CTTN Hệ số nhân (lần) Chiều cao TB (cm) Số lá/cây (lá) Chất lượng chồi CT1: ĐC 1,58 2,11 2,15 xanh đậm, mập CT2: ĐC + 1,0 mg/l Ki 1,76 2,43 2,22 xanh đậm, mập CT3: ĐC + 2,0 mg/l Ki 1,95 2,54 2,26 xanh đậm, mập CT4: ĐC + 3,0 mg/l Ki 2,43 2,48 2,20 xanh đậm, mập CT5: ĐC + 4,0 mg/l Ki 2,51 2,39 2,26 xanh đậm, mập CT6: ĐC + 5,0 mg/l Ki 2,32 2,20 2,10 xanh nhạt, nhỏ LSD 0,05 0.15 CV(%) 3.9
Ghi chú: ĐC: 1/2RE + 10 g/l đường + 0,5 g/l THT + 5,3 g/l agar + 100 ml nước dừa
Kết quả bảng 3.4 cho thấy:
Giá trị hệ số nhân chồi ở các CT đều tăng lên khi bổ sung kinetin vào môi trường nuôi cấy. Khi nồng độ kinetin tăng dần từ 0 - 4 mg/l, hệ số nhân chồi từ CT1
đến CT5 cũng tăng dần và đạt cao nhất ở CT5. Khi tăng nồng độ kinetin vượt quá 4 mg/l, hệ số nhân có xu hướng giảm xuống. CT4 (3mg/l) và CT5 (4 mg/l) có hệ số
nhân cao nhất là 2,43 lần và 2,51 lần. Tuy nhiên ở mức ý nghĩa 0,05 %, sự sai khác này là không có ý nghĩa.
Xét về chỉ tiêu chiều cao trung bình, tất cả các CT có bổ sung kinetin đều cho giá trị này cao hơn so với ĐC không bổ sung kinetin. Khi nồng độ kinetin tăng dần từ 0 - 2 mg/l, chiều cao trung bình cây từ CT1 đến CT3 cũng tăng dần và đạt cao nhất là 2,54 cm (CT3). Nếu tiếp tục tăng nồng độ kinetin lên 3-6 mg/l từ CT4- CT6 thì giá trị chiều cao trung bình lại có xu hướng giảm dần.Khi bổ sung kinetin vào môi trường nuôi, chỉ tiêu số lá/ cây có sự thay đổi nhưng không đáng kể so với
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 42 CT đối chứng và các CT còn lại, chất lượng chồi tốt. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ
kinetin vượt quá 5mg/l, chất lượng chồi xấu đi.
Từ nhận xét trên ta thấy, CT4 (3mg/l Kinetin) là công thức cho hệ số nhân chồi cao nhất trong tất cả các CT ở thí nghiệm 4. Như vậy, bổ sung vào môi trường nuôi cấy 3 mg/l kinetin là lượng tốt nhất đối với quá trình nhân nhanh cây lan Hài
P.purpuratum.
3.2.3.Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của BA và α–NAA bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh loài lan Hài P.purpuratum.
Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các hệ thống nuôi cấy mô. Đối với sự phát sinh phôi, sự tạo callus và rễ cần có tỷ lệ
auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách. Theo Huang và cs (2001) thì số lượng chồi của lan Hài lai tăng gấp hai lần sau 12 tuần nuôi cấy khi môi trường có bổ sung BA và NAA.
Thí nghiệm 5 được thực hiện nhằm nghiên cứu sự ảnh hưởng của việc bổ
sung đồng thời hai chất kích thích sinh trưởng thực vật BA (thuộc nhóm cytokinin) và α–NAA (thuộc nhóm auxin) vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh lan Hài P.purpuratum. CT đối chứng là nền môi trường: ½ RE có bổ sung10 g/l
đường + 0,5 g/l than hoạt tính + 5,3 g/l agar + 100 ml nước dừa, các CT thí nghiệm còn lại có hàm lượng BA cốđịnh là 2mg/l, đồng thời bổ sung α–NAA tăng từ 0,1- 1mg/l (như bố trí thí nghiệm). Kết quả thu được sau 12 tuần theo dõi được trình bày trong bảng 3.5.
