nghiên cứu nhân giống và tạo rễ củ in vitro cây địa hoàng (rehmannia glutinosa)

DANH MỤC BẢNG 3.1 Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% kết hợp Sodiumdichloroisocyanuric acid 3.2 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây 3.3 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và αNAA đến

GIÁO DỤC VÀO ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-

NGUYỄN THỊ THANH

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÀ TẠO RỄ CỦ IN VITRO

CÂY ĐỊA HOÀNG (Rehmannia glutinosa)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀO ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-

NGUYỄN THỊ THANH

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÀ TẠO RỄ CỦ IN VITRO

CÂY ĐỊA HOÀNG (Rehmannia glutinosa)

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác

Tôi cũng xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc

Học viên

Nguy ễn Thị Thanh

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp

đỡ của nhiều cá nhân và cơ quan đơn vị Nay luận văn đã hoàn thành, tôi xin bày

tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới:

PGS TS Nguyễn Thị Lý Anh, người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi

điều kiện, giúp đỡ tôi nghiên cứu và thực hiện đề tài

Các thầy giáo, cô giáo thuộc Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông

nghiệp Việt Nam đã nhiệt tình giảng dạy và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành

khóa học

Các cán bộ, kỹ thuật viên Viện Sinh học Nông nghiệp - Học viện Nông

nghiệp Việt Nam đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi

thực hiện luận văn Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Sinh học Nông

nghiệp đã cung cấp mẫu vật nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình và

bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập

Hà Nội, tháng 10 năm 2015

Học viên

Nguyễn Thị Thanh

1.2.1 Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô, tế bào thực vật 8 1.2.2 Các bước cơ bản của quá trình nhân giống in vitro 9 1.2.3 Ảnh hưởng của một số nhân tố đến nhân giống in vitro 11 1.2.4 Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng và phát triển của cây

1.3 Ảnh hưởng của các loại phân bón đến sự sinh trưởng và phát triển của

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.2 Vật liệu nghiên cứu 21

2.4.6 Nghiên cứu xác định giá thể và phân bón lá thích hợp cho cây địa

3.1.1 Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% kết hợp Sodium dichloroisocyanuric

3.2.2 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng nhân nhanh

3.2.3 Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi in

3.2.4: Ảnh hưởng của pepton đến khả năng nhân nhanh chồi 35

3.4.1 Ảnh hưởng của α-NAA (Axit α-naphtylaxetic) đến khả năng ra rễ

3.5 Tạo củ in vitro cây địa hoàng 42 3.5.1: Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng tạo củ in vitro cây địa

3.5.2 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tạo củ in vitro

3.5.3 Ảnh hưởng của tổ hợp đường và α-NAA đến khả năng tạo củ in

3.6 Xác định giá thể và dinh dưỡng thích hợp cho cây in vitro tại vườn

3.6.1 Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống và sinh trưởng của cây

3.6.2 Ảnh hưởng của dinh dưỡng qua lá đến sinh trưởng của cây in

DANH MỤC BẢNG

3.1 Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% kết hợp Sodiumdichloroisocyanuric acid

3.2 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây

3.3 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và αNAA đến khả năng nhân nhanh chồi

3.4 Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây

3.5 Ảnh hưởng của pepton đến khả năng nhanh nhanh chồi in vitro cây

3.6 Ảnh hưởng của chất kháng Ethylene (Thiosunfat Bac) đến khả năng

3.7 Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ của cây địa hoàng in vitro 38

3.8 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây địa hoàng in vitro 40 3.9 Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng tạo củ in vitro cây địa hoàng 42

3.10 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tạo củ in vitro của

3.11 Ảnh hưởng của tổ hợp đường và α-NAA đến khả năng tạo củ in vitro

3.12 Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống và sinh trưởng của cây in

3.13 Ảnh hưởng của dinh dưỡng qua lá đến sinh trưởng của cây in vitro

DANH MỤC HÌNH

3.1 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây địa

3.2 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng nhân nhanh chồi

3.3 Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây

3.4 Ảnh hưởng của pepton đến khả năng nhanh nhanh chồi 36

3.6 Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ của cây địa hoàng in vitro 39

3.7 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây địa hoàng in vitro 41 3.8 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây địa hoàng in vitro 41 3.9 Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng tạo củ in vitro cây địa hoàng 42

3.10a Ảnh hưởng của đường đến khả năng tạo củ in vitro của cây địa

3.10b Ảnh hưởng của đường đến khả năng tạo củ in vitro của cây địa

3.11 Ảnh hưởng của tổ hợp đường và α-NAA đến khả năng tạo củ in vitro

3.12 Ảnh hưởng của dinh dưỡng qua lá đến sinh trưởng của cây in vitro

MỞ ĐẦU

1 Đăt vấn đề

Ở Việt Nam nền y học cổ truyền rất phát triển, nhiều cây dược liệu quý đã

được sử dụng trong đó có cây địa hoàng (Rehmania glutinosa Gaertn Libosch)

Cây có nguồn gốc từ Trung Quốc có khoảng cách đây 2000 năm trước đến năm

1958 nhập trồng ở nước ta, hiện nay được phát triển trồng ở nhiều nơi từ Bắc đến Nam ( Vũ Minh Tuấn, 2009) Rễ địa hoàng thu hái về, rửa nhanh, phân loại củ to, nhỏ để riêng, đem sấy từ từ đến khi củ mềm rồi phơi hay sấy nhanh đến khô Loại củ to dùng ngay (dạng sống), tên thuốc là sinh địa Dược liệu sau khi được chế biến có tên thuốc là thục địa

Dịch chiết từ củ địa hoàng tươi theo phương pháp hiện đại có tác dụng cầm máu, ức chế tế bào ung thư, chống loét dạ dày, bảo vệ gan, tăng cường miễn dịch cho cơ thể, điều chỉnh nội tiết và chuyển hóa

Cây địa hoàng nhân giống vô tính bằng củ nên qua nhiều năm cây bị nhiễm bệnh đặc biệt các bệnh về virut dẫn đến giảm năng suất và chất lượng sản phẩm Để đáp ứng nhu cầu về phát triển sản xuất cây địa hoàng cần phải có nguồn giống chất lượng tốt Hiện nay công nghệ nuôi cấy mô tế bào là công cụ hữu hiệu cho nhân nhanh và phục hồi chất lượng cây giống, vì công nghệ này cho hệ số nhân giống cao, cây giống được trẻ hóa, loại bỏ được mầm bệnh nấm khuẩn nhiều loại giống cây trồng bị thoái hóa đã được phục tráng thành công bằng công nghệ nuôi cấy mô như: khoai lang, khoai tây, lily, hành tỏi… ( Nguyễn Thị Lý Anh, 2014),

Xuất phát từ những cơ sở trên với mong muốn góp phần phát triển sản

suất cây địa hoàng ở nước ta,chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nhân

giống và tạo rễ củ in vitro cây địa hoàng (Rehmannia glutinosa)”

2 Mục đích và yêu cầu

+ Mục đích

Xác định được yếu tố kỹ thuật làm cơ sở cho việc xây dựng quy trình

nhân nhanh và tạo củ in vitro cây địa hoàng phục vụ cho nhu cầu sản suất cây địa

hoàng ở nước ta

+ Yêu cầu

Xác định được chế độ khử trùng mẫu để tạo nguồn nguyên liệu cho nuôi

cấy in vitro

Xác định được môi trường nuôi cấy để nhân nhanh in vitro

Xác định được môi trường tạo rễ cho các chồi in vitro ở vườn ươm

Xác định môi trường tạo củ in vitro

Xác định được giá thể và chế độ dinh dưỡng cho cây in vitro ở vườn ươm

+ Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và tính mới của đề tài

Kết quả của đề tài sẽ cung cấp thêm nguồn tài liệu cho khoa học về khả năng sử dụng kỹ thuật mới trong nhân giống vô tính của cây địa hoàng nói riêng

và cây dược liệu nói chung.Đồng thời nó là tài liệu tham khảo về ứng dụng kỹ thuật nhân nhanh giống trong trồng cây địa hoàng cho người dân và các cơ sở trồng cây dược liệu

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần tích cực vào hoàn thiện quy trình nhân giống và tạo củ của cây địa hoàng Khi hoàn thiện được quy trình nhân

giống và tạo củ cây địa hoàng bằng kỹ thuật in vitro sẽ tạo điều kiện chủ động

sản xuất cây giống địa hoàng với chất lượng tốt và giá thành cạnh tranh, phát huy hết tiềm năng năng suất, chất lượng cây địa hoàng đáp ứng nguồn dược liệu trong nước và xuất khẩu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây địa hoàng

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm thực vật học

● Nguồn gốc: Cây địa hoàng có nguồn gốc từ Trung Quốc Năm 1958 cây địa hoàng được di thực vào Việt Nam từ Trung Quốc (Vũ Tuấn Minh, 2009) Những tỉnh trước đây trồng nhiều địa hoàng là: Hưng Yên, Hà Bắc, Hà Nam, Nam Định, Thái Bình, Vĩnh Phúc, ngoại thành Hà Nội Các tỉnh khác có trồng nhưng ít hơn Sau giải phóng miền Nam, địa hoàng còn được trồng ở một số tỉnh phía Nam

● Phân loại: Cây địa hoàng còn có tên gọi là cây sinh địa, thục địa, địa

hoàng hoài Tên khoa học: Rehmannia glutinosa Gaertn Libosch, Giới (regnum)

Plantae, Ngành (division) Mangnoliopsida, Lớp (class) Magnoliopsida, Bộ (ordo) Lamiales, Họ (familia) Scruphulariaceae, Chi (genus) Rehmannia,

● Đặc điểm thực vật học:

Thân: thân thảo, cao khoảng 20 – 40cm, chỉ đến khi ra hoa thì mới mọc

thành ngồng hoa cao 40 - 50 cm, vỏ màu xanh nâu

Toàn thân có lông tiết dài, mịn màu tro trắng (Chu thị Thơm và cs, 2006)

Lá: lá đơn, mọc cách màu xanh vàng, mọc vòng quanh gốc ở đốt thân,

phiến lá màu xanh, hình trứng lộn ngược đến hình bầu dục dài Ngọn lá hơi tròn, đuôi lá tù, lá dài 3 – 15cm, rộng 1.5 – 6cm, mép lá có răng cưa không đều nhau Mặt phiến lá có nhiều nếp nhăn nổi lên chia lá thành những múi nhỏ, lá dưới gốc dài hẹp Toàn thân lá và hoa có lớp lông tơ nhỏ màu tro bao phủ Cả chu kỳ sống cây địa hoàng ra được 50-55 lá, từ trồng đến ra hoa cây mọc 18-22 lá Bình quân

có 0.3 lá ra trong một ngày

Rễ: rễ củ, sau trồng 8 – 10 ngày rễ bắt đầu đâm ra ở củ hom, thường xuất

hiện ở mắt sát vết bẻ, đối diện với cực sinh ngọn Sau khi trồng 20 – 25 ngày rễ xuất hiện nhiều và có thể chia làm 3 loại:

+ Rễ tơ: xuất hiện trên những mắt của củ hom và cả ở trên các rễ củ sau này; ít có khả năng hình thành củ, có nhiệm vụ chính là hút dinh dưỡng cho cây

Rễ có kích thước ngắn, nhỏ, số lượng nhiều, xuất hiện sau khi trồng 30 ngày và

cả khi cây có củ cần hạn chế loại rễ này

+ Rễ củ: xuất hiện sau trồng 45 – 50 ngày, là loại rễ tạo củ sau này Rễ này thường xuất hiện ở mắt sát vết bẻ hoặc ở ngay vết bẻ (chỗ sùi callus), vết bẻ đối diện với với mầm chồi tạo thân, cũng có thể xuất hiện ở trên thân cây (phần sát mặt đất)

+ Rễ nửa chừng (rễ đực): không có khả năng hình thành củ do những nguyên nhân nội tại hoặc điều kiện ngoại cảnh không thích hợp như hạn hán, ẩm

độ cao, thiếu dinh dưỡng… rễ to và dài hơn rễ tơ (15 – 20cm), số lượng ít 6 – 10

rễ, rễ này tồn tại không có lợi vì nó làm tiêu hao chất dinh dưỡng

Rễ củ hình thành nhiều hay ít, sớm hay muộn phụ thuộc vào sự phân hóa bên trong của rễ và chịu ảnh hưởng rất lớn của điều kiện ngoại cảnh Củ có cuống dài 4 – 7cm, vỏ màu hồng nhạt, vàng nhạt… trên củ có nhiều mầm, rễ tơ nên rất dễ nhân bằng phương pháp vô tính Củ dài 15 – 20cm, đường kính thân

củ 1 – 4cm, ruột có màu trắng xung quanh có viền vàng Thời gian ngủ nghỉ của mầm chồi trên củ ngắn từ 5 – 7 ngày do đó thu hoạch xong phải đem trồng ngay

là tốt nhất

Hoa, quả và hạt: Hoa tự mọc thành chùm trên ngọn thân cây, đài hình

chuông, bên trên nứt thành 5 cánh, tràng hình ống hơi uốn cong dài 3 – 4cm, đầu khía 5 cánh, mặt ngoài đỏ tím mặt trong mầu vàng có vân tím Nhị cái 1, nhị đực

2 Mỗi trục hoa có 70-90 hoa, hoa màu phớt hồng Hoa thức: K(5)C(5)A4G(2) Quả bế đôi, hình tròn trứng, cánh đai bao úp Quả nhiều hạt 200- 300 hạt, hạt nhỏ, trọng lượng 1000 hạt = 0,15g hạt màu nâu nhạt.(Vũ Văn Vụ, 1997)

1.1.2 Yêu cầu về điều kiện sinh thái

● Nhiệt độ: nhiệt độ thích hợp từ 18- 250C nếu t < 100C cây ngừng sinh trưởng lá biến dạng biểu hiện ra bên ngoài từ màu lá xanh chuyển sang màu lá tím thẫm, nếu nhiệt độ thấp và kéo dài 10 ngày thì lá không thể khôi phục được chức năng quang hợp và dần dần sẽ chết Nếu t > 300C làm cho cây sớm phát triển gây mất cân đối, cây sớm ra hoa, số lá ít, sự tích luỹ dinh dưỡng về củ

củ yêu cầu về nhiệt độ thấp hơn từ 10- 180C, chênh lệch nhiệt độ ngày đêm tương đối lớn, tạo điều kiện củ lớn và tích lũy vào củ nhiều, nhanh đạt năng suất cao Căn cứ vào nhiệt độ mà người ta chú ý bố trí thời vụ thích hợp Vùng miền núi thời vụ trồng thích hợp vào tháng 3 - 4, thời vụ thu hoạch vào tháng 9-10 là tốt nhất Vùng trung du, đồng bằng Bắc Bộ có thể trồng được hai vụ; vụ xuân trồng thán g 2-3, thu hoạch tháng 6 - 7; Vụ này có tiềm năng năng suất cao, nhưng năng suất không ổn định, hay bị mất mùa do mưa lụt Vụ thu đông trồng và tháng 9 và thu hoạch vào tháng 2-3, là vụ có điều kiện trồng trọt thuận lợi hơn vụ xuân, năng suất không cao nhưng chất lượng củ tốt Như vậy vụ thu đông sản xuất để làm thuốc, vụ xuân trồng để nhân giống.( Vũ Tuấn Minh, 2009)

