụ 2.! Їnh gi‡ nồng độ DNA ph™i thai tự huyết tương thai phụ b“nh thường vˆ thai phụ tiền sản giật Chương TỔNG QUAN 1.1.! TỔNG QUAN VỀ DNA PHïI THAI TỰ DO LƯU HËNH TRONG HUYẾT TƯƠNG THAI PHỤ 1.1.1.!Nguồn gốc DNA ph™i thai tự Mặc d• DNA ph™i thai huyết tương thai phụ đ‹ biết đến với nhiều ứng dụng tiềm chế sinh học lại c˜n nhiều điều chưa s‡ng tỏ C— khả nguồn gốc DNA ph™i thai tuần hoˆn lˆ c‡c tế bˆo thai c— nh‰n m‡u mẹ [12] Nghi•n cứu Sekizawa vˆ CS (2000) thấy c— lượng lớn tế bˆo thai c— nh‰n chết theo chương tr“nh vˆ c— thể giải ph—ng DNA ph™i thai vˆo huyết tương thai phụ [13] Đ— lˆ lý mˆ số lượng tế bˆo thai vˆ nồng độ DNA ph™i thai tự huyết tương thai phụ bị tiền sản giật c— nguy sinh lệch bội tăng cao bất thường [14],[15],[16] Theo Lo vˆ CS (1999), DNA ph™i thai tự giải ph—ng c‡c thời kỳ kh‡c kh™ng theo c‡ch từ nguồn gốc [14] C— nhiều giả thuyết nguồn gốc m™ học DNA ph™i thai tuần hoˆn thai phụ, đ— c— khả năng: từ tế bˆo thai c— nh‰n lưu hˆnh v˜ng tuần hoˆn mẹ, từ rau thai vˆ trao đổi trực tiếp c‡c ph‰n tử DNA 1.1.1.1.! Nguồn gốc DNA ph™i thai tự từ tế bˆo thai c— nh‰n lưu hˆnh tuần hoˆn mẹ Theo Rudin vˆ CS (1997) hˆng ngˆy c— ph‰n chia 1011Ð1012 tế bˆo vˆ lượng tương đương để tr“ c‰n m™, c— khoảng 1Ð10g DNA c— thể bị thải trừ ngˆy vˆ c— mặt huyết tương [17] C˜n Bianchi vˆ CS (1997) tiến hˆnh kỹ thuật PCR định lượng dựa tr•n c‡c tế bˆo nguy•n vẹn m‡u thai phụ đ‹ ph‡t khoảng tế bˆo thai c— nh‰n/1ml m‡u toˆn phần thai phụ mang thai b“nh thường Từ đ—, t‡c giả cho c‡c tế bˆo thai c— nh‰n tuần hoˆn thai phụ c— thể lˆ nguồn gốc m™ học th’ch hợp DNA ph™i thai tự [12] Căn vˆo nghi•n cứu Fournie vˆ CS (1993) vˆ Sekizawa vˆ CS (2000), Bianchi vˆ CS (2004) cho DNA ph™i thai tự giải ph—ng vˆo m‡u mẹ lˆ t‡c động hệ thống miễn dịch mẹ c‡c tế bˆo thai chết theo chương tr“nh [13],[18],[19] C‡c tế bˆo vˆ c‡c acid nucleic thai tuần hoˆn thai phụ tăng c‡c biến chứng thai nghŽn tiền sản giật vˆ thai lệch bội, điều nˆy cho phŽp nghĩ chœng c— thể tồn mối li•n quan nˆo đ— Để t“m hiểu mối li•n quan c‡c tế bˆo hồng cầu c— nh‰n thai với nồng độ DNA ph™i thai tự huyết tương thai phụ, Zhong vˆ CS (2002) đ‹ sử dụng m‡u toˆn phần c‡c thai phụ mang thai nam (gồm: nh—m b“nh thường vˆ nh—m c— nguy tiền sản giật, đẻ non), tiến hˆnh đồng thời phương ph‡p: lai chỗ huỳnh quang để đếm số tế bˆo thai vˆ kỹ thuật PCR x‡c định nồng độ DNA ph™i thai tự [20] Kết cho thấy kh™ng c— mối li•n quan c‡c tế bˆo thai vˆ DNA ph™i thai tự c‡c trường hợp nˆy Điều đ— gợi ý rằng, c‡c tế bˆo hồng cầu c— nh‰n thai kh™ng phải lˆ nguồn gốc DNA ph™i thai tự m‡u thai phụ c— nguy đẻ non, v“ nh—m nˆy lượng DNA ph™i thai tự tăng c‡ch c— ý nghĩa mˆ kh™ng c— tăng tương ứng c‡c tế bˆo hồng cầu c— nh‰n thai Angert vˆ CS (2003) đ‹ giả sử sau lấy m‡u vˆo ống nghiệm, c‡c tế bˆo thai chết theo chương tr“nh tan r‹ hết ống nghiệm vˆ giải ph—ng DNA chœng; c‡c tế bˆo thai bị tan r‹ sau tiếp xœc với hệ thống miễn dịch mẹ vˆ dẫn đến giải ph—ng DNA ph™i thai nhiều hơn; sau đ— tiến hˆnh nghi•n cứu c‡c mẫu huyết tương thai phụ lấy lần vˆo thời điểm kh‡c lˆ th‡ng đầu vˆ th‡ng cuối định lượng DNA tr•n nhiễm sắc thể (NST) Y - dấu ấn thai vˆ DNA β-globin - dấu ấn DNA thai vˆ mẹ c‡c thời điểm v˜ng 24 Kết lˆ c‡c thời điểm v˜ng 24 giai đoạn thai kỳ kh™ng c— tăng DNA ph™i thai ống nghiệm [21] Như vậy, tế bˆo huyết học thai ống nghiệm kh™ng phải lˆ nguồn gốc vˆ quan trọng DNA ph™i thai tự 1.1.1.2.! Nguồn gốc DNA ph™i thai tự từ rau thai Rau thai lˆ nguồn gốc hợp lý DNA ph™i thai tự v“ k’ch thước n— c‡c tế bˆo hoạt động phong phœ Rất nhiều nghi•n cứu đ‹ thấy c— mối li•n hệ nồng độ DNA ph™i thai tự lưu hˆnh tuần hoˆn mẹ với tuổi thai [13],[22],[23] Sekizawa vˆ CS (2003) nghi•n cứu 15 thai phụ (h“nh thức đẻ lˆ mổ lấy thai) c— c•ng tuổi thai đ— gồm