MỞ ĐẦU………………………………………………………………… PHẦN I: TỔNG QUAN………………………………………………... 1.1. Đặc điểm thực vật và tình hình nghiên cứu cây Bách sao (Myoporum Bontoides A. Gray )………………………………… 1.1.1. Đặc điểm thực vật………………………………………… 1.1.2. Tình hình nghiên cứu cây Bách sao……………………… 1.2. Vài nét về terpen và phân loại của chúng……………………… 1.2.1. Các monoterpen mạch hở………………………………… 1.2.2. Các monoterpen mạch vòng……………………………… 1.2.3. Monoterpen khung iridoid và hoạt tính sinh học của chúng………………………………………………………. PHẦN II: TÌM HIỂU MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN…………………………………………... 2.1. Các phương pháp chiết………………………………………….. 2.1.1. Các phương pháp chiết thông thường…………………… 2.2.2. Các phương pháp chiết khác…………………………….. 2.2. Các phương pháp sắc ký phân lập chất……………………….. 2.2.1 Sắc ký cột………………………………………………….. 2.2.2 Sắc ký bản mỏng………………………………………….. 2.2.3 Sắc ký lỏng cao áp………………………………………… 2.3 Các phương pháp phổ phân tích cấu trúc……………………… 2.3.1 Phổ hồng ngoại (IR)………………………………………. 2.3.2 Phối khối lượng (MS)…………………………………….. 2.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)……………………. 2.3.3.1 Phổ cộng hưởng từ proton ( 1 H NMR)………….. 2.3.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 13 CNRM)…………. 2.3.3.3 Một số phổ 2D NMR……………………………… KẾT LUẬN……………………………………………………………... TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………
Trang 1MỤC LỤC
MỞ ĐẦU………
PHẦN I: TỔNG QUAN………
1.1 Đặc điểm thực vật và tình hình nghiên cứu cây Bách sao (Myoporum Bontoides A Gray )………
1.1.1 Đặc điểm thực vật………
1.1.2 Tình hình nghiên cứu cây Bách sao………
1.2 Vài nét về terpen và phân loại của chúng………
1.2.1 Các monoterpen mạch hở………
1.2.2 Các monoterpen mạch vòng………
1.2.3 Monoterpen khung iridoid và hoạt tính sinh học của chúng……….
PHẦN II: TÌM HIỂU MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN………
2.1 Các phương pháp chiết………
2.1.1 Các phương pháp chiết thông thường………
2.2.2 Các phương pháp chiết khác………
2.2 Các phương pháp sắc ký phân lập chất………
2.2.1 Sắc ký cột………
2.2.2 Sắc ký bản mỏng………
2.2.3 Sắc ký lỏng cao áp………
2.3 Các phương pháp phổ phân tích cấu trúc………
2.3.1 Phổ hồng ngoại (IR)……….
2.3.2 Phối khối lượng (MS)………
2.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)……….
2.3.3.1 Phổ cộng hưởng từ proton ( 1 H- NMR)…………
2.3.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 13 C-NRM)………….
2.3.3.3 Một số phổ 2D- NMR………
KẾT LUẬN………
TÀI LIỆU THAM KHẢO………
2 4
4 4 5 9 10 10 10
13 13 13 13 15 15 15 16 16 16 17 18 18 18 19 20 21
Trang 2Các hợp chất thiên nhiên, đặc biệt là các hợp chất có tính sinh học đóng vai
trò quan trọng trong đời sống con người Chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa
bệnh, các chất bảo vệ thực vật, nguyên liệu cho ngành công nghiệp, thực phẩm…
Theo trung tâm dữ liệu thực vật Quốc gia, thực vật rừng ngập mặn nước ta
có khoảng 47 họ với hơn 100 loài phân bố theo từng khu vực Có khoảng 21 loài
trong số này có giá trị làm dược liệu trong nhiều bài thuốc nam đã được nhân dân
sử dụng, nhất là trong thời kỳ chiến tranh, để chữa các bệnh như viêm nhiễm, sốt
rét, u nhọt,… Tuy nhiên, các nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học từ thực
vật rừng ngập mặn ở nước ta còn rất hạn chế
Ở Việt Nam họ Bách sao (Myoporaceae) chỉ có một loài đó là cây Bách sao
(Myoporum bontoides A Gray) thuộc chi Myoporum Cây mọc ở vùng ngập mặn
ven biển hoặc cửa sông từ Bắc vào Nam, nhiều nhất là ở khu vực phía Đông Bắc