● Ánh sáng: Khả năng sinh trưởng của cây địa hoàng tương đối yếu, chỉ thích nghi với khí hậu ôn hòa,đủ ánh sáng mới cho chất lượng củ tốt nhất Nếu thiếu ánh sáng cây sẽ mọc chậm, yếu ớt, cây sinh trưởng không bình thường Lá mỏng không ra hoa hoặc ra hoa không đều Song ánh sáng quá mạnh thì lá sẽ nhỏ, phiến lá dày, hoa cũng biến sắc địa hoàng là loại cây ưa sáng, nếu trồng trong vườn rợp, cây sẽ chi chit lại, củ bé

● Nước: Ẩm độ và lượng mưa lượng mưa trung bình 700- 800 mm/năm

và tập trung vào giai đoạn khi mới trồng là rất tốt Mưa cuối vụ thường gây nấm bệnh, thối củ dẫn đến thất thu (vụ hè ở miền Bắc) Tưới và tiêu nước đảm bảo độ

ẩm đất 70 – 80% trong tháng đầu, tưới ngay sau khi bón phân nếu đất khô và nhiệt độ cao Khi cây đã xanh tốt kín luống, việc tưới có thể thưa hơn hoặc có thể tát nước ngập rãnh luống rồi tháo nước ngay Làm như vậy sẽ thoả mãn độ ẩm cho đất.(Chu Thị Thơm, 2006)

● Đất: Đất trồng địa hoàng: ưa đất cát pha, thịt nhẹ, đất phù sa, đất lạ mới khai phá, đất có độ phì cao, tầng canh tác sâu, đất tơi xốp có điều kiện tưới và thoát nước thuận lợi Đất tới xốp có độ dốc 5- 10 độ có thể trồng được pH = 5,5-

7 hoặc hơi kiềm là thích hợp

● Dinh dưỡng: Địa hoàng ưa phân chuồng, phân bắc, phân dê ủ mục, ưa khô jdầu Phân lân, kali làm cho cây khỏe, cứng phát triển thân lá nhanh, nhiều

củ Bón cân đối NPK Lượng phân bón cho 1 ha: Phân chuồng: 20 – 30 tấn Phân

ure: 100 – 150 kg Phân lân (supe lân): 200 – 300 kg Phân Kali: 400 – 600 kg Tỷ

lệ N:P:K = 1:1:2

1.1.3 Giá trị sử dụng, kinh tế của cây địa hoàng

Địa hoàng là một cây thuốc quý được mệnh danh là thần dược Bộ phận dùng làm là củ dưới 2 dạng chính là sinh địa và thục địa Ở nước ta, 3/4 đơn thuốc, bài thuốc đông dược cần sinh địa và thục địa Một số bài thuốc chính đã đưa vào sản xuất công nghiệp như: sâm nhung đại bổ hoàn, ninh khôn, hà sa đại tạo hoàn, thập toàn đại bổ, lục vị hoàn, bát vị hoàn, bổ huyết hoàn, bổ tâm đan… + Sinh địa (củ địa hoàng sấy khô): theo tài liệu cổ, sinh địa có vị đắng, tính hàn Năng lực của sinh địa là bổ chân âm, lương nhiệt huyết là vị thuốc bổ dương cường tráng Theo y học cổ truyền, sinh địa vào 4 kinh Tâm, Can, Thận và Tiểu trường, có tác dụng thanh nhiệt, mát máu, ức chế huyết đường, lợi tiểu, mạnh tim nên thường được dùng trong các bệnh thiếu máu, suy nhược, tiểu đường, rong kinh, chữa thương hàn, yết hầu sưng tấy, thổ huyết, băng huyết, kinh nguyệt không đều, động thai Theo Dược điển, ngày dùng 9-15g dưới dạng thuốc sắc hoặc phối hợp với các vị thuốc khác do lương y kê đơn

+ Thục địa (sinh địa đã được chế biến) Thục địa vị ngọt, tính ấm, vào 3 kinh: Tâm, Can, Thận có tác dụng tư âm, dưỡng huyết, bổ thận, sáng mắt, thính tai, đen râu tóc (tư dưỡng), làm cường tráng cơ thể, người lao tâm khổ tứ lo nghĩ, hoại huyết nên dùng Ngoài ra, còn dùng thục địa làm thức ăn mùa hè có tác dụng bồi dưỡng cơ thể và giải nhiệt Liều dùng 8-16g một ngày, có thể dùng tới 40g dưới dạng thuốc sắc hoặc phối hợp với các loại thuốc khác

Yêu cầu sử dụng trong nước hàng năm khoảng 1000 tấn, ngoài ra còn có thể xuất khẩu sang thị trường Nhật, Hồng Kông Giá trị 1 ha sinh địa ngang 3 – 5 tấn lúa Để thỏa mãn nhu cầu trong nước và xuất khẩu, hàng năm phải sản xuất khoảng 1000 – 2000 tấn sinh địa Trên thực tế không đáp ứng được nhu cầu trong nước và xuất khẩu nên phải nhập từ Trung Quốc

Trung Quốc là nước xuất khẩu chủ yếu nên địa hoàng đạt giá trị rất cao và

ổn định (Vũ Tuấn Minh, 2009) Hiện nay với giá 7000 USD một tấn địa hoàng

hoàng, do tác dụng dược lý tốt nên đến nay được sử dụng chữa bệnh ở nhiều dân

tộc trên thế giới

1.1.4 Tình hình sản xuất địa hoàng trong nước

Để thỏa mãn nhu cầu trong nước và xuất khẩu, hàng năm phải sản xuất khoảng 1000-2000 tấn địa hoàng.Trên thực tế không đáp ứng được lượng như vậy nên chúng ta phải nhập khẩu nguyên liệu từ Trung Quốc Năm 1958 chúng ta tiến hành nhập các giống địa hoàng từ Trung Quốc là các giống: trạng nguyên hồng, đại thanh anh, tiểu thanh anh trồng ở các vùng như Hải Hưng, Hưng Yên, Bắc Ninh, Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Phú Thọ và đã có những mô hình đạt năng suất cao

Để có hiệu quả kinh tế cao, thì sản sản xuất địa hoàng ở nước ta nên đi theo chiều hướng thâm canh, chọn thời vụ tối ưu, đảm bảo năng suất ổn định ở mức từ 7 - 8 tấn/ha thì mới có thể cạnh tranh được với các sản phẩm cây này của Trung Quốc Tại Bắc Giang từ tháng 7-2011 đến tháng 6-2012, Công ty cổ phần Dược phẩm Bắc Giang chủ trì thực hiện đề tài khoa học công nghệ cấp tỉnh

"Nghiên cứu trồng trọt, thu hoạch, chế biến địa hoàng theo hướng thực hành tốt, trồng trọt, thu hái cây thuốc (GACP) và quy trình chế biến thành phẩm thục địa” Kết thúc thời hạn, công ty đã hoàn thành các mục tiêu đề ra như: điều tra, khảo sát một số vùng trồng địa hoàng tại Bắc Giang, xây dựng 2 mô hình canh tác theo hướng GACP-WHO (đạt tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế thế giới) Trong đó có 2 ha địa hoàng giống tại xã Minh Đức (Việt Yên) năng suất khoảng 8,5 tấn/ha và 1 ha địa hoàng nguyên liệu tại xã Dĩnh Trì (TP Bắc Giang) đạt 16,8 tấn/ha Công ty đã nghiên cứu, thiết lập quy trình chế biến xanh địa hoàng từ địa hoàng tươi bằng thiết bị sấy công nghiệp; quy trình chế biến thục địa từ can địa hoàng trên nồi hơi… Tháng 10 - 2012, Sở Khoa học và Công nghệ tổ chức nghiệm thu, đánh giá cao hiệu quả của đề tài Kết quả nghiên cứu được chuyển giao cho Công ty TNHH MTV Dược Bắc Giang (đơn vị trực thuộc Công ty cổ phần Dược phẩm Bắc Giang) ứng dụng và triển khai Từ tháng 7 năm nay, doanh nghiệp đã đầu tư máy móc, thiết bị chế biến địa hoàng Hiện các sản phẩm thục địa, can địa hoàng

