Bước đầu xác định sáu hợp chất isoflavone có trong hạt đậu nành bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Đồngthời, với mong muốn đóng góp một phần vào kho tư liệu của nhà nước, chính vì vậy mà em tiến hành thực hiện đề tài: “Bước đầu xác định sáu hợp chất isoflavone có trong hạt đậu nành bằ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH SÁU HỢP CHẤT ISOFLAVONE

CÓ TRONG HẠT ĐẬU NÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC

KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - HPLC

Sinh viên thực hiệnLớp

Chuyên ngànhKhóa

GVHD

Đà Nẵng, 04/2018

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH SÁU HỢP CHẤT ISOFLAVONE

CÓ TRONG HẠT ĐẬU NÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC

KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - HPLC

Sinh viên thực hiệnLớp

Chuyên ngànhKhóa

GVHD

Đà Nẵng, 04/2018

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

3. Thời gian thực hiện

 Ngày nhận đề tài: 01 tháng 01 năm 2018

 Ngày bảo vệ: 27 tháng 04 năm 2018.

4. Giáo viên hướng dẫn: TS Bùi Xuân Vững

5. Phạm vi thực hiện

Nghiên cứu tại phòng thí nghiệm trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng, địa chỉ:

459 Tôn Đức Thắng, phường Hòa Khánh Nam, quận Liên Chiểu, Tp Đà Nẵng.

Chủ nhiệm khoa Giáo viên hướng dẫn (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký

và ghi rõ họ tên)

- Sinh viên đã hoàn thành và nộp báo cáo cho khoa ngày….tháng….năm 2018

- Kết quả điểm đánh giá

Đà Nẵng, ngày … tháng…… năm 2018

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG(Ký và ghi rõ họ tên)

MỤC LỤC

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ĐẬU NÀNH 1

1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm 1

a) Nguồn gốc 1

b) Đặc điểm 1

1.1.2 Thành phần hóa học trong đậu nành 2

1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ISOFLAVONE 3

1.2.1 Nguồn gốc Isoflavone 3

1.2.2 Thành phần hóa học, tính chất, cấu trúc của isoflavone 4

1.2.3 Tác dụng của isoflavone trong phòng và điều trị bệnh 7

a) Tác dụng trên chuyển hóa của xương 7

b) Tác dụng trên tim mạch 7

c) Nâng cao chất lượng cuộc sống của phụ nữ 8

d) Tác dụng phụ có thể gặp với isoflavone đậu nành 8

e) Ứng dụng của isoflavone 8

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 9

1.3.1 Các nghiên cứu ngoài nước 9

a) Tại Hàn Quốc 10

b) Tại Australia 11

1.3.2 Các nghiên cứu trong nước 11

1.4 Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 12

1.4.1 Khái niệm 12

1.4.2 Nguyên tắc của các quá trình sắc ký 12

1.4.3 Phân loại sắc ký hấp phụ 13

1.4.4 Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ 14

a) Thời gian lưu thực t’R 15

b) Hệ số dung lượng K’ 15

c) Độ chọn lọc α 15

d) Số đĩa lý thuyết 15

e) Độ phân giải 16

f) Hệ số không đối xứng 17

1.4.5 Hệ thống HPLC 17

a) Bình đựng dung môi 18

b) Bộ phận khử khí 19

c) Bơm cao áp 19

d) Bộ phận tiêm mẫu 19

e) Cột sắc ký 19

f) Đầu dò 20

g) Bộ phận ghi tín hiệu 21

h) Thiết bị in dữ liệu 21

1.4.6 Phương pháp chọn điều kiện sắc ký 21

a) Lựa chọn pha tĩnh 21

b) Lựa chọn pha động 22

1.4.7 Các bước tiến hành sắc ký 23

a) Chuẩn bị dụng cụ và máy móc 23

b) Chuẩn bị dung môi pha động 24

c) Chuẩn bị mẫu đo HPLC 24

d) Cách vận hành thiết bị 24

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Nguyên liệu hạt đậu nành 26

2.2 Hóa chất và dụng cụ, thiết bị 26

2.2.1 Hóa chất 26

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 26

2.3 Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích 28

2.4 Nội dung nghiên cứu 28

2.4.1 Khảo sát phương pháp trích ly isoflavone 28

a) Quy trình công nghệ chiết isoflavone trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp chiết lắc thông thường 29

b) Phương pháp trích ly isoflavone bằng phương pháp lắc có hỗ trợ siêu âm 30

2.4.2 Phương pháp định tính, định lượng isoflavone bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC 31

a) Khảo sát các điều kiện tối ưu cho hệ thống HPLC để phân tích isoflavone 31

b) Khảo sát tỷ lệ thành phần pha động 32

c) Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính 33

d) Phân tích định tính isoflavone 33

e) Phân tích định lượng isoflavone 33

2.4.3 Khảo sát độ lặp lại của phép đo 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ thành phần pha động 36

3.2 Kết quả khảo sát các mẫu hạt đậu nành có isoflavone theo thành phần pha động của hệ 1. 37

3.3 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính. 40

3.3.1 Kết quả đo dãy dung dịch chuẩn STD1- STD5 40

3.3.2 Xây dựng đường chuẩn 41

3.4 Khảo sát độ lặp lại của phép đo 44

3.5 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 46

3.6 Kết quả định tính isoflavone trong mẫu dịch bã 47

3.7 Kết quả đo mẫu thực 49

3.7.1 Kết quả đo dịch hạt chiết bằng cồn 800 49

3.7.2 Kết quả đo mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp siêu âm 50

3.7.3 Kết quả đo mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp lắc 50

3.7.4 Kết quả đo mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp lắc kết hợp siêu âm 51

3.8 Tính toán hàm lượng isoflavone có trong mẫu hạt đậu nành bằng phương pháp đường chuẩn 52

3.8.1 Mẫu dịch hạt chiết bằng cồn 800 52

3.8.2 Mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp siêu âm 53

3.8.3 Mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp lắc 54

3.8.4 Mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp lắc kết hợp siêu âm 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

