Đặc tính sinh hóa và môi trường chromagar phát hiện streptococcus agalactiae

Đề tài: Đặc tính sinh hóa môi trường Chromagar phát Streptococcus agalactiae Phần Đặc tính sinh hóa Streptococcus agalactiae 1.Cấu tạo Thuộc chi Streptococcus, họ Streptococcaceae, Lactobacillales Vi khuẩn hình cầu Đăc tính Gram dương không sinh bào tử Không di động Sinh sản theo hình thức nhân đôi Nhiệt độ tối ưu 30-37°C, không phát triển 45°C Phát triển độ mặn 0-3% Có khả sử dụng Arginine số đường Ribose, glucose, maltose,saccharose, không thủy phân tinh bột - Khả lên men Ribose Glucose Manitol Sorbitol Lactose Inuline Maltose Saccharose + + - - - - + + Đặc tính sinh hóa Streptococcus Agalactiae Nhóm A B C D G esterase + - + + + Photsphatase + + + - + β-glucosidase - - - + - α- glucosidase - + - - - Glucosaminidase - - - + - Tác hại -Gây bệnh cho cá, động vật có vú người - Thường gặp đường tiêu hóa, đường sinh dục, tác nhân nhiễm khuẩn liên quan đến thai kỳ trẻ sơ sinh với tỷ lệ mắc tử vong cao - Ở phụ nữ mang thai: Gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu, viêm màng ối, viêm nội mạc tử cung, Ở trẻ sơ sinh: nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi, viêm màng não, viêm tủy, viêm tủy xương Ở người lớn: Viêm màng não, viêm khớp nhiễm khuẩn, viêm xương tủy… Ở cá: gây xuất huyết, phù mắt,… chết hàng loạt Cơ chế gây bênh • Sinh độc tố • Làm suy giảm hệ miễn dịch Phần 2: Môi trường CHROMagar phát Streptococcus Agalactiae • - Chromagar Strep B phân lập Streptococcus nhóm B (S.agalactiae) màu sắc khác khuẩn lạc • Chủng chọn lọc dựa vào xuất môi trường kết hợp kháng sinh Các đặc tính khác biệt dựa vào phản ứng với enzyme đặc hiệu, cho phép phân biệt khuẩn lạc S.agalactiae từ vi khuẩn khác không bị ức chế môi trường chọn lọc (ví dụ Enterococci) phát triển có màu xanh cây, màu xám, không màu có màu hồng mép khuẩn lạc không màu Streptococcus nhóm B : màu tím hoa cà đến hồng Các vi khuẩn gram dương cấc chủng vi khuẩn khác: màu xanh, không màu bị ức chế Thành phần Product = Base + Supplement S1 + Supplement S2 Total g/L 44.7 g/L ml/ L 0.25 g/L Composition g/L Agar 15.0 Growth factors mix Selective mix 0.25 Salts 7.5 Peptones and yeast extract 20.0 Chromogenic mix 2.2 Aspect Powder form Liquid form Powder form Storage 15/30°C 15/30°C 2/8°C Final media pH 7.3 +/- 0.2 Thành phần môi trường Brain Heart Infusion Hàm lượng 4.84 g/l Tác dụng Được làm từ não tim bò heo Rất giàu dinh dưỡng, cung cấp chất cần thiết cho sự phát triển phục hồi vi sinh vật Cao thịt 1.96 g/l Thường làm từ thịt bò Mục đích cung cấp nito dạng axitamin Biotin( vitamin H/ vitamin B7) g/l Cố định CO2 biotrypcase 7.2 g/l Cung cấp dinh dưỡng, axit amin Na2CO3 0.3 g/l Khi vi khuẩn phát triển sinh nhiều axit làm pH môi trường giảm xuống Mà pH môi trường Chromagar 7,3+/-0,2 Do natri cacbonat thêm vào để điều chỉnh pH Natri pyruvate g/l Natri pyruvate thường thêm vào môi trường nuôi cấy để bổ sung lượng, đồng thời có tác dụng bảo vệ chống lại hydrogen peroxide Axit đệm HEPES 