Xu ly so lieu trong nghien cuu duoc ly

PHẦN I MỘT SỐ NGUYÊN TẮC CƠ BẢN TRONG THỰC HÀNH DƢỢC LÝ Mục tiêu học tập Trình bày nguyên tắc thiết kế thí nghiệm, triển khai thực nghiệm, ghi nhận kết phân tích liệu thực nghiệm thực hành dược lý Thực số kỹ thuật thực hành dược lý động vật thực nghiệm: kỹ thuật bắt, giữ động vật, kỹ thuật tiêm thuốc cho động vật uống thuốc NGUYÊN TẮC THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU 1 Một số nguyên tắc thiết kế thí nghiệm - Lựa chọn động vật: tùy theo yêu cầu thí nghiệm mà lựa chọn động vật cho phù hợp Nếu yêu cầu riêng biệt thường chọn động vật trưởng thành, có khối lượng đồng đều, độ tuổi, khỏe mạnh, giống, thai không cho bú Động vật sau mua phải kiểm tra khối lượng chất lượng như: nhanh nhẹn, lông mượt, mắt sáng, răng, móng, phận sinh dục …bình thường - Chế độ nuôi dưỡng: động vật sau mua phải nuôi nơi thí nghiệm 3-5 ngày để thích nghi với môi trường Chế độ nuôi dưỡng phải phù hợp với đặc tính sinh lý tự nhiên động vật, phù hợp với yêu cầu thí nghiệm phải đồng suốt trình nghiên cứu Không dùng thức ăn có khả ảnh hưởng đến tác dụng thuốc Lựa chọn cho ăn hàng ngày hợp lý để đảm bảo cho uống thuốc dày tiêu bớt, để hấp thu thuốc tốt tránh làm dày căng mức gây tượng khác thường nhầm với tác dụng thuốc - Số lượng động vật cần dùng tuỳ thuộc vào thí nghiệm nguyên tắc chung phải đủ để đảm bảo độ tin cậy cho kiểm định thống kê (tối thiểu động vật /lô) - Phương pháp chia lô thí nghiệm: động vật thường chia ngẫu nhiên thành lô để thử thuốc Số lô tuỳ thuộc vào mục đích thí nghiệm Các lô thường sử dụng thí nghiệm gồm: Lô chứng sinh lý: dùng nước cất dùng dung môi pha thuốc Lô chứng bệnh lý: động vật gây bệnh lý thực nghiệm cho dùng nước cất dung môi pha thuốc Lô chứng dương: động vật gây mô hình bệnh lý thực nghiệm dùng thuốc biết có tác dụng mô hình thử Lô thử: động vật gây bệnh lý thực nghiệm dùng thuốc nghiên cứu (có thể có nhiều lô thử ) - Liều dùng tính theo khối lượng động vật phù hợp với loài Đối với thuốc biết rõ tác dụng dược lý mức liều có hiệu người, liều dùng động vật xác định theo nguyên tắc ngoại suy dựa vào liều có hiệu tương đương loài động vật người (bảng 1.1) Bảng 1.1 Hệ số có hiệu tương đương loài động vật người Sang loài Chuột nhắt trắng Chuột cống trắng Thỏ Chó Ngƣời Chuột nhắt trắng 1/2 1/4 1/7 1/12 Chuột cống trắng 1/2 1/4 1/7 Thỏ (mèo) 3/5 1/3 Chó 5/3 1/2 Người 12 Từ loài Đối với thuốc mới, liều thử thí nghiệm xác định sau: trước hết xác định liều LD50 , sau xác định mức liều tối đa sử dụng cho thử nghiệm dược lý (1/10 liều LD50) Từ mức liều này, giảm dần liều dùng (có thể theo cấp số nhân với công bội ½) đến mức liều thấp thể tác dụng dược lý mô hình chọn - Chỉ tiêu đánh giá: thí nghiệm dược lý lựa chọn hay nhiều tiêu đánh giá liên quan đến tác dụng dược lý độc tính cần thăm dò mô hình Chỉ tiêu phản ánh tác dụng dược lý mức độ thể (ví dụ độ phù bàn chân chuột sau gây viêm carrageenan hay thời gian ngủ chuột sau tiêm thiopental), mức độ quan (ví dụ tần suất biên độ co thắt trơn ruột cô lập), mức độ tế bào (ví dụ nồng độ insulin môi trường nuôi cấy đảo tụy cô lập) hay mức độ phân tử (ví dụ khả ức chế hoạt độ enzym cyclooxygenase ủ chất enzym với thuốc) Chỉ tiêu đánh giá thực tất lô thí nghiệm, thời điểm xác định theo thiết kế thí nghiệm để sau xử lý kết kiểm định thống kê phù hợp - Đánh giá kết thí nghiệm: tùy theo thiết kế thí nghiệm mà lựa chọn kiểm định thống kê phù hợp để: + So sánh trước - sau lô động vật thực nghiệm + So sánh lô động vật thực nghiệm: nhóm thử nhóm chứng + So sánh nhiều lô động vật thực nghiệm: nhóm chứng sinh lý, nhóm chứng bệnh lý, nhóm chứng dương nhóm thử + So sánh lặp lại nhiều thời điểm lô động vật thực nghiệm + So sánh lặp lại nhiều thời điểm lô động vật thực nghiệm khác nhau: so sánh lô (within-group) lô (between-groups) Ghi nhận kết phân tích số liệu 1.2.1 Xây dựng liệu Điều quan trọng trình thực thí nghiệm theo dõi thông số đánh giá, ghi chép lưu trữ kết thực nghiệm để phân tích, xử lý thống kê sau Thông tin cần lưu giữ bao gồm tên lô động vật thử, số thứ tự cá thể lô kết thông số đánh giá cá thể Số liệu thu thập thí nghiệm dược lý thuộc loại biến số: biến định danh (nominal), biến thứ bậc (ordinal), biến rời rạc liên tục (metric, discrete/continuous) (bảng 1.2) Đi từ biến định danh đến biến tham số, tính thông tin tăng dần khả xuất sai số đo lường tăng dần Loại số liệu nghiên cứu đặc điểm phân bố mẫu số liệu định việc lựa chọn phép toán thống kê để xử lý kết Phần mềm xử lý số liệu thường sử dụng phân tích kết thí nghiệm dược lý bao gồm: Microsoft Excel (Microsoft Office, Microsoft), Statistical Package for the Social Sciences (SPSS version 16.0, IBM) hay GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) Bảng 1.2 Đặc điểm loại số liệu thí nghiệm dược lý Loại biến số Biến định danh Đặc điểm Ví dụ Bao gồm số liệu Giới tính, tình thứ bậc trạng sống/chết Các tham số thống kê mô tả Nội dung thông tin Tần số, tỉ lệ Thấp Biến thứ bậc Bao gồm số liệu Mức độ đau (nhẹ, Tần số, tỉ lệ, Trung có thứ bậc trung bình, nặng) trung vị bình khoảng cách chúng không định lượng Biến liên tục Số liệu có thứ bậc, rời rạc phạm vi giá có thứ bậc trị phân thành khoảng định lượng Số liệu có đếm (rời rạc) đo lường (liên tục) Số lượng hồng cầu, Tần số, tỉ lệ, Cao bạch cầu/l máu trung vị, trung bình, độ lệch ngoại vi (rời rạc) chuẩn Hoạt độ enzym ASAT, ALAT huyết (liên tục) 1.2.2 Một số khái niệm thống kê - Phân bố mẫu: tuân theo phân bố chuẩn (Gausse) không tuân theo phân bố chuẩn Tính chuẩn mẫu xác định thông qua hình dạng đường phân bố mẫu (histogram) thông qua kiểm định thống kê Phân bố chuẩn, đặc trưng Χ ± SD, sử dụng kiểm định tham số Phân bố không chuẩn, đặc trưng Median tứ phân vị, sử dụng kiểm định phi tham số Hình 1.1 Phân bố kết thực nghiệm chuẩn không chuẩn - Giá trị trung bình (Mean, X) - Độ lệch chuẩn (SD): diễn tả biến thiên giá trị quan sát mẫu so với giá trị trung bình Nếu mẫu tuân theo phân bố chuẩn, 95% giá trị mẫu tìm thấy khoảng X ± SD - Sai số chuẩn (SE): diễn tả biến thiên giá trị đặc trưng (số trung bình) tính từ mẫu Với mẫu tuân theo phân bố chuẩn, khoảng X ± SE khoảng dao động giá trị trung bình 95% trường hợp - Tứ phân vị (quartiles): 25% 75% giá trị mà tương ứng có 25% 