BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC

BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC BÀI TIỂU LUẬN sắc ký KHÍ GC

SẮC KÝ KHÍ (GC) 2.1 MỞ ĐẦU Sắc ký khí phương pháp phân tích cho độ nhạy, độ tin cậy độ xác cao Ngày sắc ký khí trở thành phương pháp sắc ký quan trọng để tách xác định cấu trúc; nghiên cứu thông số hóa lý hệ số hoạt độ, entanpi, nhiệt hóa hơi, hệ số khuếch tán phân tử, động học xúc tác, v.v… Nó coi phương tiện đầu tay nhà hóa học, đặc biệt nhà hóa học hữu Sắc ký khí cột nhồi thay kỹ thuật sắc ký khí sử dụng cột mao quản Người ta gá nối thành công sắc ký khí với thiết bị xác định cấu trúc khối phổ kế GC – MS, quang phổ hồng ngoại chuyển hóa GC/FT-IR Tuy nhiên phải nhấn mạnh thiết bị sắc ký khí, phần quan trọng cột tách detector Các thiết bị gá vào coi loại detector đặc biệt Năm 1952 máy sắc ký khí đời Từ kỹ thuật GC hoàn chỉnh phát triển mạnh Ở nước ta, phương pháp sắc ký khí sử dụng từ cuối năm 70 kỷ trước Tuy nhiên phương pháp sử dụng mạnh mẽ vào năm 90 Các hợp chất hữu dễ bay axeton, rượu, andehid, hidrocacbon mạch thẳng, mạch vòng; sản phẩm dầu mỏ, thuốc bảo vệ thực vật, hóa chất độc đioxin dễ dàng xác định phương pháp Ngoài với loại detector khác nhau, người ta xác định hàm lượng số nguyên tố vô thành phần hợp chất hữu (Cl, N, P, …) Chương trình đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm nhằm nâng cao chất lượng sống, có việc kiểm tra chất lượng, đánh giá dư lượng thuốc bảo vệ thực vật loại rau, củ, phục vụ cho mục đích tiêu dùng xuất quan tâm hết vậy, phương pháp sắc ký khí sử dụng phát huy ưu việt Để hiểu rõ tính nguyên lý hoạt động thiết bị này, trước hết cần hiểu sơ đồ cấu tạo Hình 2.1 : Máy GC 2010 hãng shimazu Hình 2.2 Sơ đồ khối thu gọn thiết bị GC Hình 2.3 : Sơ đồ injetor (bộ phận nạp mẫu) GC Hai thiết bị quan trọng hệ thống GC hệ thống cột tách detector Nhờ có khí mang bom khí, mẫu từ buồng bay (Injector) dẫn vào cột tách nằm buồng điều nhiệt Quá trình sắc ký khsi xảy Sau cấu tử rời bỏ cột tác thời điểm khác nhau, cấu tử vào detector Từ chúng biến thành tín hiệu điện Tín hiệu điện khuếch đại, chuyển sang ghi đo xử lý; sau chuyển sang phận lưu trữ in ấn kết Trên sắc đồ nhận ghi, ta có tín hiệu tương ứng với cấu tử tách gọi peak Thời gian lưu peak đại lượng đặc trưng (định tính) cho chất cần tách; diện tích peak thước đo định lượng cho chất hỗn hợp cần nghiên cứu 2.2 Những khái niệm phương trình phương pháp sắc ký khí 2.2.1 Sự lưu trữ Tư liệu trình sắc ký khí sắc đồ Mỗi peak sắc đồ ứng với một nhóm cấu tử hỗn hợp cần tách Thời gian từ bơm mẫu đến điểm cực đại peak gọi thời gian lưu toàn phần t R; bao gồm thời gian chết to (chính thời gian lưu cấu tử trơ không khí, mêtan, … pha tĩnh) thời gian lưu thật (còn gọi thời gian lưu hiệu chỉnh) t’ R t’R = tR - to (1) Sắc đồ giản đồ trình bày theo không gian hai chiều Người ta đánh giá sắc đồ hệ tọa độ [x, y] Khoảng cách điểm bơm mẫu đỉnh peak (tính theo đơn vị thời gian) gọi thời gian lưu tR Nếu gọi F lưu động dòng khí mang người ta xác định thể tích lưu sau: VR = F.tR (2) Tương tự ta có: V’R = F.t’R = F(tR - to) (3) V’R = F.tR – F.to (4) V’R = VR – Vo (5) Trong đó: Vo gọi thể tích chết Do trở kháng cột tách nên áp suất đầu cột cao áp suất cuối cột suốt chiều dài cột tách có giảm áp suất Giả sử khí mang không mang đặc tính dễ bị nén, ta có mối quan hệ tuyến tính lưu lượng dòng khí độ giảm áp suất suốt chiều dài cột tách Tuy nhiên, khả dễ bị nén chất khí, lưu lượng khí mang tăng nhanh so với mức độ tăng lên độ giảm áp suất Vì vậy, để loại trừ phụ thuộc lưu lượng dòng F (cũng