0.4 g/l Điều chỉnh pH lactalbumin peptone g/l Cung cấp dinh dưỡng(whey protein sữa), số vitamin, đường glucose g/l Cung cấp cacbon, lượng agar 14 g/l Tác nhân làm đặc môi trường 5-bromo-4-chloro-3-indolyloctanoate (X-C8) 0.3 g/l Streptococcus Agalactiae phản ứng âm tính với chất X-C8 18h đầu Sau 18h cho khuẩn lạc màu xanh 6-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside (Rose-α-Glu) 0.3 g/l Khi sử dụng kết hợp chất esterase phosphatase α-glucosidase khuẩn lạc 6-chloro-3-indolyl phosphate (Rose-P) 0.3 g/l Strep B cho màu hồng đến tím hoa cà Nhóm Enterococcus, Staphylococcus cho khuẩn lạc có màu xanh Na2HPO4 0.5 g/l cung cấp photpho, thành phần acid nucleic, nucleoprotein, phospholipid, coenzyme, ATP Làm nên hệ thống đệm giúp điều chỉnh pH môi trường K2HPO4 0.5 g/l aztreonam 0.064g/l Ức chế vi khuẩn Gram (-) Tuy nhiên không ức chế Enterococcus faecalis amphotericin B 0.004g/l Chống nấm men, nấm mốc Các bước chuẩn bị ( lít) Bảo quản Cấy mẫu • • • • • • • Môi trường sau pha có màu be, mịn, đồng Lưu trữ nơi tối trước sử dụng Môi trường pha chế giữ ngày nhiệt độ phòng Các đĩa lưu giữ đến tháng tủ lạnh(2/8C) chuẩn bị cách tránh ánh sáng nước Nếu đĩa thạch làm lạnh, để nhiệt độ phòng trước cấy Cấy thành vệt dài lên đĩa Ủ điều kiện hiếu khí 37C 18-24 Quan sát xuất khuẩn lạc điển hình sau 24 ủ Nếu khuẩn lạc xuất có khuẩn lạc khó quan sát màu sắc trộn lẫn môi trường kéo dài thời gian ủ lên 48h Vi sinh vật Hình thái khuẩn lạc Streptococcus agalactiae Tím hoa cà đến hồng Enterococcus species Màu xanh thép Lactobacilli, leuconostoc, lactococci Màu hồng nhạt Tăng trưởng không đáng kể bị ức chế Vi sinh vật khác Xanh, không màu bị ức chế Giải thích • • • Hiệu suất giới hạn thải Một số vi sinh vật xuất dạng khuẩn lạc màu tím nhạt aerococcus, lactobacillus, lactococcus leuconostoc Một vài loại streptococcus tập trung nhóm A trở nên mờ nhạt dương tính giả Tuy nhiên ta phân biệt với thử nghiệm PYR: PYR(+) -> Strep A, PYR(-) -> Strep b • • • • • • • Xử lý chất Một số dòng C, F, G nhóm streptococcus xuất dạng mà tím hoa cà Rất chủng Staphylococcus xuất dạng khuẩn lạc màu tím hoa cà Tuy nhiên, chúng phân biệt kiểm tra Catalase: Catalase (-) -> StrepB; Catalase (+) -> Staphylococcus Sau sử dụng, tất phiến vật liệu bị ô nhiễm khác phải Được khử trùng xử lý thủ tục nội thích hợp Và phù hợp với luật pháp địa phương Các bị phá hủy Bằng cách tự hấp 121 ° C 20 phút Giải thích thành phần môi trường Agar Muối • • Được ly trích từ loại tảo • Tan nhiệt độ 60 - 100oC đặc lại nhiệt độ xuống 45oC Từ đây, lý giải: pH thấp nồng độ H + cao, agar chuyển sang trạng thái nhầy (không đông), pH cao nồng độ H+ bị trung hòa nhiều khiến agar cứng (hay gọi trạng thái gel) • Là nơi để vi sinh vật bám vào không bị vi sinh vật phân giải • • • • Tham gia vào thành phần trung tâm hoạt tính enzyme vi sinh vật, Là phức hợp polysaccharide tạo từ đường galactose Agar gồm phân đoạn: agarose agaropectin Agarose polymer trung tính, tạo nên tính đông agar Agaropectin polymer