Sau 12 tuần theo dõi ta thấy, hệ số nhân chồi được tăng lên khá cao khi bổ
sung đồng thời BA và α–NAA vào môi trường. Hệ số nhân chồi tăng hơn hẳn so với CT ĐC (không có chất ĐTST), tăng từ 1,58 lần (CT ĐC) lên 2,79 lần (CT2: 2mg/l BA + 0,5 mg/l α – NAA) gấp 1,77 lần. Đặc biệt, cùng với mức BA (2mg/l), khi tăng nồng độ α – NAA lên 0,3mg/l (CT3), 0,5 mg/l (CT4) thì hệ số nhân chồi tăng dần lần lượt là 3,15 lần và 3,23 lần. Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng hàm lượng α – NAA thì hệ số nhân chồi có xu hướng giảm xuống còn 2,81 lần (CT4: 1mg/l)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của BA và α–NAA bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh loài lan Hài P.purpuratum (sau 12 tuần theo dõi)
CTTD CTTN Hệ số nhân (lần) Chiều cao TB (cm) Số lá/cây (lá) Chất lượng chồi CT1: ĐC 1,58 2,11 2,15 Xanh đậm, mập CT2: ĐC + 0,1 mg/l α–NAA 2,79 2,13 2,02 Xanh đậm, mập CT3: ĐC + 0,3 mg/l α–NAA 3,15 2,24 2,06 Xanh đậm, mập CT4: ĐC + 0,5 mg/l α–NAA 3,23 2,18 2,00 Xanh đậm, mập CT5: ĐC + 1,0 mg/l α–NAA 2,81 2,31 2,16 Xanh đậm, nhỏ LSD 0,05 0.18 CV(%) 3.7
Ghi chú: ĐC: 1/2RE +2mg/l BA + 10 g/l đường + 0,5 g/l THT + 5,3 g/l agar + 100 ml nước dừa
Khi tăng nồng độ α – NAA, chỉ tiêu chiều cao cây và hệ số lá có sự thay đổi nhưng không đáng kể so với CT đối chứng, đồng thời chất lượng chồi thấp. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ α – NAA lên 1mg/l thì chất lượng chồi xấu đi. Nguyên nhân là do nồng độα – NAA cao gây độc cho mẫu
Từ những nhận xét trên ta thấy, CT3 (2 mg/l BA + 0,3 mg/l α – NAA) và CT4 (2 mg/l BA + 0,5 mg/l α – NAA) là 2 CT tốt nhất trong thí nghiệm 5. Mặc dù CT4 có giá trị hệ số nhân cao hơn CT3, song sự sai khác này không có ý nghĩa về
mặt thống kê ở mức 0,05. Bên cạnh đó, CT3 cho chỉ tiêu chiều cao cây và số lá/cây cao hơn. Đồng thời, sử dụng CT3 sẽ giúp giảm lượng α – NAA sử dụng trong thí nghiệm, do đó làm giảm chi phí ban đầu. Hệ số nhân chồi này có phần nhỉnh hơn so với kết quả nghiên cứu của Huang và cs (2001), đồng thời tương tự với các kết quả
nghiên cứu của Martin (2003), Chen và cộng sự (2004a), Thomas và Michael (2007), Hong và cộng sự (2008) cho thấy rằng, trong nhiều trường hợp, lan Hài hình thành chồi ít hơn so với các loại hoa lan khác.