đã được bán ra thị trường.Nhờ ứng dụng thành công kỹ thuật mới, ngày

16-10-2013, Công ty TNHH MTV Dược Bắc Giang được Sở Khoa học và Công nghệ

trao giấy chứng nhận Doanh nghiệp Khoa học Công nghệ Mô hình trồng, chế biến địa hoàng theo tiêu chuẩn GACP-WHO đã mở ra triển vọng nhân rộng diện tích cây trồng này trên địa bàn tỉnh, tạo nguồn dược liệu phục vụ sản xuất thuốc trong nước và xuất khẩu

1.2 Kỹ thuật nhân giống in vitro

1.2.1 Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào in vitro là học thuyết

về tính toàn năng của tế bào Theo Gottlide Haberlandt (1902) ,mỗi tế bào của bất kì cơ thể nào đều mang toàn bộ hệ thống di truyền cần thiết và đầy đủ thông tin của sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp,mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh.Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ Hàng trăm loại cây trồng đã được nhân giống trên quy mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh thành cây hoàn chỉnh với số lượng vô cùng lớn (Murashige,1980)

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất là

kết quả của các quá trình phân hóa và phản phân hóa Tất cả các tế bào trong các

cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật trưởng thành đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh Sau đó từ các tế bào phôi sinh này tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô,cơ quan có chức năng khác nhau gọi là sự phân hóa tế bào.Ví dụ: mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp,mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ,mô dẫn làm chức năng dẫn nước và dinh dưỡng

Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết,ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng phôi sinh và phát triển mạnh

mẽ Đó là quá trình phản phân hóa Ví dụ: khi nuôi cấy mô thuốc lá,các tế bào phân hóa của lá gặp điều kiện thích hợp sẽ phản phân hóa và liên tục phân chia liên tục tạo thành mô sẹo Các mô sẹo không còn là các tế bào có chức năng như

tế bào lá nữa, khi cấy chuyển trên môi trường thuận lợi thì chúng sẽ tạo thành cây

Về bản chất,đó là các quá trình hoạt hóa, ức chế các gen Trong quá trình phát triển của cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều có một số gen nhất định được hoạt hóa cho ta tính trạng mới, một số gen khác lại bị ngừng hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa Mặt khác, khi nằm trong một khối mô bình thường, tế bào luôn bị chi phối bởi các tế bào xung quanh Khi tế bào được tách riêng rẽ, tác dụng ức chế của các tế bào xung quanh không còn nữa thì các gen được hoạt hóa

và quá trình phân hóa sẽ xảy ra theo một chương trình đã được thiết lập

1.2.2 Các bước cơ bản của quá trình nhân giống in vitro

Theo Debergh (1991) thì quy trình nhân giống được chia làm 5 giai đoạn:

Lấy mẫu và xử lý mẫu

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định vi nhân giống Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào các lấy mẫu, xử lý mẫu trong điều kiện khử trùng Mỗi cây đều có ngưỡng nhiệt độ và độ ẩm phù hợp khi bảo quản và xử lý mẫu Với cây nhiệt đới thì nhiệt độ 25oC, độ ẩm 75% là điều kiện giữ mẫu thích hợp,

tỷ lệ nhiễm bệnh thấp (Debergh và Zimmerman, 1991) Cây mẹ phải là cây sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh.Việc trồng các cây

mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng

sống, sinh trưởng của mẫu nuôi cấy

Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ qua từ mẫu nuôi cấy, thường

là chồi ngọn, chồi nách hay lát cắt đốt thân, mảnh lá tùy thuộc vào đối tượng và mục đích nghiên cứu Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp

để tạo thể nhân giống in vitro Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đăc

điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng.Đối với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường dùng cách tạo cụm chồi bằng mô sẹo Trong môi trường nhân giống thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác (Nguyễn Đức Thành, 2000)

Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy giống môi trường tạo thể chồi và được bổ sung thểm hoocmon điều tiết sinh trưởng, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài Tăng thời gian chiếu sáng lên 16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng thối thiểu là 1000lux, nhiệt độ thích hợp 20-30oC Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng

sinh diễn ra nhanh Cây nhân giông in vitro ở trạng thái trẻ hóa và dược duy trì

trong thời gian dài

Tạo cây hoàn chỉnh

Để tạo rễ cho chồi phải cấy chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Môi trường ra rễ thường bổ sung 1 lượng nhỏ auxin Tuy nhiên có một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng Đối với cac phôi vô tính thường chỉ gieo trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có nồng độ cytokinin thấp để phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh (Nguyễn Như Khanh, 2002)

Chuyển cây in vitro ra vườn ươm

Cây con đã ra rễ được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong chậu nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp Sau khoảng

2 tuần, cây đã thích nghi với điều kiện bên ngoài, lúc này có thể tăng cường độ chiếu sáng và hạ độ ẩm Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quy trình nhân

giống in vitro vì cây con thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống in vitro

và ex vitro Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định dinh dưỡng ,ánh

sáng, nhiệt độ, độ ẩm nên khi chuyển ra đất với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn về các yếu tố trên dẫn đến cây con dễ bị stress, dễ mất nước và mau héo dẫn đến hiện tượng chết Để tránh hiện tượng này.vườn ươm phải mát mẻ, cường

độ chiếu sáng thấp, độ ẩm cao Cây con thường được cấy trong luống ươm có cơ

giảm sự thoát hơi nước ở lá (thường từ 7-10 ngày) Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần dần lụi đi và mọc ra rễ mới Thông thường người ta thường dùng chất kích thích ra rễ phun lên lá hoặc ngâm rễ vào dung dịch với nồng độ thấp nhằm rút ngắn thời gian ra rễ Giá thể ra cây cũng phải được xử lý trước vài ngày để loại bỏ các yếu tố như nấm bệnh gây hại cho cây con bằng cách sử dụng chế phẩm sinh học

1.2.3 Ảnh hưởng của một số nhân tố đến nhân giống in vitro

1.2.3.1 Khử trùng mẫu cấy

Với nguồn mẫu là cây địa hoàng trồng ngoài điều kiện tự nhiên, chúng tôi chọn HgCl2 0,1% hợp Sodium dichloroisocyanuric axit (NaDCC 25%) (Troclosene sodium NaDCC) là chất khử trùng, các chất này có khả năng thấm sâu vào bên trong mẫu cấy

Cây địa hoàng sau khi cắt tỉa bỏ hết lá được rửa dưới vòi nước chảy Sau đó được rửa sạch bằng nước xà phòng, lắc đều 2 - 3 lần trong 10 phút và rửa sạch dưới vòi nước Trong buồng cấy vô trùng, tráng lại mẫu bằng nước cất vô trùng sau đó khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 5 phút, tráng lại mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần Tiếp theo khử trùng mẫu trong 0,5% Troclosene sodium (NaDCC) ở các ngưỡng thời gian 5, 10 và 15 phút Rửa sạch lại mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần Sau đó cấy vào môi trường cơ bản là MS +

30 g/l Saccarose + 5,8 g/l agar Kết quả thu được sau 4 tuần nuôi cấy

1.2.3.2 Chất điều tiết sinh trưởng thực vật

Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho mô và các tổ chức Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật được chia

thành các nhóm chính sau đây:

● Nhóm các auxin

Môi trường nuôi cấy được bổ sung các auxin khác nhau như: 1H- indole acetic acid (IAA), 1-naphthaleneacetic`acid(NAA),1H-indole-3-butyricacid (IBA), 2,4-dichlorophenoxyaceticacid(2,4-D)`và naphthoxyacetic acid (NOA)

