Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật

MỤC LỤC I. VAI TRÒ CỦA BẢO QUẢN VI SINH VẬT. 3 II. CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT. 4 1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật: 4 a. Cấy truyền trên môi trường dịch thể: 4 b. Cấy truyền trên môi trường thạch: 5 c. Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch dưới lớp dầu khoáng 6 d. Phương pháp làm mất nước trong môi trường bảo quản: 6 2. Phương pháp đông khô vi sinh vật và phương pháp đông khô trực tiếp: 8 a. Phương pháp đông khô: 8 b. Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (Ldrying): 12 3. Phương pháp bảo quản lạnh sâu: 14 III. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHỔ BIẾN SỬ DỤNG TRONG BẢO QUẢN CÁC NHÓM VI SINH VẬT CỤ THỂ 16 1. Các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn 16 1.1. Bảo quản vi khuẩn 16 1.2. Bảo quản xạ khuẩn: 18 2. Bảo quản vi tảo 19 3. Các phương pháp dùng cho bảo quản nấm sợi 19 4. Phương pháp bảo quản nấm men: 24 III. DỤNG CỤ VÀ TRANG BỊ TRONG BẢO QUẢN GIỐNG: 25 1. Ống và giá đựng giống 26 2. Bình và thùng bảo quản: 26 3. Chống đông 28 VAI TRÒ CỦA BẢO QUẢN VI SINH VẬT. Công tác bảo quản giống vi sinh vật có ý nghĩa rất lớn trong mọi phòng nghiên cứu và trong công nghiệp vi sinh vật. Nó không chỉ đơn thuần giữ những chủng giống trên một vài môi trường dinh dưỡng thông thường và định kỳ cấy chuyền, mà phải làm thế nào để giống sống sót và giữ được những đặc tính ban đầu. Vì vậy công tác này tương đối phức tạp và khó khăn. Quá trình nuôi cấy đưa ra giống vi sinh vật có hoạt lực cao vào sản xuất cần qua các bước như sau: phân lập, và tuyển chọn giống, nghiên cứu các đặc tính về hình thái, sinh lý, hoá sinh, tuyển chọn các điều kiện nuôi cấy tối ưu. Bước đầu tiên cần phải chú ý là việc giữ giống sau khi đã phân lập từ đất, nước hay một cơ chất nào đó. Yêu cầu về mặt chọn giống: giống có hoạt lực cao và ổn định với hoạt lực này trong qui trình thích hợp. Giống được chọn lần đầu cũng được giữ cho những lần tiếp theo. Có thể cho rằng : công việc giữ giống liên quan đến công tác nghiên cứu và trong mọi thời gian của các xí nghiệp dùng vi sinh vật. Nếu không giữ được những đặc tính ban đầu của vi sinh vật thì mọi thành quả thu được coi như vô ích. Vì lý do trên mà các nước trên thế giới đã chuẩn bị cho khâu bảo quản giống mang tính tầm cỡ, thành lập các trung tâm, các bảo tàng giống vi sinh vật, các viện nghiên cứu. Nhiệm vụ của các bảo tàng vi sinh vật là: giữ được quần thể các tế bào giống sống sót với tỉ lệ cao và các tế bào này giữ được đặc tính ban đầu để phục vụ cho nghiên cứu và sản xuất. Nhưng cũng có những vi sinh vật không có khả năng sống và duy trì những đặc tính ban đầu. Thông thường một chủng giữ lâu trên môi trường dinh dưỡng và cấy chuyền nhiều lần có thể có những biến đổi. Như vậy cần phải chọn lựa giống và phương pháp bảo quản thích hợp để cho các thế hệ con cháu của nó không sinh ra các đột biến. Người ta chọn những khuẩn lạc riêng lẻ có những đặc điểm đặc trưng. Chọn như vậy sẽ được những tế bào cùng loại, về nguyên tắc khó gặp những thể đột biến, nhưng cũng có thể gặp phải sự xuất hiện hoặc tập trung thể đột biến, nhưng cũng có thể gặp phải sự xuất hiện hoặc tập trung thể đột biến ở chủng ban đầu. Sau khi đã chọn được những chủng cần phải tiến hành bảo quản ngay. Ngày nay có nhiều phương pháp bảo quản giống vi sinh vật. Phần nhiều những phương pháp này giữ chủng giống ở trạng thái tiềm sinh và định kỳ cấy chuyền ở môi trường thích hợp. Trong trạng thái tiềm sinh hầu như không xảy ra quá trình sống hoặc với mức độ thấp. Bảo quản ở trạng thái này cho phép giữ được những tính chất quí hiếm ban đầu. Sự lựa chọn những phương pháp bảo quản tuỳ thuộc vào khả năng của từng phòng thí nghiệm. CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thích hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giác và để trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng vi sinh vật này được chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thích hợp. Quá trình này được lặp lại trong một thời hạn nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Thực tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp với phương pháp bảo quản này như: Staphylococi, Coliform... có thể sống được vài năm theo cách này. Cho dù phương pháp này là phương pháp khá phổ biến được dùng trong các cơ sở nghiên cứu và sử dụng các chủng vi sinh vật đặc biệt là các chủng đang dùng cho nghiên cứu. Ưu và nhược điểm của phương pháp: Ưu điểm: Phương pháp này đơn giản, dễ làm, thời gian bảo quản không lâu. Nhược điểm: Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống gốc. Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữu các chủng trong quá trình bảo quản. Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp đối với các chủng bảo quản. Tốn nhiều công sức để cấy truyền. Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không thích hợp. Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến xuất hiện sau mỗi lần cấy truyền. Cấy truyền trên môi trường dịch thể: Cách tiến hành rất đơn giản là chuẩn bị 10 ml môi trường nuôi cấy nấm men (thông thường là môi trường YM Yeast extract – Maltose) trong lọ McCartney khử trùng ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút. Thường làm 2 lọ cho mỗi chủng bảo quản. Một vòng que cấy chủng nấm men bảo quản được đưa vào môi trường bằng thao tác vô trùng và giữ ở 25°C trong 72 giờ. Phải kiểm tra sự phát triển của chủng bảo quản. Sau đó các mẫu được giữ ở 4°C. Thông thường theo cách này thời gian bảo quản các chủng thường thay đổi từ 2 6 tháng. Cấy truyền trên môi trường thạch: Cấy truyền trên môi trường thạch tương tự như môi trường dịch thể nhưng ở đây môi trường được bổ sung thạch (1.6%). Giống sau khi cấy được giữ trong 72 giờ ở nhiệt độ thích hợp để đạt độ phát triển cần thiết, sau đó được để ở 48oC. Theo phương pháp này giống có thời gian sống lâu hơn phương pháp cấy truyền dịch thể, thông thường giống được bảo quản từ 36 tháng. Thời gian bảo quản có thể được kéo dài từ 23 năm nếu như các ống giống được bảo quản trong dầu parafil đã thanh trùng và được đổ lên trên môi trường thạch sao cho tạo một lớp dày khoảng 1cm. Hình 1. Bảo quản bằng phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch Giống vi sinh vật được giữ trên môi trường thạch nghiêng (đối với các giống vi sinh vật hiếu khí) hoặc trích sâu vào môi trường thạch (đối với vi sinh vật kỵ khí). Các ống giống được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 3 5°C. Định kỳ để cấy truyền giống, tuỳ từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà định kỳ cấy truyền khác nhau, song giới hạn tối đa là 3 tháng. Để công tác giữ giống được tốt, lâu hơn và đỡ bị tạp hơn, người ta thường phủ lên môi truờng đã được cấy giống vi sinh vật một lớp dầu khoáng như paraffin lỏng. Lớp paraffin này sẽ hạn chế được sự tiếp xúc của vi sinh vật đối với oxy không khí (O_2) và hạn chế sự thoát hơi nước của môi trường thạch, do vậy giống có thể bảo quản được lâu hơn và không bị nhiễm tạp, thoái hóa. Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch dưới lớp dầu khoáng Để khắc phục nhược điểm của phương pháp cấy chuyền nhiều lần cụ thể là hạn chế sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian bảo quản, tránh cho lớp thạch môi trường bị khô dần và giống có thể bị chết, thì phủ lên môi trường thạch có vi sinh vật phát triển một lớp dầu khoáng parafin dày khoảng 10mm. Lớp parafin này sẽ hạn chế sự tiếp xúc của vi sinh vật với oxygen không khí và hạn chế sự thoát hơi nước của môi trường thạch nên nồng độ các chất hoà tan không bị thay đổi, do đó áp lực thẩm thấu cũng không bị thay đổi nên không gây hại đến đời sống của vi sinh vật. Những chủng đã được xử lý ở trên, sau đó được giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 50°C và có thể bảo quản nhiều năm. Cần phải giữ sao cho duy trì sự sống được tốt mà không tạo nên ưu thế sinh sản. Đối với mỗi chủng phải thử và chọn phương pháp bảo quản thích hợp. Phương pháp giữ giống với dầu khoáng tương đối thuận tiện và cho kết quả tốt. Giống bảo quản dưới lớp dầu khoáng sau 12 tháng vẫn giữ được hình dáng bề ngoài bình thường. Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi để giữ nhiều giống vi sinh vật như: nấm men, nấm mốc,vi khuẩn, xạ khuẩn…. Phương pháp làm mất nước trong môi trường bảo quản: Phương pháp này thường dùng cho các chủng nấm sợi và nấm men. Theo phương pháp này các chủng vi sinh vật có thể được bảo quản với các chất mang phổ biến như sau: Bảo quản giống vi sinh vật trong cát: Dùng cát sông rửa sạch bằng nước nhiều lần (đến khi nước không đục), sấy khô, sàng qua rây lỗ nhỏ để loại đất và rác bẩn. Có thể dùng acid clohyric đặc để oxy hoá các chất hữu cơ (đun nóng 100°C và rửa lại bằng nước). Sấy khô ở 120°C trong 3 4 giờ. Chia cát khô vào ống nghiệm thuỷ tinh đã sấy thanh trùng ở 160180°C khoảng 2 giờ. Ta có thể kiểm tra độ vô trùng của cát bằng cách cho môi trường dịch đường hoá và thịt pepton vô trùng vào ống cát đã hấp thanh trùng. Sau đó cho vào tủ ấm 2830°C khoảng một tuần. Quan sát hàng ngày nếu thấy loại dịch này đục thì coi như cát chưa vô trùng. Đổ cát đã chuẩn bị vào các ống nghiệm giống đã thanh trùng sao cho cát không rơi vào mặt thạch, không dính lên thành ống nghiệm. Úp mặt thạch, dùng que cấy cào bào tử vào cát. Đổ cát có bào tử vào ống nghiệm vô trùng lắc đều. Chỉ bảo quản những ống cát vào bào tử khô không bị ướt và vón cục, các ống cát giống đậy bằng nút bông. Dùng parafin nóng chảy phết lên nút bông của ống nghiệm giúp cho ống giống không bị ẩm ướt và giữ ở nhiệt độ phòng hay ở 46°C. Phục hồi chủng bằng cách dùng que cấy lấy cát trong ống và cấy vào các ống thạch nghiêng, sau đó chọn lựa và cấy chuyền tiếp theo. Phương pháp bảo quản này chủ yếu áp dụng cho những nhóm vi sinh vật sinh bào tử như nấm mốc và xạ khuẩn. Bảo quản giống trong đất khô: Nghiền đất và rây lấy những hạt bằng nhau. Chia đất nghiền vào các ống nghiệm thêm 12 giọt nước,có thể thêm 12% 〖CaCO〗_3 để trung hoà các loại đất chua hoặc cho một ít than hoạt tính vào đáy ống để cho đất sau khi thanh trùng luôn khô. Đậy bông và để các ống nghiệm có đất vào giỏ đem hấp thanh trùng hai lần ở 120°C một giờ cách nhau một ngày. Kiểm tra độ vô trùng của môi trường giữ giống như đối với cát và giữ giống trong đất như là ở cát. Ngoài ra ta có thể giữ giống trong hỗn hợp cát và đất. Phương pháp này bảo quản thành công với giống Clostridium pasteurianum. Giữ giống trên hạt: Có thể giữ bào tử nấm mốc, xạ khuẩn trên các hạt thực vật khác nhau. Ở Liên Xô cũ thường bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng sinh trên hạt kê: chọn hạt kê vàng đã làm sạch, cho vào nước sôi khuấy trộn đều, giữ 30 phút cho các hạt thấm ẩm hoàn toàn rồi lọc. Tãi kê ẩm ra trên mặt khay để xoa cồn, làm nguội và các hạt phải rời nhau, rồi cho vào từng lọ (khoảng 1516 g mỗi lọ thể tích 250ml). Các bình đậy nút kín và thanh trùng ở 115°C khoảng 3040 phút. Thử vô trùng giống các phương pháp trên. Cấy vào mỗi bình 2 ml dịch huyền phù bào tử hay khuẩn ty dinh dưỡng. Lắc nhẹ cho giống đều trên các hạt kê và nuôi ở nhiệt độ 2428°C trong 8 ngày. Sau đó sấy trong các thiết bị chân không đến khi độ ẩm kê có giống phát triển không quá 8%. Kiểm tra giống và tráng parafin lên nút bông. Bảo quản ở nhiệt độ phòng trong tối và khô. Bảo quản trên giấy: Các chủng nấm men và nấm sợi được làm khô trên giấy và sau đó được bọc bằng giấy bạc và đựng trong hộp kín. Ưu thế của phương pháp này là bảo quản được lượng mẫu lớn. Bảo quản trên gelatin: Để thực hiện phương pháp này, người ta tạo dịch huyền phù chủng vi sinh vật trong môi trường có gelatin. Sau đó các giọt mẫu được làm khô trong đĩa petri. Phương pháp này có thể bảo quản được vi khuẩn trong vài năm. Phương pháp đông khô vi sinh vật và phương pháp đông khô trực tiếp: Phương pháp đông khô: Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số virut. Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động vật. Hình 2. Đông khô vi sinh vật. Đây là phương pháp phổ biến được sử dụng tại mọi bảo tàng vi sinh vật trên thế giới. Phương pháp đông khô hạn chế được sự thay đổi các đặc tính của vi sinh vật và bảo quản được trong một thời gian dài. Phương pháp lạnh đông giữ giống dựa trên nguyên tắc ức chế sự phát triển của vi sinh vật bằng cách đưa chúng vào nhiệt độ lạnh sâu ở –25°C đến –70°C. Để đảm bảo tế bào vi sinh vật không bị chết khi bị làm lạnh sâu ta cần trộn sinh khối của giống cần bảo quản với dung dịch bảo vệ (hay còn gọi là dung dịch nhũ hoá) như glycerin 15%, huyết thanh ngựa, dung dịch glucose hay lactose 10%. Việc làm tiến hành từ từ lạnh được, khi độ lạnh đạt –20°C việc tiếp tục làm lạnh cần đạt tốc độ 12°C phút. Với phương pháp này cũng cấy chuyền và làm lại, nhưng thời gian giữa các lần cấy chuyền kéo dài hơn so với phương pháp giữ giống trên thạch. Nếu giữ ở t°=15°C đến 20°C : 6 tháng cấy chuyền và làm lại một lần. Nếu giữ ở t°=30°C : 9 tháng cấy chuyền và làm lại một lần. Nếu giữ ở t°=40°C : 1 năm cấy chuyền và làm lại một lần. Nếu giữ ở t°=50°C đến 60°C : 3 năm cấy chuyền và làm lại một lần. Nếu giữ ở t°=70°C : 10 năm cấy chuyền và làm lại một lần. Phương pháp này rất đơn giản và tiện lợi, lại cho hiệu quả bảo quản khá cao. Hiện nay nó là phương pháp sử dụng khá phổ biến để bảo quản giống vi sinh vật. Phương pháp đông khô cũng giống vời phương pháp lạnh đông, tức là vi sinh vật trong quá trình xử lý sẽ được đưa vào nhiệt độ thấp ở nhiệt độ –60°C đến –70°C một cách từ từ với sự có mặt của chất bảo vệ: glutamate 3% hay lactose 1,2% + pepton 1,2% hay saccharose 8% + sữa 5% + gelatin 1,5%… Điều khác biệt với phương pháp lạnh đông là: đảm bảo an toàn hơn cho sự sống của tế bào giống, người ta làm thăng hoa nước ở trong tế bào và môi trường có chất bảo vệ trong thiết bị đông khô với áp suất 1.104 mmHg. Hỗn hợp tế bào giống và dung dịch bảo vệ được chứa trong những ampul thuỷ tinh có =10mm hay =15mm được hàn kín để đảm bảo độ khô và chân không cần thiết, nhưng ampul này được bảo quản ở t°=4 6°C hay nhiệt độ phòng. Phương pháp này d0ược coi là tối ưu cho hiệu suất bảo quản cao nhất vì có thể giữ giống vi sinh vật qua hàng chục năm vẫn có tỷ lệ sống cao và không bị biến đổi về di truyền, đồng thời chiếm diện tích bảo quản ít nhất Phương pháp đông khô được trình bày ở đây là phương pháp được dùng tại NCTC (National Colleciton Type Culture, Anh). 1.Nuôi vi khuẩn cho đông khô: Vi khuẩn được cấy trên môi trường ống thạch nghiêng thích hợp. Tuy nhiên, cũng có thể chuẩn bị dịch vi khuẩn trên môi trường dịch thể nhưng phải làm đậm đặc tế bào bằng li tâm. Tuổi của tế bào cũng rất quan trọng do đó thường chọn tế bào nằm trong pha sinh trưởng log. 2. Chuẩn bị đệm mẫu: Có thể dùng một trong hai loại đệm sau: + Đệm huyết thanh inositol; Mesoinositol: 5 gam Huyết thanh ngựa (số 3): 100 ml Thanh trùng bằng phương pháp lọc vi khuẩn, sau đó phân 5ml vào các bình vô trùng. + Đệm inositol: Môi trường dinh dưỡng bột số 2: 2.5 gam Mesoinositol: 5 gam Nước cất: đủ 100 ml. Phân 5 ml vào các bình và khử trùng tại nhiệt độ 121 3. Chuẩn bị dịch tế bào: Mật độ tế bào có ý nghĩa quan trọng đối với chất lượng bảo quản. Thông thường có thể thu sinh khối từ mỗi ống thạch nghiêng chỉ dùng cho 12 ml đệm pha mẫu để tạo dịch huyền phù tế bào. Mật độ vi khuẩn thông thường cần đạt 1010 (đối với vi sinh vật không có bào tử). Mật độ trên có thể giảm với các vi sinh vật có bào tử. Hai đệm pha mẫu trên có thể dùng với mọi vi khuẩn nhưng trong trường hợp enterobacteria thì không dùng đệm huyết thanh vì sẽ gây ra thay đổi đặc tính miễn dịch của vi khuẩn. 4. Chuẩn bị ống đông khô: Ống đông khô được rửa sạch sau đó ngâm qua đệm với dịch acid loãng (HCl 2%) và lại được rửa sạch, làm khô và chuẩn bị nút bông, ống được thanh trùng khô hoặc khử trùng theo phương pháp thông thường. 5. Chuẩn bị mẫu trước khi đông khô: Lượng dịch huyền phù vi khuẩn được đưa cẩn thận bằng pipet pasteur vào ống đông khô khoảng 0.1 0.2 ml. Chú ý mọi thao tác phải cẩn thận tránh dính mẫu vào thành hay phía trên của ống đông khô. 6. Bước tiền đông khô: Mục tiêu của bước này là làm bay hơi hết nước có thể bị lạnh đông tạo đá. Trước khi tiến hành đông khô mẫu được chuẩn bị qua bước tiền đông (như trình bày ở trên) sau đó bước tiền đông khô tiến hành khi mẫu được lắp vào hệ thống đông khô và quá trình làm mất nước trong điều kiện lạnh được tiến hành khoảng 3 giờ. 7. Tạo chỗ thắt trên ống đông khô: Sau bước tiền đông khô, yêu cầu phải tạo vết thắt. Việc tạo vết thắt được thực hiện với hệ thống đèn hàn. Tuy nhiên, hiện nay các cơ sở bảo quản vi sinh vật sử dụng hệ thống hàn và tạo vết thắt trên thiết bị tự động. 8. Hậu đông khô: Trong bước này mẫu lại tiếp tục được làm khô cho đến độ ẩm cuối cùng đạt khoảng 1%. Thời gian cho bước này có thể thay đổi từ 12 giờ. 9. Hàn ống đông khô: Việc hàn ống trực tiếp trên thiết bị đông khô (manifold) cần có kinh nghiệm và cẩn thận. Trước hết phải tiến hành khoá van và sau đó mới thực hiện thao tác hàn ống đông khô. 10. Kiểm tra độ chân không của ống đông khô: Người ta sử dụng thiết bị là đèn phát hiện mức độ chân không. Với các mẫu đạt độ chân không cần thiết thì xuất hiện màu xanh tím nhạt. Đối với các mẫu không đạt tiêu chuẩn thì không có tín hiệu hoặc màu tím đậm. 11. Kiểm tra khả năng sống của mẫu: Đếm số lượng tế bào là phương pháp chủ yếu để đánh giá chất lượng bảo quản. Việc đếm được thực hiện trước khi và ngay sau khi đông khô. Các bước kiểm tra tiếp theo có thể được thực hiện sau 1 hoặc 5 năm để đánh giá chất lượng của mẫu đông khô. Nói chung khả năng sống của vi sinh vật có bào tử cao hơn vi sinh vật không có bào tử và loại gram dương cao hơn vi sinh vật gram âm. Tuy nhiên, với vi sinh vật kỵ khí thì yêu cầu phải được tiến hành theo đúng qui trình, tránh vi sinh vật tiếp xúc với oxy. 12. Bảo quản mẫu: Mẫu thông thường được bảo quản tại 4OC hay nhiệt độ phòng. Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (Ldrying): Ngoài phương pháp đông khô như mô tả ở trên, còn có phương pháp đông khô trực tiếp. Khác biệt với phương pháp trên ở chỗ dịch huyền phù vi sinh vật được làm khô nhanh ở chế độ chân không thích hợp mà mẫu không cần làm lạnh từ trước. Phương pháp này đặc biệt có ý nghĩa đối với nhóm vi khuẩn không có khả năng sống trong nhiệt độ thấp của giai đoạn tiền đông. Các thông số quan trọng cần được quan tâm khi thực hiện phương pháp này là: Tuổi của vi sinh vật bảo quản. Thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật. Tốc độ đông khô. Nhiệt độ đông khô thấp nhất. Khoảng thời gian làm khô mẫu và độ ẩm cuối cùng của mẫu. Phương pháp đông khô trực tiếp thực hiện tương tự như phương pháp đông khô đã trình bày ở trên và được thực hiện như sau: Chuẩn bị 1, Ống đông khô rửa sạch (sonic cleaner) trong 15 phút sau đó khử trùng 170oC trong 3 giờ. 2, Môi trường Ldrying chuẩn có thành phần như sau: Đệm phosphat: 0.1M : 100 ml. Monosodium glutamat: 3 g Adonitol: 1.5 g. (Khử trùng ở 115°C20 phút). 3, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (1015 ngày). Cách tiến hành: 1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 34 ml môi trường đã thanh trùng ở trên cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử nấm có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau). 2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho mỗi chủng, dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp. Sau đó đậy bằng nút bông hay giấy bạc. 3, Đồng thời bật máy DuraDry, khi mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ 75°C, lần lượt nối ampoule mẫu vào hệ thống manifold (chú ý khoá van chân không khi nối ampoule mẫu với tube manifold sau đó lại mở ra, để đảm bảo độ chân không cần thiết khi làm đông khô phải lần lượt đưa mẫu vào khi tín hiệu đèn chỉ thị cho phép). Khi độ chân không đạt 4548 minitor, nhiệt độ 55°C tiến hành quá trình làm khô trong 3 giờ. 4, Hàn kín ampoule mẫu: Khi máy cô DuraDry đang chạy để đảm bảo độ chân không cần thiết, lần lượt khoá van cho từng ampoule mẫu và tiến hành hàn với các mẫu này tại vị trí ống bị thắt. Dùng ngọn lửa gas để đốt nóng phần ống thắt cho đều các phía và xoay đều cho thuỷ tinh chảy bịt kín ống. Sau đó dùng ngọn lửa gas để cắt rời phần trên (nối với manifold) và phần dưới chứa mẫu. Hết đợt lại khoá các van của các ampoule mẫu tiếp theo và hàn lần lượt như trên. Kiểm tra chất lượng ngay sau khi bảo quản: Để kiểm tra độ sống sót của mẫu nấm sợi bảo quản, có thể thực hiện theo cách đã được mô tả ở phần đông khô. Kiểm tra độ thuần chủng: các mẫu được cấy trên môi trường thích hợp và quan sát hình thái và các đặc điểm sinh học đặc trưng cần thiết để đánh giá khả năng tạp nhiễm và đặc tính sinh học. Thí nghiệm đánh giá nhanh thời gian bảo quản: các mẫu sau đông khô trực tiếp được giữ ở 37°C trong 2 tuần. Độ sống sót của mẫu bảo quản giảm trong 2 tuần ở 37°C tương đương với bảo quản 10 năm ở 4°C. Ưu và nhược điểm của phương pháp: Ưu điểm Phương pháp này nhanh và thuận lợi cho các đợt bảo quản số lượng lớn mẫu. Thời gian bảo quản lâu thông thường theo phương pháp này vi sinh vật được bảo quản từ 1020 năm. Tiết kiệm được công sức và sai sót nhãn mác và tạp nhiễm. Nhược điểm Nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là giá thành thiết bị. Độ ổn định của các chủng vi sinh vật bảo quản theo các đợt đông khô là khác nhau. Hơn thế nữa các chủng trước khi đem ra sử dụng phải được hoạt hoá trên môi trường thích hợp một số lần để phục hồi các đặc tính sinh học. Phương pháp bảo quản lạnh sâu: Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (196°C > 80°C). Hình 3. Bảo quản lạnh sâu Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide). Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như 20°C, 30°C, 40°C, 70°C, 140°C và 196°C. Nói chung mức nhiệt độ cao hơn 30°C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut. Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp vạn năng hơn cả. Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và cả các dòng tế bào động vật. Hình 4. Bảo quản trong nitơ lỏng Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu: Tế bào được nuôi cấy trên môi trường và nhiệt độ thích hợp nhất tại giữa hoặc đầu pha log. Pha dịch tế bào với glycerol hoặc DMSO đã thanh trùng trước để đạt nồng độ cuối cùng 10% và mật độ tế bào 106. Dịch huyền phù tế bào được đưa vào ống lạnh sâu và đóng nắp (trong trường hợp hàn ống thuỷ tinh, cần để trong dịch xanh metylene 0.05% để phát hiện các ống bị rò rỉ). Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào. Trong trường hợp có nitơ lỏng thì mẫu được chuyển sang bình nitơ lỏng. Mẫu đưa vào lạnh sâu cũng cần theo tốc độ nhất định. Thông thường tốc độ lạnh dao động 13°Cphút để đạt tới nhiệt độ 30°C ban đầu. Sau đó mẫu được làm lạnh tiếp với tốc độ cao hơn 1015°Cphút để đạt tới nhiệt độ lạnh cần thiết (100°C đến 80°C). Hiện nay, đã có các thiết bị làm lạnh sâu được chương trình hoá với tốc độ mong muốn. Tuy nhiên, cũng có thể đơn giản hơn là mẫu ban đầu được đặt trong đá khô sau đó lại đưa vào tủ lạnh sâu và đặt thời gian vài giờ để đạt nhiệt độ 65°C. Hoạt hoá mẫu: mẫu trong lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) được hoạt hoá bằng cách làm tan nhanh tới mức có thể (thông thường đưa ngay vào tủ ấm 37°C trong 4060 giây). Như vậy, theo cách trên có thể đạt được khả năng sống 95% tế bào sau 10 năm bảo quản. Ưu và nhược điểm của phương pháp: Ưu điểm: Phương pháp có thể bảo quản tế bào trong thời gian rất lâu, tỉ lệ tế bào còn sống cao. Nhược điểm: Phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro như cháy nổ... Đặc biệt phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến. Phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHỔ BIẾN SỬ DỤNG TRONG BẢO QUẢN CÁC NHÓM VI SINH VẬT CỤ THỂ Các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn Bảo quản vi khuẩn Phương pháp đông khô (Freeze drying lyophilization) Đây là phương pháp phổ biến được sử dụng tại mọi bảo tàng vi sinh vật trên thế giới. Phương pháp đông khô hạn chế được sự thay đổi các đặc tính của vi sinh vật và bảo quản được trong một thời gian dài. Phương pháp đông khô được trình bày ở đây là phương pháp được dùng tại NCTC (National Colleciton Type Culture, Anh). Nuôi vi khuẩn cho đông khô: Vi khuẩn được cấy trên môi trường ống thạch nghiêng thích hợp. Tuy nhiên, cũng có thể chuẩn bị dịch vi khuẩn trên môi trường dịch thể nhưng phải làm đậm đặc tế bào bằng li tâm. Tuổi của tế bào cũng rất quan trọng do đó thường chọn tế bào nằm trong pha sinh trưởng log. Chuẩn bị đệm mẫu: Có thể dùng một trong hai loại đệm sau: Đệm huyết thanh inositol; Mesoinositol: 5 gam Huyết thanh ngựa (số 3): 100 ml Thanh trùng bằng phương pháp lọc vi khuẩn, sau đó phân 5ml vào các bình vô trùng. + Đệm inositol: Môi trường dinh dưỡng bột số 2: 2.5 gam Mesoinositol: 5 gam Nước cất: đủ 100 ml. Phân 5 ml vào các bình và khử trùng tại nhiệt độ 121OC. Chuẩn bị dịch tế bào: Mật độ tế bào có ý nghĩa quan trọng đối với chất lượng bảo quản. Thông thường có thể thu sinh khối từ mỗi ống thạch nghiêng chỉ dùng cho 12 ml đệm pha mẫu để tạo dịch huyền phù tế bào. Mật độ vi khuẩn thông thường cần đạt 1010 (đối với vi sinh vật không có bào tử). Mật độ trên có thể giảm với các vi sinh vật có bào tử. Hai đệm pha mẫu trên có thể dùng với mọi vi khuẩn nhưng trong trường hợp enterobacteria thì không dùng đệm huyết thanh vì sẽ gây ra thay đổi đặc tính miễn dịch của vi khuẩn. Chuẩn bị ống đông khô: Ống đông khô được rửa sạch sau đó ngâm qua đệm với dịch acid loãng (HCl 2%) và lại được rửa sạch, làm khô và chuẩn bị nút bông, ống được thanh trùng khô hoặc khử trùng theo phương pháp thông thường. Chuẩn bị mẫu trước khi đông khô: Lượng dịch huyền phù vi khuẩn được đưa cẩn thận bằng pipet pasteur vào ống đông khô khoảng 0.1 0.2 ml. Chú ý mọi thao tác phải cẩn thận tránh dính mẫu vào thành hay phía trên của ống đông khô. Bước tiền đông khô: Mục tiêu của bước này là làm bay hơi hết nước có thể bị lạnh đông tạo đá. Trước khi tiến hành đông khô mẫu được chuẩn bị qua bước tiền đông (như trình bày ở trên) sau đó bước tiền đông khô tiến hành khi mẫu được lắp vào hệ thống đông khô và quá trình làm mất nước trong điều kiện lạnh được tiến hành khoảng 3 giờ. Tạo chỗ thắt trên ống đông khô: Sau bước tiền đông khô, yêu cầu phải tạo vết thắt. Việc tạo vết thắt được thực hiện với hệ thống đèn hàn. Tuy nhiên, hiện nay các cơ sở bảo quản vi sinh vật sử dụng hệ thống hàn và tạo vết thắt trên thiết bị tự động. Hậu đông khô: Trong bước này mẫu lại tiếp tục được làm khô cho đến độ ẩm cuối cùng đạt khoảng 1%. Thời gian cho bước này có thể thay đổi từ 12 giờ. Hàn ống đông khô: Việc hàn ống trực tiếp trên thiết bị đông khô (manifold) cần có kinh nghiệm và cẩn thận. Trước hết phải tiến hành khoá van và sau đó mới thực hiện thao tác hàn ống đông khô. Kiểm tra độ chân không của ống đông khô: Người ta sử dụng thiết bị là đèn phát hiện mức độ chân không. Với các mẫu đạt độ chân không cần thiết thì xuất hiện màu xanh tím nhạt. Đối với các mẫu không đạt tiêu chuẩn thì không có tín hiệu hoặc màu tím đậm. Kiểm tra khả năng sống của mẫu: Đếm số lượng tế bào là phương pháp chủ yếu để đánh giá chất lượng bảo quản. Việc đếm được thực hiện trước khi và ngay sau khi đông khô. Các bước kiểm tra tiếp theo có thể được thực hiện sau 1 hoặc 5 năm để đánh giá chất lượng của mẫu đông khô. Nói chung khả năng sống của vi sinh vật có bào tử cao hơn vi sinh vật không có bào tử và loại gram dương cao hơn vi sinh vật gram âm. Tuy nhiên, với vi sinh vật kỵ khí thì yêu cầu phải được tiến hành theo đúng qui trình, tránh vi sinh vật tiếp xúc với oxy. Bảo quản mẫu: Mẫu thông thường được bảo quản tại 4OC hay nhiệt độ phòng. Phương pháp giữ trong lạnh sâu Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu: Tế bào được nuôi cấy trên môi trường và nhiệt độ thích hợp nhất tại giữa hoặc đầu pha log. Pha dịch tế bào với glycerol hoặc DMSO đã thanh trùng trước để đạt nồng độ cuối cùng 10% và mật độ tế bào 106. Dịch huyền phù tế bào được đưa vào ống lạnh sâu và đóng nắp (trong trường hợp hàn ống thuỷ tinh, cần để trong dịch xanh metylene 0.05% để phát hiện các ống bị rò rỉ). Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào. Trong trường hợp có nitơ lỏng thì mẫu được chuyển sang bình nitơ lỏng. Mẫu đưa vào lạnh sâu cũng cần theo tốc độ nhất định. Thông thường tốc độ lạnh dao động 13 OCphút để đạt tới nhiệt độ 30OC ban đầu. Sau đó mẫu được làm lạnh tiếp với tốc độ cao hơn 1015 OCphút để đạt tới nhiệt độ lạnh cần thiết (100OC đến 80 OC). Hiện nay, đã có các thiết bị làm lạnh sâu được chương trình hoá với tốc độ mong muốn. Tuy nhiên, cũng có thể đơn giản hơn là mẫu ban đầu được đặt trong đá khô sau đó lại đưa vào tủ lạnh sâu và đặt thời gian vài giờ để đạt nhiệt độ 65OC. Hoạt hoá mẫu: mẫu trong lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) được hoạt hoá bằng cách làm tan nhanh tới mức có thể (thông thường đưa ngay vào tủ ấm 37 OC trong 4060 giây). Như vậy, theo cách trên có thể đạt được khả năng sống 95% tế bào sau 10 năm bảo quản. Một số phương pháp bảo quản khác: Bảo quản trên gelatin và silicagel. Bảo quản xạ khuẩn: Xạ khuẩn mang cả đặc tính của vi khuẩn và nấm sợi (có sợi và bào tử) do đó cần có những phương pháp bảo quản thích hợp. Thông thường xạ khuẩn cũng được bảo quản theo các cách thông thường như cấy truyền, đông khô và lạnh sâu như với vi khuẩn ở trên. Tuy nhiên, có phương pháp kinh tế mà vẫn đảm bảo chất lượng chủng bảo quản mà chúng tôi trình bày ở đây, đó là phương pháp bảo quản trong đất. Các bước tiến hành bảo quản trong đất: Chuẩn bị đất: lấy đất vườn làm khô tại 150 OC trong 6 giờ để làm chết các vi sinh vật có bào tử và trứng giun nếu có. Đất sau khi thanh trùng được nghiền nhỏ qua lưới có kích thước 30 mesh. Đất sau khi nghiền được đưa vào ống nghiệm chuẩn bị nút bông và thanh trùng trong 60 phút. Trước khi tiến hành bảo quản phải kiểm tra nhiễm sự khuẩn trong đất bằng cách cấy vòng que cấy đất từ ống nghiệm đặt vào môi trường giàu dinh dưỡng cho vi khuẩn và giữ ở 24 OC, 28 OC và 37 OC, kiểm tra sau 24 ngày. Chuẩn bị dịch huyền phù xạ khuẩn. Nước cất vô trùng được dùng để tạo dịch huyền phù xạ khuẩn (hay bào tử xạ khuẩn) từ ống thạch nghiêng. Lấy 1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi ống nghiệm và để khô tại nhiệt độ phòng (24OC) trong thời gian 1 tháng. Đập nhẹ vào thành ống cho các hạt tách đều ra và bảo quản mẫu tại 4OC. Hoạt hoá mẫu đơn giản bằng cách lấy vòng que cấy mẫu đưa lên môi trường (thạch hoặc dịch thể) và để ở nhiệt độ thích hợp. Bảo quản vi tảo Vi tảo thông thường được bảo quản theo 3 phương pháp: Cấy truyền, lạnh sâu và đông khô. Các phương pháp đã được trình bày chi tiết trong phần vi khuẩn. Một số điểm cần chú ý khi bảo quản vi tảo là ở chỗ: Nên dùng tế bào già ở pha cân bằng, phương pháp lạnh sâu cho kết quả tốt hơn phương pháp đông khô. Các phương pháp dùng cho bảo quản nấm sợi a. Phương pháp cấy truyền: Phương pháp này thường được ứng dụng với các sợi nấm có bào tử. Các chủng nấm sợi được nuôi trên môi trường thạch thích hợp và để cho sợi nấm phát triển đến mức độ cực đại, sau đó là quá trình hình thành bào tử, các ống giống này sẽ được bảo quản theo các cách khác nhau: Các ống thạch được để trong tủ lạnh (47 OC). Bảo quản trong thạch dưới lớp dầu: Các ống thạch được bảo quản dưới lớp dầu parafin có tỷ trọng tương đối Bảo quản trong thạch dưới lớp dầu: Các ống thạch được bảo quản dưới lớp dầu parafin có tỷ trọng tương đối là 0.83 0.89 đã được khử trùng ở nhiệt độ 121 OC trong 15 phút. Lớp dầu cách bề mặt thạch khoảng 1 cm. Nhiệt độ bảo quản là 1520 OC. Bảo quản trong nước, nấm sợi được nuôi trên môi trường thạch đĩa. Sau khi sợi phát triển cực đại thì cắt thành từng miếng nhỏ kích thước khoảng 6 mm2 và cho vào lọ nước đã thanh trùng. Bảo quản tại nhiệt độ phòng. Bảo quản nấm sợi có bào tử trong silicagel: Chuẩn bị: Lọ đựng silicagel (1015ml) có nắp chịu nhiệt (sắt hay nhựa) thanh trùng ở nhiệt độ 170 oC trong 3 giờ. Silicagel: Loại trong suốt, không có màu, kích thước và số lượng hạt silicagel đưa vào không quá 13 thể tích của lọ, thanh trùng ở nhiệt độ 170 °C trong 3 giờ. Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115OC20 phút). Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng, môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (1015 ngày). Cách tiến hành: Dùng pipet pasteur lấy khoảng 34 ml sữa thanh trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau). Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào lọ đựng silicagel. Chú ý silicagel hút nước và sinh nhiệt do đó việc đưa dịch bào tử vào phải được thực hiện trong chậu nước đá. Lượng dịch bào tử đưa vào không vượt quá 13 thể tích hạt silicagel trong lọ. Sau đó dùng tay lắc đều đảm bảo các hạt silicagel đều dính dịch bào tử nấm sợi. Dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp... Lọ silicagel được đậy nắp cẩn thận nhưng không vặn chặt (nới 1,5 vòng) sau đó giữ trong bình hút ẩm (độ ẩm 3540%), 25OC trong 1 tuần. Vặn chặt nút và quấn giấy parafil giữ trong 4OC. Kiểm tra độ sống sót sau khi bảo quản: Mẫu silicagel ở 4 °C, dùng que cấy vô trùng lấy ra 3 hạt silicagel để trên mặt thạch môi trường mầm thóc (Maltagar), lắc đều cho hạt silicagel tiếp xúc lên mặt môi trường. Để ở nhiệt độ thích hợp, kiểm tra tra khuẩn lạc nấm theo thời gian thích hợp. Bảo quản nấm sợi có bào tử theo phương pháp đông khô (freezdrying): Chuẩn bị: Ống đông khô rửa sạch (sonic cleaner) trong 15 phút sau đó khử trùng 170OC trong 3 giờ. Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115OC20 phút). Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (1015 ngày). Cách tiến hành: Dùng pipet pasteur lấy khoảng 34 ml sữa thanh trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau). Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 0,3 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho mỗi chủng. Dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như mã số chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp. Sau đó đậy bằng nút bông hay giấy bạc. Giữ ở 80°C trong 3 giờ trước khi tiến hành đông khô, đồng thời bật máy DuraStop, khi nhiệt độ đạt 40OC, đưa mẫu vào tủ đông khô của DuraStop, bật máy DuraDry, khi mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ 55OC, tăng nhiệt độ DuraStop lên 5OC, để qua đêm. Tăng nhiệt độ DuraStop lên 25°C, khi đạt nhiệt độ cần thiết, tắt máy hút chân không nhưng không tắt DuraDry. Tắt DuraStop, lần lượt nối tube mẫu vào hệ thống manifold, bật máy DuraDry, tiến hành hàn ống khi độ chân không đạt 4548 minitor, nhiệt độ 55OC. Chú ý: Trong trường hợp chỉ dùng DuraDry có thể được thực hiện như sau: Tiến hành các bước 1,2,3,4 như trên. Mẫu được để tiền đông khô ở 80°C trong 3 giờ. Bật máy Dura Dry, khi đạt nhiệt độ 60oC đến 55oC, độ chân không 45 minitor, gắn ống mẫu với hệ thống manifold tiến hành hàn ống khi độ chân không đạt 4548 minitor, nhiệt độ 55oC. Kiểm tra độ sống sót sau khi đông khô: Mở ống đông khô bằng cách đốt nóng đầu hàn trên đèn cồn và làm lạnh đột ngột bằng cồn đốt Dùng pipet pasteur lấy khoảng 1ml nước cất vô trùng từ ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất vô trùng làm tan đều mẫu đông khô. Hút toàn bộ dịch huyền phù sang ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất. Trộn đều và nhỏ vào 3 vị trí khác nhau (mỗi vị trí 3 giọt) trên môi trường thạch đĩa thích hợp và nghiêng cho dịch chảy đều dọc theo một hướng như hình vẽ: Hình 5. PP kiểm tra độ sống sót của vi sinh vật sau đông khô Sau đó đậy nắp đĩa, bao quanh bằng parafil và để ở nhiệt độ thích hợp. Cách đánh giá: Rất tốt: ≥ 100 khuẩn lạc. Khá: 50 – 100 khuẩn lạc. Trung bình: 1050 khuẩn lạc. Kém: < 10 khuẩn lạc. Không mọc. Bảo quản được thực hiện với các mẫu từ khá trở lên. Tuy nhiên, có một số nấm sợi mà khuẩn lạc mọc tràn lan thì có thể đánh giá như sau: Nếu các khuẩn lạc mọc đều khắp trên bề mặt đĩa là tốt. Mẻ đông khô là thành công nếu như số khuẩn lạc mọc chiếm ít nhất là nửa bề mặt môi trường trong đĩa petri. Các mẫu có số lượng khuẩn lạc mọc dưới mức trên phải làm tăng mật độ bào tử trước khi đông khô như thay đổi môi trường sinh bào tử, hoặc chuẩn bị dịch huyền phù bào tử từ 34 ống nghiệm bào tử nấm sợi. Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp đông khô trực tiếp: Phương pháp đông khô trực tiếp thực hiện tương tự như phương pháp đông khô đã trình bày ở trên và được thực hiện như sau: Chuẩn bị: Ống đông khô rửa sạch (sonic cleaner) trong 15 phút sau đó khử trùng 170oC trong 3 giờ. Môi trường Ldrying chuẩn có thành phần như sau: Đệm phosphat: 0.1M : 100 ml. Monosodium glutamat: 3 g Adonitol: 1.5 g. (Khử trùng ở 115oC20 phút). Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (1015 ngày). Cách tiến hành: Dùng pipet pasteur lấy khoảng 34 ml môi trường đã thanh trùng ở trên cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử nấm có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau). Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho mỗi chủng, dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp. Sau đó đậy bằng nút bông hay giấy bạc. Đồng thời bật máy DuraDry, khi mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ 75oC, lần lượt nối ampoule mẫu vào hệ thống manifold (chú ý khoá van chân không khi nối ampoule mẫu với tube manifold sau đó lại mở ra, để đảm bảo độ chân không cần thiết khi làm đông khô phải lần lượt đưa mẫu vào khi tín hiệu đèn chỉ thị cho phép). Khi độ chân không đạt 4548 minitor, nhiệt độ 55oC tiến hành quá trình làm khô trong 3 giờ. Hàn kín ampoule mẫu: Khi máy cô DuraDry đang chạy để đảm bảo độ chân không cần thiết, lần lượt khoá van cho từng ampoule mẫu và tiến hành hàn với các mẫu này tại vị trí ống bị thắt. Dùng ngọn lửa gas để đốt nóng phần ống thắt cho đều các phía và xoay đều cho thuỷ tinh chảy bịt kín ống. Sau đó dùng ngọn lửa gas để cắt rời phần trên (nối với manifold) và phần dưới chứa mẫu. Hết đợt lại khoá các van của các ampoule mẫu tiếp theo và hàn lần lượt như trên. Kiểm tra chất lượng ngay sau khi bảo quản: Để kiểm tra độ sống sót của mẫu nấm sợi bảo quản, có thể thực hiện theo cách đã được mô tả ở phần đông khô. Kiểm tra độ thuần chủng: các mẫu được cấy trên môi trường thích hợp và quan sát hình thái và các đặc điểm sinh học đặc trưng cần thiết để đánh giá khả năng tạp nhiễm và đặc tính sinh học. Thí nghiệm đánh giá nhanh thời gian bảo quản: các mẫu sau đông khô trực tiếp được giữ ở 37oC trong 2 tuần. Độ sống sót của mẫu bảo quản giảm trong 2 tuần ở 37oC tương đương với bảo quản 10 năm ở 4oC. Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp lạnh sâu 80 oC và nitơ lỏng (196 oC): Chuẩn bị: Chuẩn bị dung dịch glycerol 10% (3 ml trong ống nghiệm) khử trùng ở 121 oC trong 15 phút. Ống nhựa nút xoáy (2 ml), rửa sạch trong sonic cleaner, khử trùng ở 170 oC trong 3 giờ. Chuẩn bị mẫu nấm sợi trên môi trường thạch đĩa có lượng bào tử lớn Cách tiến hành: Dùng pipet pasteur hút khoảng 0,3 ml glycerol đã thanh trùng vào ống nhựa đựng mẫu. Sau đó dùng dao vô trùng cắt lấy 1 miếng nhỏ môi trường chứa cả sợi và bào tử nấm sợi cho vào ống nhựa. Lượng glycerol đủ để phủ lên miếng thạch mẫu, đậy nút và bao băng parafil sau đó dán nhãn. Mẫu trước tiên phải để ở 5oC (tạo điều kiện cho glycerol đi vào tế bào), sau đó được làm lạnh sâu tử 25oC xuống 55oC với tốc độ 1oCphút. Trong trường hợp không có thiết bị làm lạnh thì có thể để 20oC trong 3 giờ, sau đó chuyển sang 80oC hay nitơ lỏng (196oC). Chú ý: Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu thích hợp với hầu hết các nấm sợi sinh bào tử và tế bào có vách ngăn. Nhưng phương pháp này tỏ ra không thích hợp với các nấm sợi không sinh bào tử và không có vách ngăn. Trong trường hợp này cần nuôi cấy nấm sợi trên môi trường thích hợp để tạo bào tử. Nếu không khắc phục được thì phải tiến hành nuôi trên môi trường dịch thể để thu lấy sinh khối và giữ trong glycerol 10% như trên. Đánh giá khả năng sống của mẫu bảo quản: Làm tan mẫu (mẫu lấy từ tủ lạnh sâu 80oC hoặc nitơ lỏng 196oC) trong bể ổn nhiệt 37oC trong 2 phút. Dùng que cấy lấy các miếng môi trường thạch đặt vào 3 vị trí khác nhau trên môi trường thạch đĩa thích hợp. Để ở nhiệt độ thích hợp và xem khả năng mọc sau thời gian thích hợp (24 ngày). Chú ý khi lấy mẫu cần lấy cả sợi nấm để đưa vào môi trường thạch đĩa. Một số điều chú ý đối với bảo quản nấm sợi: Ảnh hưởng của ánh sáng với quá trình hình thành bào tử: Phần lớn trường hợp thì sự thành công của phương pháp bảo quản phụ thuộc vào số lượng bào tử. Ánh sáng là một tác nhân quan trọng đối với quá trình hình thành bào tử của nấm sợi, ánh sáng có bước sóng ngắn có tác dụng kích thích quá trình hình thành bào tử, ánh sáng gần vùng cực tím (3100 – 4000 nm) có tác dụng thay đổi màu sắc và kích thước khuẩn lạc. Thành phần môi trường: Nói chung các môi trường có thành phần dinh dưỡng nghèo thì thường cho lượng bào tử lớn. Tránh nhiễm tạp các con mạt (mite), các chủng nấm sợi lưu giữ thường bị mạt phá hoại. Đầu tiên chúng ăn chủng giống và làm hỏng, sau đó gây tạp nhiễm do mang bào tử và vi khuẩn trên cơ thể từ ống này sang ống khác. Vì lý do trên mà cần có biện pháp hạn chế mạt, thông thường các chủng giống phải được bảo quản ở nơi sạch, nhiệt độ 48oC. Phương pháp bảo quản nấm men: Tương tự như nấm sợi, có nhiều phương pháp bảo quản nấm men. Chúng tôi chỉ đề cập đến các phương pháp thông dụng nhất đang được sử dụng tại các bộ sưu tập nấm men lớn trên thế giới. Phương pháp cấy truyền: Cấy truyền là phương pháp đơn giản, nhanh và rẻ tiền cũng như thông dụng nhất, tuy nhiên những hạn chế của phương pháp này là dễ tạp nhiễm cũng như những thay đổi các đặc điểm sinh học, tính trạng di truyền sẽ là bất lợi khi bảo quản theo phương pháp này. Cấy truyền trên môi trường dịch thể: Cách tiến hành rất đơn giản là chuẩn bị 10 ml môi trường nuôi cấy nấm men (thông thường là môi trường YM Yeast extract – Maltose) trong lọ McCartney khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút. Thường làm 2 lọ cho mỗi chủng bảo quản. Một vòng que cấy chủng nấm men bảo quản được đưa vào môi trường bằng thao tác vô trùng và giữ ở 25oC trong 72 giờ. Phải kiểm tra sự phát triển của chủng bảo quản. Sau đó các mẫu được giữ ở 4oC. Thông thường theo cách này thời gian bảo quản các chủng thường thay đổi từ 2 6 tháng. Cấy truyền trên môi trường thạch: Cấy truyền trên môi trường thạch tương tự như môi trường dịch thể nhưng ở đây môi trường được bổ sung thạch (1.6%). Giống sau khi cấy được giữ trong 72 giờ ở nhiệt độ thích hợp để đạt độ phát triển cần thiết, sau đó được để ở 48oC. Theo phương pháp này giống có thời gian sống lâu hơn phương pháp cấy truyền dịch thể, thông thường giống được bảo quản từ 36 tháng. Thời gian bảo quản có thể được kéo dài từ 23 năm nếu như các ống giống được bảo quản trong dầu parafin đã thanh trùng và được đổ lên trên môi trường thạch sao cho tạo một lớp dày khoảng 1cm. Phương pháp bảo quản trong lạnh sâu và đông khô (xem phần các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn). DỤNG CỤ VÀ TRANG BỊ TRONG BẢO QUẢN GIỐNG: Trong các cơ sở lên men, giống thường được bảo quản trong thời gian dài, đặc biệt là các chủng phải mua từ bên ngoài. Dù sử dụng phương pháp bảo quản nào, bằng phương tiện gì, ta phải duy trì được hoạt tính vi sinh vật. Phương pháp bảo quản nên đơn giản, có chi phí hợp lý. Có hai phương pháp bảo quản giống chính là sử dụng nitơ lỏng và sấy thăng hoa (còn gọi là đông khô). Tuy nhiên sấy thăng hoa chủ yếu áp dụng cho cơ sở sản xuất giống do công nghệ và thiết bị phức tạp và đắt. Trong phần này ta đề cập đến phương pháp sử dụng nitơ lỏng. Do nhiệt độ sôi của nitơ rất thấp, 196 ºC, nên các vật liệu dùng để sử dụng trong bảo quản phải có khả năng chịu được nhiệt độ thấp này trong khoảng thời gian dài mà tính chất không thay đổi. Ống và giá đựng giống Vi sinh vật được bảo quản trong các ống nhựa PP chuyên dùng có khả năng chịu được nhiệt độ thấp của nitơ lỏng nhưng cũng chịu được nhiệt độ tiệt trùng (Hình 6). Ống này được đặt trên các giá riêng rồi đặt vào các bình hay thùng chứa. Khi đặt trong dụng cụ chứa, các giá này nên được đặt ở vùng chứa pha hơi của nitơ (Hình 7 và Hình 8). Hình 6. Ống đựng giống vi sinh vật Bình và thùng bảo quản: Để duy trì nhiệt độ rất thấp ở bên trong, các trang bị này được cách nhiệt rất kỹ lưỡng. Bên trong thường có các tấm để ngăn riêng pha lỏng của nitơ. Các nắp hay cửa ra vào được thiết kế đặc biệt để nitơ không rò rỉ ra ngoài. Các trang bị này cũng thường đặt trong phòng lạnh để tránh bị mất nhiệt (Hình 7 và Hình 8).   Hình 7 Bình bảo quản giống cỡ nhỏ   Hình 8 Thùng bảo quản giống cỡ lớn Chống đông Ở nhiệt độ rất thấp, nước trong vi sinh vật sẽ đông đặc và làm vi sinh vật bị tổn thương, thậm chí bị tiêu diệt. Để ngăn ngừa điều này người ta phải sử dụng các chất chống đông. Các chất này sẽ tạo liên kết với nước trong cơ thể vi sinh vật và nước ở dạng liên kết không bị đông đặc dù ở nhiệt độ rất thấp. Các chất chống đông thường dùng là dimetyl sulfoxit (DMSO), glyxerol. Trước khi bảo quản ta ngâm vi sinh vật trong dung dịch chống đông.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ SÀI GÒN KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  Tiểu luận: CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT GVHD: Nguyễ n Minh Hả i Lớp: L15_TP01 Nhóm 6: Nguyễn Ngọc Diễm Trương Minh Hiển Phan Hồng Lý MỤC LỤC VAI TRÒ CỦA BẢO QUẢN VI SINH VẬT CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT Phương pháp cấy truyền vi sinh vật: a Cấy truyền môi trường dịch thể: b Cấy truyền môi trường thạch: c Phương pháp giữ giống môi trường thạch lớp dầu khoáng d Phương pháp làm nước môi trường bảo quản: Phương pháp đông khô vi sinh vật phương pháp đông khô trực tiếp: a Phương pháp đông khô: b Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (L-drying): 12 Phương pháp bảo quản lạnh sâu: 14 III MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHỔ BIẾN SỬ DỤNG TRONG BẢO QUẢN CÁC NHÓM VI SINH VẬT CỤ THỂ 16 Các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn xạ khuẩn 16 1.1 Bảo quản vi khuẩn 16 1.2 Bảo quản xạ khuẩn: 18 Bảo quản vi tảo 19 Các phương pháp dùng cho bảo quản nấm sợi 19 Phương pháp bảo quản nấm men: 24 III DỤNG CỤ VÀ TRANG BỊ TRONG BẢO QUẢN GIỐNG: 25 Ống giá đựng giống 26 Bình thùng bảo quản: 26 Chống đông 28 I II I VAI TRÒ CỦA BẢO QUẢN VI SINH VẬT Công tác bảo quản giống vi sinh vật có ý nghĩa lớn phòng nghiên cứu công nghiệp vi sinh vật Nó không đơn giữ chủng giống vài môi trường dinh dưỡng thông thường định kỳ cấy chuyền, mà phải làm để giống sống sót giữ đặc tính ban đầu Vì công tác tương đối phức tạp khó khăn Quá trình nuôi cấy đưa giống vi sinh vật có hoạt lực cao vào sản xuất cần qua bước sau: phân lập, tuyển chọn giống, nghiên cứu đặc tính hình thái, sinh lý, hoá sinh, tuyển chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu Bước cần phải ý việc giữ giống sau phân lập từ đất, nước hay chất Yêu cầu mặt chọn giống: giống có hoạt lực cao ổn định với hoạt lực qui trình thích hợp Giống chọn lần đầu giữ cho lần Có thể cho : công việc giữ giống liên quan đến công tác nghiên cứu thời gian xí nghiệp dùng vi sinh vật Nếu không giữ đặc tính ban đầu vi sinh vật thành thu coi vô ích Vì lý mà nước giới chuẩn bị cho khâu bảo quản giống mang tính tầm cỡ, thành lập trung tâm, bảo tàng giống vi sinh vật, viện nghiên cứu Nhiệm vụ bảo tàng vi sinh vật là: giữ quần thể tế bào giống sống sót với tỉ lệ cao tế bào giữ đặc tính ban đầu để phục vụ cho nghiên cứu sản xuất Nhưng có vi sinh vật khả sống trì đặc tính ban đầu Thông thường chủng giữ lâu môi trường dinh dưỡng cấy chuyền nhiều lần có biến đổi Như cần phải chọn lựa giống phương pháp bảo quản thích hợp hệ cháu không sinh đột biến Người ta chọn khuẩn lạc riêng lẻ có đặc điểm đặc trưng Chọn tế bào loại, nguyên tắc khó gặp thể đột biến, gặp phải xuất tập trung thể đột biến, gặp phải xuất tập trung thể đột biến chủng ban đầu Sau chọn chủng cần phải tiến hành bảo quản Ngày có nhiều phương pháp bảo quản giống vi sinh vật Phần nhiều phương pháp giữ chủng giống trạng thái tiềm sinh định kỳ cấy chuyền môi trường thích hợp Trong trạng thái tiềm sinh không xảy trình sống với mức độ thấp Bảo quản trạng thái cho phép giữ tính chất quí ban đầu Sự lựa chọn phương pháp bảo quản tuỳ thuộc vào khả phòng thí nghiệm CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT II Phương pháp cấy truyền vi sinh vật: Đây phương pháp bảo quản đơn giản, chủng vi sinh vật cấy môi trường thích hợp (dịch thể hay thạch) ống nghiệm hay bình tam giác để điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển Sau chủng vi sinh vật chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thích hợp Quá trình lặp lại thời hạn định, đảm bảo chủng vi sinh vật chuyển đến môi trường trước già chết Thực tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp với phương pháp bảo quản như: Staphylococi, Coliform sống vài năm theo cách Cho dù phương pháp phương pháp phổ biến dùng sở nghiên cứu sử dụng chủng vi sinh vật đặc biệt chủng dùng cho nghiên cứu  Ưu nhược điểm phương pháp: Ưu điểm: Phương pháp đơn giản, dễ làm, thời gian bảo quản không lâu Nhược điểm:  Dễ bị tạp nhiễm dễ dẫn đến chủng giống gốc  Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữu chủng trình bảo quản  Phải nghiên cứu theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp chủng bảo quản  Tốn nhiều công sức để cấy truyền  Giống gốc sai sót dùng môi trường cấy truyền không thích hợp  Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi đặc điểm sinh học đột biến xuất sau lần cấy truyền a Cấy truyền môi trường dịch thể:  Cách tiến hành đơn giản chuẩn bị 10 ml môi trường nuôi cấy nấm men (thông thường môi trường YM Yeast extract – Maltose) lọ McCartney khử trùng nhiệt độ 121°C 15 phút Thường làm lọ cho chủng bảo quản  Một vòng que cấy chủng nấm men bảo quản đưa vào môi trường thao tác vô trùng giữ 25°C 72 Phải kiểm tra phát triển chủng bảo quản  Sau mẫu giữ 4°C Thông thường theo cách thời gian bảo quản chủng thường thay đổi từ 2- tháng b Cấy truyền môi trường thạch: Cấy truyền môi trường thạch tương tự môi trường dịch thể môi trường bổ sung thạch (1.6%) Giống sau cấy giữ 72 nhiệt độ thích hợp để đạt độ phát triển cần thiết, sau để 4-8oC Theo phương pháp giống có thời gian sống lâu phương pháp cấy truyền dịch thể, thông thường giống bảo quản từ 3-6 tháng Thời gian bảo quản kéo dài từ 2-3 năm ống giống bảo quản dầu parafil trùng đổ lên môi trường thạch cho tạo lớp dày khoảng 1cm Hình Bảo quản phương pháp cấy truyền môi trường thạch Giống vi sinh vật giữ môi trường thạch nghiêng (đối với giống vi sinh vật hiếu khí) trích sâu vào môi trường thạch (đối với vi sinh vật kỵ khí) Các ống giống bảo quản tủ lạnh nhiệt độ 3- 5°C Định kỳ để cấy truyền giống, tuỳ nhóm vi sinh vật khác mà định kỳ cấy truyền khác nhau, song giới hạn tối đa tháng Để công tác giữ giống tốt, lâu đỡ bị tạp hơn, người ta thường phủ lên môi truờng cấy giống vi sinh vật lớp dầu khoáng paraffin lỏng Lớp paraffin hạn chế tiếp xúc vi sinh vật oxy không khí (𝑂2 ) hạn chế thoát nước môi trường thạch, giống bảo quản lâu không bị nhiễm tạp, thoái hóa c Phương pháp giữ giống môi trường thạch lớp dầu khoáng Để khắc phục nhược điểm phương pháp cấy chuyền nhiều lần cụ thể hạn chế phát triển vi sinh vật thời gian bảo quản, tránh cho lớp thạch môi trường bị khô dần giống bị chết, phủ lên môi trường thạch có vi sinh vật phát triển lớp dầu khoáng parafin dày khoảng 10mm Lớp parafin hạn chế tiếp xúc vi sinh vật với oxygen không khí hạn chế thoát nước môi trường thạch nên nồng độ chất hoà tan không bị thay đổi, áp lực thẩm thấu không bị thay đổi nên không gây hại đến đời sống vi sinh vật Những chủng xử lý trên, sau giữ tủ lạnh nhiệt độ 50°C bảo quản nhiều năm Cần phải giữ cho trì sống tốt mà không tạo nên ưu sinh sản Đối với chủng phải thử chọn phương pháp bảo quản thích hợp Phương pháp giữ giống với dầu khoáng tương đối thuận tiện cho kết tốt Giống bảo quản lớp dầu khoáng sau 12 tháng giữ hình dáng bề bình thường Phương pháp ứng dụng rộng rãi để giữ nhiều giống vi sinh vật như: nấm men, nấm mốc,vi khuẩn, xạ khuẩn… d Phương pháp làm nước môi trường bảo quản: Phương pháp thường dùng cho chủng nấm sợi nấm men Theo phương pháp chủng vi sinh vật bảo quản với chất mang phổ biến sau:  Bảo quản giống vi sinh vật cát: Dùng cát sông rửa nước nhiều lần (đến nước không đục), sấy khô, sàng qua rây lỗ nhỏ để loại đất rác bẩn Có thể dùng acid clohyric đặc để oxy hoá chất hữu (đun nóng 100°C rửa lại nước) Sấy khô 120°C Chia cát khô vào ống nghiệm thuỷ tinh sấy trùng 160-180°C khoảng Ta kiểm tra độ vô trùng cát cách cho môi trường dịch đường hoá thịt- pepton vô trùng vào ống cát hấp trùng Sau cho vào tủ ấm 28-30°C khoảng tuần Quan sát hàng ngày thấy loại dịch đục coi cát chưa vô trùng Đổ cát chuẩn bị vào ống nghiệm giống trùng cho cát không rơi vào mặt thạch, không dính lên thành ống nghiệm Úp mặt thạch, dùng que cấy cào bào tử vào cát Đổ cát có bào tử vào ống nghiệm vô trùng lắc Chỉ bảo quản ống cát vào bào tử khô không bị ướt vón cục, ống cát giống đậy nút Dùng parafin nóng chảy phết lên nút ống nghiệm giúp cho ống giống không bị ẩm ướt giữ nhiệt độ phòng hay 4-6°C Phục hồi chủng cách dùng que cấy lấy cát ống cấy vào ống thạch nghiêng, sau chọn lựa cấy chuyền Phương pháp bảo quản chủ yếu áp dụng cho nhóm vi sinh vật sinh bào tử nấm mốc xạ khuẩn  Bảo quản giống đất khô: Nghiền đất rây lấy hạt Chia đất nghiền vào ống nghiệm thêm 1-2 giọt nước,có thể thêm 1-2% 𝐶𝑎𝐶𝑂3 để trung hoà loại đất chua cho than hoạt tính vào đáy ống đất sau trùng khô Đậy để ống nghiệm có đất vào giỏ đem hấp trùng hai lần 120°C cách ngày Kiểm tra độ vô trùng môi trường giữ giống cát giữ giống đất cát Ngoài ta giữ giống hỗn hợp cát đất Phương pháp bảo quản thành công với giống Clostridium pasteurianum  Giữ giống hạt: Có thể giữ bào tử nấm mốc, xạ khuẩn hạt thực vật khác Ở Liên Xô cũ thường bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng sinh hạt kê: chọn hạt kê vàng làm sạch, cho vào nước sôi khuấy trộn đều, giữ 30 phút cho hạt thấm ẩm hoàn toàn lọc Tãi kê ẩm mặt khay để xoa cồn, làm nguội hạt phải rời nhau, cho vào lọ (khoảng 15-16 g lọ thể tích 250ml) Các bình đậy nút kín trùng 115°C khoảng 30-40 phút Thử vô trùng giống phương pháp Cấy vào bình ml dịch huyền phù bào tử hay khuẩn ty dinh dưỡng Lắc nhẹ cho giống hạt kê nuôi nhiệt độ 24-28°C ngày Sau sấy thiết bị chân không đến độ ẩm kê có giống phát triển không 8% Kiểm tra giống tráng parafin lên nút Bảo quản nhiệt độ phòng tối khô  Bảo quản giấy: Các chủng nấm men nấm sợi làm khô giấy sau bọc giấy bạc đựng hộp kín Ưu phương pháp bảo quản lượng mẫu lớn  Bảo quản gelatin: Để thực phương pháp này, người ta tạo dịch huyền phù chủng vi sinh vật môi trường có gelatin Sau giọt mẫu làm khô đĩa petri Phương pháp bảo quản vi khuẩn vài năm Phương pháp đông khô vi sinh vật phương pháp đông khô trực tiếp: a Phương pháp đông khô: Đông khô trình mà nước lấy khỏi mẫu mẫu trạng thái lạnh sâu Ở vi sinh vật huyền phù môi trường thích hợp làm lạnh môi trường chân không Thiết bị đông khô hút nước cuối mẫu làm khô đến mức định Mẫu hàn kín môi trường chứa mẫu chân không Đây phương pháp phổ biến có hiệu cao cho bảo quản đối tượng vi sinh vật khác nấm sợi, nấm men, vi khuẩn số virut Tuy nhiên, phương pháp ứng dụng tảo, động vật nguyên sinh tế bào động vật Hình Đông khô vi sinh vật Đây phương pháp phổ biến sử dụng bảo tàng vi sinh vật giới Phương pháp đông khô hạn chế thay đổi đặc tính vi sinh vật bảo quản thời gian dài Phương pháp lạnh đông giữ giống dựa nguyên tắc ức chế phát triển vi sinh vật cách đưa chúng vào nhiệt độ lạnh sâu –25°C đến –70°C Để đảm bảo tế bào vi sinh vật không bị chết bị làm lạnh sâu ta cần trộn sinh khối giống cần bảo quản với dung dịch bảo vệ (hay gọi dung dịch nhũ hoá) glycerin 15%, huyết ngựa, dung dịch glucose hay lactose 10% Việc làm tiến hành từ từ lạnh được, độ lạnh đạt –20°C việc tiếp tục làm lạnh cần đạt tốc độ 12°C/ phút Với phương pháp cấy chuyền làm lại, thời gian lần cấy chuyền kéo dài so với phương pháp giữ giống thạch Nếu giữ t°=-15°C đến -20°C : tháng cấy chuyền làm lại lần Nếu giữ t°=-30°C : tháng cấy chuyền làm lại lần Nếu giữ t°=40°C : năm cấy chuyền làm lại lần Nếu giữ t°=-50°C đến -60°C : năm cấy chuyền làm lại lần Nếu giữ t°=-70°C : 10 năm cấy chuyền làm lại lần Phương pháp đơn giản tiện lợi, lại cho hiệu bảo quản cao Hiện phương pháp sử dụng phổ biến để bảo quản giống vi sinh vật Phương pháp đông khô giống vời phương pháp lạnh đông, tức vi sinh vật trình xử lý đưa vào nhiệt độ thấp nhiệt độ –60°C đến –70°C cách từ từ với có mặt chất bảo vệ: glutamate 3% hay lactose 1,2% + pepton 1,2% hay saccharose 8% + sữa 5% + gelatin 1,5%… Điều khác biệt với phương pháp lạnh đông là: đảm bảo an toàn cho sống tế bào giống, người ta làm thăng hoa nước tế bào môi trường có chất bảo vệ thiết bị đông khô với áp suất 1.10-4 mmHg Hỗn hợp tế bào giống dung dịch bảo vệ chứa ampul thuỷ tinh có =10mm hay =15mm hàn kín để đảm bảo độ khô chân không cần thiết, ampul bảo quản t°=4 - 6°C hay nhiệt độ phòng Phương pháp d0ược coi tối ưu cho hiệu suất bảo quản cao giữ giống vi sinh vật qua hàng chục năm có tỷ lệ sống cao không bị biến đổi di truyền, đồng thời chiếm diện tích bảo quản Phương pháp đông khô trình bày phương pháp dùng NCTC (National Colleciton Type Culture, Anh) Nuôi vi khuẩn cho đông khô: Vi khuẩn cấy môi trường ống thạch nghiêng thích hợp Tuy nhiên, chuẩn bị dịch vi khuẩn môi trường dịch thể phải làm đậm đặc tế bào li tâm Tuổi tế bào quan trọng thường chọn tế bào nằm pha sinh trưởng log Chuẩn bị đệm mẫu: Có thể dùng hai loại đệm sau: + Đệm huyết thanh- inositol; Meso-inositol: gam Huyết ngựa (số 3): 100 ml Thanh trùng phương pháp lọc vi khuẩn, sau phân 5ml vào bình vô trùng + Đệm inositol: Môi trường dinh dưỡng bột số 2: 2.5 gam Mesoinositol: gam Nước cất: đủ 100 ml 10 - Nhược điểm lớn phương pháp giá thành thiết bị - Độ ổn định chủng vi sinh vật bảo quản theo đợt đông khô khác - Hơn chủng trước đem sử dụng phải hoạt hoá môi trường thích hợp số lần để phục hồi đặc tính sinh học Phương pháp bảo quản lạnh sâu: Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu vi sinh vật bảo quản môi trường dịch thể nước cần cho hoạt động sống vi sinh vật bị bất hoạt nhiệt độ lạnh sâu (-196°C -> -80°C) Hình Bảo quản lạnh sâu Với phương pháp này, tế bào bị vỡ trình làm lạnh làm tan mẫu Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào việc tích luỹ chất điện giải mẫu bảo quản hình thành tinh thể nước tế bào Để khắc phục nhược điểm người ta bổ sung chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu làm tan nhanh glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide) Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu thực thang nhiệt độ khác -20°C, -30°C, -40°C, -70°C, 140°C -196°C Nói chung mức nhiệt độ cao -30°C cho hiệu thấp tế bào chịu nồng độ muối cao sinh từ chất điện giải Phương pháp bảo quản có hiệu với nhiều nhóm vi sinh vật khác nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn virut Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu nitơ lỏng phương pháp vạn Phương pháp thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo dòng tế bào động vật 14 Hình Bảo quản nitơ lỏng - Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu: Tế bào nuôi cấy môi trường nhiệt độ thích hợp đầu pha log - Pha dịch tế bào với glycerol DMSO trùng trước để đạt nồng độ cuối 10% mật độ tế bào 106 Dịch huyền phù tế bào đưa vào ống lạnh sâu đóng nắp (trong trường hợp hàn ống thuỷ tinh, cần để dịch xanh metylene 0.05% để phát ống bị rò rỉ) Toàn mẫu để nhiệt độ phòng 30 phút cân áp suất thẩm thấu tế bào Trong trường hợp có nitơ lỏng mẫu chuyển sang bình nitơ lỏng Mẫu đưa vào lạnh sâu cần theo tốc độ định Thông thường tốc độ lạnh dao động 1-3°C/phút để đạt tới nhiệt độ -30°C ban đầu Sau mẫu làm lạnh tiếp với tốc độ cao 10-15°C/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh cần thiết (100°C đến -80°C) Hiện nay, có thiết bị làm lạnh sâu chương trình hoá với tốc độ mong muốn Tuy nhiên, đơn giản mẫu ban đầu đặt đá khô sau lại đưa vào tủ lạnh sâu đặt thời gian vài để đạt nhiệt độ 65°C - Hoạt hoá mẫu: mẫu lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) hoạt hoá cách làm tan nhanh tới mức (thông thường đưa vào tủ ấm 37°C 4060 giây) Như vậy, theo cách đạt khả sống 95% tế bào sau 10 năm bảo quản  Ưu nhược điểm phương pháp: 15 Ưu điểm: Phương pháp bảo quản tế bào thời gian lâu, tỉ lệ tế bào sống cao Nhược điểm: - Phương pháp bộc lộ số nhược điểm đầu tư kinh phí cho thiết bị điện, nitơ lỏng rủi ro cháy nổ - Đặc biệt phương pháp không thích hợp với chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến - Phương pháp thường dùng với chủng vi sinh vật có đặc tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô III MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHỔ BIẾN SỬ DỤNG TRONG BẢO QUẢN CÁC NHÓM VI SINH VẬT CỤ THỂ Các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn xạ khuẩn 1.1 Bảo quản vi khuẩn a Phương pháp đông khô (Freeze drying/ lyophilization) Đây phương pháp phổ biến sử dụng bảo tàng vi sinh vật giới Phương pháp đông khô hạn chế thay đổi đặc tính vi sinh vật bảo quản thời gian dài Phương pháp đông khô trình bày phương pháp dùng NCTC (National Colleciton Type Culture, Anh) * Nuôi vi khuẩn cho đông khô: Vi khuẩn cấy môi trường ống thạch nghiêng thích hợp Tuy nhiên, chuẩn bị dịch vi khuẩn môi trường dịch thể phải làm đậm đặc tế bào li tâm Tuổi tế bào quan trọng thường chọn tế bào nằm pha sinh trưởng log * Chuẩn bị đệm mẫu: Có thể dùng hai loại đệm sau: Đệm huyết thanh- inositol; Meso-inositol: gam Huyết ngựa (số 3): 100 ml Thanh trùng phương pháp lọc vi khuẩn, sau phân 5ml vào bình vô trùng + Đệm inositol: Môi trường dinh dưỡng bột số 2: 2.5 gam Meso-inositol: gam 16 Nước cất: đủ 100 ml Phân ml vào bình khử trùng nhiệt độ 121OC * Chuẩn bị dịch tế bào: Mật độ tế bào có ý nghĩa quan trọng chất lượng bảo quản Thông thường thu sinh khối từ ống thạch nghiêng dùng cho 1-2 ml đệm pha mẫu để tạo dịch huyền phù tế bào Mật độ vi khuẩn thông thường cần đạt 1010 (đối với vi sinh vật bào tử) Mật độ giảm với vi sinh vật có bào tử Hai đệm pha mẫu dùng với vi khuẩn trường hợp enterobacteria không dùng đệm huyết gây thay đổi đặc tính miễn dịch vi khuẩn * Chuẩn bị ống đông khô: Ống đông khô rửa sau ngâm qua đệm với dịch acid loãng (HCl 2%) lại rửa sạch, làm khô chuẩn bị nút bông, ống trùng khô khử trùng theo phương pháp thông thường * Chuẩn bị mẫu trước đông khô: Lượng dịch huyền phù vi khuẩn đưa cẩn thận pipet pasteur vào ống đông khô khoảng 0.1- 0.2 ml Chú ý thao tác phải cẩn thận tránh dính mẫu vào thành hay phía ống đông khô * Bước tiền đông khô: Mục tiêu bước làm bay bị lạnh đông tạo đá Trước tiến hành đông khô mẫu chuẩn bị qua bước tiền đông (như trình bày trên) sau bước tiền đông khô tiến hành mẫu lắp vào hệ thống đông khô trình làm nước điều kiện lạnh tiến hành khoảng * Tạo chỗ thắt ống đông khô: Sau bước tiền đông khô, yêu cầu phải tạo vết thắt Việc tạo vết thắt thực với hệ thống đèn hàn Tuy nhiên, sở bảo quản vi sinh vật sử dụng hệ thống hàn tạo vết thắt thiết bị tự động * Hậu đông khô: Trong bước mẫu lại tiếp tục làm khô độ ẩm cuối đạt khoảng 1% Thời gian cho bước thay đổi từ 1-2 * Hàn ống đông khô: Việc hàn ống trực tiếp thiết bị đông khô (manifold) cần có kinh nghiệm cẩn thận Trước hết phải tiến hành khoá van sau thực thao tác hàn ống đông khô * Kiểm tra độ chân không ống đông khô: Người ta sử dụng thiết bị đèn phát mức độ chân không Với mẫu đạt độ chân không cần thiết xuất màu xanh tím nhạt Đối với mẫu 17 không đạt tiêu chuẩn tín hiệu màu tím đậm * Kiểm tra khả sống mẫu: Đếm số lượng tế bào phương pháp chủ yếu để đánh giá chất lượng bảo quản Việc đếm thực trước sau đông khô Các bước kiểm tra thực sau năm để đánh giá chất lượng mẫu đông khô Nói chung khả sống vi sinh vật có bào tử cao vi sinh vật bào tử loại gram dương cao vi sinh vật gram âm Tuy nhiên, với vi sinh vật kỵ khí yêu cầu phải tiến hành theo qui trình, tránh vi sinh vật tiếp xúc với oxy * Bảo quản mẫu: Mẫu thông thường bảo quản 4OC hay nhiệt độ phòng b Phương pháp giữ lạnh sâu - Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu: Tế bào nuôi cấy môi trường nhiệt độ thích hợp đầu pha log - Pha dịch tế bào với glycerol DMSO trùng trước để đạt nồng độ cuối 10% mật độ tế bào 106 - Dịch huyền phù tế bào đưa vào ống lạnh sâu đóng nắp (trong trường hợp hàn ống thuỷ tinh, cần để dịch xanh metylene 0.05% để phát ống bị rò rỉ) Toàn mẫu để nhiệt độ phòng 30 phút cân áp suất thẩm thấu tế bào Trong trường hợp có nitơ lỏng mẫu chuyển sang bình nitơ lỏng Mẫu đưa vào lạnh sâu cần theo tốc độ định Thông thường tốc độ lạnh dao động 1-3 OC/phút để đạt tới nhiệt độ -30OC ban đầu Sau mẫu làm lạnh tiếp với tốc độ cao 10-15 OC/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh cần thiết (-100OC đến -80 OC) Hiện nay, có thiết bị làm lạnh sâu chương trình hoá với tốc độ mong muốn Tuy nhiên, đơn giản mẫu ban đầu đặt đá khô sau lại đưa vào tủ lạnh sâu đặt thời gian vài để đạt nhiệt độ -65OC - Hoạt hoá mẫu: mẫu lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) hoạt hoá cách làm tan nhanh tới mức (thông thường đưa vào tủ ấm 37 OC 40-60 giây) Như vậy, theo cách đạt khả sống 95% tế bào sau 10 năm bảo quản c Một số phương pháp bảo quản khác: Bảo quản gelatin silicagel 1.2 Bảo quản xạ khuẩn: Xạ khuẩn mang đặc tính vi khuẩn nấm sợi (có sợi bào tử) cần có phương pháp bảo quản thích hợp Thông thường xạ khuẩn bảo quản theo cách thông thường cấy 18 truyền, đông khô lạnh sâu với vi khuẩn Tuy nhiên, có phương pháp kinh tế mà đảm bảo chất lượng chủng bảo quản mà trình bày đây, phương pháp bảo quản đất Các bước tiến hành bảo quản đất: Chuẩn bị đất: lấy đất vườn làm khô 150 OC để làm chết vi sinh vật có bào tử trứng giun có Đất sau trùng nghiền nhỏ qua lưới có kích thước 30 mesh Đất sau nghiền đưa vào ống nghiệm chuẩn bị nút trùng 60 phút Trước tiến hành bảo quản phải kiểm tra nhiễm khuẩn đất cách cấy vòng que cấy đất từ ống nghiệm đặt vào môi trường giàu dinh dưỡng cho vi khuẩn giữ 24 OC, 28 OC 37 OC, kiểm tra sau 2-4 ngày - Chuẩn bị dịch huyền phù xạ khuẩn Nước cất vô trùng dùng để tạo dịch huyền phù xạ khuẩn (hay bào tử xạ khuẩn) từ ống thạch nghiêng Lấy ml dịch huyền phù cho vào ống nghiệm để khô nhiệt độ phòng (24OC) thời gian tháng Đập nhẹ vào thành ống cho hạt tách bảo quản mẫu 4OC - Hoạt hoá mẫu đơn giản cách lấy vòng que cấy mẫu đưa lên môi trường (thạch dịch thể) để nhiệt độ thích hợp Bảo quản vi tảo Vi tảo thông thường bảo quản theo phương pháp: Cấy truyền, lạnh sâu đông khô Các phương pháp trình bày chi tiết phần vi khuẩn Một số điểm cần ý bảo quản vi tảo chỗ: Nên dùng tế bào già pha cân bằng, phương pháp lạnh sâu cho kết tốt phương pháp đông khô Các phương pháp dùng cho bảo quản nấm sợi a Phương pháp cấy truyền: Phương pháp thường ứng dụng với sợi nấm có bào tử Các chủng nấm sợi nuôi môi trường thạch thích hợp sợi nấm phát triển đến mức độ cực đại, sau trình hình thành bào tử, ống giống bảo quản theo cách khác nhau: - Các ống thạch để tủ lạnh (4-7 OC) - Bảo quản thạch lớp dầu: Các ống thạch bảo quản lớp dầu parafin có tỷ trọng tương đối - Bảo quản thạch lớp dầu: Các ống thạch bảo quản lớp dầu parafin có tỷ trọng tương đối 0.83- 0.89 khử trùng nhiệt độ 121 OC 15 phút Lớp dầu cách bề mặt thạch khoảng cm Nhiệt độ bảo quản 15-20 OC 19 - Bảo quản nước, nấm sợi nuôi môi trường thạch đĩa Sau sợi phát triển cực đại cắt thành miếng nhỏ kích thước khoảng mm2 cho vào lọ nước trùng Bảo quản nhiệt độ phòng b Bảo quản nấm sợi có bào tử silicagel:  Chuẩn bị: - Lọ đựng silicagel (10-15ml) có nắp chịu nhiệt (sắt hay nhựa) trùng nhiệt độ 170 oC - Silicagel: Loại suốt, màu, kích thước số lượng hạt silicagel đưa vào không 1/3 thể tích lọ, trùng nhiệt độ 170 °C - Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115OC/20 phút) - Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo chủng, môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác (10-15 ngày)  Cách tiến hành: - Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao (đối với số chủng có số lượng bào tử thấp tạo dịch bào tử từ vài ống thạch bào tử khác nhau) - Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào lọ đựng silicagel Chú ý silicagel hút nước sinh nhiệt việc đưa dịch bào tử vào phải thực chậu nước đá Lượng dịch bào tử đưa vào không vượt 1/3 thể tích hạt silicagel lọ Sau dùng tay lắc đảm bảo hạt silicagel dính dịch bào tử nấm sợi Dán nhãn, ghi thông tin cần thiết số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường nhiệt độ thích hợp - Lọ silicagel đậy nắp cẩn thận không vặn chặt (nới 1,5 vòng) sau giữ bình hút ẩm (độ ẩm 35-40%), 25OC tuần Vặn chặt nút quấn giấy parafil giữ 4OC  Kiểm tra độ sống sót sau bảo quản: -Mẫu silicagel °C, dùng que cấy vô trùng lấy hạt silicagel để mặt thạch môi trường mầm thóc (Maltagar), lắc cho hạt silicagel tiếp xúc lên mặt môi trường Để nhiệt độ thích hợp, kiểm tra tra khuẩn lạc nấm theo thời gian thích hợp c -Bảo quản nấm sợi có bào tử theo phương pháp đông khô (freez-drying):  Chuẩn bị: - Ống đông khô rửa (sonic cleaner) 15 phút sau khử trùng 170OC - Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115OC/20 phút) - Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo 20 chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác (10-15 ngày)  Cách tiến hành: - Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao (đối với số chủng có số lượng bào tử thấp tạo dịch bào tử từ vài ống thạch bào tử khác nhau) - Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 - 0,3 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho chủng Dán nhãn, ghi thông tin cần thiết mã số chủng, ngày bảo quản, môi trường nhiệt độ thích hợp Sau đậy nút hay giấy bạc - Giữ -80°C trước tiến hành đông khô, đồng thời bật máy DuraStop, nhiệt độ đạt -40OC, đưa mẫu vào tủ đông khô Dura-Stop, bật máy Dura-Dry, mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -55OC, tăng nhiệt độ DuraStop lên -5OC, để qua đêm - Tăng nhiệt độ Dura-Stop lên 25°C, đạt nhiệt độ cần thiết, tắt máy hút chân không không tắt Dura-Dry - Tắt Dura-Stop, nối tube mẫu vào hệ thống manifold, bật máy DuraDry, tiến hành hàn ống độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55OC Chú ý: Trong trường hợp dùng Dura-Dry thực sau: - Tiến hành bước 1,2,3,4 - Mẫu để tiền đông khô -80°C Bật máy Dura- Dry, đạt nhiệt độ -60oC đến -55oC, độ chân không 45 minitor, gắn ống mẫu với hệ thống manifold tiến hành hàn ống độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55oC  Kiểm tra độ sống sót sau đông khô: - Mở ống đông khô cách đốt nóng đầu hàn đèn cồn làm lạnh đột ngột cồn đốt - Dùng pipet pasteur lấy khoảng 1ml nước cất vô trùng từ ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất vô trùng làm tan mẫu đông khô Hút toàn dịch huyền phù sang ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất Trộn nhỏ vào vị trí khác (mỗi vị trí giọt) môi trường thạch đĩa thích hợp nghiêng cho dịch chảy dọc theo hướng hình vẽ: 21 Hình PP kiểm tra độ sống sót vi sinh vật sau đông khô - Sau đậy nắp đĩa, bao quanh parafil để nhiệt độ thích hợp - Cách đánh giá: Rất tốt: ≥ 100 khuẩn lạc Khá: 50 – 100 khuẩn lạc Trung bình: 10-50 khuẩn lạc Kém: < 10 khuẩn lạc Không mọc Bảo quản thực với mẫu từ trở lên Tuy nhiên, có số nấm sợi mà khuẩn lạc mọc tràn lan đánh sau: Nếu khuẩn lạc mọc khắp bề mặt đĩa tốt Mẻ đông khô thành công số khuẩn lạc mọc chiếm nửa bề mặt môi trường đĩa petri Các mẫu có số lượng khuẩn lạc mọc mức phải làm tăng mật độ bào tử trước đông khô thay đổi môi trường sinh bào tử, chuẩn bị dịch huyền phù bào tử từ 3-4 ống nghiệm bào tử nấm sợi d Bảo quản nấm sợi phương pháp đông khô trực tiếp: Phương pháp đông khô trực tiếp thực tương tự phương pháp đông khô trình bày thực sau:  Chuẩn bị: - Ống đông khô rửa (sonic cleaner) 15 phút sau khử trùng 170oC - Môi trường L-drying chuẩn có thành phần sau: Đệm phosphat: 0.1M : 100 ml Monosodium glutamat: g Adonitol: 1.5 g (Khử trùng 115oC/20 phút) - Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác (10-15 ngày)  Cách tiến hành: - Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml môi trường trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử nấm có mật độ cao (đối với số chủng có số lượng bào tử thấp tạo dịch bào 22 tử từ vài ống thạch bào tử khác nhau) - Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho chủng, dán nhãn, ghi thông tin cần thiết số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường nhiệt độ thích hợp Sau đậy nút hay giấy bạc - Đồng thời bật máy Dura-Dry, mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -75oC, nối ampoule mẫu vào hệ thống manifold (chú ý khoá van chân không nối ampoule mẫu với tube manifold sau lại mở ra, để đảm bảo độ chân không cần thiết làm đông khô phải đưa mẫu vào tín hiệu đèn thị cho phép) Khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55oC tiến hành trình làm khô - Hàn kín ampoule mẫu: -Khi máy cô Dura-Dry chạy để đảm bảo độ chân không cần thiết, khoá van cho ampoule mẫu tiến hành hàn với mẫu vị trí ống bị thắt Dùng lửa gas để đốt nóng phần ống thắt cho phía xoay cho thuỷ tinh chảy bịt kín ống Sau dùng lửa gas để cắt rời phần (nối với manifold) phần chứa mẫu Hết đợt lại khoá van ampoule mẫu hàn  Kiểm tra chất lượng sau bảo quản: - Để kiểm tra độ sống sót mẫu nấm sợi bảo quản, thực theo cách mô tả phần đông khô - Kiểm tra độ chủng: mẫu cấy môi trường thích hợp quan sát hình thái đặc điểm sinh học đặc trưng cần thiết để đánh giá khả tạp nhiễm đặc tính sinh học - Thí nghiệm đánh giá nhanh thời gian bảo quản: mẫu sau đông khô trực tiếp giữ 37oC tuần Độ sống sót mẫu bảo quản giảm tuần 37oC tương đương với bảo quản 10 năm 4oC e Bảo quản nấm sợi phương pháp lạnh sâu -80 oC nitơ lỏng (-196 oC):  Chuẩn bị: - Chuẩn bị dung dịch glycerol 10% (3 ml ống nghiệm) khử trùng 121 oC 15 phút Ống nhựa nút xoáy (2 ml), rửa sonic cleaner, khử trùng 170 oC - Chuẩn bị mẫu nấm sợi môi trường thạch đĩa có lượng bào tử lớn  Cách tiến hành: - Dùng pipet pasteur hút khoảng 0,3 ml glycerol trùng vào ống nhựa đựng mẫu Sau dùng dao vô trùng cắt lấy miếng nhỏ môi trường chứa sợi bào tử nấm sợi cho vào ống nhựa Lượng glycerol đủ để phủ lên miếng thạch mẫu, đậy nút bao băng parafil sau dán nhãn 23 Mẫu trước tiên phải để 5oC (tạo điều kiện cho glycerol vào tế bào), sau làm lạnh sâu tử 25oC xuống -55oC với tốc độ - 1oC/phút Trong trường hợp thiết bị làm lạnh để - 20oC giờ, sau chuyển sang -80oC hay nitơ lỏng (-196oC) Chú ý: Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu thích hợp với hầu hết nấm sợi sinh bào tử tế bào có vách ngăn Nhưng phương pháp tỏ không thích hợp với nấm sợi không sinh bào tử vách ngăn Trong trường hợp cần nuôi cấy nấm sợi môi trường thích hợp để tạo bào tử Nếu không khắc phục phải tiến hành nuôi môi trường dịch thể để thu lấy sinh khối giữ glycerol 10%  Đánh giá khả sống mẫu bảo quản: - Làm tan mẫu (mẫu lấy từ tủ lạnh sâu -80oC nitơ lỏng - 196oC) bể ổn nhiệt 37oC phút - Dùng que cấy lấy miếng môi trường thạch đặt vào vị trí khác môi trường thạch đĩa thích hợp Để nhiệt độ thích hợp xem khả mọc sau thời gian thích hợp (2-4 ngày) Chú ý lấy mẫu cần lấy sợi nấm để đưa vào môi trường thạch đĩa  Một số điều ý bảo quản nấm sợi: - Ảnh hưởng ánh sáng với trình hình thành bào tử: Phần lớn trường hợp thành công phương pháp bảo quản phụ thuộc vào số lượng bào tử Ánh sáng tác nhân quan trọng trình hình thành bào tử nấm sợi, ánh sáng có bước sóng ngắn có tác dụng kích thích trình hình thành bào tử, ánh sáng gần vùng cực tím (3100 – 4000 nm) có tác dụng thay đổi màu sắc kích thước khuẩn lạc - Thành phần môi trường: Nói chung môi trường có thành phần dinh dưỡng nghèo thường cho lượng bào tử lớn - Tránh nhiễm tạp mạt (mite), chủng nấm sợi lưu giữ thường bị mạt phá hoại Đầu tiên chúng ăn chủng giống làm hỏng, sau gây tạp nhiễm mang bào tử vi khuẩn thể từ ống sang ống khác Vì lý mà cần có biện pháp hạn chế mạt, thông thường chủng giống phải bảo quản nơi sạch, nhiệt độ 4-8oC Phương pháp bảo quản nấm men: Tương tự nấm sợi, có nhiều phương pháp bảo quản nấm men Chúng đề cập đến phương pháp thông dụng sử dụng sưu tập nấm men lớn giới a Phương pháp cấy truyền: Cấy truyền phương pháp đơn giản, nhanh rẻ tiền thông dụng nhất, nhiên hạn chế phương pháp dễ tạp nhiễm thay đổi đặc điểm sinh học, tính trạng di truyền bất lợi bảo quản theo phương pháp 24  Cấy truyền môi trường dịch thể: - Cách tiến hành đơn giản chuẩn bị 10 ml môi trường nuôi cấy nấm men (thông thường môi trường YM Yeast extract – Maltose) lọ McCartney khử trùng nhiệt độ 121oC 15 phút Thường làm lọ cho chủng bảo quản - Một vòng que cấy chủng nấm men bảo quản đưa vào môi trường thao tác vô trùng giữ 25oC 72 Phải kiểm tra phát triển chủng bảo quản - Sau mẫu giữ 4oC - Thông thường theo cách thời gian bảo quản chủng thường thay đổi từ 2- tháng  Cấy truyền môi trường thạch: Cấy truyền môi trường thạch tương tự môi trường dịch thể môi trường bổ sung thạch (1.6%) Giống sau cấy giữ 72 nhiệt độ thích hợp để đạt độ phát triển cần thiết, sau để 4-8oC Theo phương pháp giống có thời gian sống lâu phương pháp cấy truyền dịch thể, thông thường giống bảo quản từ 3-6 tháng Thời gian bảo quản kéo dài từ 2-3 năm ống giống bảo quản dầu parafin trùng đổ lên môi trường thạch cho tạo lớp dày khoảng 1cm b Phương pháp bảo quản lạnh sâu đông khô (xem phần phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn xạ khuẩn) IV DỤNG CỤ VÀ TRANG BỊ TRONG BẢO QUẢN GIỐNG: Trong sở lên men, giống thường bảo quản thời gian dài, đặc biệt chủng phải mua từ bên Dù sử dụng phương pháp bảo quản nào, phương tiện gì, ta phải trì hoạt tính vi sinh vật Phương pháp bảo quản nên đơn giản, có chi phí hợp lý Có hai phương pháp bảo quản giống sử dụng nitơ lỏng sấy thăng hoa (còn gọi đông khô) Tuy nhiên sấy thăng hoa chủ yếu áp dụng cho sở sản xuất giống công nghệ thiết bị phức tạp đắt Trong phần ta đề cập đến phương pháp sử dụng nitơ lỏng Do nhiệt độ sôi nitơ thấp, - 196 ºC, nên vật liệu dùng để sử dụng bảo quản phải có khả chịu nhiệt độ thấp khoảng thời gian dài mà tính chất không thay đổi 25 Ống giá đựng giống Vi sinh vật bảo quản ống nhựa PP chuyên dùng có khả chịu nhiệt độ thấp nitơ lỏng chịu nhiệt độ tiệt trùng (Hình 6) Ống đặt giá riêng đặt vào bình hay thùng chứa Khi đặt dụng cụ chứa, giá nên đặt vùng chứa pha nitơ (Hình Hình 8) Hình Ống đựng giống vi sinh vật Bình thùng bảo quản: Để trì nhiệt độ thấp bên trong, trang bị cách nhiệt kỹ lưỡng Bên thường có để ngăn riêng pha lỏng nitơ Các nắp hay cửa vào thiết kế đặc biệt để nitơ không rò rỉ Các trang bị thường đặt phòng lạnh để tránh bị nhiệt (Hình Hình 8) 26 Hình Bình bảo quản giống cỡ nhỏ 27 Hình Thùng bảo quản giống cỡ lớn Chống đông Ở nhiệt độ thấp, nước vi sinh vật đông đặc làm vi sinh vật bị tổn thương, chí bị tiêu diệt Để ngăn ngừa điều người ta phải sử dụng chất chống đông Các chất tạo liên kết với nước thể vi sinh vật nước dạng liên kết không bị đông đặc dù nhiệt độ thấp Các chất chống đông thường dùng dimetyl sulfoxit (DMSO), glyxerol Trước bảo quản ta ngâm vi sinh vật dung dịch chống đông 28 [...]... các chủng vi sinh vật có những đặc tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô III MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHỔ BIẾN SỬ DỤNG TRONG BẢO QUẢN CÁC NHÓM VI SINH VẬT CỤ THỂ 1 Các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn 1.1 Bảo quản vi khuẩn a Phương pháp đông khô (Freeze drying/ lyophilization) Đây là phương pháp phổ biến được sử dụng tại mọi bảo tàng vi sinh vật trên thế giới Phương pháp đông... b Phương pháp bảo quản trong lạnh sâu và đông khô (xem phần các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn) IV DỤNG CỤ VÀ TRANG BỊ TRONG BẢO QUẢN GIỐNG: Trong các cơ sở lên men, giống thường được bảo quản trong thời gian dài, đặc biệt là các chủng phải mua từ bên ngoài Dù sử dụng phương pháp bảo quản nào, bằng phương tiện gì, ta phải duy trì được hoạt tính vi sinh vật Phương pháp bảo quản. .. định của các chủng vi sinh vật bảo quản theo các đợt đông khô là khác nhau - Hơn thế nữa các chủng trước khi đem ra sử dụng phải được hoạt hoá trên môi trường thích hợp một số lần để phục hồi các đặc tính sinh học 3 Phương pháp bảo quản lạnh sâu: Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở... năm bảo quản c Một số phương pháp bảo quản khác: Bảo quản trên gelatin và silicagel 1.2 Bảo quản xạ khuẩn: Xạ khuẩn mang cả đặc tính của vi khuẩn và nấm sợi (có sợi và bào tử) do đó cần có những phương pháp bảo quản thích hợp Thông thường xạ khuẩn cũng được bảo quản theo các cách thông thường như cấy 18 truyền, đông khô và lạnh sâu như với vi khuẩn ở trên Tuy nhiên, có phương pháp kinh tế mà vẫn đảm bảo. .. của mẫu bảo quản giảm trong 2 tuần ở 37°C tương đương với bảo quản 10 năm ở 4°C Ưu và nhược điểm của phương pháp: Ưu điểm Phương pháp này nhanh và thuận lợi cho các đợt bảo quản số lượng lớn mẫu Thời gian bảo quản lâu thông thường theo phương pháp này vi sinh vật được bảo quản từ 10-20 năm Tiết kiệm được công sức và sai sót nhãn mác và tạp nhiễm Nhược điểm 13 - Nhược điểm lớn nhất của phương pháp này... tránh vi sinh vật tiếp xúc với oxy 12 Bảo quản mẫu: Mẫu thông thường được bảo quản tại 4OC hay nhiệt độ phòng b Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (L-drying): Ngoài phương pháp đông khô như mô tả ở trên, còn có phương pháp đông khô trực tiếp Khác biệt với phương pháp trên ở chỗ dịch huyền phù vi sinh vật được làm khô nhanh ở chế độ chân không thích hợp mà mẫu không cần làm lạnh từ trước Phương pháp. .. lượng tế bào là phương pháp chủ yếu để đánh giá chất lượng bảo quản Vi c đếm được thực hiện trước khi và ngay sau khi đông khô Các bước kiểm tra tiếp theo có thể được thực hiện sau 1 hoặc 5 năm để đánh giá chất lượng của mẫu đông khô Nói chung khả năng sống của vi sinh vật có bào tử cao hơn vi sinh vật không có bào tử và loại gram dương cao hơn vi sinh vật gram âm Tuy nhiên, với vi sinh vật kỵ khí thì... sau 10 năm bảo quản  Ưu và nhược điểm của phương pháp: 15 Ưu điểm: Phương pháp có thể bảo quản tế bào trong thời gian rất lâu, tỉ lệ tế bào còn sống cao Nhược điểm: - Phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro như cháy nổ - Đặc biệt phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến - Phương pháp này thường... bảo quản mẫu tại 4OC - Hoạt hoá mẫu đơn giản bằng cách lấy vòng que cấy mẫu đưa lên môi trường (thạch hoặc dịch thể) và để ở nhiệt độ thích hợp 2 Bảo quản vi tảo Vi tảo thông thường được bảo quản theo 3 phương pháp: Cấy truyền, lạnh sâu và đông khô Các phương pháp đã được trình bày chi tiết trong phần vi khuẩn Một số điểm cần chú ý khi bảo quản vi tảo là ở chỗ: Nên dùng tế bào già ở pha cân bằng, phương. .. lượng tế bào là phương pháp chủ yếu để đánh giá chất lượng bảo quản Vi c đếm được thực hiện trước khi và ngay sau khi đông khô Các bước kiểm tra tiếp theo có thể được thực hiện sau 1 hoặc 5 năm để 11 đánh giá chất lượng của mẫu đông khô Nói chung khả năng sống của vi sinh vật có bào tử cao hơn vi sinh vật không có bào tử và loại gram dương cao hơn vi sinh vật gram âm Tuy nhiên, với vi sinh vật kỵ khí thì