thể tích lưu V R, V’R) vào độ chênh lệch áp suất đầu cột, người ta sử dụng hệ số hiệu chỉnh:  pi  −1  p A  J=  pi  −1  p  A  (6) Trong đó: pi áp suất đầu cột pA áp suất cuối cột Mặt khác, để so sánh đại lượng lưu giữ đo điều kiện phòng thí nghiệm khác (nhiệt độ, áp suất), người ta cần phải hiệu chỉnh lưu lượng dòng theo công thức sau: FC = FA ( TC p A − p H 2O ) TA p A (7) Trong đó: FC: lưu lượng dòng hiệu chỉnh FA: lưu lượng dòng đo cuối cột tách TC: nhiệt độ cột tách TA: nhiệt độ phòng pA: áp suất phòng p H 2O : áp suất nước nhiệt độ phòng Từ người ta thu thể tích lưu hiệu chỉnh VN theo công thức sau: V N = VR' j = t R' FC j = t R' FA ( TC p A − p H 2O TA pA )  pi  −1   p 3 A  pi   p  −1 A  (8) Đối với phép đo hóa lý, người ta sử dụng khái niệm thể tích lưu riêng Đó giá trị VN tính cho gam pha tĩnh quy 0oC (273oK) Vg = VN 273 (ml.g −1 ) WL TC (9) Trong đó: WL khối lượng pha tĩnh (lỏng) Áp dụng định luật Rault Henry cho trường hợp sắc ký khí - lỏng (pha tĩnh lớp phim mỏng bao quanh chất mang rắn) ta có mối tương quan V g γ (Hệ số hoạt độ chất tan dung môi pha tĩnh nồng độ vô loãng) Vg = V N 273 γ ∞ P o M L (10) Trong đó: R: số khí lý tưởng Po: áp suất bão hòa chất tan tinh khiết nhiệt độ cho ML: khối lượng phân tử chất lỏng làm pha tĩnh Trên sở phương trình (10), người ta áp dụng có hiệu cao phương pháp sắc ký khí – lỏng để xác định hệ số hoạt độ, đóng góp vào việc nghiên cứu hệ chiết lỏng – lỏng hiệu ứng muối Khi mẫu vào cột sắc ký, chúng nhanh chóng phân bố hai pha lỏng (tĩnh) pha khí (động) Quá trình mô ta hệ số phân bố K: K= C L  n L   nG =   / CG  VL   VG    (11) = Nồng độ chất tan pha tĩnh/Nồng độ chất tan pha động = (Khối lượng chất tan pha tĩnh/Khối lượng chất tan pha động)/(Thể tích pha động/Thể tích pha tĩnh) K = ( n L / nG ).(VG / VL ) = k β (12) Trong đó: n: số mol chất tan V: thể tích toàn phần pha tĩnh cột tách K: số phân bộ, phụ thuộc vào chất chất tan, pha tĩnh nhiệt độ mà không phụ thuộc vào kiểu cột tách k: hệ số dung lượng (k = nL/nG = t’R/to) đại lượng biểu diễn mối tương quan thời gian chất tan lưu lại pha tĩnh so với thời gian chất tan lưu lại pha động β : tỷ số pha (VG/VL) Mối liên hệ thể tích lưu VR số phân bố K biểu thị phương trình: VR = VG + K.VL (13) Trong đó: VG: thể tích pha khí VL: thể tích pha tĩnh Tương tự người ta nhận mối tương quan thời gian lưu t R số phân bố K sau: ( t R − to ) K = t’R/to = t R = t o (1 + k ) = to (14) L (1 + k ) U (15) Với: L chiều dài cột U : tốc độ trung bình khí mang tR = V L 1 + K L VG U    (16) Từ phương trình (13) (16) dễ dàng nhận thấy người ta xác định số phân bố K từ giá trị lưu trữ t R VR, biết giá trị thể tích pha động VG pha tĩnh VL 2.2.2Năng suất cột tách: Năng suất tách cột sắc ký thể qua số đĩa lý thuyết n xác định sau: n =  t R   σ (17) Trong đó: tR: thời gian lưu chất tan σ : độ lệch chuẩn peak sắc ký Nếu điểm uốn Wi = σ (18) σ σ Tại nửa chiều cao peak: Wh = (2ln2)1/2 = 2,355 Tại đáy peak: Wb = σ (19) Do thiết lập mối quan hệ số đĩa lý thuyết n với đại lượng sau: t R2  t  n= = 5,545 R   Wh   Wh     2,355   t  n= = 16 R  W b  W b      t R2 2 (20) Nếu gọi chiều cao đĩa lý thuyết h chiều dài toàn thể cột tách L ta có: h= L n (đo mm) (21) Giá trị h gọi HETP, viết tắt Height Equipvalent to a Theoretical Plate (tương đương chiều cao đĩa lý thuyết) Nếu suất cột tách lớn, n lớn h nhỏ Trên thực tế người ta thường tính số đĩa lý thuyết hiệu dụng, t R thay t’R:  t R' N = 5,45  wh    (22) Từ suy độ cao hiệu dụng đĩa lý thuyết H: H= L N (23) 2.2.3Phương trình Van Deemter Từ đĩa lý thuyết, người ta xác định đại lượng