Nghiên cứu nhân giống in vitro cây mật nhân (eurycoma longifolia jack)

SƯ P M KHOA SINH K ÓA LUẬ TỐT ỆP ghiên cứu nhân giống in vitro mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) Sinh viên thực : ặng Thị Thoa huyên ngành : nhân Sinh Môi Trường Lớp : 09CSM gười hướng dẫn : Th.S Võ hâu Tuấn LỜ ẢM Ơ Để hồn thành khóa luận em xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Sư phạm, khoa Sinh – Môi trường, môn công nghệ sinh học, q thầy, cơ, gia đình bạn bè tạo điều kiện thuận lợi vật chất tinh thần để em hồn thành đề tài m xin đ c biệt g i lời cảm ơn chân thành đ n thầy gi o: ThS Võ Châu Tuấn người trực ti p hướng dẫn bảo tận tình cho em từ nhận đề tài cho đ n hồn thành khóa luận Đà Nẵng, 5/2013 Đ ng Thị Thoa DA MỤ Á TỪ V ẾT TẮT IAA : indole 3-acetic acid IBA : indole 3-butyric acid NAA : α-naphthalen acetic acid 2,4-D : diclorophenoxyacetic acid 2-iP : 6-γ- γ-dimethyl-aminopurine BA : 6-benzyl adenine KIN : kinetin MS : Murashige Skoog WPM : Woody Plant Medium DKW : Juglan Medium cs : cộng ĐHST : điều hòa sinh trưởng DA MỤ CÁC BẢ Tên bảng Bảng Trang 3.1 Hiệu kh trùng mẫu Ca(OCl)2 10% NaOCl 5% 21 3.2 Ảnh hưởng loại hạt đ n khả nảy mầm 22 3.3 Ảnh hưởng BA KIN đ n khả nảy mầm hạt 24 3.4 Ảnh hưởng BA KIN đ n khả nhân chồi từ gốc thân in vitro 3.5 Ảnh hưởng BA KIN đ n khả nhân chồi từ chồi đỉnh in vitro 3.6 Ảnh hưởng IBA NAA đ n khả tạo rễ in vitro 26 28 30 DA MỤ CÁC Hình 2.1 Ì Ả Tên hình Cây mật nhân ngồi tự nhiên Trang 18 Hạt mật nhân 2.2 (a) Hạt chín 18 (b) Hạt chưa chín 3.1 Hạt in vitro nảy mầm mơi trường MS (a) Hạt chưa chín nảy mầm sau ngày ni cấy 23 (b) Hạt chín nảy mầm sau 11 ngày nuôi cấy 3.2 Hạt in vitro nảy mầm môi trường MS 25 Nhân chồi in vitro mật nhân từ gốc thân sau tuần nuôi 3.3 cấy (a) Môi trường MS + 0,5 mg/l BA 27 (b) Môi trường MS + 2,5 mg/l BA (c) Môi trường MS + 0,5 mg/l KIN Nhân chồi in vitro mật nhân từ chồi đỉnh sau tuần nuôi 3.4 cấy (a) Môi trường MS + 0,5 mg/l BA 29 (b) Môi trường MS + 2,5 mg/l BA Rễ in vitro ph t sinh sau tuần nuôi cấy 3.5 (a) Môi trường MS + 0,5 mg/l NAA (b) Môi trường MS + 2,5 mg/l NAA 32 (c) Mơi trường MS + 0,5 mg/l IBA 3.6 Quy trình nhân giống in vitro mật nhân 33 MỞ ẦU Nguồn dược liệu người s dụng tổng hợp từ hóa học, từ vi sinh vật, từ thực vật, nguồn dược liệu từ thực vật người s dụng từ lâu nhu cầu s dụng ngày lớn [50] Việt Nam quốc gia có nguồn tài nguyên thuốc phong phú đa dạng với 3200 loài, nguồn cung cấp dược liệu nước ta chủ y u từ tự nhiên, c c vùng cao, số lượng phân t n, chất lượng dược phẩm không đều, phụ thuộc vào mùa vụ nên gây nhiều khó khăn cho việc khai th c s dụng [11] Bên cạnh đó, c c lồi dược liệu tự nhiên suy giảm số lượng t c động khai th c qu mức c c điều kiện môi trường tự nhiên ngày bất lợi,…[18] Trong vài thập niên qua, kỹ thuật nhân giống in