Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết nấm men và axit salicylic đến khả năng tích lũy protein và polysaccharide của tế bào cây mật nhân (eurycoma longifolia jack) nuôi cấy in vitro

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG m TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG TRỊNH THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT NẤM MEN VÀ AXIT SALICYLIC ĐẾN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY PROTEIN VÀ POLYSACCHARIDE CỦA TẾ BÀO CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) NUÔI CẤY IN VITRO Đà Nẵng - Năm 2017 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG TRỊNH THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT NẤM MEN VÀ AXIT SALICYLIC ĐẾN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY PROTEIN VÀ POLYSACCHARIDE CỦA TẾ BÀO CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) NUÔI CẤY IN VITRO NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS VÕ CHÂU TUẤN Đà Nẵng - Năm 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết trình bày khóa luận trung thực, khách quan chưa cơng bố cơng trình khác Đà Nẵng, tháng năm 2017 Tác giả luận văn Trịnh Thị Quỳnh LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khố luận tốt nghiệp này, xin chân thành cảm ơn quý thầy cô môn Công nghệ sinh học, khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư phạm Đại học Đà Nẵng Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc đến Thầy giáo TS Võ Châu Tuấn, ngưỡi tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ suốt q trình thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Cô giáo – người trực tiếp giảng dạy, truyền đạt giúp trau dồi kiến thức kĩ thực hành thí nghiệm suốt q trình tơi thực đề tài khố luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, bạn bè thương yêu bên giúp đỡ, động viên khích lệ tơi suốt q trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, tháng năm 2017 Tác giả luận văn Trịnh Thị Quỳnh DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid cs : cộng DNA : Axit deoxyribonucleic DW : dry weight (trọng lượng khô) IBA : indolebutyric acid ĐC : đối chứng KIN : kinetin MS : Murashige Skoog (1962) NAA : α- naphthaleneacetic acid NXB : nhà xuất PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase) SA : salicylic acid YE : yeast extract (dịch chiết nấm men) DANH MỤC BẢNG BIỂU Số hiệu bảng Tên bảng Trang 3.1 Ảnh hưởng nồng độ YE lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân 27 3.2 Ảnh hưởng nồng độ YE đến hàm lượng protein tổng số tế bào mật nhân 3.3 Ảnh hưởng nồng độ YE đến hàm lượng polysaccharide tổng số tế bào mật nhân 3.4 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung YE lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân 3.5 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung YE đến hàm lượng protein tổng số tế bào mật nhân 3.6 Ảnh hưởng thời gian bổ sung YE đến hàm lượng polysaccharide tế bào mật nhân 3.7 Ảnh hưởng nồng độ SA lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân 3.8 Ảnh hưởng nồng độ SA đến hàm lượng protein tổng số tế bào mật nhân 3.9 Ảnh hưởng nồng độ SA đến hàm lượng polysaccharide tế bào mật nhân 3.10 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung SA lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân 3.11 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung SA đến hàm lượng protein tổng số tế bào mật nhân 3.12 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung SA đến hàm lượng polysaccharide tế bào mật nhân 28 29 30 31 32 34 35 37 38 39 40 DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Số hiệu Tên hình hình ảnh 1.1 Sơ đồ biểu thị phản ứng có tế bào bị kích kháng Trang 12 2.1 Tế bào callus mật nhân 21 2.2 Sơ đồ thí nghiệm 22 3.1 Đường cong sinh trưởng tế bào mật nhân 25 3.2 Sinh khối tươi (a) sinh khối khô nghiền mịn (b) tế bào mật nhân 26 MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 Nuôi cấy tế bào thực vật 1.2 Sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học ni cấy tế bào thực vật 1.3 Chất kích kháng thực vật 10 1.4 Giới thiệu mật nhân 16 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.2 