nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan hài có nguy cơ tuyệt chủng paphiopedilum purpuratum

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BA bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh của loài lan Hài P.purpuratum 39 3.2.2.. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của Kinetin bổ sung vào môi trườn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

TRẦN THÙY MAI

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO

LOÀI LAN HÀI CÓ NGUY CƠ TUYỆT CHỦNG

PAPHIOPEDILUM PURPURATUM

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

TRẦN THÙY MAI

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO

LOÀI LAN HÀI CÓ NGUY CƠ TUYỆT CHỦNG

HÀ NỘI, NĂM 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ

rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả luận văn

Trần Thùy Mai

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi từ các thầy

cô, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới chị TS Hoàng Thị Nga –

Trưởng phòng Công nghệ sinh học thực vật, Viện Sinh học nông nghiệp; PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh – Viện trưởng Viện Sinh học nông Nghiệp - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, đánh giá kết quả và hoàn thành luận văn đồng thời bồi dưỡng cho tôi những kiến thức chuyên môn và kinh nghiệm quý báu

Tôi xin cảm ơn sự nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ của Ban lãnh đạo cùng các anh chị Viện Sinh học Nông nghiệp – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã dành cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Để hoàn thành luận văn này, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các Thầy giáo, Cô giáo, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật, Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã ủng hộ, tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành các thủ tục cần thiết để bảo vệ thành công luận văn này Tôi cũng xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình cùng toàn thể bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như trong quá trình hoàn thành khóa luận

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả luận văn

Trần Thùy Mai

1.2.1 Kỹ thuật nhân giống thực vật in vitro 18

1.2.2 Nghiên cứu về nhân giống in vitro cây lan 20

1.2.3 Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hài 23 Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 28 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 28 2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 28

2.4 Phương pháp nghiên cứu 29 2.4.1 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 29 2.4.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 29 2.4.3 Các chỉ tiêu theo dõi 33 2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu 33 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Nhóm thí nghiệm tạo vật liệu khởi đầu 34 3.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của tuổi quả đến khả năng nảy mầm của hạt

3.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nền môi trường thích hợp cho khả năng

nảy mầm của hạt Lan Hài P.purpuratum 36 3.2 Nhóm thí nghiệm nhân nhanh 38 3.2.1 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BA bổ sung vào môi trường nuôi cấy

đến khả năng nhân nhanh của loài lan Hài P.purpuratum 39 3.2.2 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của Kinetin bổ sung vào môi trường nuôi

cấy đến khả năng nhân nhanh loài lan Hài P.purpuratum 40 3.2.3 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của BA và α–NAA bổ sung vào môi trường

nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh loài lan Hài P.purpuratum 42 3.2.4 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của dịch cà chua bổ sung vào môi trường

nuôi cấý đến khả năng nhân nhanh loài lan Hài P.purpuratum 44 3.2.5 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của dịch chiết chuối bổ sung vào môi

trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh của loài lan Hài

3.2.6 Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của dịch chuối và khoai tây bổ sung vào

môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh của loài lan Hài

3.2.7 Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến sinh

trưởng, phát triển của chồi cây lan Hài P.purpuratum 48 3.2.8 Thí nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường bổ sung

vào môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của chồi lan Hài

3.2.9 Thí nghiệm 11: Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng

của chồi lan Hài P.purpuratum 52 3.3 Nhóm thí nghiệm tạo cây hoàn chỉnh 53 3.3.1 Thí nghiệm 12: Ảnh hưởng của α-NAA đến sự ra rễ của chồi loài lan

IAA Indol acetic acid

IBA Indol butyric acid

α- NAA α Naphtyl acetic acid

KC KnudsonC, 1965

Ki Kinetin

LSD 0.05 Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P = 0.05

(Least Significant Difference)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các giống lan Hài Việt Nam và mùa nở hoa 11 Bảng 1.2 Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ tự hạng bảo tồn của Tổ chức

bảo tồn thiên nhiên quốc tế (IUCN) 13

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của tuổi quả đến khả năng nảy mầm của hạt lan Hài

P.purpuratum (sau 12 tuần theo dõi) 34

Bảng 3.2: Tỷ lệ nảy mầm của lan Hài P.purpuratum trên các nền môi trường

khác nhau (sau 12 tuần theo dõi) 36 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BA bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng

nhân nhanh loài lan Hài P.purpuratum (sau 12 tuần theo dõi) 40

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của Kinetin bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả

năng nhân nhanh loài lan Hài P.purpuratum (sau 12 tuần theo dõi) 41

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của BA và α–NAA bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến

khả năng nhân nhanh loài lan Hài P.purpuratum (sau 12 tuần theo dõi) 43

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của dịch cà chua bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến

khả năng nhân nhanh loài lan Hài P.purpuratum (sau 12 tuần theo dõi) 44

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của dịch chuối bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả

năng nhân nhanh loài lan Hài P.purpuratum (sau 12 tuần theo dõi) 46

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của dịch chuối và khoai tây bổ sung vào môi trường nuôi

cấy đến khả năng nhân nhanh của lan Hài P.purpuratum (sau 12 tuần

theo dõi) 47 Bảng 3.9:Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của

chồi loài lan Hài P.purpuratum (sau 10 tuần nuôi cấy) 49

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của hàm lượng đường bổ sung vào môi trường nuôi cấy

đến khả năng sinh trưởng của chồi lan Hài P.purpuratum (sau 10 tuần

theo dõi) 50 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng của chồi lan

Hài P.purpuratum (sau 12 tuần theo dõi) 52

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của α-NAA đến sự ra rễ của chồi loài lan Hài

P.purpuratum (sau 10 tuần nuôi cấy) 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái cây và hoa của Paphiopedilum 9

Hình 1.2 Một số hình ảnh về Lan Hài P.purpuratum 17

Hình 2.1 Cây và quả loài lan Hài P.purpuratum 28

Hình 3.1: Hạt lan Hài P.purpuratum ở các tuổi quả khác nhau sau 12 tuần gieo 35

Hình 3.2 Hạt lan Hài P.purpuratum trên các nền môi trường khác nhau sau 12 tuần gieo 38

Hình 3.3 Ảnh hưởng của BA và α – NAA đến khả năng nhân nhanh của loài lan Hài P.purpuratum 44

Hình 3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng đường bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của chồi lan Hài P.purpuratum (sau 10 tuần theo dõi) 51

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Lan Hài thuộc họ Lan (Orchidaceae) là một trong những họ lớn nhất của

thực vật có hoa; là một nhóm rất khác biệt bởi cấu trúc hoa khác thường với một cánh hoa giữa (còn gọi là cánh môi) hình túi sâu trông giống như một chiếc hài nằm

ở vị trí thấp nhất của hoa, do đó trở thành tên chung của nhóm lan này (Averyanov

et al., 2003)

Việt Nam là một trung tâm đa dạng và đặc hữu lan rất quan trọng ở vùng Đông Nam Á Trong đó, tính đa dạng của lan Hài cao hơn bất cứ nơi nào trên thế giới Nhiều loài lan Hài của Việt Nam không chỉ rất hiếm mà còn có những loài đặc hữu hẹp, là báu vật quốc gia có tầm quan trọng quốc tế Các kết quả của quá trình nghiên cứu thực vật của Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật thuộc trung tâm khoa học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia Việt Nam và nghiên cứu các mẫu thu mua để buôn bán thì có 18 loài lan Hài và 4 dạng lai tự nhiên đã được biết đến một cách chắc chắn ở Việt Nam (Averyanov et al., 2008)

Tuy nhiên tình hình thực tế hiện nay do việc khai thác rừng bừa bãi, nạn cháy rừng thường xuyên, xuất bán tràn lan sang Trung Quốc xảy ra trên diện rộng đã làm trữ lượng cây bị giảm sút, không gian sống của các loài lan Hài đang bị thu hẹp, sự

đa dạng sinh học đang bị suy giảm nghiêm trọng dẫn tới nguồn tài nguyên quý mà thiên nhiên ban tặng này đang có nguy cơ tuyệt chủng Năm 1996, ba loài được đưa

vào sách đỏ Việt Nam mới, đó là P.appletonianum, P.delanatii, và P.hirsutissimum

Trong một nghiên cứu của mình năm 2003, Averyanov đã cảnh báo tiếp theo sự tuyệt chủng của lan Hài Việt Nam Một loạt các loài lan Hài khác hiện đang bị đe

dọa nghiêm trọng, trong đó sẽ có hài Vân (P.callosum), hài Hồng (P delenatii), hài Tía (P.purpuratum) và cả loài hài Hương lan (P.emersonii)

Lan Hài còn tồn tại rất ít trong vùng phân bố tự nhiên, phần lớn ở những vách núi hiểm trở, khó tiếp cận Vì vậy việc bảo tồn và phát triển các loài lan Hài của Việt Nam nói chung và đặc biệt là các loài đặc hữu khu vực miền núi phía Bắc

là nhiệm vụ vô cùng cấp thiết Nó có vai trò cực kỳ quan trọng đối với đời sống vật chất, tinh thần của con người cũng như duy trì cân bằng sinh thái tự nhiên