vitro thực vật xem công cụ hữu hiệu nhân nhanh bảo tồn nhiều lòai thuốc q hi m Cơng nghệ cho phép sản xuất nhanh, liên tục nguồn giống với chất lượng cao bệnh Trên th giới Việt Nam, nhiều lồi thuốc q nhân giống thành công kỹ thuật in vitro chẳng hạn đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge), cỏ (Stevia rebaudiana (bert)), Ceropegia bulbosa Roxb, thiên thảo (Basilicum polystachyon (L.) Moench), nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) Cây mật nhân thuộc họ Simarubaceae; phân bố chủ y u khu vực Đông Nam Á c c khu rừng thấp Mi n Điện, Đông Dương, Th i Lan, Malaysia Philippines Ở nước ta, mật nhân phân bố rộng rãi khắp nước miền Trung, Tây Nguyên, Tây Ninh đ c biệt quanh vùng Biên Hòa, Trảng Bom, Định Qu n, Đồng Nai [5, 33] Rễ thân mật nhân chứa c c hợp chất quassinoids, canthin-6 alkaloids, b-carboline alkaloids; chúng có t c dụng kích thích sản sinh hoocmon testosteron phục hồi sinh lực cho ph i nam, kháng viêm loét, ức ch ph t triển khối u ký sinh trùng [33] Ngoài tự nhiên, mật nhân nhân giống chủ y u từ hạt Tuy nhiên, hạt giống có tỷ lệ nảy mầm thấp nên việc nhân giống từ hạt khó khăn M t kh c, loài thân gỗ sinh trưởng chậm sống lâu năm phải thời gian dài (5-7 năm) thu hạt để nhân giống Hiện nay, loài thuốc có nguy tuyệt chủng việc khai th c bừa bãi qu mức để s dụng cho mục đích thương mại Do vậy, việc nghiên cứu tìm phương thức nhân nhanh giống loài nhằm bảo tồn ph t triển nguồn nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược phẩm nước ta cấp thi t [27, 35] Xuất ph t từ sở trên, thực đề tài “ ghiên cứu nhân giống in vitro mật nhân (Eurycoma longifolia Jack)” Mục tiêu nghiên cứu: xây dựng quy trình nhân nhanh giống mật nhân kỹ thuật nuôi cấy in vitro Nội dung nghiên cứu: Để đạt mục tiêu nghiên cứu đề tài, thực c c nội dung sâu đây: Nghiên cứu tạo nguyên liệu mật nhân in vitro từ hạt Nghiên cứu ảnh hưởng chất ĐHST đ n khả nhân nhanh chồi in vitro từ c c nguyên liệu khác Nghiên cứu ảnh hưởng chất ĐHST đ n khả tạo rễ in vitro - hình thành hồn chỉnh hương TỔ QUA T L ỆU 1.1 hân giống in vitro yếu tố ảnh hưởng 1.1.1 Sơ lược nhân giống in vitro 1.1.1.1 Lịch sử hình thành Năm 1902, Haberlandt đề xướng phương ph p nuôi cấy mô, t bào thực vật để chứng minh cho tính tồn t bào [3] Tính tồn t bào soma thực vật Haberlandt khởi xướng khẳng định cơng trình Steward cs mô rễ cà rốt vào năm 1958 [19] Kĩ thuật tạo dòng c c t bào đơn bội phân lập điều kiện in vitro chứng minh rằng, điều kiện thích hợp t bào soma phân hóa để ph t triển thành thể thực vật hoàn chỉnh [3] 1.1.1.2 ác giai đoạn nhân giống in vitro  Giai đoạn 1: Cấy gây (tạo nguyên liệu khởi đầu) Tùy theo loài thực vật mà chọn c c phận nuôi cấy thích hợp Nhằm tạo mẫu cấy vơ trùng mà khả sinh trưởng, trước h t mẫu vật phải kh trùng cồn 70%, HgCl2, Ca(OCl)2 