đặc trưng quan trọng n (số đĩa lý thuyết) h (độ cao đĩa lý thuyết) Tuy nhiên, vào hai đại lượng trên, ảnh hưởng điều kiện làm việc (nhiệt độ, áp suất, tốc độ dòng, …) đến đại lượng nói Phương trình Van Deemter làm sáng tỏ điều Phương trình Van Deemter viết sau: 2γ DG 8k ( df ) − i U U λ (1 + k i ) DF h = 2λdp − Trong đó: U λ : tốc độ trung bình dòng khí mang : độ không đồng chất nhồi cột dp: đường kính trung bình hạt chất mang (24) γ : hệ số Labyrinth đường khí cột DG: hệ số khuếch tán phân tử pha khí ki: hệ số dung lượng df: độ dày lớp phim pha tĩnh chất mang Phương trình Van Deemter viết gọn sau: h = A+ B + C.U U (25) Trong A đại diện cho khuếch tán tán xạ (còn gọi khuếch tán Eddy) cho ta thông tin đường khác khí chất nhồi cột định Còn B cho ta dẫn khuếch tán phân tử pha khí Đại lượng C biểu thị trở kháng cột trình chuyển khối pha động pha tĩnh 2.3 KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG THỨC LÀM VIỆC CỦA SẮC KÝ KHÍ Bộ phận quan trọng sắc ký khí cột tách detector Do khuôn khổ thời lượng giảng, tập trung giới thiệu hai phần chủ yếu Những phần có liên quan tới trình sắc ký khí đề nghị học viên tự tra cứu tài liệu tham khảo 2.3.1Các loại khí mang sử dụng sắc ký khí: P= η L.U Bo Theo phương trình ta thấy độ giảm áp suất qua cột tách tỷ lệ với độ nhớt khí mang Đối với cột dài nhồi chặt cột mao quản dài người ta phải lựa chọn khí mang có độ nhớt thấp Để phân tích nhanh người ta cần phải ý đến độ nhớt khí mang Thời gian phân tích cột tách mao quản – phim mỏng dùng H làm khí mang ngắn 1/9 thời gian dùng N2 Khi lựa chọn khí mang cần để ý đến detector sử dụng, độ tinh khiết yêu cầu tách; sử dụng phối hợp với phương thức khác Khí mang dùng phải không thay đổi trạng thái lý hóa học qua máy sắc ký khí Các loại khí dùng cho detector riêng cần ý điểm sau: − Detector độ dẫn TCD cần phải sử dụng khí mang có độ dẫn cao Hidro, Heli Khí heli có ưu điểm không nguy hiểm Trong sắc ký điều chế cần phải dùng lượng khí lớn; thích hợp khí N2 với giá rẻ; phải ý đến độ nhạy khoảng tuyến tính − Detetor ion hóa lửa FID vận hành với tất khí vô làm khí mang trừ O2 Do giá thành rẻ, không nguy hiểm nên người ta thường sử dụng nitơ Trong trường hợp kết hợp với thiết bị khác; ví dụ kết hợp sắc ký khí với khối phổ (GC – MS) người ta phải dùng Heli làm khí mang Khác với detector đo độ dẫn TCD, detector FID vận hành cần phải dùng thêm H không khí để đốt cháy lửa − Detector cộng kết lửa ECD (hay gọi detector bắt điện tử) vận hành với khí khác làm khí mang làm việc theo kiểu dòng chiều dùng nitơ; vận hành theo kiểu xung dùng Argon bổ sung 5% khí mêtan cho kết tốt Đặc điểm số khí mang thường sử dụng sắc ký khí: − Khí hidro thương mại thường đạt đủ tiêu chuẩn cho sắc ký Trong phân tích lượng vết, sử dụng pha tĩnh dễ bị hỏng; sắc ký khí điều chế cần thiết phải làm khô khí Khi sử dụng H2 làm khí mang cần dùng N2 làm khí bảo vệ thổi qua cột trước Các ống dẫn khí N phải đủ dày, tốt hết dùng ống kim loại nhỏ vừa kín vừa tiết kiệm khí H dùng cho cột tách làm việc 200oC tỏ trơ Khi sử dụng H phòng sắc ký phải có máy dò hở H2 cấm lửa − Khí heli khí trơ hóa học thích hợp cho sắc ký khí nhiệt độ cao Khi sử dụng detector ion hóa tia phóng xạ phải có heli tinh khiết − Khí Argon khí trơ khác, Ar sở hoạt tính hóa học dùng cho sắc ký khí nhiệt độ cao Do độ nhớt Ar cao sử dụng không gặp khó khăn yêu cầu dây dẫn Khí Ar ngày sử dụng nhiều làm khí mang − Khí N2: Do không nguy hiểm, giá rẻ dễ dàng làm tinh khiết nên N sử dụng nhiều sắc ký khí Nhưng cần ý với detector TCD, giá trị dẫn nhiệt N2 gần với độ dẫn nhiều khí chất