thai phụ tiền sản giật vˆ 10 thai phụ b“nh thường, t‡c giả đ‹ ph‰n t’ch c‡c cặp mẫu huyết tương mẹ vˆ huyết tương (lấy từ m‡u d‰y rốn con), sử dụng dấu ấn kh‡c tr•n c‡c NST 13, 18 vˆ 21 để ph‰n biệt DNA ph™i thai tự với DNA mẹ Kết cho thấy nồng độ trung b“nh DNA ph™i thai huyết tương d‰y rốn (trung vị 0.9%, khoảng 0.2 - 8.4%) thấp đ‡ng kể so với DNA huyết tương mẹ (14.3%, 2.3 - 64%) với p = 0,007; từ đ—, t‡c giả khẳng định DNA ph™i thai tự lưu hˆnh tuần hoˆn thai phụ c— nguồn gốc từ rau thai [24] Với mục đ’ch để chứng minh giả thuyết DNA ph™i thai tự lưu hˆnh huyết tương thai phụ c— nguồn gốc chủ yếu từ rau thai, nghi•n cứu năm 2007 tiến hˆnh tr•n hai nh—m: nh—m gồm 15 thai phụ b“nh thường tuần thứ 11 thai kỳ (11 thai phụ mang thai nam vˆ 04 thai phụ mang thai nữ) vˆ nh—m gồm thai phụ tuần thứ thai kỳ chẩn đo‡n lˆ mang thai kh™ng ph™i (c— tœi thai kh™ng c— ph™i thai), thực tế, nồng độ DNA ph™i thai tự c— xu hướng cao tập trung nh—m thai phụ mang thai kh™ng ph™i, c— lẽ thai phụ nˆy th“ qu‡ tr“nh c‡c tế bˆo rau thai chết theo chương tr“nh tăng cao Kết nˆy ủng hộ giả thuyết rau thai lˆ nguồn ch’nh c‡c DNA ph™i thai tự lưu hˆnh huyết tương thai phụ [8] 1.1.1.3.! Nguồn gốc từ trao đổi trực tiếp c‡c ph‰n tử DNA ph™i thai tự mẹ vˆ thai Nghi•n cứu nhiều t‡c giả kh‡c cho thấy c— thể ph‡t DNA ph™i thai tự số dịch thể kh‡c mẹ bao gồm dịch ối, nước tiểu, dịch n‹o tủy [25],[26],[27] Vˆ nồng độ DNA ph™i thai tự dịch ối cao gấp 100 - 200 lần so với huyết tương thai phụ [28] Với số lượng lớn DNA ph™i thai tự dịch ối liệu c— lˆm gia tăng nồng độ DNA ph™i thai tự huyết tương thai phụ, nhi•n, c‡c nghi•n cứu đ‹ cho thấy kh™ng c— tương quan nồng độ DNA ph™i thai tự dịch ối vˆ DNA ph™i thai tự huyết tương thai phụ Zhong vˆ CS (2006) đ‹ nghi•n cứu mối tương quan nồng độ DNA ph™i thai tự dịch ối vˆ huyết tương thai phụ mang thai dị tật kỹ thuật Realtime PCR, kết cho thấy nồng độ DNA ph™i thai tự nước ối trung b“nh lˆ 3978 copy/ml nước ối vˆ huyết tương lˆ 96,6 copy/ml huyết tương thai phụ, nhi•n, kh™ng c— tương quan đ‡ng kể nồng độ DNA ph™i thai tự dịch ối vˆ huyết tương thai phụ Như vậy, mˆng ối kh™ng g—p phần vˆo diện DNA ph™i thai tự lưu hˆnh huyết tương thai phụ [27] Một nghi•n cứu định lượng nồng độ DNA ph™i thai tự huyết tương, dịch ối vˆ khoang mˆng ối thai phụ tuần thứ - 9, kết nồng độ DNA ph™i thai tự dịch ối cao nhất, khoang mˆng ối thấp vˆ huyết tương thai phụ lˆ thấp [29] Một số t‡c giả cho k’ch thước DNA ph™i thai tự tuần hoˆn thai phụ 100 - 300bp, tương đương khoảng 30 - 90kDa, cˆng khẳng định DNA ph™i thai tự dịch ối kh™ng thể trao đổi trực tiếp với tuần hoˆn thai phụ Như vậy, c— mặt DNA ph™i thai tự dịch ối vˆ tuần hoˆn lˆ qu‡ tr“nh trao đổi trực tiếp từ thai vˆo dịch ối vˆ từ thai vˆo tuần hoˆn mẹ Điều nˆy cho phŽp nghĩ đến trao đổi trực tiếp c‡c ph‰n tử DNA ph™i thai tự qua rau thai qua dịch ối C— thể cho phần lớn DNA ph™i thai tự tuần hoˆn thai phụ c— nguồn gốc từ rau thai, ngoại lệ c— nguồn gốc từ c‡c tế bˆo thai c— nh‰n tuần hoˆn thai phụ vˆ c— khả từ ch’nh thai th™ng qua trao đổi trực tiếp 1.1.2.!K’ch thước DNA ph™i thai tự Để ph‰n biệt DNA ph™i thai tự hay DNA c— nguồn gốc từ thai phụ lưu hˆnh tuần hoˆn thai phụ, nhiều nghi•n cứu đ‹ tiến hˆnh Năm 2004, Chan KC vˆ CS đ‹ nghi•n cứu để x‡c định ph‰n bố k’ch thước DNA lưu hˆnh huyết tương thai phụ kỹ thuật Realtime PCR sử dụng Taqman Probe với cặp mồi gen leptin (gồm mồi xu™i vˆ mồi ngược với k’ch thước sản phẩm sau Realtime PCR tương ứng lˆ 105bp, 145bp, 201bp, 280bp, 356bp, 449bp, 576bp, 697bp, 798bp), đồng thời với cặp mồi gen SRY x‡c định ph‰n bố k’ch thước DNA ph™i thai tự lưu hˆnh huyết tương thai phụ (gồm mồi xu™i vˆ mồi ngược với k’ch thước sản phẩm sau Realtime PCR tương ứng lˆ: 107bp, 137bp, 193bp, 