HPLC DMSO PTFE

AOAC CHD MeCN EtOH MeOH ACN STD SD RSD LOD LOQ

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 1 Cây đậu nành (nguồn: tác giả)

Hình 1 2 Hình ảnh hạt đậu nành (nguồn: tác giả)

Hình 1 3 Hình ảnh giống đậu nành Đ2101 (nguồn: tác giả)

Hình 1 4 Cấu trúc hóa học của isoflavones

Hình 1 5 Cấu trúc hóa học của các aglucon

Hình 1 6 Cấu trúc hóa học của các - Glucozit

Hình 1 7 No- GMO Soy isoflavone

Hình 1 8 Calcium 600+ vitamin D3 with soy isoflavone

Hình 1 9 Active- Meno

Hình 1 10 Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải

Hình 1 11 Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B

Hình 1 12 Sắc ký đồ của chất A và chất B

Hình 1 13 Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách peak của hai chất A và B 15 Hình 1 14 Cách tính hệ số không đối xứng của peak

Hình 1 15 Các thiết bị trong hệ thống HPLC

Hình 2 1 Hạt và bột đậu nành khô

Hình 2 2 Thiết bị khuấy và thiết bị li tâm

Hình 2 3 Thiết bị lọc chân không và thiết bị cô quay chân không

Hình 2 4 Máy lắc và thiết bị sấy

Hình 2 5 Tủ lạnh và thiết bị cất nước

Hình 2 6 Thiết bị HPLC

Hình 2 7 Sơ đồ quy trình chiết lắc isoflavone dạng cao chiết từ hạt đậu nành

Hình 2 8 Quy trình chiết isoflavone bằng phương pháp lắc có hỗ trợ siêu âm trong phòng thí nghiệm

Hình 3 1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ 1 36

Hình 3 2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ 2 36

Hình 3 3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ 3 37

Hình 3 4 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi của thành phần pha động theo hệ 1. 37

Hình 3 5 Sắc ký đồ mẫu cao hạt đậu nành 38

Hình 3 6 Sắc ký đồ mẫu dịch hạt đậu nành chiết bằng cồn 80% 38

Hình 3 7 Sắc ký đồ mẫu hạt khô 39

Hình 3 8 Sắc ký đồ mẫu cao bã đậu nành 39

Hình 3 9 Sắc ký đồ mẫu dịch bã đậu nành 40

Hình 3 10 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Daidzin. 42

Hình 3 11 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Glycitin. 42

Hình 3 12 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ genistin. 43

Hình 3 13 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Daidzein 43

Hình 3 14 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Glycitein. 43

Hình 3 15 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Genistein. 44

Hình 3 16 Sắc ký đồ isoflavone trong mẫu dung dịch chuẩn 48

Hình 3.17 Sắc ký đồ isoflavone trong mẫu dịch chiết bằng cồn 800 48

Hình 3 18 Sắc ký đồ mẫu dịch hạt chiết bằng etanol 800 49

Hình 3 19 Sắc ký đồ mẫu hạt khô chiết theo AOAC với quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp siêu âm 50

Hình 3 20 Sắc ký đồ mẫu hạt khô chiết theo AOAC với quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp lắc 51

Hình 3 21 Sắc ký đồ mẫu hạt khô chiết theo AOAC với quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp lắc kết hợp siêu âm 52

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1 1 Thành phần hóa học của đậu nành 3

Bảng 1 2 Danh sách của các isoflavones 5

Bảng 1 3 Lực rửa giải của một số dung môi 23

Bảng 2 1.Nồng độ các chất chuẩn làm việc (µg/ml). 33

Bảng 3 1 Kết quả đo chuẩn STD1 40

Bảng 3 2 Kết quả đo chuẩn STD2 40

Bảng 3 3 Kết quả đo chuẩn STD3 41

Bảng 3 4 Kết quả đo chuẩn STD4 41

Bảng 3 5 Kết quả đo chuẩn STD5 41

Bảng 3 6 Tóm tắt kết quả đường chuẩn của 6 hợp chất isoflavone 44

Bảng 3 7 Độ lặp lại của hệ thống HPLC đối với Daidzin. 45

Bảng 3 8 Độ lặp lại của hệ thống HPLC đối với Glycitin 45

Bảng 3 9 Độ lặp lại của hệ thống HPLC đối với Genistin. 45

Bảng 3 10 Độ lặp lại của hệ thống HPLC đối với Daidzein 45

Bảng 3 11 Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Glycitein. 46

Bảng 3 12 Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Genistein. 46

Bảng 3 13 Kết quả LOD và LOQ 47

Bảng 3 14 Kết quả đo dịch hạt chiết bằng cồn 800 49

Bảng 3 15 Kết quả đo mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp siêu âm 50

Bảng 3 16 Kết quả đo mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp lắc 51

Bảng 3 17 Kết quả đo mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp lắc kết hợp với siêu âm 52

Bảng 3 18 Kết quả hàm lượng isoflavone có trong mẫu dịch hạt chiết bằng etanol 80053

Bảng 3 19 Kết quả hàm lượng isoflavone có trong 1g mẫu hạt khô chiết theo AOACbằng phương pháp siêu âm 54Bảng 3 20 Kết quả hàm lượng isoflavone có trong 1g mẫu hạt khô chiết theo AOACbằng phương pháp lắc 55Bảng 3 21 Kết quả hàm lượng isoflavone có trong 1g mẫu hạt khô chiết theo AOACbằng phương pháp lắc kết hợp siêu âm 56

Cuối cùng, cho em gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong hội đồng bảo vệ tốtnghiệp đã dành thời gian quý báu của mình để đọc và nhận xét khóa luận củaem.Trong quá trình làm bài báo cáo khó tránh khỏi sai sót, rất mong nhận được ý kiếnđóng góp của thầy, cô để bài báo cáo của em được hoàn thiện hơn.

