2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Viện Sinh học Nông nghiệp – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam
- Thời gian tiến hành: Từ tháng 6 năm 2013 đến tháng 8 năm 2014
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu. - Nghiên cứu nhân nhanh in vitro.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
- Môi trường nuôi cấy cơ bản: MS + 20g/l đường saccarose + 7g agar/l, Môi trường được đưa về pH = 5,7 – 5,8 ; sau đó được hấp khử trùng ở 1200C, 1,4 atm trong 20 phút.
- Điều kiện thí nghiệm: các thí nghiệm tiến hành trong điều kiện điều kiện ánh sáng: 2000 - 2500lux, thời gian chiếu sáng: 16h sáng/8h tối, nhiệt độ: 24±2oC
2.4.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
- Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức được cấy 6 bình, mỗi bình 5 mẫu và chia làm 3 lần nhắc lại.
- Các chỉ tiêu theo dõi được quan sát và đo đếm định kỳ 3 tuần một lần.
2.4.2.1. Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu
Thí nghiệm 1:Ảnh hưởng của tuổi quảđến khả năng nảy mầm của hạt
Quả lan Hài được thu ở các độ tuổi khác nhau, tiến hành khử trùng hạt bằng cồn 700 và dung dịch Johson 1% trong 7 phút. Sau đó gieo hạt trên nền môi trường Vacin and Went .
Công thức thí nghiệm Tuổi quả CT1 6 tháng CT2 7 tháng CT3 8 tháng CT4 9 tháng CT5 10 tháng
(Tuổi của quảđược tính từ khi sau khi thụ phấn đến lúc thu quả)
Sau 12 tuần theo dõi hạt lan Hài có tuổi quả thích hợp sẽđược sử dụng làm nguồn vật liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 2:Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nảy mầm của hạt
Sử dụng quả ởđộ tuổi sau thụ phấn 9 tháng, gieo hạt trên trên các nền môi trường dinh dưỡng khác nhau trong các điều kiện tối ưu để tạo protocorm.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
Công thức thí nghiệm Môi trường
CT1 VW CT2 ½ VW CT3 MS CT4 ½ MS CT5 RE CT6 ½ RE
2.4.2.2. Nghiên cứu nhân nhanh in vitro
Môi trường thích hợp ở thí nghiệm 2 + 10 g/l đường + 0,5 g/l than hoạt tính + 5,3 g/l agar+ 100 ml nước dừa sẽđược dùng làm nền môi trường (ĐC) của các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 3:Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh của chồi
Thí nghiệm được tiến hành theo các công thức sau:
Công thức thí nghiệm Môi trường
CT1 ĐC CT2 ĐC + 0,5 mg/l BA CT3 ĐC + 1,0 mg/l BA CT4 ĐC + 1,5 mg/l BA CT5 ĐC + 2 mg/l BA CT6 ĐC + 3 mg/l BA 7 ĐC + 4mg/l BA
Thí nghiệm 4:Ảnh hưởng của Kinetine đến khả năng nhân nhanh của chồi
Thí nghiệm được tiến hành theo các công thức sau:
Công thức thí nghiệm Môi trường
CT1 ĐC CT2 ĐC + 1,0 mg/l Ki CT3 ĐC + 2,0 mg/l Ki CT4 ĐC + 3,0 mg/l Ki CT5 ĐC + 4,0 mg/l Ki CT6 ĐC + 5,0 mg/l Ki
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BA và α- NAA đến khả năng nhân nhanh của chồi
Sử dụng môi trường thích hợp nhất từ thí nghiệm 2 có bổ sung thêm 2mg/l BA, đồng thời bổ sung thêm α- NAA theo các công thức:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
Công thức thí nghiệm Môi trường
CT1 ĐC
CT2 ĐC + 2 mgl/ BA + 0,1 mg/l α- NAA CT3 ĐC + 2 mgl/ BA + 0,3mg/l α- NAA CT4 ĐC + 2 mgl/ BA + 0,5mg/l α- NAA CT5 ĐC + 2 mgl/ BA + 1 mg/l α- NAA
Thí nghiệm 6:Ảnh hưởng của dịch chiết cà chua đến khả năng nhân nhanh của chồi
Công thức thí nghiệm Môi trường
CT1 ĐC
CT2 ĐC + 50g/l cà chua CT3 ĐC + 100g/l cà chua CT4 ĐC + 150g/l cà chua CT5 ĐC + 200g/l cà chua