-3-Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ, và phân hóa mạch dẫn Nói chung, các auxin được hòa tan hoặc trong ethanol hoặc trong NaOH loãng (Vũ Minh Tuấn, 2009)

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với các cytokinin Auxin có khả năng khởi đầu sự phân chia tế bào Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, tính hướng, tính ưu thế ngọn, tạo rễ và phân hóa mạch dẫn Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin được khái quát dưới đây:

o Kích thích phân chia và kéo dài tế bào

o Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên Ưu thế chồi đỉnh làm ức chế sinh trưởng của chồi nách Nếu ngắt bỏ chồi đỉnh sẽ dẫn đến sự phát chồi nách Nếu thay thế vai trò của chồi đỉnh bằng một lớp chất keo

có chứa IAA thì chồi nách vẫn bị ức chế sinh trưởng Cơ chế ức chế của chồi đỉnh liên quan đến một chất điều hoà sinh trưởng khác là ethylene Auxin (IAA) kích thích chồi bên sản sinh ra ethylen làm ức chế sinh trưởng của chồi đỉnh

o IAA đóng vai trò kích thích sự phân hoá của các mô dẫn

o Tạo và nhân nhanh mô sẹo

o Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp)

o 1H- indole-3-acetic acid (IAA),

● Nhóm các cytokinin

Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6- benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethyl- aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6-amine (kinetin), và 6-(4- 3-methyl-trans-2-butanylamino) purine (zeatin) Zeatin và 2-iP là các cytokinin

tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo Nói chung, chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các hệ thống nuôi cấy Đối với sự phát sinh phôi

để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách Vấn đề quan trọng không kém là nồng độ của hai nhóm chất điều khiển sinh trưởng này Chẳng hạn 2,4-D cùng với BA ở nồng độ 5,0 ppm kích thích sự tạo thành callus ở Agrostis nhưng nếu dùng ở nồng độ 0, 1 ppm chúng sẽ kích thích tạo chồi mặc dù trong cả 2 trường hợp tỷ lệ auxin/cytokinin là bằng 1 Cơ chế hoạt động của cytokinin là chưa được biết rõ ràng mặc dù có một số kết quả về sự có mặt của các hợp chất mang hoạt tính cytokinin trong RNA vận chuyển Các cytokinin cũng có hoạt tính tổng hợp RNA, tăng hoạt tính enzyme và protein trong các mô nhất định Chức năng chủ yếu của các cytokinin được khái quát như sau:

o Kích thích phân chia tế bào

o Tạo và nhân callus

o Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô

o Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh

o Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào

o Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài

o Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao)

o Ức chế sự hình thành rễ

o Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục

o Ức chế sự kéo dài chồi (Hoàng Tấn Minh, 2006)

Ảnh hưởng một số yếu tố khác

Agar (thạch): là thành phần quyết định trạng thái vật lý của môi trường

nuôi cấy Độ cứng của agar phụ thuộc vào nồng độ agar sử dụng và PH môi trường nuôi cấy Nồng độ agar thường sử dụng là 5-10 %, nồng độ này cho phép

ổn định trong môi trường nuôi cấy

PH của môi trường:

PH của môi trường là yếu tố rất quan trọng sự ổn định Ph của môi trường

là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào Giá trị của PH trong môi trường thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của nhiều loài thức vật biến đổi từ 5,5-6,0 Theo Nguyễn Như Khanh (1990) và khi PH thấp (môi trường axit) sẽ hoạt hóa các enzyme hydrolaza dẫn đến kìm hãm sự sinh trưởng, đồng thời kích thích sự lão hóa tế bào trong mô cấy Ngoài ra, sự bền vững và hấp thu một loạt các chất phụ thuộc vào PH môi trường : gibberelin và các vitamin rất mẫn cảm với PH

Sự hấp thu sắt cũng phụ thuộc vào PH môi trường

Độ PH ảnh hưởng tới khả năng hòa tan của ion, độ đông tụ của agar, khả năng hấp thụ dinh dưỡng của mẫu cấy, sự tăng trưởng của tế bào Để điều chỉnh

PH, ta sử dụng HCL, NaOH, KOH

1.2.3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng đường

Sự hình thành củ là một quá trình sinh lý phức tạp, liên quan mật thiết đến trạng thái ngủ nghỉ của mô nuôi cấy (Vũ Văn Vụ, 1997; Okubo, 2000) Do đó, để tạo củ thì vấn đề quan trọng nhất là xác định được các yếu tố cảm ứng cho quá trình ngủ nghỉ xảy ra

Trong môi trường nuôi cấy, các mô không có khả năng tự dưỡng do không quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài, do vậy cần cung cấp đường để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối Các loại đường thường được sử dụng làSacarose, d-glucose, d-fructose (Dood và Roberts, 1987) Sacarose là nguồn carbon được

sử dụng rộng rãi nhất cho các loại cây

Ngoài việc cảm ứng ngủ nghỉ bằng các chất điều hòa sinh trưởng, đường

thẩm thấu của môi trường tức là tác động vào áp lực nước đối với mô tế bào đang biệt hóa và kích thích chúng phát triển (Kumar et al., 2005) Nồng độ đường dao động từ 2 - 6%, tùy thuộc loài và loại mô nuôi cấy (Pelkonen, 2005)

Tuy nhiên theo nhiều báo cáo, nồng độ đường thích hợp cho phản ứng tạo

củ có thể cao hơn, khoảng 9 - 12% Đặc biệt, sacarose có vai trò như một loại

đường vận chuyển quan trọng nhất ở các cây có củ như: Lilium, Narcissus ; và

hàm lượng đường cao có ảnh hưởng tích cự đến sự hình thành củ và sự sinh trưởng phát triển của củ (Mei-Lant, 2003; Staikidou et al., 2005) Hàm lượng đường 90g/l tỏ ra thích hợp nhất trong giai đoạn tạo củ và tăng trọng lượng củ, chủ yếu do làm tăng tích lũy chất khô (Nhut et al., 2001b) Nghiên cứu của

Staikidou và cộng sự (2005) ở Narcissus cũng cho thấy vai trò quan trọng của

đường saccarose trong phản ứng tạo củ, việc bổ sung các loại đường rượu: manitol, sorbitol hay các monosaccharide, glucose, fructose vào môi trường nuôi cấy có 30 g/l saccarose đều không có hiệu quả tốt bằng việc sử dụng lượng đường saccarose 90 g/l

Nguyễn Thị Lý Anh và cs (2005) đã nghiên cứu ảnh hưởng của hàm

lượng đường và chế độ chiếu sáng đến sự hình thành củ in vitro ở cây Lily trên 2

giống: đỏ (Oriental) và vàng (Asiatic) với việc sử dụng hàm lượng đường saccaroza ở các nồng độ khác nhau 3%, 6%, 9% và 12% Kết quả cho thấy ở hàm lượng đường càng cao thì quá trình tích lũy vào củ càng mạnh mẽ Tại nồng độ đường 12% thì khối lượng trung bình củ đạt 1,25 g/củ với hệ số nhân củ đạt 3,0 lần (đối với giống Oriental) và 1,2 g/củ với hệ số nhân củ đạt 2,7 lần (đối với giống Asiatic) Trịnh Khắc Quang và cs (2011) đã thành công trong việc nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng và hàm lượng đường tới khả năng tạo củ từ vảy củ hoa Lily, kết quả sau 8 tuần nuôi cấy tại môi trường MS +

90 g/l saccarose + 0,5 mg/l αNAA cho tỷ lệ mẫu tạo củ đạt 100%; hệ số tạo củ

3,43 lần và khối lượng củ trung bình là 0,15 g

1.2.3.4.Tác dụng của một số hợp chất hữu cơ (nước dừa, pepton)