313bp, 392bp, 524bp) Kết cho thấy: 57% DNA người mẹ c— k’ch thước > 201bp; hầu hết k’ch thước DNA ph™i thai tự ngắn ≤ 193bp, 20% k’ch thước > 193bp, 0% k’ch thước > 313bp vˆ ngắn DNA c— nguồn gốc từ mẹ [30] Theo nghi•n cứu Li Y vˆ CS, sử dụng cặp mồi gen SRY th“ k’ch thước DNA ph™i thai tự < 300bp c˜n DNA c— nguồn gốc từ mẹ c— k’ch thước ph‰n tử >1kb [31] Nghi•n cứu Fan HC vˆ CS (2010), sử dụng cặp mồi gen SRY x‡c định k’ch thước DNA ph™i thai tự khoảng 130 150bp, kh™ng dˆi 250bp [32] 1.1.3.!Thời gian b‡n hủy t/2 DNA ph™i thai tự DNA ph™i thai tự chiếm khoảng 11 - 13% tổng số DNA lưu hˆnh tuần hoˆn thai phụ Thời gian xuất DNA ph™i thai tự đầu ti•n lưu hˆnh tuần hoˆn thai phụ thời điểm thai - tuần vˆ nồng độ DNA ph™i thai tự tăng dần theo tuổi thai [33] Tốc độ thay DNA ph™i thai tuần hoˆn đ‹ c‡c t‡c giả nghi•n cứu thải trừ DNA ph™i thai tuần hoˆn sau sinh Năm 1999, Lo vˆ CS nghi•n cứu c‡c thai phụ mang thai nam, thấy thời gian b‡n hủy t/2 DNA ph™i thai tự khoảng 16,3 phœt (từ 4Ð30 phœt) [14] Nghi•n cứu Smid vˆ CS (2003), nồng độ DNA thai sau sinh thấp vˆ kh™ng ph‡t DNA thai sau sinh ngˆy [34] Nghi•n cứu gần đ‰y Tsui vˆ CS (2012) c— thể ph‡t DNA thai nước tiểu thai phụ kỹ thuật MPS (massively parallel sequencing) thải trừ hết sau sinh ngˆy [35] Năm 2013, Stephanie vˆ CS thấy tốc độ giải ph—ng DNA ph™i thai tự vˆo tuần hoˆn thai phụ sau sinh xảy giai đoạn với chế động học kh‡c nhau: giai đoạn ban đầu nhanh với thời gian b‡n hủy t/2 khoảng 1h, giai đoạn chậm với thời gian b‡n hủy t/2 khoảng 13h, nhi•n sau sinh 1-2 ngˆy kh™ng ph‡t DNA ph™i thai tự [36] Do đ—, với giả thuyết kh™ng c— thay đổi đột ngột thải trừ DNA ph™i thai tự lưu hˆnh tuần hoˆn mẹ qu‡ tr“nh chuyển vˆ đẻ, c‡c t‡c giả t’nh to‡n để tr“ t“nh trạng ổn định, DNA ph™i thai tự c— thể giải ph—ng tiếp tục vˆo tuần hoˆn mẹ với tốc độ trung b“nh 2,24Ð104 copy/phœt Với tốc độ giải ph—ng vˆ thải trừ nhanh ch—ng, số lượng DNA ph™i thai đ‹ cung cấp tranh toˆn cảnh vˆ chi tiết theo thời gian sản xuất vˆ thải trừ DNA ph™i thai tự do, v“ c— ’ch cho gi‡m s‡t thai nghŽn 1.1.4.!T“nh h“nh nghi•n cứu DNA ph™i thai tự nước ngoˆi vˆ Việt Nam 1.1.4.1.! Ở nước ngoˆi a, DNA ph™i thai tự vˆ tiền sản giật Hai năm sau ph‡t c— DNA ph™i thai tự lưu hˆnh huyết tương thai phụ, Lo vˆ CS tiến hˆnh nghi•n cứu 20 thai phụ tiền sản giật (TSG), sử dụng kỹ thuật Realtime PCR định lượng nồng độ DNA ph™i thai tự vˆ chứng minh nồng độ DNA ph™i thai tự nh—m thai phụ TSG đ‹ tăng gấp lần so với nh—m thai phụ b“nh thường c— tuổi thai tương ứng [14] Kết nˆy tương tự nghi•n cứu số t‡c giả kh‡c Leung vˆ CS (2001) nghi•n cứu 18 thai phụ c— tuần thai trung b“nh lˆ 17 tuần (dao động từ 11 - 22 tuần) định lượng nồng độ DNA ph™i thai trước c— triệu chứng TSG lˆ 42 copy/ml (dao động 36 Ð 2375 copy/ml) đ— nh—m chứng (33 thai phụ) nồng độ DNA ph™i thai tương ứng lˆ 22 copy/ml (dao động từ 4,2 - 300 copy/ml) vˆ Zhong vˆ CS (2002) thấy c— gia tăng nồng độ DNA ph™i thai huyết tương thai phụ TSG [16],[20] Một nghi•n cứu tiến hˆnh với cỡ mẫu lớn bao gồm 120 thai phụ b“nh thường vˆ 120 thai phụ TSG, t‡c giả thấy nồng độ DNA ph™i thai tự huyết tương thai phụ TSG tăng cao gấp 2-5 lần so với nh—m thai phụ b“nh thường c— c•ng tuổi thai tương ứng, đồng thời thai phụ tiến triển thˆnh TSG nồng độ DNA ph™i thai tự tăng đột ngột vˆo thời điểm tuần 17 vˆ tuần 28, khoảng tuần trước c— triệu chứng TSG [37] Năm 2004, Bianchi vˆ CS ph‡t thấy nồng độ DNA ph™i thai tự c‡c mẫu huyết tương tăng l•n c‡ch c— ý nghĩa lần đầu ti•n từ tuần thai thứ 17 vˆ lần thứ hai vˆo thời điểm tuần trước c— triệu chứng l‰m sˆng TSG T‡c giả đưa giả thuyết rằng: nồng độ DNA tăng lần đầu ti•n lˆ hoại tử rau thai c‡c tế bˆo chết theo chương tr“nh, c˜n nồng độ DNA tăng lần thứ hai 10 lˆ c‡c triệu chứng