CTTN
Tỷ lệ nảy mầm của hạt (%)
Sau 4 tuần Sau 6 tuần Sau 8 tuần Sau 10 tuần Sau 12 tuần
CT1: 6 tháng 0 0 0 0 0 CT2: 7 tháng 0 0 0 0 0 CT3: 8 tháng 0 0 0 0 0 CT4: 9 tháng 0 0 0 2,5 3,0 CT5: 10 tháng 0 0 0 1,5 2,0 Kết quả bảng 3.1 cho thấy, tuổi quả có ảnh hưởng khá rõ tới khả năng nảy mầm của hạt lan Hài P.purpuratum. Hạt lan ở quả từ 6-8 tháng tuổi đều không có hiện tượng nảy mầm sau 12 tuần gieo. Hạt lan ở tuổi quả già hơn (9-10 tháng tuổi)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35 cho hạt nảy mầm sớm nhất sau 10 tuần gieo (tỷ lệ hạt nảy mầm ở quả 9 và 10 tháng tuổi lần lượt là 2,5% và 1,5%). Sau 12 tuần gieo, tỷ lệ nảy mầm của 2 công thức này tăng lên và đạt cao nhất là 3% ở hạt lan 9 tháng tuổi. Tỷ lệ nảy mầm này là rất thấp so với kết quả nghiên cứu của Lee (1998), tỷ lệ nảy mầm của loài P.delenatti cao nhất là 68% tại thời điểm 150 ngày sau thụ phấn.
Nhìn chung, hạt lan Hài P.purpuratum rất khó nảy mầm và đòi hỏi thời gian nảy mầm khá lâu. Nếu sử dụng quả non (dưới 8 tháng tuổi) đểđem vào môi trường gieo hạt thì hạt sẽ có hiện tượng bịđen lại và không thể nảy mầm được. Tuy nhiên, nếu sử dụng quả quá già (trên 10 tháng tuổi) cũng làm giảm tỷ lệ nảy mầm của hạt.
Điều này có thểđược giải thích là do khi kéo dài thời gian sau thụ phấn của quả, hạt lan Hài có hiện tượng hình thành vỏ (được quan sát dưới kính hiển vi) làm ngăn cản quá trình hấp thụ dinh dưỡng của hạt và do đó làm cho tỷ lệ hạt nảy mầm giảm đi
đáng kể (Long và cs, 2010).
Qua đây có thể kết luận: sử dụng quả lan Hài P.purpuratum có độ tuổi 9 tháng sau thụ phấn là thích hợp nhất để gieo hạt cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao.
A, B,
C,
Hình 3.1: Hạt lan Hài P.purpuratum ở các tuổi quả khác nhau sau 12 tuần gieo
A: Hạt non có hiện tượng đen lại và không thể nảy mầm; B: Hạt lan 10 tháng tuổi; C: Hạt lan 9 tháng tuối
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36
3.1.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nền môi trường thích hợp cho khả năng nảy mầm của hạt Lan Hài P.purpuratum
Dương Tấn Nhựt và cs (2005) đã nhân giống thành công lan Hài Hồng (P.delentii) bằng phương pháp gieo hạt in vitro, thu được cây con sau 90-100 ngày. Sau đó, tái tạo chồi bằng cách gây vết thương trên các mầm thu được từ gieo hạt và nuôi cấy trên môi trường lỏng đã thu được hệ số nhân là 5,2 lần.
Dựa vào nền tảng đó, chúng tôi cũng mong muốn tìm ra được môi trường thích hợp để nhân giống loài lan Hài P.purpuratum bằng phương pháp gieo hạt
in vitro.
Thí nghiệm sử dụng các nền môi trường dinh dưỡng phổ biến trong nuôi cấy mô các loài lan gồm MS, VW, RE để tiến hành gieo hạt. Cùng với mỗi môi trường nuôi cấy này, chúng tôi chỉ lấy 1/2 lượng khoáng đa lượng, giữ nguyên khoáng vi lượng, vitamin và các thành phần khác để lập các công thức tiếp theo (1/2 MS, 1/2 VW, 1/2 RE). Kết quả sau 12 tuần theo dõi được trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2: Tỷ lệ nảy mầm của lan Hài P.purpuratum trên các nền môi trường khác nhau (sau 12 tuần theo dõi)
CTTD CTTN
Tỷ lệ nảy mầm của hạt (%)
Sau 8 tuần Sau 10 tuần Sau 12 tuần
CT1: VW 0 0 1,5 CT2: ½ VW 0 2,5 3,5 CT3: MS 0 2,0 3,0 CT4: ½ MS 0 3,0 4,5 CT5: RE 0 3,5 5,0 CT6: ½ RE 0 4,5 7,5 Qua bảng 3.2 có thể thấy NMT có ảnh hưởng khá rõ rệt đến tỷ lệ nảy mầm của hạt Lan Hài P. purprzatum.