tích điện âm, làm cho agar có tính nhầy Duy trì tính ổn định kết cấu cá đại phân tử tế bào, Điều tiết trì cân áp suất thẩm thấu tế bào, Khống chế điện oxy hoá khử tế bào nguồn vật chất sinh lượng số loài vi sinh vật Nguyên tố Hợp chất sử dụng Chức sinh lý P Na2HPO4, K2HPO4 Là thành phần acid nucleic, nucleoprotein, phospholipid, coenzyme, ATP Làm nên hệ thống đệm giúp điều chỉnh pH môi trường S (NH4)2SO4, MgSO4 Là thành phần aminoacid chứa S, số vitamin; glutathione có tác dụng điều chỉnh điện oxy hoá khử tế bào Mg MgSO4 Ca CaCl2, Ca(NO3)2 Tạo tính ổn định số cofactor, enzyme trì, cần cho dựng trạng thái cảm thụ tế bào Na NaCl Thành phần hệ thống chuyển vận tế bào, trì áp suất thẩm thấu, trì tính ổn định số enzyme K KH2PO4, KH2PO4 Là cofactor số enzyme, trì áp suất thẩm thấu tế bào, nhân tố ổn định ribosome số vi khuẩn ưa mặn Fe FeS04 Là thành phần trung tâm hoạt tính enzyme phosphoryl hoá hexose, dehydrogenase acid isocitric, polymerase acid nucleic, thành phần chlorophyll bacterio-chlorophyll Thành phần sắc tố vi khuẩn số enzyme, vật chất nguồn lượng số vi khuẩn sắt, cần thiết để tổng hợp chlorophyll độc tố vi khuẩn bạch hầu Peptone cao nấm men • Peptone nguồn cung cấp N, để vi sinh vật tổng hợp nên chất chứa N tế bào • Cao nấm men chứa nhiều chất dinh dưỡng có giá trị: amino acid, peptid, vitamin đặc biệt vitamin nhóm B:Vitamin chủ yếu coenzyme hay cofactor enzyme tham gia vào trình trao đổi chất => Cung cấp nguồn N chất kích thích sinh trưởng cho môi trường nuôi cấy VSV Growth factors • Là hợp chất hữu vi sinh vật cần thiết để sinh trưởng, với số lượng nhỏ tự tổng họp đủ so với nhu cầu • Thêm chất tăng trưởng làm cho streptococcus agalactiae phát triển so với số vi sinh vật khác mẫu Selective mix số chất cho phép streptococcus phát triển ức chế số loại vi sinh vật khác ( aztreonam • Gồm 0,064 g/ l, amphoterian B 0,004 g/l ) Aztreonam không ứng chế Enterococcus faecalis • Chromogenic mix • • Chứa chất enzym liên kết với chromogen( phản ứng màu) Các chất : 5-bromo-4-chloro-3-indolyloctanoate (X-C8) 6-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside (Rose-α-Glu) 6-chloro-3- indolyl phosphate (Rose-P) • Khi enzym thể vi sinh vật chiết tách liên hợp sắc tố không màu, chất chromogen giải phóng, Trong dạng không liên hợp nó, chromophore thể màu sắc đặc trưng nó, hòa tan giảm, tạo thành kết tủa Hình ảnh khuẩn lạc Streptococcus Agalactiae ... lọc dựa vào xuất môi trường kết hợp kháng sinh Các đặc tính khác biệt dựa vào phản ứng với enzyme đặc hiệu, cho phép phân biệt khuẩn lạc S .agalactiae từ vi khuẩn khác không bị ức chế môi trường. .. Cơ chế gây bênh • Sinh độc tố • Làm suy giảm hệ miễn dịch Phần 2: Môi trường CHROMagar phát Streptococcus Agalactiae • - Chromagar Strep B phân lập Streptococcus nhóm B (S .agalactiae) màu sắc...Phần Đặc tính sinh hóa Streptococcus agalactiae 1.Cấu tạo Thuộc chi Streptococcus, họ Streptococcaceae, Lactobacillales Vi khuẩn hình cầu Đăc tính Gram dương không sinh bào tử Không di động Sinh