Hạt lan Hài rất nhỏ và gần như không có chất dự trữ để hỗ trợ cho quá trình nảy mầm, tỷ lệ nảy mầm trong tự nhiên lại rất thấp (Arditii và Ernst, 1993) Việc nhân giống các loài lan Hài chủ yếu đạt được bằng cách tạo ra sự cộng sinh của hạt

để thuận lợi cho sự nảy mầm của hạt trong nuôi cấy mô (Chen et al., 2004; Huang et

al., 2001) Bởi vậy, phương pháp nhân giống vô tính in vitro lan Hài đã và đang mở

ra triển vọng tốt cho việc bảo tồn gen và phát triển các giống lan quý này, đồng thời

mở ra triển vọng phát triển kinh tế nâng cao thu nhập cho người trồng, kinh doanh lan Hài

Từ những cơ sở khoa học và thực tế, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên

cứu nhân giống in vitro loài lan Hài có nguy cơ tuyệt chủng Paphiopedilum purpuratum”

- Xác định được tuổi quả thích hợp đưa vào nhân giống in vitro

- Xác định được nền môi trường thích hợp cho hạt nảy mầm

- Xác định được các phương pháp tạo và nhân chồi

- Xác định được ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự tạo thành cây in vitro

- Các kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp những dữ liệu cơ bản về sự sinh

trưởng, phát triển của lan Hài P.purpuratum trong điều kiện in vitro Đây là tài liệu

tham khảo hữu ích cho công tác giảng dạy, học tập về công nghệ nuôi cấy mô tế bào

thực vật và là cơ sở khoa học để đề xuất biện pháp nhân giống mới đối với loài lan Hài này

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Cung cấp phương pháp mới để nhân giống lan Hài P.purpuratum được thu

thập ở Việt Nam, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen của loài lan Hài quý có nguy cơ tuyệt chủng

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về lan Hài Paphiopedilum

Lan Hài là một nhóm rất khác biệt Chúng có thể dễ dàng nhận ra bởi cấu trúc hoa khác thường với một số cánh hoa giữa hình túi sâu trông giống như một chiếc hài (trong chuyên môn gọi là môi hay cánh môi) nằm ở vị trí thấp nhất của hoa, tạo nên một vẻ bề ngoài rất đặc sắc Cũng như vậy, tên Latin của chi lan Hài là Paphiopedilum, có thể dịch nghĩa là «chiếc hài của Paphos » Paphos là nơi sinh của Aphrodite, vị thần của tình yêu và cái đẹp trong thần thoại Hy Lạp (còn được gọi là thần Vệ nữ - Venus theo người La Mã ) và pedilon là một từ tiếng Hy Lạp có nghĩa

là cái hài hay cái giày Chiếc môi đặc sắc và hình dạng khác thường của hoa làm cho lan Hài dễ dàng phân biệt với các loài lan khác Và do vậy nó trở thành tên

chung cho nhóm này

1.1.1 Nguồn gốc và quan hệ họ hàng của lan Hài

Hầu hết các loài lan đều có nguồn gốc từ tổ tiên kiểu Hypoxis có sáu mảnh

bao hoa (ba mảnh bao hoa vòng ngoài gọi là lá đài và ba mảnh bao hoa vòng trong gọi là cánh hoa) và 6 nhị đực (ba nhị đực vòng ngoài và ba nhị đực vòng trong) Một số xu hướng chuyên hoá về hình thái có thể quan sát được trong sự tiến hoá và hình thành của các nhóm lan khác nhau Tuy nhiên, sự giảm số lượng nhị đực và sự dính liền giữa nhị (các nhị) đực hữu thụ còn tồn tại với nhị cái là sự biến đổi hoa cơ bản nhất dẫn đến sự tiến hóa của họ

Đại diện của các nhóm Lan nguyên thủy nhất có hai hoặc ba nhị đực trong

hoa Các loài này được gọi là Lan Apostasia, dưới họ Apostacioideae Đây là một

nhóm nhỏ bao gồm các loài địa lan sống ở vùng nhiệt đới châu Á và bắc Australia

và có hai chi Apostasia, Neuwiedia, với khoảng 16 loài Hoa của chúng thường phân bố đều và phần nào giống với hoa của Hypoxis

Nhóm thứ hai là lan Hài, dưới họ Cypripedioideae gồm có hai nhị đực còn

tồn tại trong hoa, nó đại diện cho một dòng tiến hoá riêng Dưới họ này bao gồm 5

chi Cyprpedium, Mexipedium, Paphiopedium, Phragmipedium, Selenipedium và

có khoảng 150 loài phân bố rộng khắp vùng nhiệt đới Á- Âu, Bắc Mỹ và Nam Mỹ

Có đến hơn 99% các loài lan chỉ có một nhị duy nhất trong hoa và đó là một trong các đặc điểm chính của họ Lan Trong các tài liệu phân loại học, các loài lan

một nhị thường được xếp vào 3 dưới họ: Vanilloideae, Orchidoideae,

Epidendroideae (Averyanov và cs., 2008) Chúng phân bố khắp nơi trên thế giới ngoại trừ hai vùng điạ cực và các hoang mạc khô cằn

1.1.2 Phân loại

Lan Hài (Paphiopedium) là một nhánh của họ Lan (Orchidaceae) thuộc bộ Lan (Orchidales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp Một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành Hạt kín (Angiospermatophyta)

Về mặt thực vật học, các loài lan Hài thuộc vào 5 chi: Cyprpedium L.,

Mexipedium V A Albert&M W Chase, Paphiopedium Pfitze, Phragmipedim Rolfe và Selenipedium Rchb.f Khoảng 50 loài của chi Cyprpedium, thường được

gọi là Hài vệ nữ, phân bố tại các vùng ôn đới và vùng núi của bán cầu bắc Vùng

nhiệt đới châu Mỹ là nơi phân bố của 25 loài thuộc các chi Mexipedium,

Phragmipedium, Senipedium Xấp xỉ 75 loài của chi Paphiopedium phân bố ở

vùng nhiệt đới châu Á từ nam Ấn độ và đông Himalaya ở phía tây đến Philippin, New Guinea và quần đảo Solomon ở phía đông Tất cả các loài lan Hài Việt Nam

đều thuộc vào chi Paphiopedium, nên ở đây chúng tôi chỉ tập trung trình bày về

các loại lan Hài thuộc chi này

1.1.3 Những nét chính của chi Paphiopedium

1.1.3.1 Sự phân bố

Khu vực phân bố của Paphiopedilum kéo dài từ vùng nhiệt đới ở chân núi

Himalaya chạy ngang sang phía đông qua Trung Quốc đến Philippin, xuống đông nam đến hầu khắp vùng Đông Nam Á và quần đảo Mã Lai, New Guines và quần đảo

Solomon Chỉ một loài P.druryi có khu phân bố rất nhỏ và biệt lập ở nam Ấn Độ

Paphiopedilum chắc chắn có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á Sự mở rộng khu phân bố của nó về phía nam và phía đông đến vùng Malaixia và tây nam Thái Bình Dương là do kết quả di cư liên tục của các loài tổ tiên và sự phân ly tỏa tròn thành nhiều loài đặc hữu địa phương và thường có khu phân bố xa nhau

Vùng tập trung nhiều loài nhất của chi Paphiopedilum là ở nam Trung Quốc

(Vân Nam, Quảng Tây) và bắc Việt Nam với 18-20 loài đã được phát hiện (Averyanov và cs, 2008) Các trung tâm đa dạng khác nhau ở bắc Sumatra và bắc Borneo, mỗi nơi có 9 loài Tuy không phong phú bằng các vùng kể trên, nhưng các vùng đa dạng của chi lan Hài cũng được phát hiện tại các vùng chân núi Himalaya, bác Mianma và Thái Lan, trung tâm của bán đảo Mã Lai và Philippin Trong mỗi vùng này đầu gặp từ 4 đến 6 loài lan Hài