Ở giai đoạn 8 tuần sau gieo, tất cả các công thức đều không có hạt nảy mầm. Sang tuần thứ 10, hiện tượng hạt nảy mầm đã xuất hiện ở hầu hết các CT thí nghiệm trừ CT1 (MS) với các tỷ lệ khác nhau từ 2 – 4,5%. Trong đó, CT6 (½ RE) có tỷ lệ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37 hạt nảy mầm cao nhất 4,5%. Ở tuần thứ 12, ở CT1 đã xuất hiện hạt nảy mầm nhưng với tỷ lệ rất thấp (1,5%), tỷ lệ hạt nảy mầm ở các công thức còn lại đều tăng lên (CT2 và CT3 tăng 1%; CT 4 và CT 5 tăng 1,5%). Riêng CT6 (½ RE) cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao nhất, đạt 7,5% số hạt nảy mầm ở giai đoạn này (từ tuần 10 đến tuần 12 sau gieo tăng từ 4,5% lên 7,5%).,
Tất cả các NMT MS, ½ MS, VW, ½ VW, RE và ½ RE đều có khả năng kích thích hạt lan Hài P.purpuratum nảy mầm. Tuy nhiên, ở môi trường dinh dưỡng có sự pha loãng thì tỷ lệ hạt lan nảy mầm cao hơn so với môi trường nền ban đầu. Đặc biệt, sử dụng nền NMT ½ RE lại cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao nhất (đạt 7,5%) và cao gấp 1,5 lần so với nền môi trường RE (5%). Điều này chứng tỏ, ở giai đoạn nảy mầm, hạt lan Hài đòi hỏi một lượng dinh dưỡng khoáng khá thấp. Nếu cung cấp nhiều khoáng sẽ tỏ ra không thích hợp và cho tỷ lệ nảy mầm giảm đáng kể. Kết quả
này cũng phù hợp với nghiên cứu của Long và cs (2010) khi chỉ ra mối quan hệ
giữa giữa lượng muối khoáng tương đối thấp và nồng độ N vô cơ trong môi trường KnudsonC (KC) và Vacin and Went (VW) đã kích thích sự nảy mầm của P.villosum var. Densissimum.
Theo Hoàng Thị Giang và cs (2010), trên nền môi trường RE, tỷ lệ nảy mầm của loài lan Hài Hằng P.hangianumperner Gurss đạt tới 67%, trong khi đó loài
P.purpuratum chỉ đạt 5% và tỷ lệ này cao nhất cũng chỉ đạt có 7,5% (trên nền môi trường 1/2RE). Điều đó chứng tỏ hạt của loài lan P.purpuratum này rất khó nảy mầm so với các loài lan Hài khác.
Như vậy, sử dụng NMT ½ RE là thích hợp nhất để tiến hành thí nghiệm gieo hạt lan Hài P.purpuratum, cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao.
Đối với loài P.purpuratum, các hạt được gieo đã phát sinh trực tiếp thành cụm chồi. Vì vậy, đối với loài lan này, chúng tôi chỉ nghiên cứu môi trường nhân nhanh cụm chồi.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38
Hình 3.2. Hạt lan Hài P.purpuratum trên các nền môi trường khác nhau sau 12 tuần gieo
A. Nền môi trường VW B.Nền môi trường MS C.Nền môi trường RE D. Nền môi trường ½ VW E. Nền môi trường ½MS G.Nền môi trường ½ RE
3.2 Nhóm thí nghiệm nhân nhanh
Thành phần môi trường nuôi cấy bao gồm các nhóm nguyên tố dinh dưỡng cần thiết cho sự sống của cây trồng, đó là: nguyên tốđa lượng, vi lượng, vitamin và các chất điều tiết sinh trưởng phù hợp. Trong đó, chất điều tiết sinh trưởng là hết sức quan trọng vì nó điều khiển con đường phát sinh hình thái của mô, tế bào nuôi cấy. Tuy nhiên, việc sử dụng chất điều tiết sinh trưởng đòi hỏi phải thử nghiệm rất tỉ
G
D E
C
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39 mỉ bởi nếu nồng độ quá cao sẽ kìm hãm sự sinh trưởng của mô cũng như tạo ra những biến dị không có lợi. Qua nhiều nghiên cứu, người ta thấy các dịch chiết hữu cơ lại chứa nhiều chất điều tiết sinh trưởng, ngoài ra chúng còn chứa các axít amin, vitamin, muối khoáng và các chất chống oxi hóa… Do vậy, trong nhóm các thí nghiệm nhân nhanh, chúng tôi tập trung nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và các loại dịch chiết hữu cơở các nồng độ và hàm lượng bổ sung khác nhau đến khả năng nhân nhanh của loài lan Hài P.purpuratum.