Dân gian thường sử dụng loài cây này để trị viêm nhiễm ngoài da, đau họng, đau
mắt và tai
Trong những năm gần đây đã có một số công trình trên thế giới nghiên cứu
về thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây Bách sao (Myoporum
bontoides A Gray) mọc ở ven biển Trung Quốc, Nhật bản Tuy nhiên ở Việt Nam
chưa có một công trình nào nghiên cứu về loài cây này Do vậy em lựa chọn đề
tài: Nghiên cứu tổng quan về cây Bách sao (Myoporum bontoides A Gray) ở
Việt Nam và tìm hiểu một số phương pháp nghiên cứu hóa học các hợp chất
thiên nhiên Nhằm tìm hiểu tình hình nghiên cứu trong nước cũng như trên thế
giới về loài cây này, góp phần làm cơ sở định hướng cho việc nghiên cứu thực
nghiệm trong thời gian tới về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây
Bách Sao
PHẦN I: TỔNG QUAN
Trang 31.1 Đặc điểm thực vật và tình hình nghiên cứu cây Bách sao (Myoporum
Bontoides A Gray )
1.1.1 Đặc điểm thực vật
Theo Trung tâm Dữ liệu Thực vật Quốc gia, họ Bách sao (Myoporaceae)
trên thế giới gồm có 5 chi và 180 loài, phân bố ở các nước nhiệt đới Ở Việt Nam
chỉ có 1 chi và một loài đó là cây Bách sao (Myoporum Bontoides A Gray.) thuộc
chi Myoporum.
Cây bách sao là một cây bụi, phát triển trên các dòng thủy triều cửa biển,
thích ứng với muối cát và môi trường đá và cũng phát triển bình thường trong vùng
cửa sông và không muối đất Nó được trồng dọc theo bờ biển để phủ xanh môi
trường, bảo vệ chống lại gió và thủy triều và cố định cát, cao khoảng 1 m, chi
nhánh vòng, với những vết sẹo lá sưng lên Nhánh non hơi dẹp, dày dày, không
lông, bìa nguyên hay có hàm răng, gân phụ không rõ, cuống dài 1,5 cm Hoa 1-3 ở
nách lá, cọng dài 2,5 cm, đài cao 4mm, răng tam giác, không lông, vành hình quặn,
tía, ống dài, có lông mịn, tai 1× 0,5cm , tiểu nhụy 4, noẵn 6-8 buồng, 1 noẵn treo
Quả nhân cứng có từ 6-8 nhân, 1 hột nhỏ, có phôi nhũ [1].
Cây phân bố ở Nam Nhật Bản, Đài Loan, Trung đến miền Nam Trung Quốc
Ở Việt Nam thường xuyên được ghi lại trong rừng ngập mặn, đặc biệt được tìm
thấy trong rừng ngập mặn của khu vực phía đông bắc ( vịnh Hạ Long )
Ở Trung Quốc, nước sắc của cây Bách sao được sử dụng trong y học dân
gian để chữa một số bệnh ngoài da, sốt, thần kinh,… Hợp chất (R)-myoporon, một
furanosesquiterpen, thành phần chính trong tinh dầu của cây Bách sao thể hiện
hoạt tính chống lại loài sâu tơ Plutella xylostella, đây là loại sâu bướm phá hoại
các loài rau họ cải và có tính kháng thuốc cao [2].
Trang 4Một số nơi còn sử dụng loài cây này để điều trị vết thương nhỏ trên da và
tổn thương nhiễm thứ cấp, ngoài ra người ta con sử dụng cây này để trị đau họng,
đau mắt và tai
Hình 1: Cây Bách Sao (Myoporum Bontoides A.Gray)
Trong những năm gần đây, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây
Bách sao đã bắt đầu được nghiên cứu trên thế giới
Năm 2008, Moe Kanemoto và cộng sự đã phân lập được mười sáu hợp chất
từ dịch chiết metanol của lá cây Bách sao, trong đó có 5 hợp chất mới, đó là hai
dẫn xuất clo có khung iridoid là myopochlorin (1) và myobontioside A (2), một
iridoid glucoside là myobontioside B (3), một acetogenin glucoside là
myobontioside C (4), và một acyclic monoterpen glucoside là myobontiosides D
(5) Mười một dẫn xuất đã biết là decaffeoylverbascoside (6), cimidahurine (7) ,
verbascoside (8) , isoverbascoside (9), và oxoverbascosid , hai phenylpropanoids ,
Trang 5meliotoside và axit ferulic β-D-glucopyranosyl, và bốn glucosides flavonoid,
chrysoeriol (13) [2].