Tính đặc hữu hẹp là đặc điểm nổi bật của các loài thuộc chi Paphiopedilum

Có đến 72% số các loài đã biết là đặc hữu hẹp với khu phân bố rất hạn chế như

Paphiopedilum delenatii, P.helenae, P.henryanum, P.tranlienianum, P.vietnamense

v à P.hangianum Rất nhiều loài trong số này mới được phát hiện tại một hoặc một vài địa điểm Chưa đến 12% tổng số các loài của chi Paphiopedilum có khu phân bố tương đối rộng Đó là Paphiopedilum villosum, P.hirsutissimun, P.appletonianum

và P.callosum

1.1.3.2 Đặc điểm hình thái

Theo mô tả của Averyanov và cộng sự (2008):

a Dạng cây

Các loài Paphiopedilum là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân

bị thu ngắn mang nhiều lá mọc thành hai hàng xếp hình quạt Tất cả các loài đều có

thân rễ nhưng thường rất ngắn Tuy nhiên, một số loài như P.malipoense và

P.micranthum lại hình thành thân rễ kéo dài kiên kết rất nhiều gốc với nhau hình thành một mạng lưới ngầm dưới đất Đối với những loài này một dòng sinh sản vô tính cũng có thể bao phủ tới một vài m2 nếu như có điều kiện sống thuận lợi Đối

với các loài khác, ví dụ như P.hirsutissimun hay P.dianthum, một số cây có thể từ

một đến 20 gốc mọc chụm thành bó dày đặc

b Lá

Lá của các loài Paphiopedium thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng

ngược hay bầu dục thuôn và mở rộng Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình

chữ V xếp lợp sít lên nhau trên thân Ở một số loài như P hirsutissimum, hay P

dianthum các lá có thể dài tới 50cm, nhưng ở một số loài khác như P helenae, cây

trưởng thành đôi khi có lá không dài quá 3cm Mặt trên của lá có thể có màu xanh

lá cây cùng màu, hay khảm bởi các mảng xanh lá cây đậm nhạt không đều nhau với các gân lá màu xanh lá cây thẫm nổi rõ Ở một số loài khác các vệt tím xỉn chỉ

thấy rõ ở gần gốc lá Rất ít loài có mặt dưới lá thuần màu xanh lá cây

c Cụm hoa

Cụm hoa thường có dạng thẳng đứng hay cong Các loài P helenae, P

dianthum, P henryanum mọc trên các vách đá dựng đứng hay P villosum phụ sinh

thường có cuống hoa ít nhiều nằm ngang hoặc chúc xuống, nhưng ở hầu hết các

loài khác thì có cuống hoa ít nhiều dựng đứng như P malipoense, P micranthum

và P appletonianum Một số loài như P dianthum có cụm hoa gồm nhiều hoa,

thường từ 2- 5 hoa Một số ít loài khác thường có một hoa trong cụm hoa, ví dụ

như P delenatii và P concolor, nhưng lại phát triển thành cụm hoa có 2 hoa trong

điều kiện thuận lợi Phần lớn các loài khác đều chỉ có một hoa riêng lẻ Trục cụm hoa của hầu hết tất cả các loài đều có lông tơ dày và ngắn Lá hoa của cụm hoa gập nhọn đến hình bầu dục tròn

có lông tơ dày ở mặt ngoài

Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường hơi xoè xuống dưới theo chiều ngang Chúng có thể hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh đặc trưng

cho loài P dianthum Cánh hoa của tất cả các loài đều có lông mềm dài dễ nhận

thấy ở mép gần gốc

Cánh hoa giữa thứ ba của hoa biến dạng rõ rệt để hình thành một môi giống

như cái bao hay hình chiếc hài có vai trò như một cái bẫy đối với các loài côn trùng có khả năng thụ phấn Môi có ba thuỳ với thuỳ giữa lõm sâu và các thuỳ bên vòng xung quanh Các nhị đực còn lại và nhị cái của lan Hài hợp lại với nhau thành một cột hình trụ (cột nhị- nhụy) ở trung tâm cuả hoa Cấu tạo chính của cột nhị- nhụy là một nhị lép hình ô nhô cao ở đỉnh được hình thành từ nhị đực bất thụ giữa của vòng ngoài Ở phía sau và bên dưới nhị lép dính với núm nhụy hình trứng hoặc hình tròn có cuống Hai nhị đực có chỉ nhị ngắn và bao phấn hình bầu dục rộng dính liền ở phía sau núm nhụy và ở 2 bên của cuống cột

đ Quả

Quả của lan Hài là dạng quả nang khô, có một ô với ba van rộng và ba van hẹp Quả mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt Quả thường chín trong điều kiện tự nhiên sau khi thụ phấn từ 6-10 tháng

e Vòng đời

Hạt lan chín rất nhẹ và dễ dàng phát tán nhờ gió Hạt không có nội nhũ, và

do vậy nó dinh dưỡng phụ thuộc vào quan hệ cộng sinh chặt chẽ với một loài nấm

rễ Hạt chín trong vòng từ sáu đến mười tháng sau khi được thụ phấn và phát tán qua khe mở của quả nang chín đã chuyển thành màu nâu và khô đi Sự nảy mầm xảy ra trên đất, trên đá hay trên cây, ở chỗ tối ngay sau khi phát tán và khi cuống của phôi được nhiễm một loại nấm rễ phù hợp Mầm rễ phát triển ra các rễ giả dài cũng bị nhiễm các sợi nấm của nấm rễ Một rễ thật nhanh chóng mọc ra từ phía sau của đỉnh chồi, tiếp theo các mầm rễ mọc dài ra và sinh ra các rễ con Sự sinh trưởng mới bắt đầu phát triển thường xảy ra trước khi kết thúc nở hoa Phần lớn các loài lan ở Việt Nam ra hoa trong điều kiện Việt Nam vào đầu mùa xuân hay mùa hè

concolor, P delenati, P malipoense đóng vai trò tương tự Tuy nhiên, phần lớn các loài

hoa không có mùi nhưng có màu sắc hoa sặc sỡ thu hút côn trùng Trong một số trường hợp hoa của loài lan không có mật bắt chước giống hoa có mật của các loài thực vật

khác Ví dụ hoa của loài P micranthum rất giống hoa của loài Đỗ Quyên Rhododendro,

một loại hoa có nhiều mật lôi kéo nhiều loài côn trùng Nước mưa giữ lại bên trong

môi của P micranthum về mặt lý thuyết cũng là một nguyên nhân nữa thu hút nhiều

loại côn trùng do thời tiết trong giai đoạn nở hoa của loài này thường rất khô

Hình 1.1 Hình thái cây và hoa của Paphiopedilum

(Nguồn: Averyanov và cs, 2008)

Ghi chú: a-Cây mang hoa; b- hoa với một cánh hoa bị cắt bỏ và lát cắt theo chiều dọc của môi; c-e: cột nhị nhụy, nhìn mặt bên (c), nhìn từ mặt trên (d) và từ mặt dưới (e)

1.1.3.3 Đặc điểm sinh thái

Các loài lan Hài là một cấu trúc không thể thiếu của rừng nguyên sinh và chúng có thể bị tuyệt chủng một cách nhanh chóng và không thể phục hồi khi các quần xã tự nhiên bị con người phá hủy (Averyanov và cs, 2008) Trong núi rừng Việt Nam, nơi còn sót lại những mảnh rừng nguyên sinh đa dạng nhất, các loài lan Hài rất phong phú

Về mặt sinh thái, các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành 2 nhóm riêng Một nhóm phân bố ở các vùng núi đá vôi phía bắc Việt Nam, nhóm còn lại sống ở các vùng núi có đá mẹ là silicat, đá phiến và cát kết Trong rừng, lan Hài có thể mọc trên đất, đá và phụ sinh Có một số loài đôi khi cũng thay đổi nơi sống ưa thích, nhưng các mọc chính vẫn là đặc trưng riêng của loài Khoảng 22% các loài lan của Việt Nam mọc trên đất (địa lan), 8% mọc trên đá, 74% còn lại là lan phụ sinh (Averyanov và cs, 2008) Trong số các loài lan phụ sinh có khoảng 15% là các loài phụ sinh trên mùn, sống ở chạc cành già trên các cây gỗ lớn tích nhiều mùn và

lá cây chết; đây thường là các loài lan có kích thước lớn Khoảng 50% các loài phụ sinh sống bám trên thân cây và cành cây Khoảng 5% sống trên các cành nhỏ, các mang lá thậm chí trên lá cây trong tán của các cây gỗ lớn Các loài lan Hài của Việt Nam có thể sống trên đất, bám đá và phụ sinh mùn

Tại Việt Nam, lan Hài thường phân bố ở các vùng có lượng mưa lớn và độ

ẩm cao Tuy nhiên, do đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên chúng thường phải trải qua một giai đoạn khô hạn Sự xuất hiện lá dày, dai và mọng nước

là hướng thích nghi tốt để cây có thể sống sót qua đợt khô hạn định kỳ và chúng sẽ phục hồi nhanh chóng khi mùa mưa trở lại Độ ẩm xung quanh rễ, kiểu đất và độ

pH, sự có mặt của các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cường độ ánh sáng là các nhân

tố quan trọng trong sự hình thành và phát triển của quần thể lan Hài

Trong rừng nguyên sinh, lan Hài phân bố không đều nhau trên các hướng sườn núi Nhưng trong các vùng rừng bị xuống cấp, chúng có khuynh hướng phát triển ở các sườn bắc, đông bắc và tây bắc của núi Tuy nhiên, lan Hài thường có điều kiện tốt nhất và hoa nở tốt hơn ở sườn nam ấm và nhiều ánh sáng hơn Ngày nay thường chỉ tìm thấy lan Hài mọc thành những đám nhỏ Các nơi sống tự nhiên

bị phá hủy bởi con người, sự thay đổi các điều kiện môi trường và việc thu hái lan

để bán đang là nguyên nhân chính gây ra sự tuyệt chủng nhanh chóng của các loài lan Hài ở khắp các vùng của Việt Nam (Averyanov và cs, 2008)