Nước dừa: dịch chiết bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường

sự sinh trưởng và phát triển của mô cấy Miller và Skook (1961) đã cho rằng

trong nước dừa có 1,3-diphenylurea là một cytokinin có tác dụng chủ yếu lên quá trình phân bào của mẫu cấy Nước dừa thường dùng ở nồng độ 5-15 %.Ngoài ra nước dừa còn có khả năng giảm bớt sự tiết hợp chất phenol của mẫu cấy (Tanaki

và Sakaniki, 1978)

Pepton: có vai trò chung là cung cấp đường, acid amin, purin, pyrimidin,

vitamin và các dưỡng chất khác có tác dụng làm tăng sự phát triển của mô sẹo và tăng chất lượng chồi trong nuôi cấy mô

1.2.3.5 Hiện tượng thủy tinh hóa mẫu cấy

Sự thủy tinh hóa trong mô cấy thực vật là một hiện tượng mà cây nuôi cấy

bị mọng nước,có thể xuất hiện những giọt nước nhỏ trên mẫu cấy Hiện tượng này sẽ làm cho cây mất nước nhanh chóng và chết khi được đưa ra ngoài tự nhiên Nó xảy ra nhiều trong nuôi cấy cây hoa cúc, hoa hồng, hoa cẩm chướng trong đó có cả cây địa hoàng Để khắc phục hiện tượng này bằng cách điều chỉnh thành phần môi trường như: tăng lượng agar, đường, điều ánh sáng, tăng chất kháng etylen và giảm các chất có chứa Ni tơ trong môi trường khi nuôi cấy, sử dụng đường manitol để tăng áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy …

1.2.4 Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng và phát triển của cây địa hoàng in vitro

Trồng cây trong giá thể là biện pháp trồng cây trong các giá thể tự tạo không phải là đất Dinh dưỡng được cung cấp cho cây thông qua phân bón trộn trong giá thể và bón thúc Giá thể được trồng trong các túi bầu đen hoặc một số giá thể khác nhau như khay chậu nhựa, sứ, gỗ, kim loại tùy từng sở thích và điều kiện môi trường mà người ta chọn giá thể thích hợp

Giá thể trồng cây cũng có rất hiều loại nhưng hầu hết được phối trộn từ các vật liệu dễ kiếm trong tự nhiên như: trấu hun, xơ dừa, mùn cưa, cát, bột đá Tuy nhiên giá thể được tạo ra phải có độ thông thoáng và có khả năng giữ nước tốt

Ở các nước đang phát triển, hỗn hợp đặc biệt gồm đá trân châu, than bùn

có sẵn ở dạng sử dụng được cung cấp ngay cho mục đích thay thế đất Các trang trại thâm canh chủ yếu ở các nước đang phát triển thiên về nhập khẩu những hỗn

có ở địa phương Thực tế môi trường nhiệt đới có rất nhiều vật liệu có thể sử dụng pha chế hỗn hợp bầu trong vườn ươm Có rất nhiều công thức phối trộn dựa vào khả năng có sẵn của nguyên liệu có tỉ lệ 1:1:1 là cát rây+ đất vườn+ phân hữu cơ; Đất vườn+ bột xơ dừa+ phân hữu cơ hay đất vườn+ phân chuồng+ bột

xơ dừa Theo Lawtence; Newell (1950) cho biết ở Anh sử dụng hỗn hợp đất mịn+ than bùn+ cát khô có tỉ lệ 2:1:1 để gieo hạt, để trồng cây là 7:3:2 Theo Kaplina (1976) đối với cùng một loại cây nhưng với thành phần giá thể khác nhau cho năng suất khác nhau

1.3 Ảnh hưởng của các loại phân bón đến sự sinh trưởng và phát triển của

cây invitro khi trồng trong điều kiện tự nhiên

Có rất nhiều loại phân bón cho cây trồng, nhưng xuất phát từ nguồn sản xuất, nguồn khai thác, số lượng cần bón và cách thức bón, … mà người ta có thể tạm thời chia thành 5 loại phân sau:

Phân vô cơ (hay còn gọi phân khoáng hoặc phân hóa học) là các loại phân có chứa yếu tố dinh dưỡng dưới dạng muối khoáng thu được nhờ các quá trình vật

lý và hóa học Phân vô cơ bao gồm các loại phân đơn (phân đạm, phân lân, phân kali, …), phân hỗn hợp, vôi,

Phân hữu cơ là phân chứa những chất dinh dưỡng ở dạng những hợp chất hữu cơ như: phân chuồng, phân xanh, than bùn, phụ phế phâm nông nghiệp, phân rác, phân vi sinh, phân hữu cơ sinh học, …

Phân vi lượng là hỗn hợp các chất hóa học nhằm cung cấp các loại nguyên

tố vi lượng cho cây, nhiều khi còn bổ sung các nguyên tố siêu vi lượng, đất hiếm, chất kích thích sinh trưởng

Phân phức hợp hữu cơ vi sinh là loại phân có đầy đủ thành phần phân

vi sinh, phân hữu cơ, phân vi lượng và phân vô cơ Tùy thuộc vào nhu cầu sản xuất mà có thể cân đối phối trộn các loại phân nguyên liệu sao cho cây trồng phát triển tốt nhất mà không cần phải bón bất kỳ loại phân đơn nào Phân phức hợp hữu cơ vi sinh có thể dùng để bón lót hoặc bón thúc Loại phân này có hàm lượng dinh dưỡng cao nên khi bón cần trộn với đất bột hoặc bón xa gốc để

tránh hiện tượng xót cây Nếu sản xuất đúng công thức thì đây là loại phân tốt nhất, bao gồm chế phẩm vi sinh, phân vi sinh, phân hữu cơ vi sinh và phân phức hợp hữu cơ vi sinh Cây hoàn toàn không thể phát triển bình thường nếu không

có các nguyên tố vi lượng như Bo (B), Man gan (Mn), kẽm ( Zn), đồng ( Cu), Molipđen (Mo), một số cây cần cả nhôm (Al), Silic (Si) Người ta đã chứng minh những nguyên tố này là tuyệt đối cần thiết cho cây.Các nguyên tố đó được xem như là các chất kích thích và các loại phân bón chứa chúng là các loại phân xúc tác hoặc phân kích thích, chúng thúc đẩy sự phát triển của thực vật

Phân bón lá là hỗn hợp của một số phân đa lượng, vi lượng và một số chất điều hòa sinh trưởng Loại phân này dung để phun lên lá, hoa quả và thân cây

Cơ chế tác dụng của phân bón lá:

Cấu trúc của lá gồm có lớp cutin, khí khổng và chất sáp ở bên ngoài che phủ, lớp bì mô có nhiều chất mộc, bán mộc, pectin, được phối hợp với lực căng trên mặt lá Do đó, trong phân bón lá, người ta phải dùng chất có nhũ dầu, chất detergent hoặc chất ướt để giúp chất phân lỏng dính vào lá Một cách đơn giản,

sự hấp thu phân vào lá là do sự chênh lệch nồng độ dung dịch giữa chất phân ở bên ngoài lá và dung dịch ở bên trong lớp cutin của bì mô lá, nhờ đó chất phân được thẩm thấu vào bên trong lá

Cách sử dụng phân bón lá:

Sử dụng phân bón lá phải ở những nồng độ thích hợp theo chỉ dẫn ghi trên bao bì cho từng loại cây.Nếu cao cây sẽ bị bội thực và chết, nếu bón nồng độ thấp thì hiệu lực không rõ Nên phun phân bón lá vào lúc khí khổng đang mở, phun khi nhiệt độ dưới 300C, trời không nắng, không mưa, không có gió khô, phân bón lá chỉ phát huy tác dụng khi cung cấp đủ nước, phân qua rễ.Thời gian phun: 9-10h sáng và 2-3h chiều về mùa đông, 7-8h sáng hoặc 5-6h chiều về mùa

hè Không phun khi mưa, nắng to do bay hơi, tỷ lệ lỗ khí khổng đóng không cao Không nên phun sau mưa do cây đã no nước