Phương pháp nghiên c ứu 21 2.2.1 Phương pháp nuôi c callus 22 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào mật nhân có bổ sung chất kích kháng 22 a Ảnh hưởng dịch chiết nấm men lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân 22 b Ảnh hưởng axit salicylic lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân 23 2.2.3 Xác định sinh khối tế bào 23 2.2.4 Định lượng protein tổng số phương pháp so màu máy UV-Vis 23 2.2.5 Định lượng polysacchride tổng số phương pháp so màu máy UVVis 24 2.2.6 Xử lý thống kê 24 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Sinh trưởng tế bào mật nhân ni cấy huyền phù bình tam giác 25 3.2 Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết nấm men đến sinh trưởng tế bào, hàm lượng protein polysaccharide tế bào mật nhân nuôi cấy in vitro 27 3.3 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung dịch chiết nấm men đến sinh trưởng tế bào, hàm lượng protein polysaccharide c tế bào mật nhân nuôi cấy in vitro 30 3.4 Ảnh hưởng nồng độ axit salicylic đến sinh trưởng tế bào, hàm lượng protein polysaccharide c tế bào mật nhân nuôi cấy in vitro 34 3.5 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung axit salicylic đến sinh trưởng tế bào, hàm lượng protein polysaccharide tế bào mật nhân nuôi cấy in vitro 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Từ xa xưa, người biết sử dụng số cỏ để làm thực phẩm làm thuốc điều trị bệnh tật vết thương Những tác dụng phòng, chữa bệnh, tăng cường bảo vệ sức khoẻ thực vật người chủ yếu hợp chất thiên nhiên mà chúng sinh tổng hợp, tích luỹ q trình sinh trưởng phát triển Mặc dù, từ năm kỷ XX, ngành Hóa học hữu phát triển đạt nhiều thành tựu đáng kể, hàng loạt nhóm thuốc hóa học mới, có hiệu điều trị cao đời, giá trị dược liệu có nguồn gốc thực vật nhiều nhà khoa học quan tâm Bởi sau nhà khoa học phát nhiều thuốc tổng hợp hóa học tồn phần có cấu trúc hóa học xa lạ, ngoại lai với cấu trúc hóa học hợp chất thiên nhiên nên sinh nhiều tác dụng phụ độc hại cho người Do đó, để khắc phục nhược điểm thuốc hóa học, nhiều nhà khoa học quay lại nghiên cứu hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên [4],[13] Tuy nhiên, tác động nhiều yếu tố khác dẫn đến diện tích sống tự nhiên thuốc ngày bị thu hẹp Cho nên, việc sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật đường canh tác truyền thống tổng hợp hóa học gặp nhiều khó khăn, khó đáp ứng đủ nhu cầu dược liệu ngày tăng tương lai [16] Điều đặt cho nhà khoa học nhà sản xuất nhiệm vụ tìm kiếm giải pháp nhằm cung cấp nguyên liệu cho nguồn dược phẩm tự nhiên Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ngày phát triển mạnh có nhiều ưu điểm so với canh tác truyền thống tổng hợp hóa học việc sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học Chúng đạt đường nuôi cấy callus, nuôi cấy tế bào huyền phù [8] Trong đó, ni cấy tế bào huyền phù có bổ sung chất kích kháng thực vật biện pháp làm tăng hiệu suất tổng hợp hoạt chất sinh học Sự kích kháng trình gây tăng cường tổng hợp chất thứ cấp, nhằm đảm bảo tồn tại, tăng tính chống chịu cạnh tranh thực vật Nghiên cứu ni cấy tế bào huyền phù có bổ sung chất kích kháng nhằm 3.5 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung axit salicylic đến sinh trưởng tế bào, hàm lượng protein polysaccharide tế bào mật nhân nuôi cấy in vitro 3.5.1 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung axit salicylic đến sinh trưởng tế bào mật nhân in vitro Tế bào mật nhân nuôi cấy mơi trường MS có bổ sung 100 µM SA nhằm nghiên cứu khả sinh trưởng thời điểm kích kháng khác (0, 10 ngày) trình bày bảng 3.10 Bảng 3.10 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung SA lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân Thời điểm bổ sung SA Khối lượng tế bào (g) (ngày) Tươi Khô 28.33 cb 0.60 c 27.80dc 0.59 dc 10 29.99 b 0.64 b ĐC 36.97 a 0.78 a Kết từ bảng 3.10 cho thấy, thời điểm bổ sung axit salicylic có ảnh hưởng lên sinh trưởng tế bào mật nhân Ở tất thời điểm bổ sung, sinh khối thấp đối chứng Trong thấp 28,33 g tươi (0,6 g khô) 27,8 g tươi (0,59 g khô) tương ứng thời điểm bổ sung ngày Sai khác thời điểm khơng có ý nghĩa thống kê (p