hữu Hình 2.8: Detector ECD 2.4.4 Detector FTD (NPD) – Flame Thermionic Detector Detector nhiệt hóa ion lửa cho độ nhạy cao phân tích hợp chất hữu chứa nitơ phốt pho, phụ thuộc vào điều kiện phân tích Detector loại chứng tỏ khả phân tích loại chất trao đổi, dư lượng hóa chất sử dụng nông nghiệp cacbamat phốt phát, lượng vết hợp chất chứa nitơ phốt nitrosamine, trimethylamine, acrylonitril nhựa Mặc dù chế phản ứng xác detector chưa hiểu cách đầy đủ; chế phản ứng đề nghị cho hợp chất chứa nitơ phốt mô tả sau: Hợp chất nitơ hữu tách khỏi cột dạng cyanoradicals (CN*) diphosphoric radicals (PO 2*) sau bị phân ly nhiệt bề mặt hạt kim loại kiềm nung nóng (nguồn kim loại kiềm) Các radicals cung cấp electrons phóng từ bề mặt miếng kim loại kiềm nung nóng (miếng kim loại kiềm Rb) trở thành ion CN- diphosphoric ions (PO2-) Các ion kết hợp với nguyên tử hidrogen kim loại Rb trở thành cation sau phóng thích electron phát dòng điện collector detector phát tín hiệu Trong detector FTD GC – 2010 nguồn ion miếng kim loại kiềm quấn dây platin Dòng điện AC đốt nóng dây platin để sau đốt nóng miếng kim loại kiềm Cấu tử mẫu đưa khỏi cột phóng thích cuối cột sau trộn với lượng nhỏ khí hydrogen Các cấu tử sau va chạm với miếng kim loại kiềm nung đỏ Các phản ứng khác xảy bề mặt môi trường xung quanh ác cấu tử mẫu sau phóng phía buồng phản ứng qua trung tâm collector Hình 2.9: Đetector NPD 2.4.5 Điều khiển nhiệt độ cột tách Một yêu cầu quan trọng SKK hợp chất cần xác định phải bay Muốn bay phải cần nhiệt độ Tuy nhiên trình bay có chương trình nhiệt độ tối ưu dễ dàng tách cấu tử khỏi độ nhạy độ xác cao Nhiệt độ buồn bơm mẫu phải đảm bảo cho hỗn hợp chất bay hoàn toàn trước vào cột Nếu nhiệt độ thấp số chất sót lại buồng bơm mẫu dẫn đến kết phân tích không xác, đồng thời gây nhiễm bẩn cho lần phân tích Nhiệt độ cột có tác dụng làm tăng khả phân bố hai pha tĩnh động; có nghĩa khả tách chất hỗn hợp khỏi nhau; đồng thời rút ngắn thời gian phân tích Chính trình chạy sắc ký, người ta thường chạy chương trình nhiệt độ (gradient nhiệt độ) Hình 2.10: Sơ đồ GC 2.4.6 Liên hợp phương pháp SKK với phương pháp vật lý xác định cấu trúc Các phương pháp vật lý để giải thích cấu trúc, ví dụ phương pháp phổ nguyên tắc áp dụng cho hỗn hợp đa cấu tử Các phổ đồ (của phương pháp phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng, …) có sức thuyết phục lớn trước đo phổ, mẫu ban đầu tách thành cấu tử riêng biệt Trong số phương pháp tách thông dụng (chưng cất, chiết, sắc ký, …) phương pháp sắc ký khí điều chế có nhiều ưu điểm Phương pháp cho phép thu nhận cấu tử với lượng tinh khiết cao thời gian ngắn lượng mẫu đủ lớn để đo phổ Bằng cách người ta phối hợp phương pháp tách phương pháp xác định cấu trúc Vào năm đầu thập kỷ 70, kỹ thuật liên hợp kín (on-line combination) phương pháp SKK quang phổ khối lượng đời Trong trường hợp này, người ta không cần phải thu nhận cấu tử riêng biệt từ cột sắc ký điều chế Các cấu tử tách khỏi cột sắc ký đưa vào nguồn ion máy khối phổ Tại chúng phân mảnh tách khỏi nhờ từ trường vào nhân quang để chuyển hóa thành tín hiệu điện Ứng với peak sắc ký đồ, người ta nhận khối phổ đồ riêng biệt Hiện có hai loại ghép nối tương đối hiệu việc nghiên cứu, xác định cấu trúc; là: 2.4.6.1 Liên hợp sắc ký khí - Khối phổ ký (GC – MS) Sở dĩ người ta thực thuận lợi liên hợp sắc ký khí - khối phổ ký hai phương pháp có đặc tính chung sau: − Mẫu nghiên cứu trạng thái khí − Cả hai phương pháp có độ nhạy phát cao − Tốc độ phân tích hai phương pháp tương tự Độ khác biệt đáng kể hai phương pháp là: cột sắc ký tồn áp