75% giá trị mẫu bé giá trị - Trung vị (median): giá trị mẫu, tính giá trị cỡ mẫu lẻ trung bình giá trị cỡ mẫu chẵn - Kiểm định giả thuyết: phương pháp để xác định liệu có đủ chứng để khẳng định giả thuyết thay hay không Có giả thuyết: giả thuyết H0 giả thuyết thay Thí nghiệm Dược lý thiết kế để chứng minh giả thuyết thay xác xuất sai cao giả thuyết H0 - Giá trị p: biến cố tồn giả thuyết H0 Nếu p > 0,05, không phát khác biệt mức ý nghĩa 95% Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê xác định p < 0,05 1.2.3 Xử lý thống kê Phân tích thống kê bắt đầu test kiểm định phân bố mẫu Có thể xác định xác đặc tính phân bố mẫu với cỡ mẫu lớn, nhiên với khoảng 5-20 giá trị đo lường thực hành dược lý, việc thiết lập phân bố mẫu nhiều không xác Trong số trường hợp, với n < 30 người ta coi mẫu liệu phân bố phi tham số (nonparametric distribution) Kiểm định thống kê áp dụng tùy theo đặc tính phân bố mẫu Trong trường hợp mẫu phân bố tham số (parametric) phân bố Gausse, mẫu đại diện giá trị trung bình độ lệch chuẩn kiểm định test tham số Trong trường hợp phân bố phi tham số, mẫu đại diện trung vị tứ phân vị 25% 75% kiểm định test phi tham số Test phi tham số áp dụng với biến định danh, biến thứ bậc biến rời rạc Sau đó, tùy theo yêu cầu nghiên cứu mà áp dụng test kiểm định khác Với mẫu, sử dụng test so sánh cặp (paired) test so sánh mẫu độc lập (không cặp, unpaired), tùy thuộc vào mẫu độc lập hay phụ thuộc (hình 1.2) Trong trường hợp so sánh nhiều mẫu đo lường lặp lại nhiều thời điểm, áp dụng kiểm định khác (hình 1.3) Biến liên tục mẫu Phân bố chuẩn Test tham số Độc lập Phân bố không chuẩn Test phi tham số Phụ thuộc (trƣớc – sau) Student T-test không cặp Độc lập Student T-test cặp Mann-Whitney test không cặp Phụ thuộc (trƣớc – sau) Wilcoxon test cặp Hình 1.2 Tóm tắt kiểm định thống kê áp dụng so sánh mẫu Biến liên tục > mẫu Phân bố chuẩn Test tham số Độc lập Phân tích phƣơng sai Phân bố không chuẩn Test phi tham số Phụ thuộc (trƣớc – sau) Phân tích phƣơng sai Độc lập Test KruskalWallis Nếu có khác biệt dùng hậu kiểm so sánh cặp: Dunnett, LSD, Turkey, Scheffé Phụ thuộc (trƣớc – sau) Test Friedmann Nếu có khác biệt dùng hậu kiểm so sánh cặp: test Dunnett Hình 1.3 Tóm tắt kiểm định thống kê áp dụng so sánh nhiều mẫu Bài tập áp dụng (kiểm định mẫu độc lập, phân bố chuẩn với test tham số): Nghiên cứu tác dụng tăng lực thuốc thí nghiệm chuột bơi, thời gian bơi tính phút chuột lô (12 chuột/lô): lô chứng uống nước muối sinh lý (lô 1), lô uống thuốc thử liều thấp (lô 2) lô uống thuốc thử liều cao (lô 3) thu kết sau: Thời gian bơi chuột (phút) Thứ tự Lô Lô Lô 210 161 376 202 216 216 146 184 192 74 133 399 175 393 187 53 44 258 32 33 128 32 312 309 239 38 126 10 33 154 182 11 346 309 240 12 71 294 368 (theo Đỗ Trung Đàm 2003) Từ kết thực nghiệm trên, kết luận tác dụng tăng lực thuốc thử? Giải vấn đề phần mềm SPSS 16.0: Bước Xây dựng liệu - Khai biến - Nhập số liệu Bước Tính toán thông số đặc trưng mẫu thời gian bơi lô - Kiểm định tính chuẩn mẫu: sử dụng SPSS: Analyse\Descriptive Statistics\Explore\Plot\Normality plots with tests Dùng phép kiểm định Kolmogorov-Smirnov