Môi trường thích hợp nhất từ thí nghiệm 2 ( ½ RE ) được sử dụng làm nền môi trường cho nhóm thí nghiệm này.
3.2.1.Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BA bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh của loài lan Hài P.purpuratum
BA (6-benzylaminopurine) là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật thuộc nhóm cytokinin, được sử dụng khá phổ biến trong môi trường nuôi cây mô nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ. Thí nghiệm 3 được thực hiện nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả
năng nhân nhanh của lan Hài P.purpuratum. Kết quả của thí nghiệm sau 12 tuần theo dõi được trình bày trong bảng 3.3.
Qua bảng 3.3 có thể thấy, tất cả các CT có bổ sung BA đều cho hệ số nhân chồi cao hơn so với CT đối chứng (không bổ sung BA). Khi tăng nồng độ BA từ 0 - 3mg/l (từ CT1 đến CT6) thì hệ số nhân chồi có xu hướng tăng dần, đạt 2,67 lần (CT 5) và cao nhất là 2,83 lần ở CT6 (3mg/l BA); đồng thời chồi mới sinh ra có màu xanh đậm, mập, chất lượng chồi tốt. Nếu tiếp tục tăng nồng độ BA vượt quá mức 3 mg/l, hệ số nhân chồi sẽ có hiện tượng giảm, chất lượng chồi sinh ra cũng xấu hơn. Cụ thể, ở CT7 bổ sung 4 mg/l BA cho chồi màu xanh nhạt, hệ số nhân chồi là 2,44 lần.
Bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy đều cho giá trị chiều cao trung bình cây thấp hơn so với đối chứng, chỉ tiêu hệ số lá/cây có xu hướng giảm nhưng không
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BA bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh loài lan Hài P.purpuratum (sau 12 tuần theo dõi)
CTTD CTTN Hệ số nhân (lần) Chiều cao TB (cm) Số lá/cây (lá) Chất lượng chồi CT1: ĐC 1,58 2,11 2,15 xanh đậm, mập CT2: ĐC + 0,5 mg/l BA 1,83 2,02 2,08 xanh đậm, mập CT3: ĐC + 1,0 mg/l BA 1,98 2,08 2,06 xanh đậm, mập CT4: ĐC + 1,5 mg/l BA 2,24 1,96 2,07 xanh đậm, mập CT5: ĐC + 2,0mg/l BA 2,67 1,87 2,02 xanh đậm, mập CT6: ĐC + 3,0 mg/l BA 2.83 1,83 2,08 xanh đậm, mập CT7: ĐC + 4,0 mg/l BA 2,44 1,64 1,94 Xanh nhạt, mập LSD 0,05 0.17 CV(%) 4.3
Ghi chú: ĐC: 1/2RE + 10 g/l đường + 0,5 g/l THT + 5,3 g/l agar + 100 ml nước dừa
Có thể thấy, CT5 (2mg/l BA) và CT6 (3mg/l BA) là hai công thức tốt nhất trong thí nghiệm 3. Cả 2 công thức đều cho chất lượng chồi tốt, CT6 cho hệ số nhân chồi cao hơn CT5, tuy nhiên sự sai khác này không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Bên cạnh đó, sử dụng CT5 (2mg/l BA) sẽ giúp hạn chế lượng BA bổ sung vào môi trường, giảm được khả năng tạo biến dị không mong muốn, đồng thời tiết kiệm kinh phí cho thí nghiệm hơn so với CT6 (3mg/l).
Như vậy, nồng độ BA có ảnh hưởng nhất định đến sự hình thành chồi lan Hài. Nồng độ BA bổ sung vào môi trường nuôi cấy có hiệu quả nhất đối với quá trình nhân nhanh của cây lan Hài P.purpuratum trong thí nghiệm 3 là 2mg/l.
3.2.2. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của Kinetin bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh loài lan Hài P.purpuratum
Cũng như BA, Kinetin (6-furfurolaminopurrine) là một chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm cytokinin, được sử dụng khá phổ biến trong nuôi cấy mô- tế bào nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41 tiến hành đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung kinetin vào môi trường nuôi đến khả
năng nhân nhanh cây lan Hài P.purpuratum. Kết quả thí nghiệm sau 12 tuần theo dõi được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của Kinetin bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh loài lan Hài P.purpuratum (sau 12 tuần theo dõi)