TSG lˆm rối loạn c‡c chức mẹ kŽo theo rối loạn bˆi tiết DNA ph™i thai [19] Zhong vˆ CS (2004) định lượng nồng độ DNA ph™i thai trước c— triệu chứng TSG lˆ 423 copy/ml (dao động 97 - 1642 copy/ml), nh—m chứng: 129 copy/ml (dao động từ 31 - 318 copy/ml) [38] Trước đ—, Lo vˆ CS (1999) đ‹ chứng minh: b•n cạnh nồng độ DNA ph™i thai tự tăng cao c˜n k•m theo tăng lưu hˆnh tế bˆo thai c— nh‰n huyết tương thai phụ TSG [14] Nghi•n cứu năm 2005, định lượng nồng độ DNA ph™i thai tự huyết tương c‡c thai phụ b“nh thường vˆ thai phụ TSG kỹ thuật Realtime PCR sử dụng cặp mồi gen DYS14 thay v“ cặp mồi gen SRY c‡c nghi•n cứu trước lại thấy nồng độ DNA ph™i thai huyết tương nh—m thai phụ TSG tăng cao gấp 10 lần so với nh—m thai phụ b“nh thường [39] Ban đầu, c‡c t‡c giả cho nồng độ DNA ph™i thai tự huyết tương thai phụ tăng cao lˆ kết hợp rau thai bất thường dẫn tới lˆm gia tăng nồng độ DNA ph™i thai tự vˆ chức gan vˆ thận bị suy giảm dẫn tới lˆm giảm độ thải DNA ph™i thai tự tuần hoˆn [7],[40] Một nghi•n cứu kh‡c đ‹ chứng minh nồng độ DNA ph™i thai tự lưu hˆnh huyết tương nh—m thai phụ TSG cao nh—m thai phụ b“nh thường tuần 17 - 20 thai kỳ, nhi•n, kh‡c biệt kh™ng đ‡ng kể nồng độ DNA ph™i thai tự hai nh—m nˆy tuần từ 25 - 28 thai kỳ vˆ kh™ng c— kh‡c biệt tuần từ 13 - 16 thai kỳ [37] Theo nghi•n cứu Sifakis vˆ CS (2009), thai phụ c— nồng độ DNA ph™i thai tự lưu hˆnh huyết tương thai phụ tăng tuần 11- 13 thai kỳ th“ tiến triển thˆnh TSG nặng giai đoạn sau thai kỳ, nhi•n, thai phụ tiến triển thˆnh TSG nhẹ th“ nồng độ DNA ph™i thai tự tương đương với nh—m thai phụ b“nh thường [9] Seval M.M vˆ CS (2015) d•ng kỹ thuật Realtime PCR để định lượng DNA ph™i thai tự 16 thai phụ c— thai từ 137 Zhong X.Y., Gebhardt S., Hillermann R., et al (2005) Parallel assessment of circulatory fetal DNA and corticotropin-releasing hormone mRNA in earlyand late-onset preeclampsia Clin Chem, 51 (9), 1730-1733 138 DÕSouza Edna, Nair Sona, Nadkarni Anita, et al (2012) SRY sequence in maternal plasma: Implications for non-invasive prenatal diagnosis: First report from India Indian Journal of Human Genetics, 18 (1), 87-90 139 Tjoa M.L., Cindrova-Davies T., Spasic-Boskovic O., et al (2006) Trophoblastic oxidative stress and the release of cell-free feto-placental DNA Am J Pathol., 169, 400-404 140 Gauthier V.J., Tyler L.N vˆ Mannik M (1996) Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice J Immunol, 156 (3), 1151-1156 141 Zeerleder S (2006) The struggle to detect circulating DNA Crit Care, 10 (3), 142 142 Julian C.G (2011) High altitude during pregnancy Clin Chest Med, 32,21-31 143 Eric Wang, Annette Batey, Craig Struble, et al (2013) Gestational age and maternal weight effects on fetal cell-free DNA in maternal plasma Prenat Diagn, 33, 662-666 144 Wataganara T., Peter I., Messerlian GM., et al (2004) Inverse correlation between maternal weight and second trimester circulating cell-free fetal DNA levels Obstet Gynecol, 104, 545-550 145 Taglauer ES., Wilkins-Haug L vˆ Bianchi DW (2014) Review: Cell-free fetal DNA in the maternal circulation as an indication of placental health and disease Placenta, 35 (Suppl), S64-68 146 Tao H., Wang X.M vˆ Ji X.H (2005) [Study on the relation between concentration of circulating non-host fetal DNA in pregnant women and preeclampsia] Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi, 40 (12), 808-811 147 Hahn S., Rusterholz C., Hosli I., et al (2011) Cell-free nucleic acids as potential markers for preeclampsia Placenta, 32 Suppl, S17-20 148 Palmer S.K., Moore L.G., Young D., et al (1999) Altered blood pressure course during normal pregnancy and increased preeclampsia at high altitude (3100 meters) in Colorado Am J Obstet Gynecol, 180 (5), 1161-1168 149 Zhong X.Y., Laivuori