Đà Nẵng, ngày 20 tháng 04 năm 2018

Sinh viên thực hiện

bổ sung vào trong các thực phẩm chức năng để cải thiện sức khỏe của con người.

Nguồn nguyên liệu để sản xuất isoflavone rất phong phú như hạt ngũ cốc, rauquả, nhưng đậu nành là nguồn nguyên liệu chủ yếu bởi vì hàm lượng isoflavonetrong đậu nành khá cao đặc biệt trong đậu nành nảy mầm Cùng với hàng ngàndược liệu quý có ở Việt Nam, đậu nành là một trong những dược liệu quý, đậu nành

đã được biết đến là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao vì chứa hàm lượng proteincao hơn bất kỳ loại nông sản nào Trong đậu nành còn chứa rất nhiều khoáng chất,các sinh tố B đặc biệt là các hóa chất thảo mộc có khả năng ngăn ngừa trị liệu bệnhtật

Điều này làm các nhà khoa học say mê nghiên cứu là khám phá ra các hóa thảomộc có trong đậu nành và những ứng dụng của chúng trong lĩnh vực y khoa trị liệu,trong đó các isoflavones là loại hóa chất thảo mộc mang lại nhiều ứng dụng Đồngthời, với mong muốn đóng góp một phần vào kho tư liệu của nhà nước, chính vì

vậy mà em tiến hành thực hiện đề tài: “Bước đầu xác định sáu hợp chất

isoflavone có trong hạt đậu nành bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC”

-CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ĐẬU NÀNH [3]

Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành (tên khoa học Glycine max (L) Merrill) là

loại cây họ Đậu (Fabaceae) giàu hàm lượng protein, trên thế giới có 1000 loại đậutương với nhiều đặc điểm khác nhau, hạt đậu nành có giá trị dinh dưỡng và kinh tếrất cao Quả đậu dài có nhiều lông vàng, mỗi quả có từ 1-4 hạt, thông thường có 2-3hạt Hạt hình cầu hay hình bầu dục, có màu sắc thay đổi tùy theo giống cây trồng(màu vàng, đen, nâu, xanh) Trọng lượng một hạt đậu tương thay đổi từ 20-400mg/hạt

b) Đặc điểm

 Hình dạng: hạt đậu nành có nhiều hình dạng khác nhau từ tròn tới thon và dẹt.

 Màu sắc: vàng xanh, xám, nâu hoặc đen và các màu trung gian Phần lớn màu

vàng, loại đậu nành màu vàng là loại tốt nên thường được ưa chuộng

 Kích thước: có 3 loại, to là loại 1000 hạt nặng 300g trở lên, trung bình là loại

1000 hạt nặng 100 - 300g, nhỏ là loại 1000 hạt nặng dưới 150g

 Cấu trúc hạt đậu nành gồm 3 thành phần:

+ Vỏ (chiếm 8%) là lớp ngoài cùng có chức năng bảo vệ phôi khỏi nấm vàchống nhiễm vi khuẩn trong quá trình tồn trữ, có nhiều màu khác nhau nhưng đặctrưng cho từng loại giống thường có màu vàng hay màu trắng Màu sắc của hạt thayđổi tùy theo giống và là đặc điểm để phân biệt giống, vỏ hạt chứa sắc tố anthocyanintùy theo hàm lượng sắc tố này mà hạt có 4 màu khác nhau: vàng, nâu, xanh, đen

1

+ Phôi ( chiếm 2%) là phần sinh trưởng của hạt khi lên mầm, chứa hai lá mầm

và có chức năng dự trữ dinh dưỡng Ngoài ra, phôi có 3 bộ phận khác: rễ mầm, trụdưới lá mầm và trụ trên lá mầm

+ Nhân (hay tử diệp chiếm 90%) gồm 2 lá mầm tích trữ lượng liệu của hạt, chiếm phần lớn khối lượng hạt, chứa lượng đạm và dầu cao nhất trong toàn hạt

Hình 1 2 Hình ảnh hạt đậu nành (nguồn: tác giả)

 Giống đậu nành Đ2101- tại địa bàn Quảng Nam, huyện Đại Lộc:

+ Thời gian gieo trồng trung bình (90-100 ngày), có khả năng sinh trưởng phát triểntốt, cứng, chống chịu sâu, bệnh tốt, thích hợp với gieo trồng cho vụ Xuân (gieo từtháng 11 âm lịch đến tháng 2) và vụ Đông

+ Có số quả/ cây nhiều từ 38-42 quả và có khối lượng hạt lớn (170-185 gam), hạt màu vàng đẹp, có chất lượng hạt khá (protein 41,0% và lipit 19,9%)

Hình 1 3 Hình ảnh giống đậu nành Đ2101 (nguồn: tác giả)

1.1.2 Thành phần hóa học trong đậu nành

2

 Các vitamin A, B1, B2, D, E, F,các enzyme, sáp nhựa, cellulose.

Hạt đậu nành là thành phần

có giá trị sử dụng cao nhất vì nókhông những chứa đầy đủ chấtdinh dưỡng cần thiết mà còn tồntại các hóa thảo mộc có tác dụngphòng ngừa và điều trị bệnh đặcbiệt là các căn bệnh thời đại như:bệnh ung thư, các bệnh liên quanđến tim mạch

Thành phần và cấu trúc củatừng thành phần trong hạt đậutương phụ thuộc vào nhiều yếu tố,bao gồm giống, mùa vụ, vùng địa

lí, và môi trường Thành phầntổng quát của đậu nành được trìnhbày trong bảng dưới đây

Bảng 1 1 Thành phần hóa học của đậu nành

1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ISOFLAVONE

1.2.1 Nguồn gốc Isoflavone

Isoflavone có nguồn gốcphytoestrogen thực vật thuộc nhómcác hợp chất flavonoid Chúng là cáchợp chất phenolic, có cấu trúc và sựvận hành giống như estrogen ở người,

vì thế còn được gọi là estrogen thảomộc Trong tự nhiên, các isoflavoneđược thấy có nhiều trong các loại thựcvật như: các loại đậu khác nhau,

3

cỏ ba lá đỏ, cỏ linh lăng, củ sắn dây trong đó hàm lượng cao nhất là ở đậu nành vàcác thực phẩm có chứa đậu nành [10].