OCH 3
OH
O
O
O
OH
OH OH
O
O
OH OH
H
O OH
3
O Glc
O
O 4
OH
OH
OH
O O
OH
OH
OH O
O
OH
OH
OH O
OH OH
OH OH
6 7
Trang 6OH
O O
OH O
O OH
OH
OH
OH OH
HO OH
O
O O
OH
OH O O OH
OH OH
OH
8 9
OH
O
OH
HO
O
OH
O
OH HO
O
OH
10 11
OH
O
OH HO
O
OCH 3
PCH3
OH
O
OH
HO
O
O
CH3
12 13
Năm 2008, Deng Yecheng và cộng sự đã nghiên cứu khả năng ức chế chống
lại các loại nấm gây bệnh từ dịch chiết metanol của cây Bách sao, kết quả cho thấy
các chất chiết xuất từ thân và lá của cây bách sao được dùng làm chất ức chế hoạt
động chống lại bảy loại nấm Chất có hoạt tính cao được xác định là epingaione
(14), chất này có khả năng ức chế lại bảy loại nấm nếu trên [3].
Trang 7O
H
O
O Me
14
Năm 2011, Huang Li-Lan và công sự đã phân lập được một dẫn xuất của
flavanonol là (2R, 3R) -3,5,7-trihydroxyflavanon-3-axetat (15) Cấu trúc của chất
này được xác định nhờ các phương pháp phổ MS, NMR và X-ray đơn tinh thể
Đây là hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ cây Bách sao Hợp chất này thể hiện
yg/mL Đây là loại nấm gây bệnh đạo ôn ở cây lúa, căn bệnh này diễn ra ở 85 quốc
gia trên toàn thế giới, mỗi năm người ta ước tính bệnh này đã tiêu diệt lượng lúa đủ
để nuôi hơn 60 triệu người [4].
O OH
15
Trong những năm gần đây, Cây Bách Sao (Myoporum bontoides A.Gray) đã
được nghiên cứu trên thế giới Ở Việt Nam cho đến nay vẫn chưa có một công
trình nào nghiên cứu về hóa sinh học của cây này, vì vậy phần tổng quan này sẽ
làm cơ sở tiền đề cho các nghiên cứu về hóa sinh học của Cây Bách Sao trong thời
gian tới
1.2 Vài nét về terpen và phân loại
Tecpen có nguồn gốc từ các đơn vị isopren, có công thức phân tử
lượng các đơn vị isopren liên kết Đây được gọi là quy tắc Isopren hoặc quy tắc
Trang 8C5 Các đơn vị isopren có thể được liên kết với nhau để hình thành các chuỗi mạch
hở hoặc có thể được sắp xếp để tạo thành vòng [5].
Tecpen có thể được phân loại theo số lượng đơn vị isoprene trong phân tử :
tecpineol
isopren
1.2.1 Một số monoterpen mạch hở
Geraniol (16) có trong tinh dầu hoa hồng Xitroneol (17) có trong tinh dầu
xả Các hợp chất này đều có mùi thơm đặc trưng, là những đơn hương quý dùng
Trang 9
CH3
OH
CH3 CH3 16 CH3 CH3
CH2OH
CH 3 H
17
1.2.2 Một số monoterpen mạch vòng
Mentol (18 ) có trong tinh dầu bạc hà, không những được đưa vào kẹo bánh,
kem đánh răng,…mà còn dùng làm thuốc chữa bệnh Cis-terpin-1,8 (19) được
dùng làm thuốc ho ( long đàm, giảm tiết đàm ) Cineol-1,8 (20) được điều chế từ
cis-terpin-1,8 có ứng dụng sát trùng và trị ho
OH
OH
OH
O
18 19 20 1.2.3 Monoterpen khung iridoid và hoạt tính sinh học của chúng
Monoterpen khung iridoid là monoterpen dạng 2 vòng ghép bao gồm một
là Iridomyrmecin (21).
Trang 10Các Iridoid được khoa học chứng minh có khả năng loại bỏ các gốc tự do có
hại, kiểm soát lượng cholesterol, tăng cường năng lượng, bảo vệ tim mạch, tăng
cường hệ thống miễn dịch,giảm viêm nhiễm, chống đột biến tế bào, và giúp não bộ
hoạt động khỏe hơn Các Iridoid được sinh ra từ thực vật như một cơ chế phòng vệ
chống nhiễm trùng và các mối đe dọa khác Đây là nhóm chất được tìm thấy từ rất
nhiều loài thực vật dùng làm thuốc Trong thiên nhiên nhóm chất này thường tồn
tại ở dạng iridoid glucoside
Một số các chất iridoid glucoside có hoạt tính mạnh như: aucubin (22),
catalpol (23).