ho c NaOCl… [19]  Giai đoạn 2: Nhân nhanh Vật liệu khởi đầu in vitro chuyển sang môi trường nhân nhanh, cần bổ sung tổ hợp phytohormone mới, tăng tỉ lệ cytokinin/auxin Nhiệt độ khoảng 25270C 16 chi u s ng/ ngày, tối thiểu 1000 lux [22, 15]  Giai đoạn 3: Tạo rễ Trong số trường hợp rễ tạo môi trường nhân nhanh ho c chồi phải chuyển sang mơi trường có auxin ho c khơng có auxin để tạo rễ [19]  Giai đoạn 4: Chuyển đất Đây giai đoạn chuyển từ mơi trường vơ trùng ngồi tự nhiên Cần huấn luyện cho thích nghi với thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh, nước…, qu trình thích nghi dài 2-3 tuần [9] 1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình nhân giống in vitro thực vật 1.1.2.1 guồn mẫu vật nuôi cấy điều kiện khử trùng  Nguồn mẫu vật nuôi cấy Nguyên liệu s dụng cho nuôi cấy mô, t bào thực vật đoạn rễ, thân, c c phần l , cấu trúc phơi, chí quan dự trữ m t đất ho c mẫu thân ngầm… [3] Tùy vào loài thực vật mục đích nghiên cứu mà việc lựa chọn nguồn mẫu vật thích hợp để đạt hiệu tối ưu nghiên cứu nhân giống in vitro lô hội (Aloe Vera L Var Chinensis) Guo-li cs (2010), ti n hành nuôi cấy l , rễ, chồi thân vào c c môi trường kh c nhau, thân cho t i sinh cao (15,6 chồi/mẫu) môi trường MS + 2,0 mg/l BA + 2.0 mg/l IAA [29]; nghiên cứu Hassan cs (2008) nhân giống cỏ mực (Eclipta alba (Linn.) Hassk), s dụng chồi đỉnh chồi n ch để nuôi cấy, quan s t chồi đỉnh cho số lượng chồi nhiều (18 chồi/mẫu) môi trường MS + 0,5 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA [32] Dựa vào c c loài thực vật kh c mà nguyên liệu nuôi cấy kh c s dụng chồi n ch làm nguyên liệu nuôi cấy nghiên cứu nhân giống in vitro cỏ (Stevia rebaudiana (bert)) Thiyagarajan Venkatachalam (2012) [44]; Manonmani cs (2012) nghiên cứu nhân giống in vitro dây thìa canh (Gymnema Sylvestre R.) đốt thân [42]  Điều kiện kh trùng Môi trường nuôi cấy mô, t bào thực vật thường chứa đường, muối kho ng, vitamin thích hợp cho vi khuẩn nấm ph t triển với tốc độ cao, bên cạnh mẫu vật ni cấy thường chứa c c vi sinh vật gây ảnh hưởng đ n qu trình ni cấy C c dung dịch thường dùng để kh trùng mẫu cấy caxi hypoclorit, natri hypoclorit, clorua thuỷ ngân… [3, 22] Tùy vào loại mẫu vật mà lựa chọn c c chất kh trùng kh c nhau, nồng độ kh c Nghiên cứu Agostini cs (2001) nhân giống Cunila Incisa Benth chồi n ch, mẫu cấy kh trùng tốt cồn 70% 30 giây natri hypoclorit 0,1% 20 phút [23] Nghiên cứu Cao Thị Thủy cs (2011) xây dựng quy trình nhân giống in vitro xuyên khung (Ligusticum wallichii Frach.) chồi đỉnh, mẫu cấy kh trùng tốt s dụng HgCl2 0,15% 10 phút [20] Năm 2011, Nguyễn Thanh Tùng cs (2011) nghiên cứu nhân giống in vitro sa nhân tím chồi đỉnh, chồi đỉnh kh trùng HgCl2 0,1% 5-14 phút tỉ lệ sống cao (91,11%) kh trùng HgCl2 0,1% 12 phút [17] K t nghiên cứu Manonmani cs (2012) nhân