Ở cây đậu nành, isoflavone có trong toàn bộ các phần: hạt, lá, cuống, mầm và

rễ Trong hạt đậu nành thì phôi có hàm lượng isoflavone cao nhất

1.2.2 Thành phần hóa học, tính chất, cấu trúc của isoflavone

Isoflavone là các chất hữu cơ thuộc nhóm polyphenolic (các chất có nhiều vòngphenyl) có liên quan với các flavonoid (isoflavone và flavonoid khác nhau ở vị trígắn của vòng benzen) và nó có nhiều lợi ích cho sức khỏe [10], [3]

Cấu trúc cơ bản của isoflavone gồm 2 vòng benzen: A và B nối với dị vòngpyron C

B

A C

Hình 1 4 Cấu trúc hóa học của isoflavones [1]

Isoflavone trong hạt đậu nành tồn tại ở dạng tự do (aglucon) và dạng liên kết(glucosid), bao gồm: daidzin, genistin, glycitin, các malonyl và axetyl tương ứngcủa chúng, trong một số trường hợp chúng có mặt ở cả 4 dạng hóa học với mỗidạng có chứa ba đồng phân và tạo nên 12 loại cụ thể:

1 Aglycones (daidzein, genistein và glycitein)

Hình 1 5 Cấu trúc hóa học của các aglucon

2. β-glycosides (daidzin, genistin và glycitin)

4

Hình 1 6 Cấu trúc hóa học của các - Glucozit

3. Các glucosides (daizin, malonyk-genistin và

malonyl-glycitin)

4. Acetyl-glucosides (acetyl-daidzin, acetyl-genistin, và acetyl-glycitin)

Cấu trúc hóa học của các isoflavone của 4 nhóm trên được cho ở bảng 1.2 bởi tác giả Mortensen cùng các cộng sự

Bảng 1 2 Danh sách của các isoflavones [1],[3].

Tên

Daidzein

GlyciteinGenisteinDaidzin

GlycitinGenistin

Acetyl hoặcManolyl daidzin

Acetyl hoặc

Manolyl glycitin

Acetyl hoặcManolyl genistin

Có hai loại isoflavone quan trọng trong đậu nành là daidzein và genistein, hợpchất này có cấu trúc hóa học gần giống kích thích tố nữ estrogen Còn được gọi làestrogen thực vật (phytoestrogen) Estrogen thực vật có tác dụng tương tự nhưestrogen tự nhiên nhưng yếu hơn

Genistin và daidzin là những phân tử tương đối lớn, tan tốt trong nước, tínhphân cực cao, nên khó hấp thu qua ống tiêu hóa Muốn cho dễ hấp thu và trở nên cógiá trị sinh học, phải thủy phân chúng thành các aglycon, tức làm mất thành phầnglycozit trong phân tử Muốn vậy, cần có xúc tác các enzym đặc hiệu làglycosidese Ống tiêu hóa của người không tạo được glycosidase, nên cơ thể khôngthể thủy phân được isoflavone và isoflavone chưa có giá trị sinh học

Ngược lại, một số tạp khuẩn định cư trong ruột sẽ tạo glycosidase cần cho quátrình thủy phân nêu trên, giúp cho sự hấp thụ các isoflavone.Các aglycon sẽ hấp thu

ở ruột non Nồng độ đỉnh của aglycon trong máu chỉ đạt được 4-6 giờ sau khi uốngchất chiết xuất từ hạt đậu nành, tức là khi các glycozit đã được thủy phân qua xúctác enzym của tạp khuẩn tại ruột

Lactobacillus sporogenes là vi khuẩn chính sản xuất glycosidase giúp cân bằngtạp khuẩn ruột, xúc tác cho thủy phân daidzin và genistin sang daidzein vàgenistein có hoạt tính “phytoestrogen”

Cùng với tác dụng hiệu quả tổng hợp của các hợp chất trong đậu nành khi dùnglàm thực phẩm, người ta cho rằng isoflavone giúp làm giảm nguy cơ ung thư ngực,ung thư ruột, các nghiên cứu trên động vật đã chứng minh sử dụng các sản phẩmđậu tương đã ức chế được ít nhất 5% khả năng ung thư

Nhiều nghiên cứu cho thấy đậu nành chứa nhiều isoflavone và được coi là thựcphẩm gia tăng nữ tính và bảo vệ phụ nữ giảm chứng bệnh như: tim mạch, rối loạntiền mãn kinh, ung thư và loãng xương nên đậu nành còn được mệnh danh là

“thần dược” của phụ nữ

6

1.2.3 Tác dụng của isoflavone trong phòng và điều trị bệnh [3], [5]

Nghiên cứu cho thấy những tác dụng có lợi của isoflavone có trong hạt đậunành trên các triệu chứng vận mạch ở tuổi mãn kinh: isoflavone trong đậu nành làmgiảm cường độ bốc hóa, giảm số lần làm đổ mồ hôi đem, mang lại lợi ích hiểnnhiên nâng cao chất lượng sống của phụ nữ mãn kinh Isoflavone đậu nành khônggây thay đổi có ý nghĩa về FSH hoặc về độ dày của màng trong tử cung, khôngthấy tăng các tác dụng phụ estrogen không mong muốn

a) Tác dụng trên chuyển hóa của xương

Nhiều nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ gãy xương do loãng xương ở phụ nữ châu Áthấp hơn hẳn so với ở các nước phương Tây Sự khác biệt này có liên quan tới sửdụng nhiều thức ăn chế từ đậu nành Hiệu lực của isoflavone đậu nành trên quátrình dinh dưỡng của xương ở phụ nữ sau mãn kinh đã cho thấy tăng có ý nghĩa vềmật độ khoáng ở xương