Qua 3 thí nghiệm (3-5), môi trường tốt nhất để tăng hệ số nhân chồi loài
P.purpuratum là: 1/2RE + 2 mg/l BA và 0,3 mg/l α – NAA + 10 g/l đường + 0,5 g/l THT + 5,3 g/l agar + 100 ml nước dừa, hệ số nhân chồi đạt 3,15 lần sau 12 tuần nuôi cấy.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44
Hình 3.3. Ảnh hưởng của BA và α – NAA đến khả năng nhân nhanh của loài lan Hài P.purpuratum (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.4. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của dịch cà chua bổ sung vào môi trường nuôi cấý đến khả năng nhân nhanh loài lan Hài P.purpuratum
Dịch chiết cà chua là một loại dịch chiết hữu cơ tự nhiên, thường được bổ
sung vào môi trường nuôi cấy nhằm làm tăng sự phát triển của các mô sẹo hay cơ
quan nuôi cấy. Trong cà chua có rất nhiều chất dinh dưỡng, đặc biệt là các vitamin và các chất hữu cơ. Thí nghiệm 6 được thực hiện để nghiên cứu sự ảnh hưởng của dịch chiết cà chua bổ sung vào môi trường nhân nhanh đến hệ số nhân cây lan Hài
P.purpuratum. Cà chua được gọt vỏ, bỏ hết hạt, chỉ lấy phần thịt quả, sau đó tiến hành thí nghiệm ở các nồng độ khác nhau. Kết quả thu được sau 12 tuần theo dõi
được thể hiện ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của dịch cà chua bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh loài lan Hài P.purpuratum (sau 12 tuần theo dõi)
CTTD CTTN Tỷ lệ mẫu sống (%) Hệ số nhân (lần) Chiều cao TB (cm) Số lá/cây (lá) CT1: ĐC 91 1,43 1,98 2,00 CT2: ĐC+50 g/l cà chua 80 1,79 1,78 1,84 CT3: ĐC+100 g/l cà chua 71 1,53 1,67 1,77 CT4: ĐC+150 g/l cà chua 67 1,23 1,52 1,63 CT5: ĐC+200 g/l cà chua 62 1,11 1,34 1,45 LSD 0,05 0.11 CV(%) 4.1
Ghi chú: ĐC: 1/2RE + 10 g/l đường + 0,5 g/l THT + 5,3 g/l agar +100 ml nước dừa
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45 Từ kết quả bảng trên ta thấy:
Bổ sung dịch chiết cà chua vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng không tốt
đến sự sinh trưởng và khả năng nhân nhanh chồi của lan Hài P.purpuratum. Tất cả
các CT có bổ sung dịch chiết cà chua đều có tỷ lệ mẫu sống thấp hơn so với CT ĐC không bổ sung dịch chiết cà chua. Tỷ lệ mẫu sống có xu hướng giảm mạnh khi tăng lượng dịch chiết cà chua trong môi trường nuôi cấy. CT ĐC có tỷ lệ mẫu sống cao nhất là 91%, khi tăng lượng dịch chiết lên 200g/l (CT5), tỷ lệ mẫu sống chỉ còn 62%.
Cùng với việc giảm tỷ lệ mẫu sống, chiều cao trung bình, số lá/cây cũng đều có xu hướng giảm dần, chất lượng chồi cũng xấu đi khi tăng hàm lượng dịch chiết cà chua cao nhất là 1,98cm và 2,00 lá/cây, khi tăng hàm lượng dịch chiết cà chua lên 200g/l ở CT5 thì các chỉ tiêu này giảm mạnh lần lượt là 1,34 cm và 1,45 lá/cây.
Khi bổ sung thêm 50g/l dịch chiết cà chua vào môi trường nuôi cây ở CT2 thì hệ số nhân tăng từ 1,43 lần lên 1,79 lần. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng hàm lượng dịch chiết cà chua từ 100 - 200g/l (từ CT4-CT6) thì hệ số nhân có xu hướng giảm mạnh, thấp nhất là 1,11 lần (CT6); đồng thời chất lượng chồi cũng xấu đi. Có thể dịch chiết cà chua khi bổ sung vào môi trường đã sinh một hợp chất nào đó không thích hợp cho loài lan Hài P.purpuratum sinh trưởng và nhân nhanh chồi.
Như vậy, không nên bổ sung dịch chiết cà chua vào môi trường nuôi cấy nhân nhanh loài lan Hài P.purpuratum.
