lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phỏửn I : Cồ sồớ lyù thuyóỳt HPLC laỡ chổợ vióỳt từt cuớa 04 chổợ caùi õỏửu bũng tióỳng Anh cuớa phổồng phaùp sừc kyù loớng hióỷu nng cao ( High Performance Liquid Chromatography) ,trổồùc kia goỹi laỡ phổồng phaùp sừc kyù loớng cao aùp (High Pressure Liquid Chromatography) Phổồng phaùp naỡy ra õồỡi tổỡ nm 1967-1968 trón cồ sồớ phaùt trióứn vaỡ caới tióỳn tổỡ phổồng phaùp sừc kyù cọỹt cọứ õióứn . Hióỷn nay phổồng phaùp HPLC ngaỡy caỡng phaùt trióứn vaỡ hióỷn õaỷi hoaù cao nhồỡ sổỷ phaùt trióứn nhanh choùng cuớa ngaỡnh chóỳ taỷo maùy phỏn tờch .Hióỷn nay noù aùp duỷng rỏỳt lồùn trong nhióửu nghaỡnh kióứm nghióỷm õỷc bióỷt laỡ ổùng duỷng cho nghaỡnh kióứm nghióỷm Thuọỳc . Vaỡ noù hióỷn laỡ cọng cuỷ õừc lổỷc trong phỏn tờch caùc thuọỳc õa thaỡnh phỏửn cho pheùp õởnh tờnh vaỡ õởnh lổồỹng . Phỏửn I : Cồ sồớ lyù thuyóỳt 1 - Khaùi nióỷm : Sừc kyù loớng hióỷu nng cao laỡ mọỹt phổồng phaùp chia taùch trong õoù pha õọỹng laỡ chỏùt loớng vaỡ pha tộnh chổùa trong cọỹt laỡ chỏỳt rừn õaợ õổồỹc phỏn chia dổồùi daỷng tióứu phỏn hoỷc mọỹt chỏỳt loớng phuớ lón mọỹt chỏỳt mang rừn ,hay mọỹt chỏỳt mang õaợ õổồỹc bióỳn õọứi bũng lión kóỳt hoaù hoỹc vồùi caùc nhoùm chổùc hổợu cồ .Quaù trỗnh sừc kyù loớng dổỷa trón cồ chóỳ hỏỳp phuỷ,phỏn bọỳ ,trao õọứi Ion hay phỏn loaỷi theo kờch cồợ ( Rỏy phỏn tổớ ) . 2- Nguyón từc cuớa quaù trỗnh sừc kyù trong cọỹt : Pha tộnh laỡ mọỹt yóỳu tọỳ quan troỹng quyóỳt õởnh baớn chỏỳt cuớa quaù trỗnh sừc kyù vaỡ loỹai sừc kyù . Nóỳu pha tộnh laỡ chỏỳt hỏỳp phuỷ thỗ ta coù Sừc kyù hỏỳp phuỷ pha thuỏỷn hoỷc pha õaớo . Nóỳu pha tộnh laỡ chỏỳt trao õọứi Ion thỗ ta coù Sừc kyù trao õọứi ion . Nóỳu pha tộnh laỡ chỏỳt Loớng thỗ ta coù Sừc kyù phỏn bọỳ hay sừc kyù chióỳt . Phỏửn I : Cồ sồớ lyù thuyóỳt Nóỳu pha tộnh laỡ Gel thỗ ta coù Sừc kyù Gel hay Rỏy phỏn tổớ . Cuỡng vồùi pha tộnh õóứ rổớa raới chỏỳt phỏn tờch ra khoới cọỹt ,chuùng ta cỏửn coù mọỹt pha õọỹỹng . Nhổ vỏỷy nóỳu chuùng ta naỷp mỏựu phỏn tờch gọửm họựn hồỹp chỏỳt phỏn tờch A,B,C Vaỡo cọỹt phỏn tờch ,kóỳt quaớ caùc chỏỳt A,B,C Seợ õổồỹc taùch ra khoới nhau sau khi õi qua cọỹt .Quyóỳt õởnh hióỷu quaớ cuớa sổỷ taùch sừc kyù ồớ õỏy laỡ tọứng hồỹp caùc tổồng taùc . Chỏỳt phỏn tờch A +B+C Pha tộnh Pha õọỹng F2 F3 F1 Phỏửn I : Cồ sồớ lyù thuyóỳt Tọứng cuớa 03 tổồng taùc naỡy seợ quyóỳt õởnh chỏỳt naỡo õổồỹc rổớa raới ra khoới cọỹt trổồùc tión khi lổỷc lổu giổợ trón cọỹt laỡ nhoớ nhỏỳt ( F1) .vaỡ ngổồỹc laỷi . ọỳi vồùi mọựi chỏỳt ,sổỷ lổu giổợ õổồỹc qui õởnh bồới 03 lổỷc F1,F2,F3 .Trong õoù F1 vaỡ F2 giổợ vai troỡ quyóỳt õởnh .coỡn F3 laỡ yóỳu tọỳ aớnh hổồớng khọng lồùn . õỏy F1 laỡ lổỷc giổợ chỏỳt phỏn tờch trón cọỹt .F2 laỡ lổỷc keùo cuớa pha õọỹng õọỳi vồùi chỏỳt phỏn tờch ra khoới cọỹt . Nhổ vỏỷy vồùi caùc chỏỳt khaùc nhau thỗ F1 vaỡ F2 laỡ khaùc nhau ,Kóỳt quaớ laỡ caùc chỏỳt khaùc nhau seợ di chuyóứn trong cọỹt vồùi tọỳc õọỹ khaùc nhau vaỡ taùch ra khoới nhau khi ra khoới cọỹt . ( nhổ hỗnh dổồùi õỏy ) Phỏửn I : Cồ sồớ lyù thuyóỳt : Phỏửn minh hoaỷ quaù trỗnh taùch caùc chỏỳt A vaỡ B trong cọỹt taùch sừc kyù Thồỡi gian A B Pha õọỹng Pháưn I : Cå såí l thuút 3 - Phán loải sàõc k : Theo cå chãú tạch sàõc k ngỉåìi ta phán loẵi nhỉ sau : 3.1 Sàõc k háúp phủ : Quạ trçnh sàõc k dỉûa trãn sỉû háúp phủ mảnh ,úu khạc nhau ca pha ténh âäúi våïi cạc cháút tan v sỉû rỉía gii ( phn háúp phủ ) ca pha âäüng âãø kẹo cháút tan ra khi cäüt .Sỉû tạch mäüt häùn håüp phủ thüc vo tênh cháút âäüng hc ca cháút háúp phủ . Trong trỉåìng loải ny cọ 02 loải háúp phủ : + Sàõc k háúp phủ pha thûn ( NP - HPLC) : Pha ténh phán cỉûc ,pha âäüng khäng phán cỉûc . + Sàõc k háúp phủ pha âo (RP - HPLC) : Pha ténh khäng phán cỉûc ,pha âäüng phán cỉûc . Loải sàõc k ny âỉåüc ạp dủng ráút thnh cäng âãø tạch cạc häùn håüp cạc cháút cọ tênh cháút gáưn tỉång tỉû nhau v thüc loải khäng phán cỉûc,phán cỉûc úu hay trung bçnh nhỉ cạc Vitamin,thúc hả nhiãût gim âau Hiãûn nay chụng ta âang sỉí dủng chè cọ loải sàõc k ny m thäi. Phỏửn I : Cồ sồớ lyù thuyóỳt Chuớ yóỳu hióỷn nay chuùng ta sổớ duỷng loỹai sừc kyù hỏỳp phuỷ pha õaớo ( RP ) Trong dổồỹc õióứn USP khi chuùng ta tra cổùu cọỹt coù giaù trở tổồng ổùng nhổ sau : L1 : RP 18 Kờch thổồùc haỷt tổồng ổùng tổỡ 5 - 10 àm L7 : RP 8 Kờch thổồùc haỷt tổồng ổùng tổỡ 5 - 10 àm L3 : Si 60 Kờch thổồùc haỷt tổồng ổùng tổỡ 5 - 10 àm Vaỡ coỡn mọỹt sọỳ loaỷi cọỹt khaùc nhổ cọỹt Diol , Cọỹt NH 2 ,CN . . vv Phỏửn I : Cồ sồớ lyù thuyóỳt 4 - Caùc õaỷi lổồỹng õỷc trổng cuớa sừc kyù õọử Kóỳt quaớ cuớa quaù trinh taùch caùc chỏỳt õổồỹc Detector phaùt hióỷn ghi thaỡnh sừc kyù õọử nhổ hỗnh trón Pháön I : Cå såí lyï thuyãút t o t ’ r2 t ’ r1 t r1 t r2 T o : Thåìi gian læu chãút t ’ r1 : Thåìi gian læu thæûc cháút A t ’ r2 : Thåìi gian læu thæûc cháút B t r1 : Thåìi gian læu cháút A t r2 : Thåìi gian læu cháút B Phỏửn I : Cồ sồớ lyù thuyóỳt Tổỡ caùc thọng sọỳ cuớa caùc peak trón õỏy ,nhióửu õaỷi lổồỹng õỷc trổng vóử lyù thuyóỳt õổồỹc õổa ra õóứ aùnh giaù mọỹt quaù trỗnh sừc kyù .Dổồùi õỏy laỡ mọỹt sọỳ õaỷi lổồỹng thổồỡng duỡng trong thổỷc tóỳ vaỡ caùch thay õọứi caùc õaỷi lổồỹng naỡy coù lồiỹ cho quaù trỗnh phỏn tờch sừc kyù. 4.1 Thồỡi