suất lớn áp suất môi trường (do độ chênh lệch áp suất đầu cuối cột), nguồn ion máy khối phổ hoạt động với chân không cao (khoảng 10 -6mmHg) Để gá nối cột tách sắc ký với nguồn ion, giải pháp phải chiết khí mang khỏi mẫu, trước đưa mẫu vào buồng ion Có độ chân không nguồn ion không bị ảnh hưởng Các separator hoạt động lọc phân tử nối với bơm chân không cao tốc với công suất 10ml/phút Lẽ đương nhiên trình chiết khí mang, phần phân tử mẫu bị mát Trong liên hợp GC – MS, separator đóng vai trò phận tiếp giáp (interface) Tùy theo loại separator mà hệ số hiệu dụng dao động từ 10 – 70% Thể tích chết separator cần phải nhỏ đến mức tối thiểu để không ảnh hưởng đến suất tách cột sắc ký Tại bề mặt separator không phép xảy trình hấp phụ phân hủy xúc tác gây Trong trường hợp cột mao quản, người ta đưa trực tiếp mẫu từ cột mao quản vào thẳng nguồn ion mà không cần dùng separator Sở dĩ với cột mao quản lưu lượng dòng khí mang nhỏ (1 – ml/phút) nên không gây ảnh hưởng đáng kể đến chân không nguồn ion máy khối phổ Với việc sử dụng khối phổ kế làm detector đặc thù cho thiết bị sắc ký khí, người ta thu thông tin quý giá việc xác định cấu trúc chất lạ, đặc biệt chất chuẩn Phương pháp thu thành công đáng kể lĩnh vực nghiên cứu hóa dầu, hóa học hợp chất tự nhiên, hóa sinh hóa học lâm sàng Trong 30 năm trở lại đây, liên hợp GC – MS công cụ thiếu đại hội olympic để phân tích hàm lượng chất kích thích dopping nước tiểu vận động viên thể thao Nhìn chung liên hợp GC – MS có ưu điểm sau: − Lượng mẫu nhỏ (ít 1μg) − Nghiên cứu hợp chất không bền − Tiến hành tốt việc tách nhận biết đồng thời hỗn hợp nhiều cấu tử Hình 2.11: Máy sắc ký khí ghép khối phổ 2.4.6.2 Liên hợp sắc ký khí - phổ hồng ngoại (GC – IR) Trong phương pháp GC – MS, người ta nhận xác công thức tổng quát cấu tử tách từ cột sắc ký số thông tin quan trọng mặt cấu trúc dựa sở phân mảnh chế phân mảnh suy từ khối phổ đồ Để xác định xác cấu trúc hóa học cấu tử tách từ cột sắc ký, nhiều trường hợp người ta phải có thêm thông tin khác nhóm chức, nối đôi liên hợp, độ chuyển dịch hóa học hạt nhân 1H 13C, … Với đời kỹ thuật liên hợp sắc ký khí – Quang phổ hồng ngoại (GC – IR) người ta biết thêm thông tin khác, nhóm chức (liên kết đôi, liên kết ba, vòng thơm, CO, CN, ête, …) lý băng phổ hồng ngoại phản ánh tồn dao động quay phân tử nhóm chức tương ứng Điểm khó khăn phương pháp ghép nối chỗ mẫu SKK trạng thái khí mẫu phổ hồng ngoại nằm dạng lỏng rắn Để khắc phục khó khăn trên, cấu tử sau rời cột tách (cột sắc ký) ngưng tụ đĩa kim loại (thường vàng) hạ nhiệt độ tới oK (nhiệt độ heli lỏng) Quá trình gọi thuật ngữ chuyên môn phân lập matrix (matrix insolation) Ánh sáng hồng ngoại gửi qua cửa sổ nhỏ nằm thành đĩa kim loại Ở phía bên đĩa, đối diện với nguồn sáng, lắp nhân quang làm detector Như vậy, ứng với cửa sổ đĩa kim loại, người ta nhận phổ đồ hồng ngoại tương ứng Với máy đo đại, thời gian đo mẫu giây lượng chất cần thiết khoảng 10-5 – 10-6g Ngày người ta chế thiết bị hồng ngoại chuyển hóa Fourier; thời gian đo mẫu 1s với hiệu suất phân giải khoảng 4cm-1 Với loại thiết bị này, ánh sáng hồng ngoại không cần phải quét từ 4000cm-1 đến 400cm-1 Người ta cần gửi xung (bao gồm tất bước sóng dải hồng ngoại) qua mẫu; đo lấy ánh sáng đáp ứng sau qua mẫu, chuyển hóa Fourier tín hiệu đáp ứng (theo đơn vị thời gian) thành tín hiệu tương ứng thông thường (theo đơn vị sóng tần số) Bằng cách này, người ta nhận nhiều phổ đồ hồng ngoại tương ứng với peak sắc ký đồ Thông qua việc so sánh phổ đồ đó, người ta kiểm nghiệm chất lượng trình tách sắc ký Ví dụ hai cấu tử có chúng peak