H., Y O Livingston J.C., et al (2001) Elevation of both maternal and fetal extracellular circulating deoxyribonucleic acid concentrations in the plasma of pregnant women with preeclampsia Am J Obstet Gynecol, 184 (3), 414-419 150 Enninga E.A L., Nevala W.K., Holtan S.G., et al (2015) Immune Reactivation by Cell-Free Fetal DNA in Healthy Pregnancies Re-Purposed to Target Tumors: Novel Checkpoint Inhibition in Cancer Therapeutics Frontiers in Immunology, (424) 151 Papantoniou N., Bagiokos V., Agiannitopoulos K., et al (2013) RASSF1A in maternal plasma as a molecular marker of preeclampsia Prenat Diagn, 33 (7), 682-687 152 Crowley A., Martin C., Fitzpatrick P., et al (2007) Free fetal DNA is not increased before 20 weeks in intrauterine growth restriction or pre-eclampsia Prenat Diagn, 27 (2), 174-179 153 Poon L.C., Musci T., Song K., et al (2013) Maternal plasma cell-free fetal and maternal DNA at 11-13 weeks' gestation: relation to fetal and maternal characteristics and pregnancy outcomes Fetal Diagn Ther, 33 (4), 215-223 154 Stein W., Muller S., Gutensohn K., et al (2013) Cell-free fetal DNA and adverse outcome in low risk pregnancies Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 166 (1), 10-13 155 Contro E., Bernabini D vˆ Farina A (2017) Cell-Free Fetal DNA for the Prediction of Pre-Eclampsia at the First and Second Trimesters: A Systematic Review and Meta-Analysis Mol Diagn Ther, 21 (2), 125-135 156 Finning K.M., Martin P.G., Soothill P.W., et al (2002) Prediction of fetal D status from maternal plasma: introduction of a new noninvasive fetal RHD genotyping service Transfusion, 42 (8), 1079-1085 157 Kim S.Y., Kim H.J., Park S.Y., et al (2016) Early Prediction of Hypertensive Disorders of Pregnancy Using Cell-Free Fetal DNA, Cell-Free Total DNA, and Biochemical Markers Fetal Diagn Ther, 40 (4), 255-262 158 Kumar N vˆ Singh A.K (2018) Cell-Free Fetal DNA: A Novel Biomarker for Early Prediction of Pre-eclampsia and Other Obstetric Complications Curr Hypertens Rev, 159 Roberts J.M vˆ Bell M.J (2013) If we know so much about preeclampsia, why havenÕt we cured the disease? J Reprod Immunol, 99, 1-9 160 Steegers E.A., Von Dadelszen P., Duvekot J.J., et al (2010) Preeclampsia Lancet 376, 631-644 161 Conde-Agudelo A., Villar J vˆ Lindheimer M (2004) World Health Organization systematic review of screening tests for pre-eclampsia Obstet Gynecol., 104 (1367-1391), 162 Hui L (2013) Non-invasive prenatal testing for fetal aneuploidy: Charting the course from clinical validity to clinical utility Ultrasound Obstet Gynecol, 41, 2-6 163 Sifakis S., Koukou Z vˆ Spandidos D.A (2015) Cell-free fetal DNA and pregnancy-related complications (review) Mol Med Rep., 11 (4), 2367-2372 B GIỗO DỤC VË ĐËO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HË NỘI NGUYỄN THỊ PHƯƠNG LAN NGHIæN CỨU DNA PHïI THAI TỰ DO TRONG HUYẾT TƯƠNG THAI PHỤ BẰNG K THUT REALTIME PCR NHM D BỗO SM TIN SN GIẬT Chuy•n ngˆnh: Dị ứng vˆ miễn dịch M‹ số : 62720109 LUN ỗN TIN S Y HC Ngi hng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thanh Thœy PGS.TS Nguyễn Đức Hinh HË NỘI Ð 2018 LỜI CẢM ƠN Để hoˆn thˆnh luận ‡n nghi•n cứu sinh m“nh, t™i xin bˆy tỏ l˜ng k’nh trọng vˆ biết ơn s‰u sắc tới: - PGS.TS Nguyễn Thanh Thœy - Ph— trưởng Bộ m™n Sinh lý bệnh Miễn dịch Trường Đại học Y Hˆ Nội - PSG.TS Nguyễn Đức Hinh - Hiệu trưởng, Ph— trưởng Bộ m™n Phụ Sản - Trường Đại học Y Hˆ Nội Hai người Thầy đ‹ trực tiếp hướng dẫn, d“u dắt, động vi•n, giœp đỡ vˆ tạo điều kiện thuận lợi cho t™i suốt qu‡ tr“nh học tập vˆ nghi•n cứu để hoˆn thˆnh Lun n ny - PGS.TS Nguyn Duy ỗnh - Gim đốc Bệnh viện Phụ Sản Hˆ Nội, Ph— trưởng Bộ m™n Phụ Sản, chủ nhiệm đề tˆi "Nghi•n cứu kết hợp si•u ‰m vˆ định lượng DNA ph™i thai