Aucubin là một hợp chất iridoid glucoside, trong đó thành phần iridoid gồm
kết O-glucozit
Catalpo là một iridoid glucoside Sản phẩm tự nhiên này nằm trong các lớp
học của iridoid glycosid , mà chỉ đơn giản là monoterpene với một đường phân tử
đính kèm Mặc dù hoạt tính của catalpol cũng như nhiều Iridoids khác đã không
được thiết lập đầy đủ, có bằng chứng là chức năng chính của họ là để kích thích
sản xuất vỏ thượng thận nội tiết tố , làm tăng sản xuất hormone giới tính Catalpol
cũng trưng bày chống viêm hoạt động và có thể làm tăng sản xuất nội tiết tố
androgen sinh ra bởi các tuyến thượng thận, có thể dẫn đến sự gia tăng khối lượng
22 23
Trang 11PHẦN II: TÌM HIỂU MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HỢP
CHẤT THIÊN NHIÊN
2.1 Các phương pháp chiết, tách và phân lập hợp chất từ thực vật
2.1.1 Các phương pháp chiết tách thông thường
Chiết là quá trình lôi kéo các hợp chất từ pha này sang pha khác Tùy vào
đặc tính của các pha chiết và các kĩ thuật hỗ trợ, người ta có thể phân loại thành
nhiều hình thức chiết khác nhau
Các hình thức chiết khác nhau như:
1 Chiết lỏng - lỏng (LLE) là quá trình chiết mà cả hai pha đều là chất lỏng
không trộn lẫn.Thông thường là một dung môi phân cực (nước) và một dung môi
kém phân cực hơn ( hữu cơ)
2 Chiết lỏng- rắn: là việc hấp thụ các chất trong dung dịch vào bề mặt của các
chất hấp phụ, sau đó sử dụng các dung môi thích hợp hoặc nhiệt độ để giải hấp các
chất đó đưa vào thiết bị phân tích
3 Vi chiết pha rắn(SPE): Trong chiết pha rắn, việc lựa chọn vật liệu hấp phụ là
quan trọng để đạt được hiệu quả lôi kéo các hợp chất hữu cơ từ pha lỏng tốt nhất
*Chất hấp thụ phân cực: Sử dụng các chất hấp thụ phân cực để tách các chất
phân tích hòa tan trong dung môi không phân cực Chất hấp thụ phân cực phổ biến
2.1.2 Các phương pháp tách, chiết khác
a Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm
Trong quá trình chiết xuất, đôi khi sóng siêu âm cũng được sử dụng để tăng
hiệu quả chiết Sóng siêu âm với tần số 20 KHz thường được sử dụng Sóng siêu
âm có tác dụng làm tăng sự hòa tan của chất tan vào dung môi và tăng quá trình
Trang 12khếch tán của chất tan Sóng siêu âm cường độ cao cũng có thể phá vỡ cấu trúc tế
bào, thúc đẩy quá trình chiết Chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm thường được sử
dụng trong chuẩn bị mẫu phân tích thay cho phương pháp ngâm lạnh hay chiết
Soxhlet cổ điển Khi đó, người ta nhúng bình chiết vào một bể siêu âm có chứa
nước, sóng siêu âm phát ra từ các đầu phát sẽ truyền qua môi trường nước và đi
vào hỗn hợp chiết
b Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng
Khi chiếu bức xạ điện từ ở tần số 2450MHz (bức xạ trong vi sóng của dải
sóng điện từ) vào môi trường các chất phân cực, các phân tử sẽ chịu đồng thời của
hai tác động: sự dẫn truyền ion và sự quay lưỡng cực dưới tác dụng của lực điện
trường.cả hai tác động này sẽ làm sinh ra nhiệt trong lòng khối vật chất làm cho
việc gia nhiệt nhanh và hiệu quả hơn rất nhiều so với phương pháp dẫn nhiệt
truyền thống Trong chiết xuất , trong chiếu xạ vi song vào môi trường có chứa các
tiêu phân dược liệu vào dung môi phân cực, các phân tử dung môi và các chất phân
cực sẽ dao động và nóng lên nhanh chóng làm tăng khả năng hòa tan các chất vào
dung môi Thêm vào đó vi song cũng làm phá hủy cấu trúc vách tế bào thực vật
làm các chất tan giải phóng trực tiếp vào dung môi chiết làm cho quá trình chiết
chuyể thành hòa tan đơn giản Điều này làm cho việc chiết xuất nhanh hơn nhưng
cũng làm dịch chiết nhiều tạp chất hơn
c Chiết siêu giới hạn