sắc ký đồ, ứng với nhánh peak sắc ký, người ta nhận phổ đồ hồng ngoại khác hẳn Kỹ thuật liên hợp sắc ký khí với quang phổ hồng ngoại chuyển hóa Fourier ký hiệu tắt GC – FT – IR (Gas Chromatography – Fourier Technology – Infrared) Hình 2.12: GC-IR 2.5 PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG Trước phân tích định tính định lượng, phải khảo sát thông số kỹ thuật hệ thống sắc ký 2.5.1 Khảo sát chương trình nhiệt độ Trong sắc ký khí, nhiệt độ đóng vai trò quan trọng việc làm bay tách cấu tử khỏi Việc chương trình hóa nhiệt độ ảnh hưởng đến phân bố cấu tử hai pha [lỏng (tĩnh) – khí (động)]; đồng thời thay đổi hệ số tách peak Cách tiến hành: Dùng 16 hoạt chất chuẩn biết nồng độ; khống chế tốc độ bơm mẫu; tốc độ dòng khí mang không thay đổi suốt trình (kể áp suất cột nhiệt độ detector) − − Chạy sắc ký ghi đo phổ theo chương trình nhiệt độ khác − So sánh độ phân giải, khả tách peak để chọn chương trình cho phù hợp 2.5.2 Khảo sát tốc độ dòng Để nâng cao hiệu cột tách, bên cạnh yếu tố nhiệt độ tốc độ dòng ảnh hưởng trực tiếp đến suất cột tách Do vậy, việc khảo sát để lựa chọn tốc độ dòng tối ưu góp phần đảm bảo cho phép phân tích đạt độ xác cao Cách tiến hành: Bước 1: Giữ nguyên thông số chương trình nhiệt độ chọn trên; cố định lượng bơm mẫu vào cột μl Tốc độ dòng sử dụng mức sau: 26 cm/s; 31 cm/s; 36 cm/s; 46 cm/s Bước 2: Chạy sắc ký mẫu chuẩn hỗn hợp chứa 16 hoạt chất pha sẵn theo tốc độ dòng khác Ghi phổ thu nhận Bước 3: Xử lý số liệu độ phân giải phổ đồ; sở chọn tốc độ dòng thích hợp 2.5.3 Đánh giá độ nhạy detector theo dòng khí bổ trợ Thực nghiệm cho thấy dòng khí bổ trợ có ảnh hưởng đến độ nhạy detector Để chọn dòng khí bổ trợ phù hợp với độ nhạy cực đại detector, cần tiến hành khảo sát theo bước sau: Bước 1: Chọn DDT để khảo sát Pha dung dịch chuẩn DDT có hàm lượng 12 ppm (12 μg/ml); hút 0,2 ml cho vào bình định mức 10ml; dùng hexan để định mức tới vạch Bước 2: Giữ nguyên thông số tối ưu chương trình nhiệt độ, tốc độ dòng thông số khác Tiến hành khảo sát dòng khí bổ trợ theo mức 20, 25, 30, 35, 40, 45 ml/phút Bước 3: Điều chỉnh dòng khí bổ trợ mức thấp tiến hành khảo sát tốc độ dòng từ thấp đến cao Bước 4: Sau lần chạy sắc ký tốc độ dòng khí bổ trở khác nhau, ghi nhận kết Bước 5: Dựa kết thu nhận để chọn tốc độ dòng khí bổ trợ thích hợp (tối ưu) [peak cao, gọn, cân đối; số đếm lớn nhất] 2.5.4 Khảo sát thời gian lưu Để đáp ứng yêu cầu phân tích định tính định lượng sắc ký khí, cần phải xác định thời gian lưu hợp chất riêng biệt nhóm 16 hoạt chất đề cập Quá trình xác định thời gian lưu thực lần để tính giá trị trung bình sai số trung bình Bước 1: Điều chỉnh thông số kỹ thuật khảo sát mức chọn Bước 2: Chuẩn bị dung dịch chuẩn hoạt chất có nồng độ xác định Bước 3: Tiến hành chạy sắc ký theo thứ tự dung dịch hoạt chất Bước 4: Ghi thời gian xuất peak điểm cực đại TR cho hoạt chất Hiện nay, người ta sản xuất sử dụng hàng trăm loại hóa chất bảo vệ thực vật khác Vì xác định hàm lượng dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật cần phải có chuẩn loại hóa chất bảo vệ thực vật để xác định thời gian lưu; có xác định xác hàm lượng Những thiết bị sắc ký khí đại có chương trình phần mềm có khả lặp lại phép đo với độ xác cao; ví dụ: với hoạt chất chuẩn, máy ghi đo lần đưa kết 03 sắc độ hoàn toàn trùng Trong trường hợp phát chất lạ mà chuẩn cần phải có phối hợp sắc ký khí khối phổ GC – MS phổ hồng ngoại GC – FT – IR để xác định cấu trúc phân tử, từ có khả định tên Ví dụ: Khảo sát thời gian lưu thuốc trừ sâu theo chế độ hoạt động GC/ECD Điều kiện chạy thiết bị sau: - Nhiệt