ứng dụng dự b‡o sớm tiền sản giật" đ‹ c— nhiều ý kiến quý b‡u vˆ tạo điều kiện thuận lợi để t™i c— thể hoˆn thˆnh Luận ‡n - Thầy, C™ Chủ tịch Hội đồng, c‡c Thầy, C™ Hội đồng chấm luận ‡n đ‹ c— nhiều ý kiến quý b‡u giœp t™i hoˆn thiện Luận ‡n Trong qu‡ tr“nh học tập vˆ nghi•n cứu để hoˆn thˆnh luận ‡n, t™i đ‹ nhận nhiều giœp đỡ, đ—ng g—p ý kiến quý b‡u Nhˆ Trường, Đơn vị c™ng t‡c, c‡c Thầy, C™, bạn b•, đồng nghiệp vˆ gia đ“nh T™i xin tr‰n trọng cảm ơn: - Ban gi‡m hiệu Trường Đại học Dược Hˆ Nội, Ban Gi‡m hiệu Trường Đại học Y Hˆ Nội đ‹ tạo điều kiện giœp đỡ t™i hoˆn thˆnh Luận ‡n nˆy - PGS.TS Phạm Đăng Khoa, nguy•n Trưởng m™n Sinh lý bệnh - Miễn dịch Trường Đại học Y Hˆ Nội, người Thầy đ‹ ủng hộ, dˆnh cho t™i nhiều thuận lợi qu‡ tr“nh học tập Bộ m™n - ThS Hồ Quang Huy, gi‡o vụ Sau đại học Bộ m™n Sinh lý bệnh - Miễn dịch Trường Đại học Y Hˆ Nội đ‹ nhiệt t“nh, c— tr‡ch nhiệm vˆ tạo điều kiện thuận lợi để t™i hoˆn thˆnh Luận ‡n - TS Nguyễn Thị Thường - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương vˆ TS L• Ngọc Anh - Trường Đại học Y Hˆ Nội đ‹ giœp đỡ vˆ c— nhiều ý kiến quý b‡u giœp t™i hoˆn thiện Luận ‡n - ThS Nguyễn Thị Hiền - Trưởng Bộ m™n Y học sở Trường Đại học Dược Hˆ Nội đ‹ giœp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho t™i suốt qu‡ tr“nh học tập vˆ c™ng t‡c - Ban chủ nhiệm, c‡c Thầy, C™ vˆ anh chị Bộ m™n Sinh lý bệnh Miễn dịch Trường Đại học Y Hˆ Nội, Ph˜ng Đˆo tạo Sau đại học Trường Đại học Y Hˆ Nội, Bộ m™n Y học sở Trường Đại học Dược Hˆ Nội, Trung t‰m chẩn đo‡n trước sinh Bệnh viện Phụ Sản Hˆ Nội, Khoa kh‡m bệnh vˆ Khoa Sản bệnh Bệnh viện Phụ sản Trung ương, Ph˜ng kh‡m Vạn Phœc đ‹ động vi•n vˆ tạo điều kiện cho t™i hoˆn thˆnh Luận ‡n CN Nguyễn Minh Huyền, KTV Đỗ Thị Hương Bộ m™n Sinh lý bệnh Miễn dịch Trường Đại học Y Hˆ Nội đ‹ tham gia thực kỹ thuật vˆ giœp đỡ t™i thời gian thực đề tˆi nghi•n cứu Bộ m™n T™i xin gửi lời cảm ơn tới c‡c thai phụ đ‹ đồng ý tham gia nghi•n cứu để t™i c— số liệu luận ‡n nˆy T™i xin ch‰n thˆnh cảm ơn bạn b•, đồng nghiệp đ‹ ủng hộ t™i suốt qu‡ tr“nh học tập vˆ nghi•n cứu Sau c•ng, t™i xin cảm ơn bố mẹ, chồng, c‡c vˆ người th‰n gia đ“nh đ‹ hết l˜ng ủng hộ, động vi•n t™i suốt qu‡ tr“nh học tập vˆ lˆ nguồn động lực giœp t™i vượt qua kh— khăn để hoˆn thˆnh Luận ‡n Hˆ Nội, th‡ng năm 2018 Nguyễn Thị Phương Lan LỜI CAM ĐOAN T™i lˆ Nguyễn Thị Phương Lan, nghi•n cứu sinh kh—a 29 Trường Đại học Y Hˆ Nội, chuy•n ngˆnh Dị ứng - Miễn dịch, xin cam đoan: Љy lˆ luận ‡n th‰n t™i trực tiếp thực hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thanh Thœy - Bộ m™n Sinh lý bệnh - Miễn dịch vˆ PGS.TS Nguyễn Đức Hinh - Bộ m™n Phụ Sản Trường Đại học Y Hˆ Nội C™ng tr“nh nˆy kh™ng tr•ng lặp với nghi•n cứu nˆo kh‡c đ‹ c™ng bố Việt Nam C‡c số liệu vˆ th™ng tin nghi•n cứu lˆ hoˆn toˆn ch’nh x‡c, trung thực vˆ kh‡ch quan, đ‹ x‡c nhận vˆ chấp thuận sở nơi nghi•n cứu T™i xin hoˆn toˆn chịu tr‡ch nhiệm trước ph‡p luật cam kết nˆy Hˆ Nội, ngˆy 30 th‡ng năm 2018 Người viết cam đoan Nguyễn Thị Phương Lan MỤC LỤC Mục lục Đặt vấn đề Chương Tổng quan 1.1.! Tổng quan DNA ph™i thai tự lưu hˆnh huyết tương thai phụ 1.1.1.!Nguồn gốc DNA ph™i thai tự 1.1.2.!K’ch thước DNA ph™i thai tự 1.1.3.!Thời gian b‡n hủy t/2 DNA ph™i thai tự 1.1.4.!T“nh h“nh nghi•n cứu DNA ph™i thai tự nước ngoˆi vˆ Việt Nam 1.2.! Tổng quan tiền sản giật 14 1.2.1.!Kh‡i niệm tiền sản giật 14 1.2.2.!Yếu tố nguy vˆ chế bệnh sinh tiền sản giật 15 1.2.3.!Một số triệu chứng điển h“nh tiền sản giật 19 1.2.4.!Ph‰n loại vˆ chẩn đo‡n tiền sản giật 20 1.2.5.!Ti•n lượng 21 1.2.6.!C‡c biến chứng tiền sản giật 21 1.2.7.!Một số dấu ấn sinh học sử dụng chẩn đo‡n, theo d›i 24 tiền sản giật 1.3.! Kỹ thuật Realtime PCR định lượng DNA 26 1.3.1.!Kỹ thuật PCR 26 1.3.2.!Kỹ thuật Realtime