Hiệu lực isoflavone đậu nành trên chuyển hóa của xương cũng được khẳngđịnh trong các nghiên cứu lâm sàng khác

Isoflavone còn làm giảm nguy cơ loãng xương nhờ ức chế được hoạt tính củahủy cốt bào, nên có tác dụng hiệp đồng chống tiêu xương nhờ hoạt tính estrogencủa thuốc này

b)Tác dụng trên tim mạch [5]

Chế độ dinh dưỡng giàu đậu nành sẽ làm giảm nguy cơ bệnh động mạch vành(CHD) Isoflavone đậu nành có những tác dụng khác nhau chống rối loạn lipit- máu

ở người mãn kinh, có thể cắt nghĩa được sự giảm các nguy cơ tim mạch Đậu nành

và chiết xuất của đậu nành cũng có những tác dụng khác có lợi cho tim mạch, đãđược sơ kết bởi nhóm các chuyên gia Hội Mãn kinh Bắc Mỹ:

 Làm giảm huyết áp tâm trương

 Làm giảm cholesteron toàn phần, giảm cholesteron “xấu”, giảm triglyserid

 Chống tiểu cầu

 Ngăn chặn sự tiến triển của các mảng vữa xơ

 Cải thiện tính đàn hồi động mạch

7

 Chống oxy hóa, loại bỏ các gốc tự do, đối kháng với tác hại của sựlipoperoxy hóa của lecithin và của LDl- cholesterol sản sinh ra các sản phẩmcuối cùng có hại, vì các sản phẩm có ái lực rất cao với thành động mạch vàgây ra những mảng vữa xơ.

Ngoài ra isofalvone còn có các tác dụng trên các chức năng nhận thức có tácdụng thuận lợi trong điều trị sự suy giảm nhận thức và sa sút trí tuệ ở phụ nữ caotuổi.Vì vậy có thể suy ra là phytoestrogen cũng có thể có các lợi ích tương tự

c) Nâng cao chất lượng cuộc sống của phụ nữ

Làm giảm cường độ bốc hỏa, mất ngủ, trầm cảm, khô âm đạo trong thời kì mãnkinh Giảm số lần đổ mồ hôi đêm, giảm tích mỡ bụng, chống da nhăn, sạm, giảmkhô xơ tóc

Nâng cao chất lượng của da: chống oxy hóa, làm làn da mịn màng, mềm mại,linh hoạt Chống lão hóa: isoflavone đậu nành ngăn ngừa sự suy giảm chức năngbuồng trứng sớm của phụ nữ, do đó trì hoàn sự xuất hiện của mãn kinh, làm chậmquá trình lão hóa Ngăn ngừa được ung thư vú ở phụ nữ

d) Tác dụng phụ có thể gặp với isoflavone đậu nành

Đậu nành và isoflavone của đậu nành dung nạp tốt, loại trừ một vài trường hợphiếm gây rối loạn nhẹ đường tiêu hóa Người dị ứng với rau đậu cũng có thể bị dịứng với thức ăn chế biến từ đậu nành (sữa đậu nành, đậu phụ, bột đậu nành, )

e) Ứng dụng của isoflavone

Isoflavone được bổ sung dùng làm dược phẩm chức năng để chống lão hóa, chống ung thư, làm đẹp, cân bằng nội tiết tố nữ thời mãn kinh

Một số thực phẩm chức năng như:

- Tinh chất mầm đậu nành No- GMO soy isoflavone: được

làm từ đậu nành không biến đổi gen, cung cấp isoflavone

cho phụ nữ tuổi tiền mãn kinh, giảm nguy cơ tim mạch, ung

thư Mỗi viên No-GMO SOY isoflavone có chứa:

8

- Thuốc bổ cho phụ nữ calcium 600+ vitamin D3 with soy isoflavones bổ sungthêm isoflavone cho phụ nữ Hai viên có chứa 1200 mg canxi, 40 IU vitamin D và

50 mg isoflavone đậu nành

- Active- memmo là một thực phẩm chức năng có bổ sung isoflavone Đây là hợpchất giống estrogen, giúp cân bằng nội tiết tố nữ,duy trì tuổi thanh xuân Trong mỗiviên active-meno có bổ sung 50 mg isoflavone và ngoài ra sản phẩm còn có vitamin

B1, B12, B6

Hình 1 8 Calcium 600+ vitamin D3 with soy

Hình 1 9 Active- Meno

isoflavone

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.3.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Hiện nay, trên thế giới việc nghiên cứu chiết isoflavone từ đậu nành rất phổbiến và đang được quan tâm bởi những tác dụng tuyệt vời mà hợp chất này manglại Nước và ethanol là 2 dung môi được nhiều tác giả sử dụng để chiết xuấtisoflavone vì tính thân thiện với môi trường và không độc hại của chúng Để chiếttách được isoflavone ta cần phải lựa chọn được dung môi trích ly: đó là các dungmôi hòa tan được các hợp chất cần trích ly Isoflavone là các hợp chất phân cực nênchủ yếu sử dụng dung môi phân cực

Nhiều tác giả nghiên cứu chiết xuất isoflavone từ đậu nành sử dụng các dungmôi khác nhau như: methanol, ethanol, acetonitrile hoặc với dimethyl sulfoxide(Barne et al 1994; Lin và Giusti, 2005; Luthuria et al 2007) Tuy nhiên, ứng dụngtrong công nghiệp thì ethanol và nước vẫn là dung môi ưa thích vì ý nghĩa môitrường và có lợi sức khỏe cho người tiêu dùng

Các tài liệu công bố khác cũng thường sử dụng một số dung môi như: MeCN,EtOH, MeOH, ACE, Trong đó một số nghiên cứu đã so sánh và cho kết quả:

9

Theo nghiên cứu của Eldrige (1982) sử dụng dung môi MeOH và EtOH;etylacetate và MeCN với đậu nành tách béo để trích ly isoflavone Theo đánh giánày 80% MeOH sẽ cho hiệu quả trích ly isoflavone là cao nhất