cỡ mẫu lớn 50 phép kiểm định Shapiro-Wilk cỡ mẫu nhỏ 50 Mẫu coi có phân phối chuẩn mức ý nghĩa (Sig.) lớn 0,05 Kết kiểm định với liệu lô cho thấy mẫu có phân phối chuẩn Chú ý: Để nhận biết phân phối chuẩn mẫu SPSS, sử dụng giản đồ Histogram (phân phối chuẩn giản đồ có dạng hình chuông úp đối xứng với tần số cao nằm tần số thấp dần nằm bên) giản đồ xác suất chuẩn (normal Q-Q plot) (phân phối chuẩn giản đồ xác suất có quan hệ tuyến tính) 10 Quan sát trạng thái hô hấp, màu sắc chi, niêm mạc mũi, miệng chuột sau uống thuốc Dùng đồng hồ bấm giây xác định thời gian từ đưa thuốc vào thể đến chuột chết Mổ quan sát ruột động vật thí nghiệm chết Thông số đánh giá Biểu tác dụng ion Ba++ hệ thống: trạng thái hô hấp, màu sắc chi, niêm mạc mũi, miệng chuột sau uống thuốc, thời gian từ đưa thuốc vào thể đến chuột chết, nhu động trơn tiêu hóa So sánh biểu động vật Giải thích rút áp dụng thực tế 37 Thí nghiệm ẢNH HƢỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ĐẾN DƢỢC ĐỘNG HỌC CỦA THUỐC GÂY MÊ HÔ HẤP Mục tiêu học tập Sau hoàn thành thực tập này, sinh viên có khả năng: Trình bày nguyên tắc thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng nồng độ đến dược động học thuốc gây mê hô hấp Phân tích thiết kế thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng nồng độ đến dược động học thuốc gây mê hô hấp Thực thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng nồng độ đến dược động học thuốc gây mê hô hấp Phân tích kết thí nghiệm Liên hệ kết thí nghiệm vào thực tế sử dụng thuốc Nguyên tắc thí nghiệm Khi sử dụng thuốc gây mê hô hấp, nồng độ thuốc ảnh hưởng đến trình vận chuyển phân bố thuốc biểu qua thay đổi thời gian tiềm tàng thời gian mê Gây mê cho động vật thí nghiệm ether mê với nồng độ khác So sánh thời gian tiềm tàng thời gian tác dụng thuốc để đánh giá ảnh hưởng nồng độ đến dược động học thuốc Động vật thí nghiệm Chuột nhắt trắng, hai giống, khoẻ mạnh, cân nặng 18-22g Chuột thí nghiệm sau mua nuôi ổn định điều kiện phòng thí nghiệm ngày trước thí nghiệm, ăn viên thức ăn chuẩn dành cho chuột thí nghiệm, uống nước tự Hóa chất, dụng cụ thí nghiệm Hóa chất: Dung dịch ether gây mê Dụng cụ thí nghiệm: bình thủy tinh có nắp mài thể tích tương ứng lít 1,5 lít, đồng hồ bấm giây Tiến hành thí nghiệm Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành lô, lô 6-10 con: Lô 1: chuột gây mê bình thủy tinh tích lít 38 Lô 2: chuột gây mê bình thủy tinh tích 1,5 lít Cách tiến hành gây mê sau: cho vào bình thủy tinh 0,7 mL ether (nhỏ từ từ vào thành bình) sau đậy nắp lại Dùng đồng hồ bấm giây xác định thời gian tiềm tàng thời gian mê chuột Thông số theo dõi, đánh giá: - Thời gian tiềm tàng - Thời gian mê Xử lý số liệu Kết thí nghiệm trình bày bảng sau: Bảng kết thí nghiệm STT … Trung bình SD P h thích Tên chuột Thời gian tiềm tàng Lô Lô Thời gian mê Lô Lô D độ lệch chuẩn; p: so sánh giá trị thời gian tiềm tàng trung bình lô chuột thí nghiệm Kết biểu diễn dạng TB± SD (TB: giá trị trung bình lô, SD: sai số chuẩn) So sánh giá trị trung bình lô one-way ANOVA, dùng LSD test, DunnettT3 test để so sánh giá trị trung bình lô Phân tích