PCR 28 Chương Đối tượng vˆ phương ph‡p nghi•n cứu 38 2.1.! Đối tượng nghi•n cứu 38 2.1.1! Ti•u chuẩn lựa chọn đối tượng nghi•n cứu 38 2.1.2! Ti•u chuẩn loại trừ 39 2.2.! Cỡ mẫu nghi•n cứu 39 2.3.! Phương ph‡p nghi•n cứu 39 2.3.1.! Thiết kế nghi•n cứu 39 2.3.2.! C‡c bước tiến hˆnh nghi•n cứu 40 2.3.3.! C‡c số cần x‡c định nghi•n cứu 43 2.3.4.! Kỹ thuật x‡c định c‡c số nghi•n cứu 43 2.4.! Địa điểm vˆ thời gian nghi•n cứu 51 2.5.! Trang thiết bị vˆ m‡y m—c phục vụ nghi•n cứu 52 2.6.! Phương ph‡p ph‰n t’ch số liệu 52 2.7.! Đạo đức nghi•n cứu 53 Chương Kết nghi•n cứu 54 3.1.! Một số đặc điểm đối tượng nghi•n cứu 54 3.1.1.! Đặc điểm tuổi vˆ huyết ‡p 54 3.1.2.! Tuổi thai đối tượng nghi•n cứu 54 3.1.3.! Đặc điểm tỷ lệ ph• 55 3.1.4.! Một số đặc điểm huyết học 56 3.1.5.! Một số đặc điểm h—a sinh m‡u 58 3.1.6.! Ph‰n bố mức protein niệu 58 3.1.7.! Một số đặc điểm trẻ sơ sinh c‡c sản phụ b“nh thường vˆ tiền 59 sản giật 3.2.! Hoˆn chỉnh vˆ x‰y dựng đường chuẩn kỹ thuật Realtime 60 PCR để định lượng DNA ph™i thai tự huyết tương thai phụ 3.2.1.! Chiết t‡ch DNA 60 3.2.2.! Thực kỹ thuật PCR lồng để ph‡t DNA sau chiết t‡ch 60 3.2.3.! Thực kỹ thuật PCR lồng để kiểm tra c— mặt đoạn gen 62 cần định lượng huyết tương thai phụ 3.2.4.! Hoˆn chỉnh vˆ x‰y dựng đường chuẩn kỹ thuật Realtime PCR để định lượng DNA ph™i thai tự huyết tương thai phụ 63 3.3.! Định lượng nồng độ DNA ph™i thai tự huyết tương 69 thai phụ kỹ thuật Realtime PCR 3.3.1.! Định lượng nồng độ DNA ph™i thai tự huyết tương thai 69 phụ b“nh thường 3.3.2.! Định lượng nồng độ DNA ph™i thai tự huyết tương thai 70 phụ tiền sản giật 3.3.3.! X‡c định thay đổi nồng độ DNA ph™i thai huyết tương 74 thai phụ b“nh thường vˆ thai phụ tiền sản giật Chương Bˆn luận 75 4.1.! Một số đặc điểm đối tượng nghi•n cứu 76 4.2.! Hoˆn chỉnh vˆ x‰y dựng đường chuẩn kỹ thuật Realtime 78 PCR định lượng DNA ph™i thai tự huyết tương thai phụ 4.2.1.! Hoˆn chỉnh kỹ thuật chiết t‡ch DNA ph™i thai tự theo quy tr“nh 78 Randen I vˆ CS 4.2.2.! Kết PCR lồng kiểm tra DNA sau chiết t‡ch 79 4.2.3.! Kết PCR lồng để ph‡t đoạn gen cần định lượng 79 4.2.4.! Hoˆn chỉnh vˆ x‰y dựng đường chuẩn kỹ thuật Realtime PCR 80 4.3.! Nồng độ DNA ph™i thai tự huyết tương mẹ nh—m 85 thai phụ b“nh thường vˆ thai phụ tiền sản giật, ứng dụng dự b‡o sớm tiền sản giật 4.3.1.! Nồng độ DNA ph™i thai tự huyết tương thai phụ b“nh 86 thường 4.3.2.! Nồng độ DNA ph™i thai tự huyết tương thai phụ tiền sản 92 giật Kết luận 104 Kiến nghị 105 Tˆi liệu tham khảo Phụ lục DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT αFP anpha-fetoprotein CI: Confidence Interval (Khoảng tin cậy) Coef Coefficient (hệ số) Ct: Threshold cycle (Chu kỳ ngưỡng) DNA: Deoxyribonucleic acid E: Eficiency (Hiệu quả) HATT: Huyết ‡p t‰m thu HATTr: Huyết ‡p t‰m trương HCG Human Chorionic Gonadotropin IL: Interleukin Nested PCR: Nested Polymerase Chain Reaction (PCR lồng) NST: Nhiễm sắc thể OR: Odds Ratio (Tỷ suất ch•nh) PCR: Polymerase Chain Reaction RhD: Rhesus D RNA: Ribonucleic acid RR: Relative Risk (Nguy tương đối) Sq: Starting quantity (Số lượng DNA đ’ch ban đầu) SRY: Sex-determining region of Y (V•ng định giới nằm tr•n NST Y) THA: Tăng huyết ‡p TSG: Tiền sản giật WHO: World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Một số yếu tố nguy tiền sản giật 15 Bảng 1.2 Ph‰n loại tiền sản giật 21 Bảng 2.1 Tr“nh tự mồi phản ứng PCR x‡c định gen NST X 45 Bảng 2.2 Tr“nh tự mồi phản ứng PCR x‡c định gen NST Y 47 Bảng 2.3 Tr“nh tự mồi vˆ mẫu d˜ phản ứng Realtime PCR x‡c 49 định gen SRY NST Y Bảng 3.1 Một số đặc điểm tuổi, huyết ‡p đối tượng nghi•n 54 cứu Bảng 3.2 Thống k• tuổi thai đối tượng nghi•n cứu 55 Bảng 3.3 T“nh trạng ph• đối tượng nghi•n cứu 55 Bảng 3.4 Một số đặc điểm huyết học đối tượng nghi•n cứu 56 Bảng 