Bảng 1.1 Các giống lan Hài Việt Nam và mùa nở hoa Loại Hài (tên Latinh) Mùa nở hoa Loại Hài (tên Latinh) Mùa nở hoa

P.appletonianum Xuân P.bargigerum Thu

P.callosum Hạ P.concolor Cuối Xuân, đầu Hạ

P.delenatii Xuân P.dianthum Cuối thu

P.emersonii Xuân P.gratrixianum Xuân

P.hangianum Cuối thu P.helenae Thu

P.hirsutissimum Xuân P.malipoense Xuân

P.micranthum Xuân P.purpuratum Thu

P.tranlienianum Thu P.vietnamense Đông

P.hemannnii Thu

(Nguồn: http://www.vuonhoalan.net)

1.1.4 Thực trạng Lan Hài hiện nay

Hiện nay, nhu cầu hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng trên thế giới cũng như trong nước đang ngày càng gia tăng Tỷ lệ hàng năm của ngành sản xuất hoa tươi trên thế giới là 10%, đạt khoảng 40 tỷ USD Trong năm 2000, kim ngạch xuất khẩu hoa lan cắt cành đạt 128 triệu USD Vì vậy việc trồng lan đã trở thành một ngành kinh tế của nhiều nước trên thế giới và đang phát triển mạnh mẽ ở khu vực Đông Nam Á

Lan Hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao nhất, được yêu chuộng, sưu tầm và săn lùng nhiều nhất trên thế giới Việt Nam là một trung tâm sản xuất

lan Hài lớn của thế giới với trên 20 loài thuộc chi Paphiopedilum Lan Hài Việt

Nam bao gồm nhiều loài giá trị như lan Hài đỏ, lan Hài vàng, lan Hài tía, lan Hài trắng, lan Hài vân, lan Hài vân duyên, lan Hài đốm, lan Hài lông hay lan Hài râu,…

Paphiopedilum vietnamense là một loại lan Hài đặc biệt có ở miền Bắc Việt Nam,

nó có giá trị khoảng 50 Euro trên thị trường

Trên thế giới, khoảng 50 loài của chi Cypripedium, thường được gọi là Hài vệ

nữ phân bố tại các vùng núi của bán cầu bắc Vùng nhiệt đới châu Mỹ là nơi phân

bố của khoảng 25 loài thuộc các chi Mexipedium, Phragmipedium Rolfe và

Selenipedium Xấp xỉ 75 loài của các chi Paphiopedilum phân bố ở vùng nhiệt đới

châu Á từ nam Ấn Độ và đông Himalaya ở phía tây đến Philippine, New Guinea và

Quần đảo Solomon ở phía đông Các loài nhiệt đới châu Á của chi Paphiopedilum

đã được lai giống để trồng rất phổ biến trong khoảng 140 năm gần đây Các loài

thuộc chi Phragmipedium cũng đã được lai giống để trồng nhưng ít phổ biến hơn

(Averyanov et al., 2008)

Một số lớn các loài lan Hài và các dòng nhân tạo đã được trồng và trở thành nhóm cây cảnh phổ biến tại nhiều quốc gia Mặc dù vậy, phần lớn các loài này đều rất hiếm gặp trong tự nhiên Phần lớn chúng phân bố ở các nơi hiểm trở không hoặc rất khó đến được như các vách đá dựng đứng, mỏm đá gần thác nước hay trong tán của các cây gỗ cao Một số loài đã bị tuyệt chủng và một số loài đang có nguy cơ bị tuyệt chủng bởi sự tận thu khai thác bất hợp pháp Lan Hài đã được chỉ định là có nguy cơ tuyệt chủng bởi các Công ước quốc tế về buôn bán các loài động vật, thực vật hoang dã (CITES, CITES Appendices, 2008)

Ở Việt Nam, với sự hiện hữu của hơn 20 loài thuộc chi Paphiopedilum, Việt

Nam là một trong những quốc gia có nguồn lan Hài tự nhiên phong phú nhất Không những phong phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều loài lan Hài đặc hữu

có giá trị thẩm mỹ cao, được thế giới ưa chuộng Điều này tạo nên tình trạng thu nhập và xuất khẩu lan Hài ồ ạt không kiểm soát được, dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm trong tự nhiên Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện nay, lan Hài càng biến mất nhanh chóng

Thật khó mà tìm được bất kỳ loài cây nào khác trong hệ thực vật hoang dại của Việt Nam mà có tốc độ tuyệt chủng nhanh như lan Hài Tất cả các

Paphiopedilum ở Việt Nam đang biến mất một cách nhanh chóng Dựa trên những nghiên cứu thực địa gần đây, tình trạng bảo tồn các loài lan Hài trong tự nhiên theo quy chuẩn các thứ hạng về mức độ đe dọa tuyệt chủng của Tổ chức bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) được tổng kết ở bảng 2 dưới đây

Bảng 1.2 Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ tự hạng bảo tồn

của Tổ chức bảo tồn thiên nhiên quốc tế (IUCN)

Đã bị tuyệt chủng (EX) P malipoense var Hiepii

Đã tuyệt chủng ngoài thiên

P.aspersum, P.barbigerum var.Lokianum,

P callosum, P dianthum, P emersonii,

P gratrixianum, P hangiannum, P helenae,

P hanryanum, P x herrmannii, P malipoense var.Jackii, P malipoense var.malipoense,

P micranthum, P.purpuratum, P tralienianum

Sắp bị tuyệt chủng (VU) P appletoniaum, P concolor, P hirsutissimum var

Chiwuawnum, P hirsutissimum var Esquirolai, P villosun var annamense

Thiếu dẫn liệu (DD) P x affine, P x datalanse, P villosum var boxalli (Nguồn: Averyanov et al, 2008)

Trên thực tế, mức độ đe dọa tuyệt chủng đối với tất cả các lan Hài Việt Nam được chỉ ra ở đây đã bị thay đổi nhiều trong thời gian gần đây do sự suy giảm nhanh các quần thể được biết Rất có thể là đa số các lan Hài hoang dại của Việt Nam sẽ bị hoàn toàn tuyệt chủng trong một thời gian gần nhất

Sự thay đổi môi trường sống do con người gây nên và việc thu mua với số lượng lớn để buôn bán hiện nay là nhân tố chính là suy giảm nhanh chóng các loài lan Hài

Việc mở rộng các vùng nông thôn và phát triển đất nông nghiệp, các hoạt động chặt phá rừng, xây dựng đường xá, việc sử dụng đất cho phát triển công nghiệp, hiện đại hóa nền kinh tế quốc dân đã làm gia tăng tốc độ suy giảm nơi sống

tự nhiên của lan Hài trên toàn bộ Việt Nam Các loài Paphiopedilum, cũng như các

loài Lan khác, rất nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường Chúng là nhóm thực vật bị đe dọa tuyệt chủng đặc biệt và sẽ biến mất trước tiên sau khi nơi sống tự

nhiên của chúng bị suy thoái Chỉ có một vài loài Lan, nhất là P concolor và P

hirsutissmum có thể sống sót sau một thời gian trong các quần xã rừng thứ sinh Tuy nhiên, tuyệt đại đa số các loài bị tiêu diệt hoàn toàn cùng với sự phá hủy của rừng nguyên sinh Bởi vậy, sự sống sót của loài lan Hài trong tự nhiên liên quan trực tiếp với diện tích rừng nguyên sinh còn lại, chiếm không quá 17% tổng diện tích lãnh thổ vào năm 1982 (Averyanov et al, 2008) Với nhịp độ phá rừng hàng năm tới 3110 km2, diện tích rừng còn lại hiện nay rất nhỏ Hiện nay, các khu rừng nguyên sinh cổ xưa chỉ con bao phủ chưa đến 1% diện tích lãnh thổ

Các hoạt động khai thác gỗ theo kế hoạch, việc chặt phá cây gỗ trên diện rộng không kiểm soát được phục vụ nhu cầu xây dựng, củi đốt, việc đốt nương làm rẫy của đồng bào dân tộc ít người cùng với hiện tượng cháy rừng thường xuyên là các nguyên nhân chính làm biến mất nhanh các khu rừng nhiệt đới nguyên sinh ở Việt Nam

Yếu tố rất quan trọng thứ hai dẫn đến sự tuyệt chủng của các loài

Paphiopedilum ở Việt Nam trong những năm gần đây là việc thu hái trên quy mô lớn của những người dân địa phương để bán Việc thu hái trên diện tích rộng và

xuất khẩu một lượng lớn các loài Paphiopedilum mọc trong tự nhiên xảy ra khắp

nơi trong vài năm gần đây Tỷ lệ lợi nhuận trong việc này tương phản với các biện pháp bảo vệ mạnh của các nước lân cận