3.2.5. Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của dịch chiết chuối bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh của loài lan Hài P.purpuratum
Theo Van Staden và cs (1975), dịch chuối chứa nhiều thành phần dinh dưỡng quan trọng về mặt sinh lý là serotonin, norepinephrine cùng với dopamine và một số
catechomaline chưa xác định. Việc bổ sung dịch nghiền chuối vào môi trường nuôi cấy hoa lan thường kích thích sự sinh trưởng bởi nó có tác dụng ổn định pH môi trường và chứa hợp chất có hoạt tính cytokinin tự nhiên.
Với thành phần dinh dưỡng như vậy, liệu việc bổ sung dịch chuối vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và hệ số nhân của cây lan Hài P.purpuratum hay không? Thí nghiệm 7 được thực hiện nhằm mục đích trả lời cho câu hỏi đó. Kết quả theo dõi sau 12 tuần được trình bày trong bảng 3.7
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 46
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của dịch chuối bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh loài lan Hài P.purpuratum (sau 12 tuần theo dõi)
CTTD CTTN Hệ số nhân (lần) Chiều cao TB (cm) Số lá/cây (lá) CT1: ĐC 1,43 1,98 2,00 CT2: ĐC+50 g/l chuối 1,61 2,18 2,32 CT3: ĐC+100 g/l chuối 2,05 2,24 2,35 CT4: ĐC+150 g/l chuối 1,96 2,19 2,31 CT5: ĐC+200 g/l chuối 1,94 2,22 2,33 LSD 0,05 0.14 CV(%) 4.4
Ghi chú: ĐC: ½ RE +10 g/l đường + 0.5 g/l THT +5.3 g/l agar+100 ml nước dừa
Kết quả thí nghiệm trên cho thấy, việc bổ sung dịch chuối vào môi trường nuôi cấy có hiệu quả tác động đến khả năng nhân nhanh của chồi lan Hài
P.purpuratum. Ở CT đối chứng (không bổ sung dịch chuối) cho hệ số nhân chồi là 1,43. Khi tăng lượng dịch chuối từ 0 - 100 g/l (CT2 và CT3) thì hệ số nhân chồi tăng. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng lượng dịch chuối vượt quá mức 100 g/l (150 g/l ở
CT4 và 200 g/l ở CT5) thì hệ số nhân sẽ bị giảm đi. Có thể nhận thấy, CT3 cho tỷ lệ
tạo chồi cao nhất với hệ số nhân chồi là 2,05 lần. Tuy nhiên, hệ số nhân chồi này là rất thấp so với kết quả hệ số nhân chồi lan Hài Hằng tới 4,3 lần khi bổ sung 100g/l dịch chiết chuối vào môi trường nuôi cấy (Hoàng Thị Giang và cs., 2010).
Từ bảng 3.7 có thể thấy, bổ sung dịch chiết chuối có hiệu quả làm tăng chiều cao trung bình và hệ số lá/cây. Khi tăng hàm lượng dịch chuối từ 0g/l (ĐC) lên 50g/l (CT1) thì chiều cao trung bình cây tăng từ 1,98cm lên 2,18 cm và hệ số lá/cây tăng từ 2 lá/cây lên 2,32 lá/cây. Tuy nhiên, khi bổ sung lượng dịch chuối trên 50g/l thì hai chỉ tiêu này gần như không được cải thiện.