3.5 Đặc điểm số lượng hồng cầu, hematocrit, hemoglobin 57 đối tượng nghi•n cứu Bảng 3.6 Đặc điểm h—a sinh m‡u đối tượng nghi•n 58 cứu Bảng 3.7 Ph‰n bố mức độ protein niệu thai phụ 58 Bảng 3.8 Trọng lượng thai lœc đẻ 59 Bảng 3.9 H“nh thức đẻ 59 Bảng 3.10 Bảng đo độ tinh DNA chiết t‡ch đối tượng 60 nghi•n cứu Bảng 3.11 Kết kiểm tra vˆ ph‡t DNA sau chiết t‡ch PCR lồng với cặp mồi X1X2, X1X3 61 Bảng 3.12 Kết kiểm tra vˆ ph‡t DNA gen SRY sau 62 chiết t‡ch PCR lồng với cặp mồi Y1.5Y1.6 vˆ Y1.7Y1.8 Bảng 3.13 Nồng độ DNA ph™i thai tự trung b“nh c‡c quý 69 nh—m thai phụ b“nh thường Bảng 3.14 Nồng độ DNA ph™i thai tự trung b“nh c‡c quý 71 nh—m thai phụ tiền sản giật Bảng 3.15 Mối tương quan nồng độ DNA ph™i thai huyết 72 tương với số yếu tố thai phụ tiền sản giật Bảng 3.16 Mối tương quan nồng độ DNA ph™i thai với tuần 73 thai, ph•, huyết ‡p t‰m thu, huyết ‡p t‰m trương thai phụ tiền sản giật Bảng 3.17 Mối tương quan nồng độ DNA ph™i thai với tuần 73 thai, ph• vˆ protein niệu thai phụ tiền sản giật Bảng 3.18 Nồng độ DNA ph™i thai tự huyết tương 74 nh—m thai phụ b“nh thường vˆ thai phụ tiền sản giật quý thai kỳ Bảng 4.1 Liệt k• c‡c k•nh k’nh lọc nguồn s‡ng k’ch th’ch vˆ k•nh 83 lọc huỳnh quang c— tr•n IQ5 tương ứng với c‡c reporter khuyến c‡o sử dụng C‡c chữ đậm lˆ reporter tối ưu chọn cho mˆu Bảng 4.2 Nồng độ DNA ph™i thai tự nh—m thai phụ b“nh 87 thường Bảng 4.3 Nồng độ DNA ph™i thai tự nh—m thai phụ b“nh thường vˆ nh—m thai phụ tiền sản giật 92 DANH MỤC HíNH Trang H“nh 1.1 Động mạch xoắn ốc thai phụ b“nh thường vˆ thai phụ 18 tiền sản giật H“nh 1.2 T—m tắt chế bệnh sinh tiền sản giật 19 H“nh 1.3 Minh họa biểu đồ khuếch đại vẽ l•n c‡c đường biểu diễn 29 khuếch đại mẫu chuẩn vˆ mối quan hệ số lượng DNA đ’ch c— c‡c mẫu chuẩn vˆ chu kỳ ngưỡng tương ứng H“nh 1.4 Minh họa biểu đồ khuếch đại thể c‡c đường biểu diễn 30 khuếch đại mẫu chuẩn vˆ mối quan hệ số lượng DNA đ’ch c— c‡c mẫu chuẩn vˆ chu kỳ ngưỡng tương ứng H“nh 1.5 T—m tắt chế hoạt động sử dụng chất huỳnh quang 31 lˆ SYBR-I Realtime PCR H“nh 1.6 T—m tắt chế hoạt động Taqman Probe 32 Realtime PCR H“nh 1.7 T—m tắt chế hoạt động Beacon probe 33 Realtime PCR H“nh 1.8 T—m tắt chế hoạt động probe lai Realtime 34 PCR H“nh 3.1 H“nh ảnh điện di sản phẩm sau PCR lồng với cặp mồi 61 X1X3 vˆ X2X3 H“nh 3.2 H“nh ảnh điện di sản phẩm sau PCR lồng với cặp mồi 63 Y1.5Y1.6 vˆ Y1.7Y1.8 H“nh 3.3 E.coli c— chứa plasmid TOPO 65 H“nh 3.4 H“nh ảnh điện di sản phẩm sau PCR kiểm tra DNA 65 gen SRY c— plasmid H“nh 3.5 H“nh ảnh điện di sản phẩm sau PCR với cặp mồi SRY - 66 245R vˆ SRY - 109F H“nh 3.6 Đường chuẩn gen SRY cho t’n hiệu tốt với E = 96,3% 67 vˆ R*2 = 0,991 H“nh 3.7 Đường chuẩn gen SRY cho t’n hiệu tốt với E= 90% 68 vˆ R*2 = H“nh 4.1 DNA ph™i thai tự k’ch hoạt qu‡ tr“nh vi•m th™ng qua 96 thụ thể TLR-9 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 3.1 Mối li•n quan tuần thai vˆ nồng độ DNA ph™i thai 70 tự nh—m thai phụ b“nh thường Biểu đồ 3.2 Mối li•n quan tuần thai vˆ nồng độ DNA ph™i thai 71 tự nh—m thai phụ tiền sản giật Biểu đồ 3.3 Nồng độ DNA ph™i thai tự (log) huyết tương thai phụ b“nh thường vˆ thai phụ tiền sản giật quý thai kỳ 74 ... nghi•n cứu đề tˆi "Nghi•n cứu DNA ph™i thai tự huyết tương thai phụ kỹ thuật Realtime PCR nhằm dự b‡o sớm tiền sản giật" với c‡c mục ti•u sau: 1.! Hoˆn chỉnh vˆ x y dựng đường chuẩn kỹ thuật Realtime. .. huyết tương thai phụ mang thai dị tật kỹ thuật Realtime PCR, kết cho th y nồng độ DNA ph™i thai tự nước ối trung b“nh lˆ 3978 copy/ml nước ối vˆ huyết tương lˆ 96,6 copy/ml huyết tương thai phụ, ... kỹ thuật Realtime PCR để định lượng DNA ph™i thai tự lưu hˆnh huyết tương thai phụ 2.! Їnh gi‡ nồng độ DNA ph™i thai tự huyết tương thai phụ b“nh thường vˆ thai phụ tiền sản giật 3 Chương TỔNG