Cũng như các loài lan Hài khác của Việt Nam, P.purpuratum hiện đang biến mất với tốc độ nhanh chóng Lan Hài P.purpuratum đã được liệt kê vào phụ lục 1

của công ước Cites và danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng quý hiếm nhóm 1 của Nghị định số 32/2006/NĐ-CP ngày 30/3/2006 để nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại Bảo vệ phần quần thể nhỏ nhoi còn sót lại ở các khu bảo tồn thiên nhiên Hoàng Liên Sơn (các tỉnh Lào Cai và Lai Châu) Cần nhân

rộng việc gieo ươm loài lan Hài P.purpuratum để vừa tạo nguồn cây cảnh, đồng

thời bảo vệ nguồn gen

1.1.5 Giới thiệu loài Paphiopedilum purpuratum

1.1.5.1 Lịch sử phát hiện

Mẫu Paphiopedilum purpuratum được John Lindley mô tả lần đầu vào năm

1837 dựa trên hình vẽ một cây trồng của Messrs.Loddiges of Hackney Nguồn gốc của cây này được nói là từ quần đảo Mã Lai (Malay Archipelago), nơi được Hooker nhắc lại trong tạp chí Thực vật Crustis vào năm 1856 Tuy nhiên, hầu như chắc chắn

là những cây này xuất phát từ Hồng Không (Seidenfaden, 1992)

Thông tin đầu tiên của loài Paphiopedilum purpuratum ở Đông Dương có

trong một lá thư của Wilhelm Micholitz gửi cho Frederick Sander Cribb (1998) đã nghiên cứu bức thư đó và nhận ra rằng trong hai lá thư của Micholitz từ tháng 12-1903,

ông đã thu 1000 cây P.purpuratum ở Dankia, khoảng 10-12 km về phía tây bắc của

thành phố Đà Lạt ở nam Việt Nam (Seidenfaden, 1992) Thông tin này hiện nay vẫn còn

là điều nghi ngờ

Thông tin đáng tin cậy đầu tiên về sự có mặt của Paphiopedilum purpuratum

ở Việt Nam được Averyanov và cộng sự (2000a,b) đưa ra Họ thông báo rằng loài này

có ở bắc Việt Nam, gần biên giới Trung Quốc Cùng thời gian này, các cây

P.purpuratum có nguồn gốc ở Việt Nam bắt đầu xuất hiện trên thị trường lan quốc tế

1.1.5.2 Phân bố

Phạm vi phân bố của P.purpuratum bên ngoài lãnh thổ Việt Nam trải rộng từ

Hồng Kông tới các khu vực lân cận của tỉnh Quảng Đông và đảo Hải Nam ở đông nam Trung Quốc và đông nam Vân Nam

Ở Việt Nam, P.purpuratum được tìm thấy ở các vùng: Cao Bằng, Lào Cai,

Lâm Đồng Đó là các khu vực núi có độ cao 1200-1500m Khí hậu ở đây là khí hậu nhiệt đới gió mùa miền núi Loài này mọc ở khu vực có sự khác biệt theo mùa rõ rệt giữa mùa đông khô lạnh và mùa hè ẩm ướt với nhiệt độ khá ôn hòa là phổ biến Những quần

thể lớn nhất của P.purpuratum ở Việt Nam nằm ở trên các sườn dốc của núi đá vôi ở độ

cao 1200-1400m Nó mọc trong rừng nguyên sinh cây lá rộng, thường xanh và nửa rụng

lá, khá thưa phân bố chủ yếu ở gần đường đỉnh (Averyanov và cs, 2000a)

P.purpuratum ở Việt Nam là loài địa lan, thường mọc trên các lớp đất giàu mùn

và được phủ một lớp lá cây dầy Cây thường mọc phân tán hoặc tạo thành các đám nhỏ

trên các sườn núi đá vôi dốc ở bất kỳ hướng phơi nào dưới tán cây thưa Ở Việt Nam, hiện tại còn sót lại rất ít vì nó đã bị những người buôn Lan thu mua với số lượng lớn, cần

có biện pháp bảo vệ khẩn cấp

1.1.5.3 Đặc điểm nhận dạng

Paphiopedilum purpuratum là loài thân cỏ mọc ở đất với 4-6 lá Lá hình bầu dục tới hình bầu dục thuôn, nhọn hoặc gần nhọn ở đỉnh với 3 răng không đều nhau, kích thước 7-14 x 2,3 – 4,2 cm, xanh nhạt ở dưới, có đốm khảm xanh thẫm và xanh nhạt ở trên, mép có lông ria ngắn ở phía gốc Cụm hoa thẳng đứng, 1 hoặc hiếm khi 2 hoa, cuống cụm hoa dai 10-20 cm, mảnh, tím tía, phủ lông tía thẫm; lá hoa hình trứng-bầu dục hẹp, nhọn, kích thước 1,5-1,7 x 0,7 cm, xanh, phủ lông trắng; lá đài lưng trắng xanh ở gốc, có những đường gân màu tía nâu rõ; lá đài hợp xanh với các gân thẫm hơn, thường có 2 sọc dọc nâu tía; các cánh hoa màu tía nâu bóng loáng, xanh nhạt ở gần gốc

và vàng hồng ở đỉnh, có các đốm đen nâu dày đặc ở hai phần ba phía dưới; môi tía nâu thẫm; nhị lép nâu vàng son nhạt, tía đỏ dọc theo mép, có gân xanh quanh phần giữa trắng; bầu và cuống dài 2,5-4 cm, xanh, phủ lông trắng; núm nhụy trắng vàng; chỉ nhị xanh; khối phấn vàng mật Lá đài lưng hình trứng hẹp, nhọn, dài kích thước 2- 3,5 x 1,2-1,6 cm Cánh hoa ít nhiều nằm ngang, hình bầu dục hẹp tới thuôn, nhon tới tù, kích thước 3,5- 4,6 x 0,9- 1,3 cm, lông ria đen dài Môi dài 3,3- 4,4 cm, rộng 2- 2,7 cm, có các mụn lồi nhỏ trên các thùy bên uốn cong Nhị lép hình bán nguyệt với các thùy bên hình lưỡi liềm nhọn, hẹp, dài 8mm, rộng 8-11mm, phủ lông, có răng nhọn ở đỉnh Nhị

có đầu chỉ nhị kéo dài nhọn 2n = 40 (Averyanov và cs, 2008)

Thời gian hoa nở trong tự nhiên vào tháng 9 – 10, cây tái sinh bằng hạt

A, B,

Hình 1.2 Một số hình ảnh về Lan Hài P.purpuratum

(Nguồn: www.slipperorchids.info)

A, Các bộ phận của cây; B, Hoa Lan Hài P.dianthum; C, Cây sinh trưởng ngoài tự nhiên; D, Phân bố địa lý

1.2 Tổng quan về kỹ thuật nhân giống in vitro lan Hài

Trước kia, do Paphiopedilum là giống lan đa thân nên người ta thường dùng

phương pháp tách bụi để nhân giống, đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và cây con tách ra có tỷ lệ sống cao nhưng không đáp ứng đủ nhu cầu cây giống Với tình trạng hiện nay các loài lan Hài đang bị tận thu một cách quá mức thì rất cần thiết phải có một phương pháp hiệu quả để nhân giống các loài lan Hài Phương pháp nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào sẽ là công cụ hiệu quả

nhất trong việc khôi phục lại các loài lan Hài đang có nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên (Long et al., 2010)

1.2.1 Kỹ thuật nhân giống thực vật in vitro

1.2.1.1 Khái niệm nhân giống thực vật in vtro

Phương pháp nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô – tế bào (nhân giống in

vitro) dựa tên cơ sở về tính toàn năng và khả năng phân hóa, phản phân hóa của tế bào,

mô thực vật Đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã thực sự mang lại hiệu quả kinh tế to lớn (Vũ Văn Vụ và cs, 2001), (Hoàng Minh Tấn và cs, 2006) Tính ưu việt

của phương pháp nhân giống in vitro là việc sử dụng các mô nuôi cấy có kích thước nhỏ,

sự tương tác giữa các tế bào trong mô sẽ đơn giản hơn, mô nuôi cấy dễ phân hóa và sau

đó dễ tái sinh hơn Ngoài ra, nhân giống vô tính in vitro cho phép nhân giống cây trồng ở

quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), hệ số nhân cao và cho ra các cá thể sạch bệnh, hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền Đó là ưu việt mà các phương pháp nhân giống khác không có được (Hoàng Thị Lan Hương và cs, 2004) và (Võ Hà Giang, Ngô Xuân Bình, 2010)

Kỹ thuật vi nhân giống được ứng dụng hiệu quả vào các mục đích sau:

- Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus, tạo hàng loạt cây giống có chất lượng cao cung cấp cho sản xuất

- Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt

- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gưn quý làm vật liệu cho công tác giống

- Duy trì nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây rau, cây hoa và các cây trồng khác

1.2.1.2 Các giai đoạn trong nhân giống thực vật in vitro

Theo Georger (1993), quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các

bước sau:

Bước 0: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ

(cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy

mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu

cấy in vitro

Bước 1: Nuôi cấy khởi động

Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cần

đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá…Chồi ngọn, chồi nách được sử dụng để nhân nhanh các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúc… Ở súp lơ thì dùng hoa

tự non, ở bầu bí các mảnh lá mầm là nguyên liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh

in vitro Chồi non nảy mầm từ hạt cũng có thể được sử dụng làm mẫu cấy ban đầu

Bước 2: Nhân nhanh

Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi

vô tính Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp

để có hiệu quả cáo nhất Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi Chế độ nuôi cấy thường là 25-270C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-4000lux Tuy nhiên, đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần quang chu kỳ chiếu

sáng giờ/ngày, nhân nhanh phong lan Phaleanopsis ở giai đoạn đầu cần che tối…

Bước 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng Theo Murashige, giai đoạn này giai đoạn ưu tiên cho sự tạo rễ của chồi để sau đấy có thể chuyển chúng sang môi trường trồng trọt tự nhiên Tạo rễ cho chồi là một phần rất quan

trọng của bất kỳ quy trình nhân in vitro nào Đôi khi một số chồi cần được kéo dài

trước khi tạo rễ Để giảm chi phí nhân giống, nhiều thí nghiệm chuyển chồi không

rễ từ môi trường in vitro và tạo rễ ở bên ngoài phòng nuôi cấy

Giai đoạn này thường được chia thành:

+ Giai đoạn a: kéo dài mầm hoặc chồi tạo thành để cung cấp chồi có kích thước thích hợp cho giai đoạn tiếp theo

+ Giai đoạn b: tạo rễ cho chồi in vitro hoặc ngoài tự nhiên (extra vitrum)

Bước 4:Thích ứng cây in vitro ra điều kiện tự nhiên

Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:

+ Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá,

số rễ, chiều cao cây)

+ Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước

+ Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp

Có hai lý do chính gây khó khăn cho giai đoạn này mà cần phải khắc phục là:

+ Chồi in vitro được tạo ra trong môi trường có độ ẩm cao và cường độ ánh

sáng thấp Điều này làm cho lá có ít lớp sáp hơn hoặc sáp có thành phần hóa học

thay đổi so với những cây mọc trong tự nhiên hay nhà kính Một số cây in vitro, khí

khổng của lá có thể không bình thường, không có khả năng đóng hoàn toàn trong

điều kiện độ ẩm tương đối thấp Do đó, cây in vitro mất nước nhanh hơn khi đưa ra

môi trường bên ngoài

+ Cây con in vitro là các cơ thể dị dưỡng, nguồn dinh dưỡng và năng lượng

đều do môi trường nuôi cấy cung cấp Khi đưa ra điều kiện tự dưỡng, điều này đòi hỏi thời gian và điều kiện phù hợp để cây làm quen Sự chuyển sang trạng thái tự dưỡng chỉ xảy ra sau khi cấy đó làm quen với điều kiện tự nhiên một thời gian (Trigiano RN and Gray DJ., 2000)

1.2.2 Nghiên cứu về nhân giống in vitro cây lan

Năm 1909, Noel Bernard nhà thực vật người Pháp đã phát hiện ra ảnh hưởng của nấm trong việc nảy mầm hạt lan Ông thấy cây lan con nảy mầm trong rừng đều nhiễm nấm Ông đã cô lập các nấm ở rễ cây lan con và cấy vào hạt lan, bằng cách này 100% hạt lan nảy mầm Hạt lan chỉ nảy mầm khi cộng sinh với nấm bởi chúng không có nội nhũ và nấm cộng sinh đã cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho sự

nảy mầm của chúng (Knudson, L., 1992), (Ochora J., W.D Stock, H.P.Linder and L.E Newton, 2001)

Thí nghiệm đầu tiên trong nuôi cấy mô, tế bào hoa lan là vào năm 1922, Lewis Knudson đã chứng minh rằng nấm không cần thiết cho sự nảy mầm cuả hạt lan nếu hạt được gieo trên môi trường agar có bổ sung muối và đường cơ bản ở nồng độ thích hợp trong điều kiên vô trung Nó trở thành môi trường cơ bản cho việc nhân nhanh cây lan từ hạt cho đến ngày nay (Knudson, L., 1992)

Năm 1946, công trình nghiên cứu của Knudson (Mỹ) đã mở ra hướng ứng dụng công nghệ sinh học trong nuôi cấy lan Nhờ vậy, người ta đã sản xuất được khối lượng lớn trong thời gian ngắn, bảo tồn và duy trì nguồn gen, chọn lọc được những giống sạch virus từ các dòng được lai tạo, xây dựng các xí nghiệp sản xuất công nghiệp có sản lượng lớn và giá thành cây giống hạ

1.2.2.1 Nghiên cứu lựa chọn mẫu nuôi cấy

Để tạo dòng vô tính mang đặc tính di truyền của cơ thể mẹ, bắt buộc nguồn mẫu cấy ban đầu phải là các mô, cơ quan sinh dưỡng của cây mẹ Từ các mô, cơ quan sinh dưỡng này cần phải tạo được thể sinh chồi (protocorm) nhờ môi trường nuôi cấy có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng thích hợp

Theo Pierik (1997), việc nhân giống cây lan trở nên khá đơn giản từ việc

gieo hạt lan in vitro Các hạt lạn được gieo in vitro khi quả đã chín hoặc khi quả đã

sinh trưởng được ít nhất 2/3 thời gian từ khi thụ tinh đến khi quả chín Việc khử trùng bề mặt các quả xanh như thế rất đơn giản, chỉ cần nhúng trong cồn 900 Sau

đó dùng các dụng cụ vô trùng để mở vỏ quả và gieo hạt trên môi trường thạch Môi trường gieo hạt lan không cần bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng tổng hợp nhân tạo bởi các chất này thường có ảnh hưởng không mong muốn đến quá trình nảy mầm của hạt như hình thành các mô sẹo, tạo các chồi biến dị Trong khi đó, các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên như nước dừa, dịch nghiền chuối, khoai tây, cà chua…

có tác dụng kích thích sự nảy mầm của hạt lan (Pierik, 1997) Hàng loạt các tác giả

đã sử dụng phương pháp này trong nhân giống các loài lan bản địa, đặc biệt là các loài lan có nguy cơ bị tuyệt chủng cao (Shu Fung lo, 2004), (Zettler et all., 2000), Ochora et al, 2001), (Stewart and Kane, 2006) và (Lee Y.I et al., 2010)

1.2.2.2 Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy

Nền môi trường nuôi cấy với nồng độ và tỷ lệ khác nhau của các nguyên tố

khoáng đa, vi lượng, vitamin… có ảnh hưởng rất rõ rệt đến kết quả nuôi cấy in vitro

cây lan Nhiều tác giả đã xác nhận dùng các môi trường VW, MS, KC rất tốt cho nuôi cấy mô các loài thuộc họ lan Khi nghiên cứu ảnh hưởng của 3 loại môi trường

trên đối với nuôi cấy mô cây Dendrobium “Sonia”, các nhà nghiên cứu tại Đại học

Mauritius kết luận môi trường MS có hiệu quả nhất trong nhân nhanh PLB (Puchoa,

2004) Đối với cây Vanda dearei và Cymbidium findlaysonianum sự sinh trưởng

của PLB tốt nhất trên môi trường 1/2 MS sau đó đến môi trường KC và VW (Tawaro et al., 2008) và (Roslina Jawan et al., 2010)

Các tác giả Bùi Thị Hường và Trần Văn Minh (2010) cũng đã thu được kết quả tương tự khi nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau đến nuôi cấy mô lan Trong năm loại môi trường nghiên cứu (MS, VW, KC, Orchmax và Lindemann),

môi trường tốt nhất cho cây Dendrobium lai là MS và cho cây Cymbidium lai là

Orchmax

1.2.2.3 Ảnh hưởng của nguồn carbon hữu cơ

Ảnh hưởng của nguồn các bon hữu cơ đến nuôi cấy in vitro cây lan đã được

nhiều tác giả quan tâm, nghiên cứu Roslina Jawan và cộng sự đã chứng minh được chồi

Vanda dearei sinh trưởng tốt hơn trên môi trường nuôi cấy bổ sung đường saccharose

so với đường glucose và fructose Đồng thời trong 3 nồng độ đường saccharose nghiên cứu (1,2,4%) thì nồng độ 2% là thích hợp nhất (Roslina Jawan et al., 2010)

Nồng độ đường 2% cũng được cho là thích hợp trong nuôi cấy lan Cymbidium Với cây Cattleya granulosa thì nồng độ saccaroza thích hợp cho sự sinh trưởng của

chồi là 1,5% và cho sự tạo rễ là 3% (Pinto et al., 2010)

Dương Tấn Nhựt và cộng sự thuộc Phân viện Sinh học Đà Lạt đã nghiên cứu ảnh hưởng của các monosaccharide và disaccharide lên quá trình phát sinh phôi vô tính cây lan Hồ Điệp Kết quả monosaccharide không thích hợp cho nuôi cấy phôi

vô tính cây lan Hồ Điệp, gây chết 100% mẫu cấy, disaccharide tỏ ra thích hợp hơn (nguồn: Báo cáo tổng kết khoa học –Phân viện Sinh học Đà Lạt, 2006)