gian lổu thổỷc t r : Retention time Thồỡi gian lổu cuớa mọỹt chỏỳt laỡ thồỡi gian tờnh tổỡ khi bồm mỏựu vaỡo cọỹt cho õóỳn khi chỏỳt õoù ra khoới cọỹt õaỷt giaù trở cổỷc õaỷi. Thồỡi gian lổu cuớa mọựi chỏỳt laỡ hũng õởnh vaỡ caùc chỏỳt khaùc nhau thỗ thồỡi gian lổu seợ khaùc nhau trón cuỡng mọỹt õióửu kióỷn sừc kyù õaợ choỹn .Vỗ vỏỷy thồỡi gian lổu laỡ õaỷi lổồỹng õóứ phaùt hióỷn õởnh tờnh caùc chỏỳt. Thồỡi gian lổu phuỷ thuọỹc vaỡo caùc yóỳu tọỳ : + Baớn chỏỳt sừc kyù cuớa pha tộnh. + Baớn chỏỳt ,thaỡnh phỏửn,tọỳc õọỹ cuớa pha õọỹng + Cỏỳu taỷo vaỡ baớn chỏỳt phỏn tổớ cuớa chỏỳt tan + Trong mọỹt sọỳ trổồỡng hồỹp thồỡi gian lổu coỡn phuỷ thuc vaỡo pH cuớa pha õọỹng . [...]... dng, nhiãût âäü v chỉång trçnh dung mäi Nãúu l chỉång trçnh rỉía gii Gradient Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký Hãû thäúng trang bë: - Loải Detector: - Van tiãm máùu,thãø têch tiãm - Hãû âỉåìng dáùn Cạc úu täú khạc : nhiãût âäü ,âäü nhảy ca detector bỉåïc sọng phán têch Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký III.1 : Lỉûa chn pha ténh - Dỉûa vo cạc ti liãûu ,Dỉåüc âiãøn ,thnh pháưn v tênh cháút ca cạc cháút... lãn v mạy sàõc k s Phần II: Hệ thống HPLC II.3- Pump Cao ạp : - Mủc âêch âãø båm pha âäüng vo cäüt thỉûc hiãûn quạ trçnh chia tạch sàõc k Pump phi tảo âỉåüc ạp sút cao khong 3000-6000 PSI hồûc 250 at âãún - 500 at ( 1at =0.98 Bar) v pump phi tảo dng liãn tủc Lỉu lỉåüng båm tỉì 0.1 âãún 9.999 ml/phụt (hiãûn nay â cọ nhiãưu loải Pump cọ ạp sút ráút cao lãn âãún 1200 bar) - Mạy sàõc k lng ca chụng ta hiãûn... lng hiãûu nàng cao - Cäüt pha ténh thäng thỉåìng lm bàòng thẹp khäng rè ,chiãưu di cäüt khong 10 -30cm ,âỉåìng kênh trong 1-10mm ,hảt cháút nhäưi cåỵ φ = 5-10 µm.(ngoi ra cn cọ mäüt säú trỉåìng håüp âàûc biãût vãư kêch thỉåïc v Phần II: Hệ thống HPLC cháút nhäưi cäüt cåỵ φ = 1.8 -5 µm cọ thãø dng cäüt ngàõn ( 3-10 cm ) v nh ( âỉåìng kênh trong 1-4.6 mm)loải cäüt na cọ hiãûu nàng tạch cao - Cháút nhäưi... cạc loải cäüt khạc nhau Chụng ta thäng thỉåìng dng 02 loải cäüt pha thûn ( NP) v cäüt pha âo ( RP) Ngoi ra ta cọ thãø dng mäüt säú loải cäüt khạc nhỉ cäüt CN ,cäüt NH2 , Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký Cäüt pha thûn ( NP): Silicagel trung tênh Pha ténh :Cäüt ny l loải cäüt dng âãø tạch cạc cháút khäng phán cỉûc hay êt phán cỉûc Trãn bãư màût hoảt âäüng ca nọ cọ chỉïa cạc nhọm OH phán cỉûc ỉa nỉåïc... mãưm nháûn,tên hiãûu v sỉí l dỉỵ liãûu v âiãưu khiãøn hãû thäúng HPLC 8- In dỉỵ liãûu Phần II: Hệ thống HPLC II.1 - Bçnh âỉûng dung mäi - Hiãûn tải mạy HPLC thỉåìng cọ 04 âỉåìng dung