1.4 Các nghiên cứu về nuôi cấy mô cây địa hoàng

1.4.1 Trên thế giới

Nuôi cấy mô địa hoàng trên thế giới đã đạt nhiều thành công trong 10 năm gần đây Phần lớn các nghiên cứu đều đến từ các trường đại học ở Trung Quốc- quê hương của địa hoàng

Năm 2003, ChenMinYan đã nghiên cứu thành công quy trình nuôi cấy địa

hoàng in vitro và công bố kết quả trong luận văn thạc sĩ của mình Kết quả của

luận văn đã chỉ ra rằng: sử dụng gốc của địa hoàng làm nguyên liệu, rửa khử trùng chúng với cồn 75 độ từ 25-30 phút và HgCl2 từ 15-20 phút cho tỷ lệ nhiễm mẫu thấp nhất, cải thiện tỷ lệ nảy chồi mới trong quá trình nuôi cấy Sau đó, chồi được cấy chuyển trong môi trường MS bổ sung BA 0,5mg/l + NAA 0,1mg/l có khả năng tăng trưởng tốt hơn Các cây giống trong ống nghiệm được cắt, tách thành các đốt, chồi nuôi cấy trong MS bổ sung BA 0,5mg/l + NAA 0,1mg/l là phù hợp và cho tỷ lệ nhân chồi 6,5 sau 4-5 tuần Khi nghiên cứu môi trường tái sinh với nguyên liệu gồm thân lá, cuống lá cho kết quả nuôi cấy trên môi trường

MS có bổ sung BA 1,0 mg/l, NAA 0,5 mg/l, tỷ lệ cảm ứng của mô sẹo là 100%

và 95,6%.Một vài mô sẹo xanh ngọc lục hoặc màu xanh lá cây được hình thành khi các lá nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BA 0,5mg/l, NAA 0,3mg/l,

và tỷ lệ cảm ứng của mô sẹo là 96% Sau 25 ngày nuôi cấy các tỷ lệ khác biệt từ

mô sẹo lá là khoảng 44,4%; trong khi những chiếc lá được nuôi cấy trên môi trường MS với sự kết hợp khác nhau và nồng độ 2,4-D/BA, tỷ lệ cảm ứng của

mô sẹo có thể đạt 100%, và hầu hết các mô sẹo là màu xám và màu vàng, và khó

để hình thành chồi , nhưng nó có thể dễ dàng hình thành các gốc từ bề mặt của

mô sẹo Các chồi tái sinh từ mẫu cấy khác nhau mà đạt 1-2cm đã được tách ra và chuyển vào môi trường MS có bổ sung sửa đổi với NAA 0.05 mg /l cho rễ, sau 15-20 ngày kể từ ngày các tỷ lệ khác biệt của các gốc là khoảng 100% Khi cây con đã được chuyển ra trồng trên giá thể kết hợp các chất mùn và cát trong 2-3 tuần, tỷ lệ sống sót của cây con có thể đạt 96,7%

Năm 2006, Liu Meng-lin cũng tiến hành thí nghiệm tìm ra điều kiện môi trường nuôi cấy cảm ứng callus khi môi trường MS cơ bản được thay đổi nông

độ 2.4D, NAA và BA.Kết quả chỉ định rằng tỷ lệ mô sẹo cảm ứng từ lá, cuống lá, thân cây là 100% trong điều kiện MS + 1,0~1,5mg NAA 2,4D và NAA là 2 loại auxin có thể tạo ra mô sẹo, nhưng mô sẹo lớn nhanh hơn trong môi trường 0.5mg/l BA

Năm 2009, một nhóm nghiên cứu của trường đại học quốc tế Chung Nam Hàn Quốc đã công bố một bài báo về nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ lá trong môi trường MS cơ bản có bổ sung nồng độ khác nhau của TDZ Kết quả cho thấy,số lượng cao nhất của mỗi chồi đạt tỷ lệ 2,1 và tăng trưởng của thân thêm trung bình 1,2cm thu được trên môi trường MS bổ sung 1 mg /l TDZ Việc

bổ sung 0,1 mg / l NAA và 3g /l Gelrite trong môi trường MS có chứa 1 mg /l TDZ được cải thiện đáng kể sự tái sinh chồi của địa hoàng đã cứng lại và trồng

ra đất cùng với một tỷ lệ sống 73%

1.4.2 Ở Việt Nam

Hiện nay ở Việt nam đã có một số nghiên cứu nhằm nâng cao năng suất, chất lượng sản phẩm địa hoàng ở nhiều khu vực tỉnh thành trong cả nước của các nhà nghiên cứu khoa học (Vũ Minh Tuấn, 2009)

Tuy nhiên, tài liệu nghiên cứu về nhân giống nuôi cấy mô cây địa hoàng

ở nước ta còn rất hạn chế và hầu như chưa có công trình nào được công bố chính thức Gần đây nhất mới chỉ có một khoá luận tốt nghiệp của sinh viên Mai Đăng Hùng (Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệpViệt Nam) khảo sát về nuôi cấy mô cây địa hoàng và bước đầu xác định được môi trường nhân nhanh

thích hợp là MS+1mg/BA+0,1mg/α-NAA và môi trường ra rễ của chồi in vitro là

MS +0,3mg/IBA Với thực trạng này, việc tiếp tục nghiên cứu xây dựng quy

trình nhân giống và tạo củ in vitro cây địa hoàng nhằm tạo nguồn giống chất

lượng cao phục vụ phát triển cây dược liệu có giá trị này là rất cần thiết

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây địa hoàng Rehmannia glutinosa (Gaertn) Libosch)

Nguồn mẫu cây địa hoàng đang sản xuất ở huyện Việt Yên, tỉnh Bắc Giang

2.2 Vật liệu nghiên cứu

Các chồi mầm từ củ của cây trồng trong điều kiện tự nhiên, các chồi kích thước 0.8-2.5cm và có 1 đến 3 lá

2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Phòng công nghệ sinh học thực vật - Viện Sinh học Nông nghiệp – tầng 3 nhà B Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Thời gian nghiên cứu từ 02/05/2014 đến 20/05/2015

2.4 Nội dung nghiên cứu

2.4.1 Xác định chế độ khử trùng của mẫu cấy

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl2 0, 1% kết hợp Sodium dichloroisocyanuric axit (NaDCC 25%) đến hiệu quả khử trùng

Môi trường nền: MS +30g/l saccaroza + 5,0g/l agar ph=5,8-6,0

0,1%(phút)

NaDCC 0,5%(phút)

2.4.2 Xác định môi trường nhân nhanh in vitro

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến nhân nhanh chồi in vitro

Môi trường nền: MS +30g/l saccaroza + 5,5g/l agar PH=5,8-6,0

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng BA+ α-NAA đến nhân nhanh chồi in vitro

Môi trường nền: MS +30g/l saccaroza + 5,5g/l agar PH=5,8-6,0

Môi trường nền Α-NAA(mg/l) CT1(ĐC)

MS0 + BA*( nồng độ thích hợp nhất ở thí nghiệm 2)

Môi trường nền Nước dừa(ml/l) CT1(ĐC)

MS0 +BA*( nồng độ thích hợp nhất ở thí nghiệm 2)

0

Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của pepton đến khả năng nhanh nhanh chồi

Môi trường nền Pepton(g/l) CT1(ĐC)

MS0 +BA*( nồng độ thích hợp nhất ở thí nghiệm 2)

2.4.3 Nghiên cứu chống thủy tinh hóa mẫu cấy

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kháng Ethylene ( Thiosunfat Bạc )

đến sự thủy tinh hóa của cây

Môi trường nền Thiosunfat Bạc (µM/l) CT1(ĐC)

2.4.4 Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ của cây

địa hoàng in vitro

Môi trường nền: MS +30g/l saccaroza + 5,5g/l agar PH=5,8-6,0

Môi trường nền α-NAA (mg/l) CT1(ĐC)

Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây địa

hoàng in vitro

Môi trường nền: MS +30g/l saccaroza + 5,5g/l agar PH=5,8-6,0

2.4.5 Nghiên cứu môi trường tạo củ in vitro

Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng tạo củ cây địa

hoàng in vitro

MS0 +30g đường

Thí nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tạo

củ in vitro của cây địa hoàng

Môi trường nền Sacaroza (g/l) CT1(ĐC)

MS0

0

Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của đường và α-NAA đến khả năng tạo

củ in vitro của cây địa hoàng

CT1: MSo + Sacaroza * ( nồng độ đường tối ưu ở thí nghiệm 10)

Môi trường nền α-NAA(mg/l) CT1(ĐC) MS0 + Sacaroza * ( nồng

độ đường tối ưu ở thí nghiệm 11)

Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống và sinh

trưởng của cây địa hoàng in vitro

CT1: Đất phù sa

CT2: Đất phù sa + trấu hun với tỷ lệ 1:1

CT3: Đất phù sa + mùn dừa với tỷ lệ 1:1

CT4: Mùn dừa + trấu hun với tỷ lệ 1:1

Thí nghiệm 13: Nghiên cứu ảnh hưởng của dinh dưỡng qua lá đến sinh trưởng

của cây in vitro của vườn ươm

CT1: Đối chứng (phun nước lã)

CT2: Phân bón lá Yogen 30-10-10

CT3: Phân bón lá Atonik

CT4: Phân bón lá đầu trâu 502

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm trong phòng được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, mỗi công thức 30 cây chia làm 3 lần nhắc lại mỗi lần nhắc lại 10 cây Các chỉ tiêu theo dõi đo đếm định kỳ 5-7 ngày/lần tùy theo từng thí nghiệm Các thí

nghiệm ngoài vườn ươm được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ RCB, mỗi công thức theo dõi 30 cây chia làm 3 lần nhắc lại mỗi lần nhắc lại 10 cây

Các loại phân bón lá phun theo liều lượng và nồng độ khuyến cáo trên bao

bì Định kỳ phun 5-7 ngày/lần

Môi trường nuôi cấy

Môi trường MS (Murashige và Skoog,1962) Môi trường MS có bổ sinh các chất điều tiết sinh trưởng với các nồng độ khác nhau tùy từng thí nghiệm

Giá trị PH của môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trước khi khử trùng: 5,8-6,0

Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở 1210, áp suất 1 atm trong

20 phút

Điều kiện nuôi cấy

Các dụng cụ được sử dụng trong nuôi cấy: dao,kéo, banh kẹp được vô trùng bằng cồn Tủ cấy vô trùng

Nhiệt độ phòng nuôi 250 C ± 20C

Độ ẩm 70%

Cường độ chiếu sáng 2000lux-3000lux

Thời gian chiếu sáng 14h sáng/10h tối

2.5.2 Phương pháp tiến hành

Phương pháp khử trùng mẫu cấy

Các chồi mầm từ củ của cây trồng trong điều kiện tự nhiên, các chồi kích thước 0.8-2.5cm và có 1 đến 3 lá là có thể thu hoạch để dùng làm mẫu Cắt bỏ lá, cho vào rửa với xà phòng trong khoảng 10 phút Sau đó rửa sạch lại với nước trong 5 phút cho sạch xà phòng Sau đó tiến hành thí nghiệm khử trùng trong buồng cấy Rửa lại mẫu với nước cất vô trùng 3 lần, mỗi lần 3 phút sau khi khử trùng bằng các loại hóa chất

Phương pháp nuôi cấy khởi động

Các mẫu khử trùng được cắt bằng dao cấy thành các đoạn từ 1-1,5cm mang một chồi nách hoặc chồi ngọn Sau đó cấy vào môi trường MS có bổ sung

Phương pháp nhân nhanh

Chồi bất định có chiều cao khoảng 1-1,5cm cấy vào môi trường nhân nhanh MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng

Các đoạn hình thành từ cây nuôi cấy mô được cắt ra thành các mảnh kích thước khoảng 7 x 7 mm,sau đó đặt vào môi trường MS có bổ sung tổ hợp BA và các loại auxin khác nhau

Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh

Sau giai đoạn nhân nhanh, các chồi có chiều cao 3-4cm, có trạng thái sinh trưởng và phát triển bình thường được cấy vào môi trường ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh Môi trường ra rễ là môi trường MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng nhóm auxin

Phương pháp đưa cây ra vườn ươm

Cây địa hoàng sau khi ra rễ được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar

và được trồng vào giá thể nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp Sau khoảng 2 tuần, cây đã thích nghi với điều kiện bên ngoài, lúc này có thể tăng cường độ chiếu sáng và hạ độ ẩm Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quy trình nhân

2.6 Các chỉ tiêu theo dõi

Tổng số mẫu nuôi cấy

Số mẫu tạo chồi

Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = _ x 100

Tổng số mẫu chồi

Tổng số chiều cao của chồi

Chiều cao TB của chồi(cm) =

Tổng số chồi đo được

Tổng số cây bị thủy tinh

Tỷ lệ cây bị thủy tinh TB trên mẫu cấy(%) = _ x 100 Tổng số mẫu đo đếm

Tổng chiều dài của rễ

Chiều dài TB của rễ (cm) =

Tổng số cây sống

Tỷ lệ cây sống (%) = _x 100

Tổng số cây trồng

Tổng số chiều cao của cây

Chiều cao TB cây (cm) =

Tổng số cây đo được

Kiểm tra độ biến động của thí nghiệm được biểu hiện qua chỉ số tiêu chuẩn CV%

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tạo vật liệu khởi đầu

3.1.1 Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% kết hợp Sodium dichloroisocyanuric axit (NaDCC 0.5%) đến hiệu quả khử trùng

HgCl2 là hóa chất có tính khử trùng mạnh,hiệu quả và được sử dụng phổ

biến nhất với hầu hết các mẫu nhân giống in vitro Nếu sử dụng trong thời gian

ngắn,tỷ lệ mẫu nhiễm cao,nếu kéo dài thời gian sử dụng thì dễ làm tổn thương tới mẫu,ảnh hưởng tới khả năng tạo chồi của mẫu và có thể dẫn tới chết mẫu Chính

vì thế, tôi tiến hành nghiên cứu hiệu quả khử trùng của HgCl2 0,1% kết hợp

Sodiumdichloroisocyanuric acid ở các mức thời gian khác nhau Sau 4 tuần theo

dõi thí nghiệm thì Kết quả thu được ở bảng 3.1 dưới đây:

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% kết hợp Sodiumdichloroisocyanuric

acid (NaDCC 0.5%) đến hiệu quả khử trùng (sau 4 tuần nuôi cấy)

Tỷ lệ mẫu sạch (%)

Tỷ lệ mẫu sạch

HgCl2

0,1% NaDCC 0.5% sạch sống(%) Tỷ lệ mẫu

Tỷ lệ mẫu sạch chết (%)

Với thời gian 5 phút thì cho kết quả mẫu nhiễm là 70,2% còn với 10 phút

là 34,3% ,khi tăng thời gian lên 15 phút thì lệ mẫu nhiễm giảm đi rõ rệt còn có 21,7% Tỷ lệ nghịch với mẫu nhiễm là mẫu sạch tăng dần theo thời gian,khi thời gian khử trùng thấp thì tỷ lệ mẫu sống cao CT1 là 80,5%,ở CT2 là 63,2%, ở CT3

là 31,6% Tuy vậy, nếu sử dụng trong một thời gian dài dễ làm mẫu tổn thương

và chết nhiều Khi xử lý khử trùng kép với thời gian 15 phút của NaDCC 0.5%