1.2.2.4 Ảnh hưởng của hỗn hợp các chất hữu cơ tự nhiên

Trong nuôi cấy in vitro cây lan, hàng loạt các tác giả trong và ngoài nước đã

đi sâu nghiên cứu về ảnh hưởng của các hỗn hợp chất hữu cơ tự nhiên đến sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy Khi nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến nuôi

cấy lan Cymbidium trên môi trường KC, các tác giả Nhật đã chỉ rõ: Trong 6 nồng độ

được nghiên cứu (từ 0-25%) thì nồng độ nước dừa 10% có hiệu quả nhất đối với

việc tăng khối lượng tươi của cây in vitro Đồng thời, đối với sự sinh trưởng của PLB, chồi và rễ cây Cymbidium, việc bổ sung phối hợp cả dịch nghiền của chuối và

táo vào môi trường KC tỏ ra có hiệu quả hơn khi chỉ bổ sung riêng lẻ từng chất Nhưng đối với sự sinh trưởng của cây con thì bổ sung dịch nghiền chuối với hàm lượng 155 lại cho hiệu quả cao nhất Các tác giả Thái Lan cũng khẳng định: đối với

cây lan Cymbidium findlaysonianum môi trường VW có bổ sung 15% nước dừa, 5%

dịch chuối nghiền, 5% dịch nghiền khoai tây, 2% saccharose và 0,2% than hoạt tính

đã tỏ ra có hiệu quả hơn môi trường VW chỉ bổ sung 15% nước dừa và 2% saccharose trong nhân nhanh thể PLB và phát triển PLB thành cây con (Tawaro et al., 2008)

Ở nước ta, việc sử dụng các hỗn hợp chất hũu cơ tự nhiên trong nuôi cấy in

vitro cây lan đã được nhiều tác giả thực hiện Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2003) đã khẳng định các hợp chất BA, Kinetin không có tác dụng tích cực trong giai đoạn nhân nhanh thể PLB và chồi của lan Hồ Điệp Mặt khác, để tăng hệ số

nhân cà chất lượng chồi của in vitro nên sử dụng các loại dịch nghiền của khoai tây,

cà rốt, chuối… Các tác giả này cũng đã xác định được môi trường (VW+ 10% nước dừa + 1g pepton + 30g khoai tây + 30g cà rốt) là thích hợp nhất cho nhân nhanh PLB và chồi lan Hồ điệp lai S8-11 Hiệu quả các hỗn hợp hợp chất hữu cơ tự nhiên

cũng được khẳng định trong nuôi cấy in vitro cây Paphiopedilum hangianum Gurss

(Hoàng Thị Giang và cs, 2010)

1.2.3 Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hài

1.2.3.1 Nghiên cứu trên thế giới

Mặc dù sự hình thành hạt của lan Hài rất lớn nhưng tỷ lệ hạt nảy mầm trong

tự nhiên lại rất thấp vì hạt lan Hài quá nhỏ, không chứa chất dự trữ và chỉ có một

phôi chưa phân hóa, nên không thể phát triển theo phương thức bình thường được,

do đó các loài lan Hài rất hiếm dạng dại (Arditti and Ernst 1993) Sự cộng sinh của hạt lan chín trong tự nhiên thường rất khó khăn (Lee et al, 2006), với tần số từ 35 đến 68% trong 12 loài lan Hài đã được nghiên cứu (Lee, 1998; Tay et al.,1988;

Chen et al., 2004b; Zeng et al., 2006; Lee, 2007) Hai loài lan Hài P.villosum (Lindl

ex Hook) Stein và P.barbigerum có tỷ lệ hình thành quả rất thấp tương ứng là 8%

và 26% (Banziger, 1996; Shi et al., 2008)

Theo Liu và cộng sự (2006) thì loài lan Hài P.armeniacum có khoảng thời

gian từ khi hạt nảy mầm đến khi hình thành cây phải mất 4 năm

Những nỗ lực để tạo ra các khối mô sẹo của lan Hài từ các đoạn gốc, thân đã không thành công Tuy nhiên, một vài loài lan Hài lai đã thành công trong việc tạo

ra protocorms, mô sẹo, chồi,… từ hạt Điều đó nói lên rằng lan Hài lai là dễ nhân hơn so với các loài bản địa Do đó, việc nhân giống các loài lan Hài chủ yếu đạt được bằng cách tạo ra sự cộng sinh của hạt để thuận lợi cho sự nảy mầm của hạt trong nuôi cấy mô (Lin et al., 2000; Chen et al., 2004a; Huang et al., 2001)

Kết quả nghiên cứu của Long và cs (2010) về ảnh hưởng của sự chín của hạt giống, môi trường nuôi cấy, nguồn carbon và các chất phụ gia hữu cơ đến sự nảy

mầm, phát triển protocorm, và sinh trưởng của 4 loài Lan Hài P.villosum var

densissimum, P.insigne, P.bellatulum , và P.armeniacum đã cho thấy khi sử dụng

hạt giống đạt 200 ngày tuổi tỷ lệ nảy mầm của hạt đạt cao nhất trong khi tỷ lệ nảy mầm của hạt sau thụ phấn 300 ngày là thấp nhất Điều này là do sau khi thụ phấn kéo dài thì hạt có hiện tượng hình thành vỏ (được quan sát dưới kính hiển vi) và nó

đã ngăn cản sự hấp thu dinh dưỡng của hạt làm cho tỷ lệ nảy mầm giảm đi đáng kể Kết quả tương tự cũng đã được chỉ ra bởi Ding và cs (2004)

Theo Lee (1998) sự nảy mầm của loài P.delenatii tối ưu tại thời điểm 150

ngày sau thụ phấn (68%), tỷ lệ nảy mầm giảm mạnh khi hạt thu ở 210 ngày sau thụ phấn do khi này hạt đã chín đầy đủ Ở 150 ngày sau thụ phấn, lớp cutin được hình thành đầy đủ và các tế bào noãn đã hình thành không bào, do đó cho phép sự hấp thu dinh dưỡng tốt nhất

Kết quả nghiên cứu của Long và cs (2010), Lee (1998, 2007), Ding và cs

(2004) cho thấy ảnh hưởng của sự trưởng thành hạt giống đến sự nảy mầm phụ thuộc vào loài Sự nảy mầm của hạt lan là tương đối thấp do nội nhũ không phát triển trong quá trình phát triển của hạt Hơn nữa, vỏ hạt rất mỏng có thể không đủ

để bảo vệ phôi từ sự khô hạn Sự hình thành của một lớp biểu bì trên bề mặt phôi có thể đảm bảo duy trì độ ẩm cho các tế bào phôi cũng như bảo vệ sự tác động của điều kiện vật lý Tuy nhiên lớp biểu bì làm giảm tỷ lệ nảy mầm của hạt trong ống nghiệm (Lee et al., 2006)

Thông thường sự sinh trưởng trưởng và phát triển của cây trong nuôi cấy in

vitro phụ thuộc vào thành phần của các nguyên tố đa lượng, vi lượng, nguồn carbon, và chất điều tiết sinh trưởng trưởng Các kết quả nghiên cứu về thành phần môi trường nuôi cấy đến sự nảy mầm của hạt lan Hài của Long và cs (2010) đã cho thấy có mối quan hệ giữa giữa lượng muối khoáng tương đối thấp và nồng độ N vô

cơ trong môi trường KnudsonC (KC) và Vacin and Went (VW) đã kích thích sự nảy

mầm của P.villosum var densissimum (nồng độ muối khoáng sản: KC, 13,42 mM,

WV, 16,3 mM; nồng độ N vô cơ: KC, 12,25 mM, VW, 3,78 mM;) Sự nảy mầm đạt cao nhất trên môi trường KC Hiệu quả kích thích sự nảy mầm của hạt lan trên môi trường KC có thể liên quan đến một thực tế là trong môi trường KC có một lượng canxi tương đối cao nồng độ (4,23 mM) so với VW (1,94 mM), và 1/4MS, ½MS (0.75 và 1.5 mM) Việc cung cấp canxi ảnh hưởng đến tăng trưởng và sự phân chia nhân của thực vật Protocorms thu được trên VW lớn hơn trên 1/2MS, có thể được liên quan đến nồng độ phosphate tương đối cao (4,74 mM) của VW so với 1/4MS

và 1/2MS (0.32 và 0,62 mM) và KC (1,84 mM) Phosphate được hấp thu bởi rễ giả

có thể đã kích thích tăng trưởng protocorm Phản ứng này là tương tự như quan sát khác trên cây lan Bletia purpurea (Lam.) DC (Dutra et al., 2008)

Ngoài sacarose là nguồn carbon sử dụng chính trong môi trường nuôi cấy mô

tế bào thì các loại đường khác như Glucose, fructose, maltose, mannitol, cũng có hiệu quả (Li, 2002) Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của nguồn carbon khác nhau đến

sự nảy mầm của hạt lan Hài loài P.villosum var Densissimum, Long và cs đã nhận

thấy sự nảy mầm của hạt đạt cao nhất trên môi trường có bổ xung glucose và cao gấp 2 lần so với môi trường có saccarose, kết quả này cũng phù hợp nghiên cứu của