mäi vo âáưu båm cao ạp Cho phẹp chụng ta sỉí dủng 04 bçnh chỉïa dung mäi cng 1 láưn âãø rỉ gii theo t lãû mong mún v täøng t lãû dung mäi ca 04 âỉåìng l 100 % Tuy nhiãn theo kinh nghiãûm thç chụng ta êt khi sỉí dủng... thuút 4.2 Säú âéa l thuút N: Säú âéa l thuút l âải lỉåüng biãøu thë hiãûu nàng ca cäüt trong mäüt âiãưu kiãûn sàõc k nháút âënh Mäùi âéa l thuút trong cäüt sàc k giäúng nhỉ l mäüt låïp pha ténh cọ chiãưu cao l H ,Táút nhiãn låïp ny cọ tênh cháút âäüng tỉïc l mäüt khu vỉûc ca hãû phán tạch m trong âọ mäüt cán bàòng nhiãût âäüng hc âỉåüc thiãút láûp giỉỵa näưìng âäü trung bçnh ca cháút tan trong pha ténh... + Âỉåìng kênh v âäü háúp phủ ca hảt pha ténh + Täúc âäü v âäü nhåït ( âäü phán cỉûc )ca pha âäüng + Hãû säú khuúch tạn ca cạc cháút trong cäüt Vç váûy våïi mäüt âiãưu kiãn sàõc k xạc âënh thç chiãưu cao H cng hàòng âënh âäúi våïi mäüt cháút phán têch v Pháưn I : Cå såí l thuút 4.2 Säú âéa l thuút N: Säú âéa l thuút N âỉåüc tênh theo cäng thỉïc sau : N = 5,54 ( tR / W0,5)2 Trong âọ : tR : Thåìi gian... cạc cháút háúp thủ quang âáy l loải thäng dủng nháút +Detector hunh quang âãí phạt hiãûn cạc cháút hỉỵu cå phạt hunh quang tỉû nhiãn cng nhỉ cạc dáùn cháút cọ hunh quang L loải Detector cọ âäü chn lc cao nháút +Loải hiãûn âải âải hån cọ Detector Diod Array ,ELSD (Detector tạn xả bay håi ) cạc Phần II: Hệ thống HPLC Ngoi ra cn cọ mäüt säú loải Detector khạc l : + Detector âiãûn họa : Âo dng ,cỉûc phäø... âäúi xỉïng T : ( Tailing factor) Hãû säú khäng âäúi xỉïng T cho biãút mỉïc âäü khäng âäúi xỉïng ca Peak trãn sàõc k âäư thu âỉåüc T âỉåüc tênh bàòng t säú âäü räüng ca 02 nỉía Peak tải âiãøm 1/10 chiãưu cao Peak : T = a/b a b Peak dảng âäïi xỉïng hçnh Gauss trãn thỉûc tãú khọ âảt âỉåüc vç váûy phi quan tám âãún hãû säú khäng âäúi xỉïng T, Pháưn I : Cå såí l thuút 4.4Hãû säú khäng âäúi xỉïng T : ( Tailing... Mạy HP:C gäưm cạc bäü pháûn cå bn âỉåüc tọm tàõt trãn så âồ sau : Column Degasse Pump Tiêm mẫu Detector Phần II: Hệ thống HPLC Trong âọ : 1- Bçnh chỉïa dung mäi pha âäüüng 2- Bäü pháûn khỉí khê 3- Båm cao ạp 4-Bäü pháûn tiãm máùu ( bàòng tay hay Autosample) 5-Cäüt sàõc k ( Pha ténh ) ( âãø ngai mäi trỉåìng hay trong bäü âiãưu nhiãût ) 6- Detector ( nháûn tên hiãûu ) 7-Hãû thäúng mạy tênh gàõn pháưn . phaùp sừc kyù loớng hióỷu nng cao ( High Performance Liquid Chromatography) ,trổồùc kia goỹi laỡ phổồng phaùp sừc kyù loớng cao aùp (High Pressure Liquid. . Hióỷn nay phổồng phaùp HPLC ngaỡy caỡng phaùt trióứn vaỡ hióỷn õaỷi hoaù cao nhồỡ sổỷ phaùt trióứn nhanh choùng cuớa ngaỡnh chóỳ taỷo maùy phỏn tờch