Như vậy, không nhất thiết bổ sung dịch chuối vào môi trường nuôi cấy để (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 47
3.2.6. Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của dịch chuối và khoai tây bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh của loài lan Hài P.purpuratum
Dịch khoai tây là một loại dịch chiết hữu cơ tự nhiên thường được sử dụng trong môi trường nhân nhanh một số loài Lan (lan HồĐiệp, lan Tai Trâu…). Thành phần dinh dưỡng của khoai tây: Nước: 75%; Gluxit: 21%; Protein: 2%; Cenluloza: 1%; Năng lượng: 92% Kcal/100g; Canxi: 10 mg%; Photpho: 50 mg%; Sắt: 1.2 mg%; Vitamin C: 15 mg% (Theo bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm Việt Nam 2000). Ảnh hưởng của dịch chuối và dịch khoai tây bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến hệ số nhân cây lan Hài P.purpuratumđược trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của dịch chuối và khoai tây bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh của lan Hài P.purpuratum
(sau 12 tuần theo dõi)
CTTD CTTN Hệ số nhân (lần) Chiều cao TB (cm) Số lá/cây (lá) CT1: ĐC 1,43 1,98 2,00 CT2: ĐC+50g/lCT+50g/lKT 1,78 2,34 2,45 CT3: ĐC+50g/lCT+100g/lKT 1,83 2,38 2,51 CT4: ĐC+100g/lCT+50g/lKT 2,54 2,41 2,60 CT5: ĐC+100g/lCT+100g/lKT 2,47 2,46 2,64 LSD 0,05 0.14 CV(%) 3.9
Ghi chú:+ CT: Chuối tiêu, KT: Khoai tây
+ ĐC: ½ RE +10 g/l đường+0,5 g/l THT+5,3 g/l agar+100 ml nước dừa
Xét về chỉ tiêu hệ số nhân chồi, có thể thấy rằng tất cả các CT có bổ sung thêm dịch chuối và dịch khoai tây đều cho hệ số nhân cao hơn so với CT đối chứng (không bổ sung dịch chuối và dịch khoai tây). Khi tăng hàm lượng chuối và khoai tây thì hệ số nhân tăng dần, ở CT4(100 g/l chuối + 50 g/l khoai tây) cho hệ số nhân
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 48 cao nhất và khác biệt khá rõ rệt so với ĐC và các CT2, CT3 (2,54 lần). Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng hàm lượng chuối và khoai tây lên CT5 (100 g/l chuối + 50 g/l khoai tây) thì hệ số nhân giảm xuống, mặc dù chỉ tiêu chiều cao cây và số lá/cây có cao hơn nhưng không đáng kể.
Nhận thấy, trong số các công thức nghiên cứu của chúng tôi, CT4 ( nền môi trường ½ RE +10 g/l đường+0,5 g/l THT+5,3 g/l agar+100 ml nước dừa +100g/l chuối tiêu và 50g/l khoai tây là công thức hơn hẳn các công thức khác về hệ số nhân chồi và các chỉ tiêu sinh trưởng. So sánh với kết quả nghiên cứu Nguyễn Thị Sơn và cs (2012) khi nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan Hoàng Thảo, việc bổ sung dịch chiết khoai tây vào môi trường nuôi với hàm lượng 60g/l cho hiệu quả nhân giống khá cao (hệ số nhân đạt 4,83 lần sau 8 tuần theo dõi) thì hệ số này là khá thấp. Qua 3 thí nghiệm (6 - 8), chúng tôi thấy khi bổ sung các dịch chiết hữu cơ
vào môi trường nuôi cấy cho hệ số nhân chồi không cao như các loài lan khác mà còn làm giảm khả năng sống của các mẫu cấy. Có thể các dịch chiết hữu cơ khi bổ
sung vào môi trường đã sinh một hợp chất nào đó không thích hợp cho loài lan Hài
P.purpuratum tăng hệ số nhân hệ số nhân chồi. Do vậy không nhất thiết bổ sung các dịch chiết hữu cơ vào môi nuôi cấy để tăng hệ số nhân chồi lan Hài P.purpuratum.
3.2.7. Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng, phát triển của chồi cây lan Hài P.purpuratum
Trong nhân giống nhờ nuôi cấy mô thì nền môi trường nuôi cấy có vai trò
đặc biệt quan trọng bởi chúng cung cấp các nguyên tố khoáng đa, vi lượng và các chất hữu cơ cho các mẫu cấy. Nền môi trường nuôi cấy có liên quan rất chặt đến sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy in vitro. Theo nhiều tác giả thì môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hóa tế bào và cơ
quan trong nuôi cấy. Nhiều nền môi trường cơ bản được dùng trong nuôi cấy mô,