Nguyên tắc của phương pháp này như sau: Trong điều kiện áp suất binh
thường khi nâng nhiệt độ một chất lỏng tới điểm sôi của nó, chất lỏng sẽ hóa hơi
Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ và đồng thời tăng áp suất của hệ lên quá một
nhiệt độ và áp xuất nhất định nào đó, người ta sẽ thu được một “chất lỏng” gọi là
chất lỏng quá tới hạn Chất lỏng này không giống với chất lỏng trạng thái thông
thường mà mang cả đặc tính của chat khí và chất lỏng nên có khả năng hòa tan các
Trang 13chất đồng thời có độ nhớt thấp và khả năng khếch tán cao có thể dung để hòa tan
các chất và ứng dụng vào trong chiết xuất các chất dược liệu
d Chiết dưới áp suất cao
Khả năng hòa tan của các chất trong dung môi phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ
Vì vậy trong chiết xuất người ta thường tăng nhiệt độ để giảm lượng dung môi và
thời gian chiết Tuy nhiên việc tăng nhiệt dộ để chiết có giới hạn của nó là nhiệt độ
sôi của dung môi Khi hóa hơi dung môi không còn khả năng hòa tan các chất nữa
Để khác phục điều này, người ta tiến hành chiết ở áp suất cao dựa vào nguyên tắc :
năng hòa tan của dung môi lên gấp rưỡi Trong quá trình chiết dưới áp suất, dung
môi chiết được đưa tới nhiệt độ và áp suất gần với vùng giới hạn
2.2 Các phương pháp sắc ký phân lập chất
2.2.1 Sắc ký cột
Sắc ký cột là phương pháp sắc ký mà pha tĩnh được nhồi trong một cột hình
trụ hở 2 đầu hoặc được tráng trong long của một mao quản có đường kính rất hẹp
Tùy theo tính chất và lượng chất lượng mẫu mà người ta chọn pha tĩnh phù hợp với
loại chất Chất hấp phụ có thể là chất phân cực hoặc chất không phân cực Pha tĩnh
được nhồi vào cột theo phương pháp nhồi khô hoặc nhồi ướt Thông thường người
ta hòa tan hỗn hợp chất nghiên cứu vào một dung môi ( pha động) với lượng vừa
đủ rồi nạp lên cột theo cách phù hợp sao cho chất nghiên cứu lan thành một lớp
phẳng lên cột, sau đó tiến hành sắc ký
2.2.2 Sắc ký bản mỏng
Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha
động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách Phương
pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường
là sicagel , aluminium oxit hoặc xenlulozơ được phủ trên một mặt phẳng chất trơ
Trang 14Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích
hợp và được hút lên bản sắc kí bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên
tính phân cựccủa các thành phần trong dung dịch Trong quá trình di chuyển qua
lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo
hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ
trên lớp mỏng Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi
ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào
tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động
2.2.3 Sắc ký lỏng cao áp
Trong sắc ký lỏng cao áp (HPLC), để tăng hiệu năng tách của cột sắc ký,
người ta thường sử dụng chất nhồi cột với đường ksinh rất nhỏ , thường dưới 10ym
thước của hạt rất nhỏ, để dung môi có thể chảy qua với dòng tối ưu người ta phải
dùng bơm để nén với áp suất cao (có thể tới 400 atm) để đẩy dòng dung môi qua
cột
2.3 Các phương pháp phổ phân tích cấu trúc [6]
2.3.1 Phổ hồng ngoại (IR)
động các phân tử khác nhau sẽ hấp phụ những vùng bức xạ khác nhau Các dao
động của các nhóm được phân ra thành loại dao động hóa trị và dao động biến
dạng , và 2 loại dao động này được phân thành nhiều kiểu dao động khác nhau
- Dao động hóa trị là những dao động làm thay đổi chiều dài liên kết nhưng
không làm thay đổi góc liên kết của các nguyên tử trong phân tử, bao gồm
dao động hóa trị đối xứng và dao động bất hóa trị đối xứng