thống kê phần mềm SPSS 16.0, khác biệt lô coi có ý nghĩa thống kê p< 0,05 Phân tích kết liên hệ với thực tế sử dụng đường đưa thuốc thực tế sử dụng thuốc 39 Thí nghiệm ẢNH HƢỞNG CỦA PILOCARPIN VÀ CHLORAMPHENICOL ĐẾN THỜI GIAN NGỦ DO THIOPENTAL Mục tiêu học tập Sau hoàn thành thực tập này, sinh viên có khả năng: Trình bày mục đích nguyên tắc thí nghiệm tác dụng cảm ứng ức chế enzym chuyển hóa thuốc Phân tích cách thiết kế thí nghiệm chứng minh tác dụng cảm ứng ức chế enzym chuyển hóa thuốc Thực thí nghiệm chứng minh tác dụng cảm ứng ức chế enzym chuyển hóa thuốc Xử lý phân tích kết thí nghiệm Liên hệ kết thí nghiệm vào thực tế sử dụng thuốc Mục đích thí nghiệm Chứng minh tác dụng cảm ứng enzym chuyển hóa thuốc pilocarpin tác dụng ức chế enzym chuyển hóa thuốc chloramphenicol Nguyên tắc - Pilocarpin thuốc gây cảm ứng enzym gan, dùng thuốc bị chuyển hóa gan Pilocarpin làm tăng chuyển hóa, làm giảm tác dụng thuốc dùng - Chloramphenicol thuốc gây ức chế enzym gan Khi dùng thuốc bị chuyển hóa gan Chloramphenicol gây giảm chuyển hóa thuốc, làm tăng dạng chưa chuyển hóa hoạt tính dẫn đến làm tăng tác dụng thuốc dùng - Tiến hành gây cảm ứng ức chế enzym gan pilocarpin chloramphenicol Đánh giá tác dụng việc cảm ứng ức chế enzym gan lên thời gian ngủ thiopental thông qua việc kéo dài rút ngắn thời gian ngủ thiopental Động vật, hóa chất, thiết bị Động vật - Chuột nhắt trắng chủng Swiss, hai giống, cân nặng từ 18-22 g, khỏe mạnh 40 - Động vật nuôi ổn định điều kiện phòng thí nghiệm ngày trước thực nghiên cứu, nuôi dưỡng thức ăn chuẩn, uống nước tự Hóa chất - Dung dịch NaCl 0,9%, pilocarpin 0,15%, chloramphenicol 0,4%, thiopental 0,4% Thiết bị Đồng hồ bấm giây, bô can thủy tinh, bơm & kim tiêm 1ml Bố trí thí nghiệm Chuột nhắt trắng, giống đực, khỏe mạnh chia ngẫu nhiên thành lô, lô -10 - Lô 1: lô chứng - Lô 2: lô gây cảm ứng enzym gan - Lô 3: lô gây ức chế enzym gan Cách tiến hành thí nghiệm Chuột lô tiêm màng bụng thuốc tương ứng sau - Lô 1: tiêm màng bụng dung dịch NaCl 0,9% với thể tích 0,1 ml/10g chuột - Lô 2: tiêm màng bụng dung dịch pilocarpin 0,15 % liều 15 mg/kg với thể tích 0,1 ml/10 g chuột - Lô 3: tiêm màng bụng dung dịch chloramphenicol 0,4 % liều 40 mg/kg với thể tích 0,1 ml/10 g chuột - Chuột tiêm dung dịch NaCl, pilocarpin, chloramphenicol vào thời điểm 72 giờ, 48 giờ, 24 trước làm thí nghiệm - Một sau tiêm thuốc lần cuối, chuột tiêm tĩnh mạch đuôi dung dịch thiopental 40mg/kg với liều 0,1 ml/10 g chuột Dùng đồng hồ bấm giây ghi lại thời gian ngủ chuột (thời gian tính từ lúc chuột phản xạ thăng có phản xạ thăng trở lại) Thông số đánh giá Thời gian ngủ chuột (phút) Phƣơng pháp xử lý số liệu - Với số liệu thuộc phân phối chuẩn , kết biểu diễn dạng M ± SD (M: giá trị trung bình lô, SD: độ lệch chuẩn), so sánh giá trị trung bình lô 41 one –way ANOVA, dùng Dunnestt test LSD test để so sánh giá trị trung bình lô - Với số liệu không thuộc phân phối chuẩn, kết trình bày dạng trung vị khoảng (giá trị cực tiểu – giá trị cực đại) Dùng thuật toán Mann-Whitney U test để so sánh kết lô - Phân tích thống kê phần mềm SPSS, khác biệt lô coi có ý nghĩa p