Một nghiên cứu đi tiên phong của Murphy (1981) đã so sánh những dung môikhác nhau như: MeOH, ACE, MeCN và chloroform –MeOH kết quả đã chỉ ra rằngvới dung môi tinh khiết thì nó sẽ làm tăng hiệu quả trích ly tổng hàm lượngisoflavone và theo nghiên cứu này thì MeCN cùng với nước hoặc acid thì cho hiệuquả trích ly cao hơn các dung môi còn lại

Năm 1990 Viện ung thư quốc gia Mỹ đã xem xét vai trò của đậu nành trongphòng bệnh ung thư và xác định ở đậu nành có 5 nhóm chất chống ung thư Trong

đó người ta đặc biệt chú ý đến tác dụng chống ung thư của isoflavone, một nhómhóa chất gần như không tồn tại trong các thực phẩm khác ngoài đậu tương Mộttrong các isoflavone của đậu nành được nghiên cứu nhiều nhất trong 7-8 năm qua

là genistein Hơn 50 công trình nghiên cứu của các trường đại học danh tiếng trênthế giới đã chỉ ra rằng genistein có khả năng ngăn chặn sự phát triển của khối u.Bên cạnh ngăn cản sự hình thành các mạch máu mới (một điều kiện tiên quyết đểkhối u phát triển), genistein còn ức chế các men (enzim) trong các loại tế bào ungthư, và do đó nó được coi là chất có khả năng phòng chống nhiều ung thư khácnhau

a) Tại Hàn Quốc

Các nhà khoa học đã thực hiện nghiên cứu so sánh thành phần isoflavone trongphôi, lá mầm, vỏ hạt và hạt đậu nành Trong quá trình nghiên cứu, các khoa học gianhận định, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp tối ưunhất để phân tách isoflavone từ các mẫu thí nghiệm Quá trình phân tách được thựchiện như sau:

Chín mẫu đậu nành sử dụng trong thí nghiệm có cỡ hạt đa dạng từ trung bìnhđến lớn, trọng lượng 25-40g/100 hạt Điều kiện chăm sóc và gieo trồng các mẫu tốt,thu hoạch vào vụ mùa 2004 tại Hàn Quốc, sau đó cất giữ, bảo quản trong kho vàđem phân tích vào năm 2005 Mẫu được sơ bộ qua máy nghiền để tách riêng cácthành phần: phôi, mầm, vỏ hạt Các mẫu được để khô, làm sạch, sau đó nghiềnthành bột mịn Trộn 2 gram bột mẫu với 10ml axetonitrile (ACN) và 2ml HCl 0.1N.Hỗn hợp được để trong 2h ở nhiệt độ phòng trước khi đem lọc qua giấy lọc

10

Whatman Sau khi lọc kiệt, dịch cô được để lạnh khô ở -40 rồi hòa tan lại trong 10ml metanol 80% là lọc qua tia lọc 0,40 m.

Phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp dựa theo phương pháp đã được thực hiện bởiWang và Murphy (1994) và Kim, Jung, Ahn và Chung (2005).Hệ thống sắc ký lỏnghiệu năng cao được sử dụng để nghiên cứu gồm: máy sắc lỏng cao áp hãngShimadzu, sử dụng detector photodiot array phân giải cao ( hãng SPD M 10A) cùngvới lắp cột sắc kí 250mm x 4,6mm I.D x 5 , quá trình dò bằng dectector UV 254nm

Bộ tổng hợp dung môi linear HPLC gradient, sử dụng pha động gồm dung môi

A ( 0,1% glacial axetic axit trong nước cất) và dung môi B (0,1% glacial axetic axittrong ACN ).Bơm 20 mẫu vào máy sắc ký lỏng cao áp Qúa trình tách các peak tốtnhất khi dung môi B tăng từ 15% đến 35% trong thời gian 60 phút, giữ ở 35% trong

5 phút, và trở về 15% trong 5 phút với tốc độ dòng 1ml/phút Tổng thời gian phântách một mẫu trong khoảng 85 phút, sau đó chuyển sang mẫu kế tiếp

Cả dung môi và nước cất sử dụng trong sắc ký lỏng cao áp HPLC phải đạt độtinh khiết 99,9% và đã hút chân không

1.3.2 Các nghiên cứu trong nước

So với thế giới thì việc tiến hành nghiên cứu, tận dụng nguồn nguyên liệu từcông nghiệp thực phẩm vẫn còn hạn chế Đặc biệt việc nghiên cứu chiết táchisoflavone từ hạt đậu nành vẫn chưa được quan tâm chú trọng khi mà hằng năm córất nhiều địa phương trồng đậu nành

Việc nghiên cứu chiết tách isoflavone ở trong nước cũng đã có một vài nghiêncứu nhưng người ta tiến hành khai thác hoạt chất quý này ở các loại thực vật: sắndây, cỏ ba lá, cỏ linh lăng và trong đó có đậu nành là nguồn nguyên liệu giàuisoflavone nhất Theo tác giả Đỗ Hoa Viên (2004) đã tiến hành tách chiết

11

phytoestrogen (isoflavone) từ đậu tương và sắn dây, sau đó tiến hành định tính đểnhận biết sự có mặt của isoflavone nhờ HPLC Kết quả, tác giả đã khẳng định được

sự có mặt của isoflavone và định lượng được 2 cấu tử có trong isoflavnone là:Genistein và Daidzein

Trong nước theo PGS.TS Đỗ Thị Hoa Viên khi tiến hành chiết isoflavone từđậu nành cũng đã thực hiện các bước theo quy trình sau:

Hạt đậu nành

cho dung môi chiết

chiết bằng cách lắc (144 vòng/phút, 60phút, 20 ) 

lọc chân không 

cô chân không (hỗn hợp cao chiết)

sắc ký bảnmỏng

Có thể nói, tính cho đến thời điểm hiện nay thì vẫn chưa có công trình nghiêncứu nào tiến hành khai thác các isoflavone từ hạt đậu nành một cách hoàn chỉnh

1.4 Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC [4]

HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc kýlỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi làsắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)

Phương pháp này ra đời năm 1967 – 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từphương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển

và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích

1.4.1 Khái niệm

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động làchất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểuphân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã đượcbiến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựatrên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử)

1.4.2 Nguyên tắc của các quá trình sắc ký

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký vàloại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ Nếu pha tĩnh làchất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc

ký phân bố hay sắc ký chiết Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử.Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có một phađộng Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B,C… vào cột phân tích, kết quả là các chất A, B, C… sẽ được tách ra khỏi nhau sau

12

khi đi qua cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tươngtác.