độ injector: 2700C - Nhiệt độ cột: ban đầu 800C giữ 0,5 phút sau tăng lên 100C/phút đến 2800C, giữ nhiệt độ 2800C 29.5 phút - Nhiệt độ detector: 3000C - Chạy chế độ đẳng áp 28 Kpa - Tỷ số chia: 1.0 - Lưu lượng dòng make-up: 28 ml/phút - Current: 1.00 nA - Tổng dòng 12.4ml/phút - Column flow: 4.7ml/phút - Loại cột mao quản SPB-608 µ - Cách tiến hành: Lấy xác l hoạt chất chuẩn đơn pha chế sẵn bảng 3.2, tiến hành chạy GC cho hoạt chất (mỗi hoạt chất bơm lần) Thời gian lưu (Tr) hoạt chất trình bày bảng sau: Thời gjan lưu Tr (phút) Lần Lần Lần Tr trung bình sai số (phút) 11.627 11.629 11.632 11.629 ± 0.006 16.938 17.000 16.957 16.965 ± 0.079 Alachlor 17.225 17.229 17.235 17.230 ± 0.013 Metolachlor 18.000 18.086 18.047 18.044 ± 0.107 Fipronil 18.373 18.376 18.38 18.376 ± 0.009 Chlorfluazuron 20.168 20.074 20.103 20.115± 0.120 Cypermethrin 30.926 30.931 30.898 ± 0.131 Hoạt chất Lufenuron Chlorothalonil 30.837 Bảng 2.2: Thời gian lưu HCBVTV (Ghi chú: tính sai số với giá trị độ tin cậy 95%) Riêng cypermethrin có peak gần Sau sắc ký đồ thời gian lưu hoạt chất: Hình 2.13: Các sắc ký đồ thời gian lưu 7HCBVTV khảo sát 2.5.5 Xác định giới hạn phát –LOD (limit of detection) chất phân tích Giới hạn phát ( cực tiểu phát hiện) hàm lượng tối thiểu chất phân tích phát đầu dò máy (detector) LOD loại detector xác định cách so sánh thang đo, chiều cao tín hiệu S (signal) chất phân tích với chiều cao đường (noise) LOD tương ứng với nồng độ thích hợp cho: S =3 N S N Hình 3.2 Tín hiệu LOD Đây tiêu chuẩn nhằm đảm bảo kết phân tích chắn không bị ảnh hưởng can nhiễu Ví dụ: xác định LOD số thuốc trừ sau máy GC 2010 hãng Shimazu Cách tiến hành: - Xác định đường detector cách chạy GC hỗn hợp dung môi hexan:aceton=1:1 (v/v), với thể tích bơm µl - Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn đơn, cách pha loãng với hệ số pha loãng so với chuẩn đơn là: 1 1 , , , , 16 Sau đo GC với lần bơm 1µl - Ghi nhận chiều cao tín hiệu S chất phân tích chiều cao đường (N) 3≤ cho với nồng độ chất chuẩn nhỏ ( C min), thì: loãng mẫu chuẩn tính LOD theo công thức: LOD = Hoạt chất S = < 10 N Τ0 3C T0 LOD (ppb) Lufenuron 7.178 ± 0.062 Chlorothalonil 2.746 ± 0.023 Alachlor 5.497 ± 0.051 Metolachlor 2.892 ± 0.047 Fipronil 0.189 Chlorfluazuron 0.491 Cypermethrin 1.970 ± ± ± 0.031 0.036 0.046 Bảng 2.3: Kết LOD , dừng pha 2.5.6 Khảo sát giới hạn định lượng (LOQ: Limit of quantitation) LOQ hàm lượng tối thiểu chất phân tích định lượng mẫu với độ xác độ lặp lại tin cậy Nếu S chiều cao tín hiệu peak chất ≤ LOQ = phân tích N chiều cao tín hiệu đường mẫu trắng : S ≤5 N Ví dụ: - Lần lượt hút xác 0.5ml, 0.3ml, 0.2ml, 0.1ml, 0.06ml, 0.02ml dung dịch HCBVTV chuẩn hỗn hợp cho vào bình tam giác có chứa 50g rau bó xôi chuẩn bị bình tam giác tương tự không chứa HCBVTV để làm mẫu trắng - Chiết dư lượng HCBVTV đo GC/ECD sơ đồ 3.2 Đo mẫu trắng trước, sau tiến hành đo mẫu có chứa HCBVTV, lần đo tiến hành trừ trắng Đến tín hiệu peak chất phân tích cao lần tín hiệu đường chọn giá trị nồng độ để tính LOQ: Công thức tính: LOQ = V *C * 50 1000 ( ng/g) Với: - V(ml) thể tích HCBVTV thêm vào mẫu rau bó xôi để tín hiệu chất phân tích ≤ LOQ = thoả mãn điều kiện S ≤5 n - C (ppm) nồng độ HCBVTV chuẩn thêm vào Kết sau: HCBVTV LOQ (ng/g) HCBVTV LOQ(ng/g) Lufenuron 1.976 Fipronil 0.064 Chlorothalonil 3.600 Chlorfluazuro n 0.996 Alachlor 3.984 Cypermethrin 1.198 Metolachlor 1.992 Bảng 2.4: Kết xác định LOQ 2.5.7 Phân tích định tính định lượng Phân tích định tính: So sánh sắc đồ chuẩn sắc đồ mẫu phân tích theo thời gian lưu chất phân tích − Phân tích định lượng: Xây dựng đường chuẩn dựa diện tích chiều cao peak Từ đường chuẩn tính hàm lượng chất cần nghiên cứu − Ví dụ: đường chuẩn thuốc trừ sâu Fipronil (Thao tác xây dựng đường chuẩn phần mềm GC-Solution) − Phân tích cấu trúc: Dựa phổ GC – MS kết hợp phổ GC – FT – IR v [...]