Thí nghiệm 7:Ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh của chồi
Công thức thí nghiệm Môi trường
CT1 ĐC
CT2 ĐC + 50 g/l chuối CT3 ĐC + 100 g/l chuối CT4 ĐC + 150 g/l chuối CT5 ĐC + 200 g/l chuối
Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của dịch chiết chuối và dịch chiết khoai tây đến khả năng nhân nhanh của chồi
Công thức thí nghiệm Môi trường
CT1 ĐC
CT2 ĐC+50g/l CT+50g/l KT CT3 ĐC+50g/l CT+100g/l KT CT4 ĐC+100g/l CT+50g/l KT CT5 ĐC+100g/l CT+100g/l KT
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
Thí nghiệm 9:Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của chồi
Công thức thí nghiệm Môi trường
CT1 MS CT2 ½ MS CT3 VW CT4 ½ VW CT5 RE CT6 ½ RE
Thí nghiệm 10:Ảnh hưởng của hàm lượng đường bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của chồi
Công thức thí nghiệm Môi trường
CT1 5 gam/lít
CT2 10 gam/lít
CT3 15 gam/lít
CT4 20 gam/lít
Thí nghiệm 11:Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến khả năng sinh trưởng của chồi
Công thức thí nghiệm Môi trường
CT1 ĐC, 500 lux
CT2 ĐC, 1000 lux
CT3 ĐC, 1500 lux
CT4 ĐC, 2000 lux
2.4.2.3. Nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Thí nghiệm 12:Ảnh hưởng của α-NAA đến sự ra rễ của chồi
Những chồi đơn, phát triển tốt, có từ 3-4 lá được đưa vào môi trường ra rễđã chuẩn bị như sau:
Công thức thí nghiệm Môi trường
CT1 ĐC
CT2 ĐC + 0,3 mg/l α-NAA CT3 ĐC + 0,5 mg/l α-NAA CT4 ĐC + 0,7 mg/l α-NAA
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
2.4.3. Các chỉ tiêu theo dõi
-Khả năng nảy mầm của hạt (%).
-Chiều cao cây (cm): chiều dài từ gốc đến ngọn. -Chiều cao trung bình cây:
Chiều cao trung bình cây (cm/cây) = Σ chiều cao cây
Σ số cây -Hệ số nhân chồi: Hệ số nhân chồi (%) = Σ số chồi bật × 100 Σ số chồi cấy -Số rễ hình thành trên chồi cấy: Số rễ hình thành (rễ/cây) = Σ số rễ Σ số chồi cấy -Tỷ lệ cây sống: Tỷ lệ cây sống (%) = Σ số cây sống × 100 Σ số cây ban đầu - Số lá trên cây:
Số lá trên cây (lá/cây) = Σ số lá × 100
Σ số lá ban đầu - Màu sắc lá
2.4.4. Phương pháp xử lý số liệu.
Các số liệu được tính toán trên máy tính theo chương trình Microsoft Excel và chương trình IRRISTAT4.0.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nhóm thí nghiệm tạo vật liệu khởi đầu
Quả lan Hài P.purpuratum ở các độ tuổi khác nhau được sử dụng làm nguồn vật liệu cho nhóm thí nghiệm này. Quả sau khi thu hái được mang về khử
trùng qua các bước: dùng vải sạch thấm cồn 700 lau sạch bề mặt quả, ngâm trong dung dịch Johnson 1% trong 7 phút, tráng lại 3 lần nước cất vô trùng. Sau đó tách lớp vỏ ngoài thu lấy hạt để gieo vào môi trường thí nghiệm.
3.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của tuổi quảđến khả năng nảy mầm của hạt lan Hài P.purpuratum.
Hạt lan Hài rất nhỏ và gần như không có chất dự trữđể hỗ trợ cho quá trình nảy mầm (Arditti và Ernst, 1993) nên việc gieo hạt lan Hài trong ống nghiệm tốn khá nhiều thời gian và khả năng nảy mầm của hạt thấp hơn rất nhiều so với các loài lan khác. Trong đó, tuổi quả được sử dụng để lấy hạt đem vào môi trường gieo có
ảnh hưởng khá rõ đến quá trình này. Kết quả sau 12 tuần gieo hạt lan Hài
P.purpuratumở các tuổi quả khác nhau được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của tuổi quảđến khả năng nảy mầm của hạt lan Hài P.purpuratum (sau 12 tuần theo dõi)