Cao và Jia (2003), Abdoulaye và Mark (2006) Maltose đã được báo cáo như là một

nguồn đường hiệu quả cho sự tăng trưởng của cây lan vũ nữ Oncidium, Gower

Ramsey Tuy nhiên maltose là ít hiệu quả trong việc thúc đẩy sự nảy mầm của hạt lan Hài (Huang et al., 2001; Oldach et al., 2001; Cao and Jia, 2003; Abdoulaye and Mark 2006; Long et al., 2010)

Theo Huang và cs (2001) thì số lượng chồi của lan Hài lai tăng gấp hai lần sau 12 tuần nuôi cấy khi môi trường có bổ sung BA và NAA Trong khi đó TDZ ức chế sự dài ra của chồi cũng như rễ Kết quả của Martin (2003), Chen và cộng sự (2004a), Thomas và Michael (2007), Hong và cộng sự (2008) cho thấy rằng, trong nhiều trường hợp, lan Hài hình thành chồi ít hơn so với các loại hoa lan khác Nồng

độ chất điều tiết sinh trưởng ngoại sinh (PGRs) cần thiết cho vi nhân giống của Lan

Hài phụ thuộc vào loài Nồng độ BA tương đối cao làm tăng số lượng chồi của P

villosum var densissimum và P.armeniacum nhưng lại giảm ở P.insigne

1.2.3.2 Nghiên cứu ở Việt Nam

Khi nghiên cứu đa dạng di truyền loài lan Hài đốm (Paphiopedilum concolor

Pfitzer) bản địa của Việt Nam (2009), tác giả Khuất Hữu Trung và cộng sự đã nhận

xét: Loài lan hài đốm (P concolor Pfitzer) bản địa của Việt Nam rất đa dạng và

phong phú Các mẫu giống thu thập tại các vùng sinh thái khác nhau đều có các đặc điểm đặc trưng riêng về hình thái Kết quả phân tích bằng kỹ thuật RAPD-PCR chỉ

ra hệ số tương đồng di truyền của các mẫu Hài đốm dao động từ 0,56 đến 0,94; 16 mẫu lan Hài đốm nghiên cứu được phân thành 6 nhóm khác nhau Phương pháp mô

tả các đặc điểm hình thái và phương pháp đánh giá đa hình di truyền ở mức độ ADN có thể bổ sung và hỗ trợ lẫn nhau để công việc phân loại dưới loài trở nên chính xác hơn, phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng một cách có hiệu quả các nguồn gen lan Hài bản địa của Việt Nam

Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2005, 2007), đã nhân giống được loài lan Hài

đỏ- một loài Lan đặc hữu của Việt Nam (Paphiopedilum delenatii) bằng kỹ thuật

gây vết thương cơ giới, nuôi cấy lỏng và kéo dài đốt thân có chứa mắt để tái sinh chồi từ việc sử dụng các hạt lan sáu tháng tuổi được nuôi cấy trên môi trường Knudson C kết hợp với việc gây vết thương và nuôi cấy trên môi trường lỏng đã thu

được 5,2 chồi/mẫu ban đầu khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 1,0mg/l TDZ Còn các cây sau khi được kéo dài đoạn thân bằng cách sử dụng ánh sáng trắng của đèn huỳnh quang và ánh sáng đỏ của đèn LED, được cắt thành từng đốt rồi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các chất diều tiết sinh trưởng khác nhau Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo chồi cao nhất (75%) khi môi trường có bổ xung 2,0mg/l BA, còn trên môi trường có bổ sung 1,5mg Zeatin hoặc 1,5mg/l TDZ thì cho chất lượng chồi tốt nhất

Năm 2006, tác giả Đặng Xuyến Như và cộng sự đã thành công trong việc tạo

ra các cây con của hai loài lan Hài Hằng (P.hangianum) và Hài Tam Đảo

(P.gratrixianum ) bằng cách gieo hạt của các loài Lan này trong nuôi cấy in vitro

Hoàng Thị Giang và cộng sự (2010) đã nghiên cứu nhân giống in vitro giống lan Hài Hằng (Paphiopedilum hangganum perner gurss) từ nguồn nguyên liệu ban

đầu là hạt lấy từ quả 6 – 10 tháng tuổi Môi trường nuôi cấy là RE cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao nhất (58 – 67%) Môi trường nhân nhanh là môi trường RE có bổ sung

150 ml/l nước dừa và 100 g/l chuối cho hệ số nhân cao nhất đạt 4,3 lần và cùng trên nền môi trường RE có bổ sung 0,4-0,6mg/l α-NAA cho khả năng ra rễ tốt nhất

Có thể thấy, trên thế giới và Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về nuôi cấy in

vitro lan Hài Paphiopedilium, tuy nhiên việc nghiên cứu về loài lan Hài

P.purpuratum hầu như chưa được đề cập đến Do đó, đề tài nghiên cứu của chúng tôi là hết sức cần thiết để tạo nền móng cơ sở cho việc bảo tồn và phát triển loài lan

Hài tía P.purpuratum đang có nguy cơ tuyệt chủng ở Việt Nam

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Lan Hài P.purpuratum (Hài tía) được thu thập ở Việt Nam

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu

Quả loài lan Hài P.purpuratum (Hài tía) ở các độ tuổi khác nhau được sử

dụng để làm nguồn vật liệu ban đầu cho các thí nghiệm

Sử dụng các mầm cây Lan Hài P.purpuratum có kích thước từ 1,2 đến 1,5

cm để tiến hành thí nghiệm nhân nhanh

Hình 2.1 Cây và quả loài lan Hài P.purpuratum

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: Viện Sinh học Nông nghiệp – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam

- Thời gian tiến hành: Từ tháng 6 năm 2013 đến tháng 8 năm 2014

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu

- Nghiên cứu nhân nhanh in vitro

- Nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Môi trường nuôi cấy cơ bản: MS + 20g/l đường saccarose + 7g agar/l, Môi trường được đưa về pH = 5,7 – 5,8 ; sau đó được hấp khử trùng ở 1200C, 1,4 atm trong 20 phút

- Điều kiện thí nghiệm: các thí nghiệm tiến hành trong điều kiện điều kiện ánh sáng: 2000 - 2500lux, thời gian chiếu sáng: 16h sáng/8h tối, nhiệt độ: 24±2oC

2.4.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

- Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức được cấy

6 bình, mỗi bình 5 mẫu và chia làm 3 lần nhắc lại

- Các chỉ tiêu theo dõi được quan sát và đo đếm định kỳ 3 tuần một lần

2.4.2.1 Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của tuổi quả đến khả năng nảy mầm của hạt

Quả lan Hài được thu ở các độ tuổi khác nhau, tiến hành khử trùng hạt bằng cồn 700 và dung dịch Johson 1% trong 7 phút Sau đó gieo hạt trên nền môi trường Vacin and Went

Công thức thí nghiệm Tuổi quả

CT1 6 tháng CT2 7 tháng CT3 8 tháng CT4 9 tháng CT5 10 tháng

(Tuổi của quả được tính từ khi sau khi thụ phấn đến lúc thu quả)

Sau 12 tuần theo dõi hạt lan Hài có tuổi quả thích hợp sẽ được sử dụng làm nguồn vật liệu cho các thí nghiệm tiếp theo

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nảy mầm của hạt

Sử dụng quả ở độ tuổi sau thụ phấn 9 tháng, gieo hạt trên trên các nền môi trường dinh dưỡng khác nhau trong các điều kiện tối ưu để tạo protocorm

Công thức thí nghiệm Môi trường

2.4.2.2 Nghiên cứu nhân nhanh in vitro

Môi trường thích hợp ở thí nghiệm 2 + 10 g/l đường + 0,5 g/l than hoạt tính + 5,3 g/l agar+ 100 ml nước dừa sẽ được dùng làm nền môi trường (ĐC) của các thí nghiệm tiếp theo

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh của chồi

Thí nghiệm được tiến hành theo các công thức sau:

CT2 ĐC + 0,5 mg/l BA CT3 ĐC + 1,0 mg/l BA CT4 ĐC + 1,5 mg/l BA CT5 ĐC + 2 mg/l BA CT6 ĐC + 3 mg/l BA

7 ĐC + 4mg/l BA

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của Kinetine đến khả năng nhân nhanh của chồi

Thí nghiệm được tiến hành theo các công thức sau:

CT2 ĐC + 1,0 mg/l Ki CT3 ĐC + 2,0 mg/l Ki CT4 ĐC + 3,0 mg/l Ki CT5 ĐC + 4,0 mg/l Ki CT6 ĐC + 5,0 mg/l Ki

Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BA và α- NAA đến khả năng nhân

nhanh của chồi

Sử dụng môi trường thích hợp nhất từ thí nghiệm 2 có bổ sung thêm 2mg/l

BA, đồng thời bổ sung thêm α- NAA theo các công thức: