Ly thuyet sac ky (seminar)

• Trong hóa học phân tích, vấn đề định lượng chất trong đối tượng phức tạp là một công việc khó khăn mà các phương pháp định lượng trực tiếp không thực hiện được, nguyên nhân là do:- Ảnh

SEMINAR

PHÂN TÍCH SẮC KÝ -

ThS GVC NGUYỄN THỊ HUỆ Khoa Hóa Học - ĐHKHHuế

• Trong hóa học phân tích, vấn đề định lượng chất trong đối tượng phức tạp là một công việc khó khăn mà các phương pháp định lượng trực tiếp không thực hiện được, nguyên nhân là do:

- Ảnh hưởng của yếu tố nền

- Các chất cần phân tích rất giống nhau

- Nồng độ các chất cần phân tích rất thấp

• Phương pháp phân tích sắc ký có thể phân tích được các đối tượng phức tạp này vì nó có thể:

- Tách các chất rất giống nhau ra khỏi nhau

- Định lượng các chất.

Tách TBVTV ra khỏi môi trường của nó bằng phương

pháp chiết

Tách loại các chất có độ phân cực tương tự TBVTV đó

Chuyển môi trường và làm giàu TBVTV đến nồng độ phù

hợp

Phân tích để xác định hàm lượng TBVTV có trong mẫu.

VÍ DỤ: PHÂN TÍCH MỘT LOẠI THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT (TBVTV) trong đối tượng rau quả Phải đi theo các bước

sau đây:

CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

1. Lịch sử phát triển

• Phương pháp sắc ký được phát hiện vào năm 1903 do nhà thực vật học người Nga Michael C Txvet khi ông tách các chất trong diệp lục tố, thí nghiệm được tiến hành như sau:

• Năm 1931, Vinterstin và Lederer đã dùng phương pháp của Txvet để tách các Carotine và nhận thấy giá trị

của phương pháp trong kỹ thuật điều chế

• Năm 1941, Martin và Synge đã phát triển sắc ký phân bố trên giấy và đưa ra thuyết đĩa để giải thích các quá

trình sắc ký

• Năm 1952, những máy sắc ký khí mới ra đời tỏ ra có ưu thế do hiệu quả tách rất cao Cột mao quản và các detector được cải tiến, làm tăng độ phân giải và độ nhạy của phương pháp ⇒ phân tích đươc các chất có hàm lượng nhỏ cỡ ppm và ppb ⇒ phát triển phương pháp nhanh và ứng dụng nhiều trong thực tế.

• Năm 1970, Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời, vật liệu nhồi cột được cải tiến, computer và các thiết bị phụ trợ được đưa vào ⇒ tăng cường khả năng tách của phương pháp.

• Các kỹ thuật ghép nối giữa sắc ký và các phương pháp khác như:

Sắc ký - Khối phổ ( GC-MS, LC- MS), sắc ký và cộng hưởng từ hạt nhân, sắc ký

đa chiều, sắc ký điện di mao quản (CEC)…

Phương pháp có độ chính xác, độ nhạy cao, phân tích được nhiều đối tượng phức tạp.

2 BẢN CHẤT CỦA PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

Sắc ký là quá trình tách động dựa trên sự phân chia các cấu tử chất phân tích lên 2 pha - pha tĩnh là pha đứng yên có khả năng hấp thu chất phân tích, pha động là pha chuyển dịch dọc theo pha tĩnh – trong quá trình pha động chuyển dịch dọc theo pha tĩnh Do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

Lực tương tác giữa pha tĩnh và cấu tử chất phân tích thường là: Lực phân bố, hấp phụ, lực ion, lực rây phân tử

Quá trình sắc ký khác cơ bản với các quá trình tách khác ở 2 điểm:

- Sự phân bố chất phân tích lên 02 pha lặp đi lặp lại nhiều lần (hàng ngàn lần, hàng triệu lần)

- Pha động đi qua pha tĩnh.

Hình 1 Hình vẽ minh họa sự phân tách 2 cấu tử A, B

trong mẫu phân tích trong cột sắc ký.

• Hợp chất có ái lực nhiều với pha động thì có xu hướng ra khỏi cột trước.

• Hợp chất có ái lực nhiều với pha tĩnh bị giữ lại lâu hơn trong cột và ra sau

Pha động

C B

Hình 2 Mô hình tách chiết 3 cấu tử bằng

phương pháp sắc ký

A

tRC tRB tRA VRC VRB VRA

4 CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG DÙNG TRONG SẮC KÝ

4.1 TỐC ĐỘ CỦA CẤU TỬ A (uA)

● Khi pha động chứa một cấu tử cần phân tích A nào đó đi qua cột chứa pha tĩnh thì chất phân tích tự phân bố giữa 2 pha theo hệ số phân

bố:

A(đ) ↔ A(t)

KD = (1)

[A]t là nồng độ của A trong pha tĩnh ở thời điểm này trong cột

[A]đ là nồng độ của A trong pha động.

● Cấu tử A có thể di chuyển qua cột chỉ khi nó ở trong pha động.

● Nếu KD rất lớn, A lưu lại lâu trên pha tĩnh và đi ra khỏi cột rất chậm.

● Để xem chất phân tích sẽ ra nhanh như thế nào, chúng ta cần biết chất phân tích trong pha động đang ở phần thời gian nào Phần thời gian này có nghĩa là phần chất phân tích A trong pha động ở thời điểm bất kỳ nào đó.

f = Phần thời gian của chất A trong pha động =

tRC tRB tRA VRC VRB VRA

● Chất phân tích A đi ra khỏi cột ở thời điểm bất kỳ tR được gọi là thời gian lưu.

Từ tốc độ A và chiều dài cột, thời gian lưu được tính:

tR = = = = (6)

● Pha động chảy qua cột với tốc độ u → khoảng thời gian pha động ở trong cột là:

tđ = L/u (7)

● Thời gian lưu của một chất bất kỳ không ở trong pha tĩnh (KD= 0, k’= 0) cũng bằng tđ

→ Yếu tố này cho phép ta đo tđ dễ dàng bằng cách theo dõi tốc độ đi ra khỏi cột của một chất nào đó không bị giữ trên cột

4.5 ĐỘ LƯU TƯƠNG ĐỐI (α)

Thời gian lưu hoặc thể tích lưu của một chất có thể được so sánh với thời gian lưu hoặc thể tích lưu của một chất chuẩn nào đó Tỉ số đó được gọi là độ lưu tương đối (α )

4.6 HÀM LƯỢNG CHẤT PHÂN TÍCH

Hình 3 Sắc đồ hỗn hợp 2 chất 1 và 2

V(ml) Nồng độ chất phân tích

Bơm mẫu t=0

Ví dụ 1 Dùng sắc đồ ở hình 3 và cho Vt = 10 ml, hãy tính các đại lượng liệt kê dưới đây:

Thời gian lưu tR,

Thời gian lưu pha động tđ,

Thể tích lưu VR,

Thể tích lưu pha độngVđ,

Tốc độ dòng F,

Thể tích lưu hiệu chỉnhVR’,

Thời gian lưu hiệu chỉnh tR’,

Độ lưu tương đối α,

Hệ số dung lượng k’,

Hệ số phân bố KD

● Vấn đề đặt ra là có bao nhiêu đĩa lý thuyết liên hợp với cột sắc ký đối với sắc đồ ở H.3 → Để trả lời câu hỏi này

chúng ta phải nhận ra rằng: Phân bố trong qt sắc ký tương tự như đường cong sai số chuẩn (H.4)

+ Đỉnh sắc ký là đỉnh của đường cong Gauss.

+ Bề rộng của đường cong (W) đó tỉ lệ thuận với độ lệch chuẩn,

+ Bề rộng pic tăng lên theo ( n: số lần thí nghiệm, trong sắc ký thì n là số lần chuyển cân bằng – số đĩa lý thuyết)

+ Thời gian lưu tăng trực tiếp theo n

a. Hãy tính số đĩa lý thuyết đối với cột sắc ký, có sắc đồ ở hình 3.

b. Nếu cột dài 120 cm, hãy tính H cho cột này?

Số đĩa lý thuyết của cột sắc ký :

n = (nA + nB)/2 = 4,2.103 đĩa lý thuyết

b H = L/n = 120/ 4,2.103 = 0,029 cm/ đĩa lý thuyết

4.9 ĐỘ PHÂN GIẢI

● Điều quan tâm thú vị là xác định xem 1 cột sắc ký phải chứa bao nhiêu đĩa lý thuyết để tách được 2 chất ra khỏi nhau Nghĩa là các pic ứng với chất phân tích A và chất phân tích B có độ phân giải tốt đến bao nhiêu

● Hình 3 cho thấy A và B được tách tốt khi Pic A về đến đường nền trước khi pic B bắt đầu Rõ ràng là

độ phân giải của 2 pic phụ thuộc vào điều chúng được tách ra xa như thế nào

( ∆tR) và các pic đó rộng như thế nào ( W)

● Từ đỉnh pic 1 cần WA/2 thời gian để về đến đường nền ( bỏ qua đuôi của đường cong sai số chuẩn), pic thứ 2 sẽ bắt đầu WB/2 thời gian đến đỉnh pic thứ 2 ( bỏ qua đuôi của đường cong sai số chuẩn)

Như thế sẽ phân giải được 2 pic nếu:

∆tR = tRA- tRB ≥ +

Chú ý: Do các pic có đuôi, nên cần 1 giá trị= 1,5 để có được sự phân giải đường nền” Khi độ phân

giải R = 1,0 thì sẽ có 2,5% của pic A thuộc về pic B và 2,5% của pic B lại nằm trong pic A Khi R = 1,5 thì phần xen phủ là 0,1%

Ví dụ 4 Hãy tính độ phân giải đối với sự phân tách 2 chất A và B nếu một cột dài 200 cm được thay thế cho cột dài 120 cm ( ở ví dụ 3)

Cách 2: Ta có R ∼

R2/R1 =

R2 = R1 = 1,25

5 CÁC THUYẾT CƠ BẢN DÙNG TRONG SẮC KÝ

Vì tính chất phức tạp của các lực tương tác trong hệ sắc ký nên cho đến nay chưa có thuyết nào giải thích một cách trọn vẹn được tất cả các quá trình xảy ra trong hệ sắc ký đang vận hành Mỗi thuyết đưa ra đều chỉ giải thích cho một quá trình chính nào đó xảy ra trong cột sắc ký

Hiện nay có 2 thuyết được sử dụng phổ biến trong sắc ký đó là : - Lý thuyết đĩa tương đương

- Lý thuyết Dòng khuếch tán

5.1 Lý thuyết Đĩa đương lượng ( gọi tắt là Lý thuyết đĩa)

Xét sự phân bố đơn giản trong dòng không liên tục theo sơ đồ chiết Craig Với hệ chứa cấu tử A, KD = 1, Vđ =

Vt, lượng chất ban đầu bằng 1.

- Tất cả các phểu đều chứa cùng 1 thể tích chất lỏng Vt dùng làm pha tĩnh.

- Cho chất A vào phểu thứ nhất (đánh số 0), sau đó thêm một thể tích dung môi Vđ dùng làm pha động

không trộn lẫn với chất lỏng đầu.

- Chất A trong chất lỏng sẽ được phân bố giữa 2 pha cho đến khi đạt trạng thái cân bằng.

- Chuyển Vđ trong phểu số 0 sang phểu số 1 rồi thêm thể tích dung môi Vđ vào phểu số 0 Và cứ tiếp tục như thế…

1/4

1/8 1/8

¼ 1/4

2/8 2/8

1/8 1/8

1/16 1/16

3/16 3/16

3/16 3/16

1/16 1/16

1/32 1/32

1/8 1/8

3/16 3/16

1/8 1/8

1/32 1/32

a. Mỗi phểu trong sơ đồ chiết Craig là một đĩa lý tưởng/ cân bằng trao đổi chất giữa 2 pha xảy ra tức thời

b. Thể tích pha động Vđ và pha tĩnh Vt là bằng nhau và không

đổi trong tất cả các đĩa

c Dòng pha động đồng nhất ở mọi đĩa

d. Chỉ xét trong trường hợp đường đẳng nhiệt phân bố tuyến tính K = ( 5.1)

e Không có hiện tượng khuếch tán phân tử trong 2 pha

dV

Hình vẽ: Phân bố Poission

Cđ,i-1 Cđ,i Cđ, i+1

Ct, i-1 Ct, i Ct, i+1

Cho 1 thể tích vô cùng nhỏ ( vi phân) pha động dV liên tục từ phểu này sang phểu khác Ta xét sự trao đổi chất ở phểu thứ i

- Ở phểu i, lượng chất từ phểu (i-1) chuyển vào là: Cđ,i-1.dV

- Lượng chất thay đổi ở pha động và pha tĩnh ở phểu i là:

Vđ.dCđ, i và VtdCt, i

Do đó ta có:

Cđ,i-1.dV – Cđ,i.dV = Vđ.dCđ,i+ VtdCt,i (5.1) Thay 5.1 vào 5.2 ta có:

(Cđ,i-1 – Cđ,i).dV = Vđ.dCđ,i+ Vt.dKCđ,i.

(Cđ,i-1 – Cđ,i).dV = Vđ.dCđ,i+ KVt.dCđ,i.

dCđ,i(Vđ + kVt) = (Cđ,i-1 – Cđ,i).dV

= (5.3)Giải phương trình vi phân này ta được:

Cđ,i = (5.4)

Hình 7 Sự phân bố của chất theo phân bố Poision.

Mô tả sự phụ thuộc của phần chất fC(i) =

** Hãy khảo sát hàm phân bố fC(x), fC(i):

fC(x) và fC(i) đạt cực đại khi i= n ; Lấy đạo hàm f ‘C(i) và cho f ‘C(i) = 0

Đường cong có 2 điểm uốn tại 2 hoành độ n = i+_

Nếu biểu diễn phần chất ( nồng độ chất) ra khỏi cột theo thể tích pha động đã đưa vào cột hoặc thời gian chạy sắc ký ta thu được đường cong xuất điển hình trong tách sắc ký ( có dạng Pic)

Th

eo th uyế

t n

ày sự gi ãn rộ

ng vù

ng ch

ất t rên cộ

t là do qu

á tr ìn

h kh uếc

g ph

a đ ộn

g đ

i v

ào cột

•

Kh

i q

uá trì nh sắ

c k

ý d iễn ra , c

ó o

3 lo

ại kh uếc

h tá

n q uyết đị nh sự di ch uyển củ

a

ch

ất t

an xu

ất h iện , gồ m:

•

Kh uếc

h tá

n x oáy

•

Kh uếc

h tá

n p hân tử

•

Kh uếc

h tá

n d

o c huy ển kh ối.

5.2 THUYẾT

DÒNG

KHUẾCH TÁN

39

1. Khuếch tán xoáy:

( Hiệu ứng đường đi không bằng nhau)

Giả sử ta xét 02 vi dòng pha động A,B trong một đoạn cột:

Hình 9 Mặt cắt dọc của một đoạn cột

A

B

A B

2 Khuếch tán phân tử trong pha lỏng và pha khí (Sự khuếch tán dài)

Độ giãn rộng vùng chất trên cột do sự khuếch tán phân tử được mô tả bằng phương trình:

Hk = 2αDđ/u

Hk: Phần cột sắc ký mà cấu tử di chuyển được do sự khuếch tán trong một đơn vị thời gian khảo sát Dđ: Hệ số khuếch tán tự do của cấu tử trong pha động

u: Tốc độ di chuyển thẳng của dòng pha động

α: Hệ số khúc khuỷu, phụ thuộc vào hình dáng của hạt và khoảng cách giữa các hạt chất nhồi ( độ xít đặc)

3 Sự khuếch tán do chuyển khối

Các cấu tử có khối lượng phân tử khác nhau sẽ có tốc độ di chuyển khác nhau → tốc độ trao đổi chất giữa 2

pha của các cấu tử khác nhau (sự chuyển khối khác nhau)

Ảnh hưởng của sự chuyển khối được mô tả bằng phương trình:

Hm= βu/Dt

Hm: Phần cột sắc ký mà cấu tử di chuyển được do sự chuyển khối trong một đơn vị thời gian khảo sát.

Dt: Hệ số khuếch tán của cấu tử trong pha tĩnh

β : Hệ số phụ thuộc vào bản chất của hệ sắc ký và bề dày của pha tĩnh (nếu pha tĩnh lỏng) hoặc bề dày của lớp chất hấp thu (nếu pha tĩnh là rắn)

Kết hợp các yếu tố trên với lý thuyết đĩa, VanDeemter

đã đưa ra phương trình đơn giản sau:

Là phư ơng tr ình cơ bả

n m

ô tả m

ối l iên hệ gi

ữa sự di ch uyể

n củ

a ch

ất t

an với tốc độ

dòn

g p

ha động tr ong qu

á tr ình ph

a đ ộng ch

ạy tro

ng cột sắ

Đố

i v

ới

một cộ

t s

ắc k

ý, c hất ta

n di ch uyể

n tr

ên cột kh ông ch

ỉ p

hụ thu

ộc vào bả

n ch

ất l

ực tư ơng

tác gi

ữa

nó với ph

a tĩ

nh

mà còn ph

ụ th uộc và

o tố

c độ dò

ng pha độ ng.

•

Tro

ng một

hệ sắc ký, khi th

ay đổi t

ốc

độ

di c huy

ển thẳ

ng của dòn

g p

ha động th

ay đổi t heo ( do

u t hay đổ i H tha

•

Giả

i th ích đư

ợc h iện tư ợng gi

ãn rộn

g v ùng sắ

c k

ý ch

ọn

hệ sắc ký để tá

ch cá

c đố

tư ợng th ích hợ p.

* Ý NGHĨA CỦA

PHƯƠNG TRÌNH

VANDEEMTER

45

* MỘT SỐ DẠNG KHÁC CỦA PHƯƠNG TRÌNH VANDEEMTER

- Phương trình Knox: H = Au1/3 + B/u + Cu

Áp dụng khi u nhỏ ( như trong LC), khi đó phân tử chất tan chịu nhiều tác động khác , A không độc lập với u nữa

- Phương trình VanDeemter cho trường hợp tốc độ dòng pha động rất lớn (cột mao quản hở) A = 0 H = B/u + Cu

* CÁC HỆ QUẢ TỪ PHƯƠNG TRÌNH VANDEEMTER

Ở tốc độ tối ưu, giá trị của H là:

Hmin = A + 2 = 0,0224 cmTại tốc độ tối ưu, số đĩa lý thuyết của cột là:

n = = = 6,7 103 đĩalý thuyết

CÁC TỪ VIẾT TẮT

GC: Gas Chromatography ( Sắc ký khí)

LC : Liquid Chromatography ( Sắc ký lỏng)

GSC : Gas – Solid Chromatography ( Sắc ký khí - rắn)

GLC : Gas –Liquid Chromatography ( Sắc ký khí - lỏng)

HPLC : High – Performance Liquid Chromatography

( Sắc ký lỏng hiệu năng cao)LSC : Liquid– Solid Chromatography ( Sắc ký lỏng- rắn)

LLC : Liquid–Liquid Chromatography ( Sắc ký lỏng- lỏng)

IEC : Ion – exchange Chromatography ( Sắc ký trao đổi ion)

IC : Ion Chromatography ( Sắc ký ion)

SEC : Size – Exclusion Chromatography ( Sắc ký rây phân tử)

AC : Affinity Chromatography ( Sắc ký ái lực)

TLC : Thin Layer Chromatography ( Sắc ký bản mỏng)

PC : Paper Chromatography ( Sắc ký giấy)

Planar Chromatography : Sắc ký phẳng ( PlaC)