giống in vitro dây thìa canh (Gymnema Sylvestre R.) mắt thân, mẫu cấy kh trùng tốt s dụng HgCl2 0,01% phút [42] 1.1.2.2 Môi trường nuôi cấy  Nguồn carbon Đường vừa nguồn carbon cung cấp cho mẫu ni cấy đồng thời cịn tham gia vào điều chỉnh khả thẩm thấu mơi trường, nồng độ thích hợp 2-3% Theo Trigiano Gray (2000) hidratcacbon đóng góp 50-70% vào khả thẩm thấu mơi trường [22, 3] Ba nguồn carbon chủ y u sucrose, glucose fructose ảnh hưởng đ n trao đổi chất t bào môi trường nuôi cấy Khi s dụng sucrose nuôi cấy, sucrose thủy phân nhanh chóng nhờ enzime invertase tạo thành glucose fructose trước hấp thụ vào t bào (Felker cs, 1989) C c t bào thực vật hấp thụ glucose trước fructose khả chuyển hóa glucose trực ti p qu trình đường phân, fructose chuyển hóa thành sucrose glucose trước tham gia vào qu trình đường phân (Dijkema cs, 1988) [40] Nghiên cứu Sombatphol (2012) c c y u tố ảnh hưởng đ n việc tích lũy hydroxycanthin-9-6-one mật nhân ni cấy rễ, qua thí nghiệm ảnh hưởng nguồn carbon đ n tích lũy hydroxycanthin-9-6-one rễ cho thấy ni cấy rễ mơi trường ½ WPM bổ sung sucrose fructose cho k t sinh khối cao tích lũy hydroxycanthin-9-6-one cao sau 60 ngày nuôi cấy [55] Nghiên cứu Lim cs (2011) ảnh hưởng nguồn carbon nitơ đ n thay đổi sinh lí ni cấy t bào mật nhân, t bào nuôi cấy môi trường MS bổ sung c c loại đường sucrose, glucose fructose, k t cho cao, nghiên cứu Hassan cs (2001) k t nhân chồi in vitro cao môi trường MS bổ sung 0,25 mg/l BA [31], nghiên cứu kh c Hassan cs (2012) nhân chồi in vitro mật nhân từ chồi đỉnh, môi trường MS bổ sung BA có khả kích thích ph t sinh chồi cao KIN, hiệu ph t sinh chồi cao môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA với 1,82 chồi/mẫu cấy [30] Theo k t chúng tôi, môi trường bổ sung BA kích thích ph t sinh chồi cao KIN đạt cao nuôi cấy chồi đỉnh gốc thân môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA Tuy nhiên mẫu vật gốc thân môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA cho hệ số nhân chồi tốt nhất, gấp 7,3 lần so với nuôi cấy chồi đỉnh (đạt 15,3 chồi/mẫu sau tuần nuôi cấy) 3.4 Ảnh hưởng chất ST đến khả tạo rễ in vitro Chồi có chiều cao 2cm với 1-3 lá/chồi từ thí nghiệm cấy chuyển lên môi trường MS môi trường MS bổ sung IBA NAA có nồng độ từ 0,5-2,5 mg/l, theo dõi đ nh gi khả ph t sinh rễ nhằm tạo in vitro hoàn chỉnh sau tuần ni cấy K t trình bày bảng 3.6: Bảng 3.6 Ảnh hưởng IBA NAA đ n khả tạo rễ in vitro Khả phát sinh rễ NAA (mg/l) IBA (mg/l) - - Tỉ lệ chồi tạo rễ (%) 0,5 - 75 9,3a 3,7b 1,0 - 50 7,5b 0,7de 1,5 - 50 5,0c 0,5de 2,0 - 25 1,0de 0,5de 2,5 - 0e 0e - 0,5 65 4,0c 9,2a - 1,0 25 2,0d 1,5cd - 1,5 1,3d 0,3e - 2,0 0e 0c - 2,5 0e 0c Số rễ/chồi 1,3d hiều dài rễ (cm) 2c Chú thích: C c chữ c i kh c cột sai kh c có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p