Hình 1 10 Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trướctiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại Đối với mỗi chất, sự lưugiữ được quy định bởi ba lực F1, F2, F3 Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định,còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2

là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột Như vậy với các chấtkhác nhau thì F1 và F2 là khác nhau Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyểntrong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột như hình 1.11

Phađộng

+ Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP): pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực.Loại sắc ký này được áp dụng rất rộng rãi, thành công để tách các hỗn hợp cácchất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực, phân cực yếu haytrung bình Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo (RP).Một số loại cột như: cột C18, cột C8, cột Diol –Si-(CH2)2-O-CH2-CH(OH)-

CH2OH, cột aminopropyl –Si-(CH2)3- NH2, cột cyanopropyl –Si(CH3)2-(CH2)3CN…

to

• t0 : thời gian lưu chết

• trA: thời gian lưu chất A trB: thời gian lưu chất B

• t’rA: thời gian lưu thực chất A t’rB: thời gian lưu thực chất B

Hình 1 12 Sắc ký đồ của chất A và chất B.

a) Thời gian lưu thực t’ R

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khichất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định vàcác chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đãchọn Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất Thời gianlưu phụ thuộc vào các yếu tố:

14

+ Bản chất sắc ký của pha tĩnh.

+ Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

+ Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

+ Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha độngTrong một phép phân tích nếu tR’ nhỏ quá thì sự tách kém Còn nếu tR’ quá lớnthì peak bị doãng và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất dài đồngthời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác củaphép phân tích kém Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố đã trìnhbày ở trên

b) Hệ số dung lượng K’

Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong haipha động với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượngchất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng

Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém Nếu K’ lớn thì peak bị doãng.Trong thực tế K’ từ 1 - 5 là tối ưu

c) Độ chọn lọc α

Độ chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi hai chất A và B

có K’A và K’B khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn

lọc (với K’B > K’A)

( với càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng)

Hình 1 13 Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách peak của hai chất A và B

d) Số đĩa lý thuyết

Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc

ký nhất định Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký giống như là một lớp pha tĩnh có

15

chiều cao là H Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phântách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trungbình của chất tan trong pha tĩnh và pha động.

Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố:

+ Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh

+ Tốc độ và độ nhớt (độ phân cực) của pha động

+ Hệ số khuếch tán của các chất trong cột

Vì vậy với một điều kiện sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định

Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức sau:

Trong đó, - tR là thời gian lưu của chất phân tích

- W0,5 là độ rộng tại ½ của peak Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ

e) Độ phân giải

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên mộtđiều kiện sắc ký đã cho Độ phân giải của hai peak cạnh nhau phải được tính theocông thức sau:

Trong thực tế nếu các peak cân đối thì độ phân giải tối thiểu để hai peak táchnhau là R = 1,0 Trong phép định lượng R = 1,5 là phù hợp

 Nếu R nhỏ thì các peak chưa tách hẳn, việc tính toán diện tích peak sẽ không chính xác, lúc này phải tìm cách tăng R theo ba cách sau:

 Làm thay đổi K’ bằng cách thay đổi lực rửa giải của pha động (thay đổi độ phân cực nếu là RP - HPLC, thay đổi cường độ ion nếu là IE – HPLC )

 Làm tăng số đĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dài hơn hoặc cột có kích thước nhỏ hơn

 Làm tăng độ chọn lọc bằng cách dùng cột khác phù hợp hơn với quá trình tách hoặc thay đổi thành phần pha động

 Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, độ nhạy sẽ

16

kém Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ pha động hay dùng chương trình gradientdung môi Tuy nhiên trong quá trình chạy sắc ký nếu dùng chương trình dung môithì một số pha động có tỷ lệ thay đổi sẽ kéo theo sự thay đổi đường nền làm ảnhhưởng rất lớn đến thời gian lưu và diện tích của các peak ta phân tích.

Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình gradient dung môi mà chủyếu là chúng ta phải tìm được hệ pha động rửa giải phù hợp, đáp ứng các yêu cầutrong quá trình phân tích

f) Hệ số không đối xứng

Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của peak trên sắc ký

đồ thu được T được tính bằng tỷ số độ rộng của hai nửa peak tại điểm 1/10 chiềucao peak:

Hình 1 14 Cách tính hệ số không đối xứng của peak.

Peak dạng đối xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được vì vậy phải quan tâmđến hệ số không đối xứng T

 Khi T 2,5 thì phép định lượng được chấp nhận

 Khi T > 2,5 thì điểm cuối của peak rất khó xác định, vì vậy phép định lượngcần phải thay đổi các điều kiện sắc ký để làm cho peak cân đối hơn theo cáccách sau:

+ Làm giảm thể tích chết tức là đoạn nối từ cột đến detector

+ Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên

+ Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu hay giảm thể tích tiêm mẫu

1.4.5 Hệ thống HPLC

17

4 - Bộ phận tiêm mẫu (tiêm bằng

syringe hay auto sampler)

6 - Đầu dò detector (nhận tín hiệu)

7 - Hệ thống máy tính điện tử cài đặtphần mềm nhận tín hiệu, xử lý số liệu

và điều khiển toàn bộ hệ thống

Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùngmột lúc mà chúng ta chỉ sử dụng tối đa là 3 hoặc 2 đường để cho hệ pha động luônđược pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổnđịnh Hiện 4 đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải gradient dung môitheo thời gian và công tác xây dựng tiêu chuẩn

Lưu ý: Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và

có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích Các hóachất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết phântích và phải lọc qua hệ thống lọc 0,2 – 0,45 µm nhằm mục đích tránh làm hỏng cột

18

sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra các peak tạp trong quá trình phân tích.

b) Bộ phận khử khí

Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môipha động Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọtkhí thì một số hiện tượng sau đây sẽ xảy ra:

 Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gianlưu của peak thay đổi

 Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì

có thể Pump sẽ không hút được dung môi khi đó áp suất không lên và máysắc ký sẽ ngừng hoạt động

Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai

c) Bơm cao áp

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký Bơmphải tạo được áp suất cao khoảng 3000 - 6000 PSI hoặc 250 - 500 atm (1atm = 0,98bar) và bơm phải tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 9,999 ml/phút Hiệnnay đã có nhiều loại pump có áp suất rất cao lên đến 1200 bar

Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối đa 412 bar Tốc độdòng 0,1- 9,999 ml/phút Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt

d) Bộ phận tiêm mẫu

Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy Với

dung tích của loop là 5 – 100 l

Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột: bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng syringe)

và tiêm mẫu tự động (auto sampler)

e) Cột sắc ký

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10 – 30 cm,

đường kính trong 1- 10 mm, hạt chất nhồi cỡ = 5 - 10 m Ngoài ra còn có một

số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt …

Với chất nhồi cột cỡ = 1,8 - 5 m có thể dùng cột ngắn 3 - 10 cm và nhỏ(đường kính trong 1 - 4,6 mm) loại cột này có hiệu năng tách cao Chất nhồi cột tùytheo loại cột và kiểu sắc ký Thông thường chất nhồi cột là silicagel (pha thường)

19

hoặc là silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo),ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm oxid, polyme xốp, chất traođổi ion

Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấphơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong thiết bị điều nhiệt Lưu ý: tuyệt đối khôngđánh siêu âm vì sẽ làm hư cột

f) Đầu dò

Đầu dò (hay còn gọi là detector) là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏicột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theotính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp vàphải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích

độ dẫn điện; độ dẫn nhiệt; chiết suất

Trên cơ sở đó người ta chế tạo các loại detector sau:

 Detector quang phổ tử ngoại từ 200 đến 380 nm

 Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV/Vis): từ 190 đến 900 nm.

 Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tựnhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang Đây là loại detector có độ chọnlọc cao nhất

 Loại hiện đại hơn có detector Diod Array, ELSD (detector tán xạ bay hơi) cácdetector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ

hấp thu cực đại của các chất

 Detector điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng…

 Detector chiết suất vi sai: detector khúc xạ.

 Detector đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt.

20

g) Bộ phận ghi tín hiệu

Để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang

 Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của peak, chiều cao…

 Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất

cả các thông số, phổ đồ và các thông số của peak như tính đối xứng, hệ số phângiải trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầucủa người sử dụng như: nồng độ, RSD, SD

h) Thiết bị in dữ liệu

Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện hồ sơ

1.4.6 Phương pháp chọn điều kiện sắc ký

Muốn có một kết quả tốt nhất ta phải tìm được các điều kiện sắc ký tốt nhất cho một hỗn hợp mẫu, các điều kiện đó bao gồm:

 Pha tĩnh gồm: loại pha tĩnh và kích thước cột.

 Pha động: - Thành phần và tỷ lệ, pH, tốc độ dòng, nhiệt độ… nếu là chương trình rửa giải isocratic

- Thành phần và tỷ lệ, pH, tốc độ dòng, nhiệt độ vàchương trình dung môi… nếu là chương trình rửa giải gradient

a) Lựa chọn pha tĩnh

Dựa vào các tài liệu, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phântích; ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp có thể là cột pha thường, cột pha đảo hay cácloại cột khác nhau…

Thông thường ngành ta dùng 2 loại cột pha thường (NP) và cột pha đảo (RP).Ngoài ra ta có thể dùng một số loại cột khác như cột cyanopropyl, cột aminopropyl,cột diol

Cột pha thường (NP): silicagel trung tính

 Pha tĩnh: loại cột này dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân cực Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm – OH phân cực ưa nước

 Pha động : dùng cho loại này là các dung môi không phân cực hay ít phân cực như: methanol, benzen, acetonitril, chlorofom …

Cột pha đảo (RP): silicagel đã alkyl hóa

21

 Pha tĩnh: loại cột này dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, cácchất phân cực có thể tạo cặp ion Trên bề mặt hoạt động các nhóm – OH đã bị alkylhóa tức là thay thế nguyên tử H bằng các mạch carbon thẳng (C8 hay C18 tươngđương RP-8 hay RP-18) hay các mạch carbon vòng (phenyl- tương đương cộtphenyl) Vì thế nó ít phân cực hay phân cực rất ít.

 Pha động : Pha động dùng trong loại này là các dung môi có phân cực như:methanol, acetonitril, nước hay các loại dung dịch đệm, hỗn hợp của các dung môi -đệm

Sự tách của chất nhồi loại cột này có độ lặp lại cao và hiện nay chúng ta chỉ sửdụng loại này là chủ yếu

Pha động có thể làm thay đổi: độ chọn lọc α, thời gian lưu, hiệu năng tách củacột, độ phân giải, tính đối xứng của peak

Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành phầnphù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp các chất cần phântích Chính vì vậy pha động cần có các yêu cầu sau:

 Pha động phải trơ với pha tĩnh Không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học ( ví dụ giá trị pH: 2,5 < pH < 8,5)

 Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúngđặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phùhợp để không làm tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột

Ví dụ: đệm phosphat rửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên cột

 Pha động phải bền vững theo thời gian: càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất làpha động không bị phân hủy trong suốt thời gia phân tích mẫu

 Phải có độ tinh khiết cao: dung môi cho HPLC, hoá chất tinh khiết phân tích

 Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.

22