... ứng với một peak trên sắc ký đồ Thông qua việc so sánh các phổ đồ đó, người ta còn có thể kiểm nghiệm chất lượng của quá trình tách sắc ký Ví dụ nếu hai cấu tử có chúng một peak trên sắc ký đồ, thì ứng với mỗi nhánh của peak sắc ký, người ta có thể nhận được phổ đồ hồng ngoại khác hẳn nhau Kỹ thuật liên hợp sắc ký khí với quang phổ hồng ngoại chuyển hóa Fourier được ký hiệu tắt là GC – FT – IR (Gas Chromatography... Liên hợp sắc ký khí - Khối phổ ký (GC – MS) Sở dĩ người ta có thể thực hiện khá thuận lợi liên hợp sắc ký khí - khối phổ ký là vì cả hai phương pháp này cùng có những đặc tính chung như sau: − Mẫu được nghiên cứu trong trạng thái khí − Cả hai phương pháp đều có độ nhạy phát hiện cao − Tốc độ phân tích của cả hai phương pháp tương tự nhau Độ khác biệt đáng kể giữa hai phương pháp là: trong cột sắc ký luôn... này vào máy sắc ký khí cũng là những vấn đề được nhiều nhà khoa học nghiên cứu và hoàn chỉnh Hình 2.4: 1 Cột nhồi; 2 Cột mao quản WCOT; 3 Cột mao quản PLOT Sơ đồ biểu diễn thiết diện cắt ngang của cột nhồi, cột mao quản WCOT; PLOT Hình 2.5: Cột mao quản 2.3.4 Cơ sở lý thuyết của sắc ký khí cột mao quản Về cơ bản không có sự khác biệt có tính nguyên tắc giữa sắc ký khí cột mao quản và sắc ký khí cột nhồi... chất kích thích dopping trong nước tiểu của các vận động viên thể thao Nhìn chung liên hợp GC – MS có những ưu điểm sau: − Lượng mẫu nhỏ (ít hơn 1μg) − Nghiên cứu được các hợp chất không bền − Tiến hành tốt việc tách và nhận biết đồng thời hỗn hợp nhiều cấu tử Hình 2.11: Máy sắc ký khí ghép khối phổ 2.4.6.2 Liên hợp sắc ký khí - phổ hồng ngoại (GC – IR) Trong phương pháp GC – MS, người ta nhận được chính... peak sắc ký có thể ngược Trong phân tích định lượng, hệ số hiệu chỉnh đặc trưng sẽ xê dịch rất mạnh khỏi 1 khi dùng khí mang có độ dẫn cao − Không khí và oxy: Độ tinh khiết của Oxy thương mại cũng đạt yêu cầu cho Sắc ký khí, nhưng cần phải sấy khô vì trong bom đựng khí thế nào cũng có nước Không khí nén có thể lấy từ bom hoặc bơm nén kiểu dầu, trường hợp thứ hai cần làm cho hơi dầu không vào thiết bị sắc. .. nghiên cứu của mình Tuy vậy, để chủ động và đỡ tốn kém nên tự tiếnhành tẩm lấy các chất nhồi cột mong muốn − * Cột mao quản: Sắc ký khí cột mao quản là một hình thái đặc biệt của phương pháp sắc ký khí; được đặc trưng bởi năng suất cột tách và hiệu suất phân giải rất cao Trong sắc ký khí cột nhồi, độ dài của cột tách thông thường là dưới 5 mét; trường hợp đặc biệt người ta đã chế được cột dài tới 20 mét... hàm lượng của nó Những thiết bị sắc ký khí hiện đại có chương trình phần mềm có khả năng lặp lại phép đo với độ chính xác cực kỳ cao; ví dụ: với một hoạt chất chuẩn, máy có thể ghi đo 3 lần và đưa ra kết quả 03 sắc độ hoàn toàn trùng nhau Trong trường hợp phát hiện chất lạ mà không có chuẩn thì cần phải có sự phối hợp sắc ký khí và khối phổ GC – MS hoặc phổ hồng ngoại GC – FT – IR để xác định cấu trúc... dầu không vào thiết bị sắc ký khí 2.3.2 Cột tách sắc ký khí Trong thực tế có nhiều dạng cột tách khác nhau nhằm thỏa mãn các mục đích nghiên cứu Nhìn chung, cột tách sắc ký cần đạt những yêu cầu sau: − Đảm bảo trao đổi chất tốt giữa pha động và pha tĩnh nhờ việc tối ưu hóa các thông số của phương trình Van Deemter − Độ thấm cao, tức là độ giảm áp suất nhỏ với một tốc độ khí mang nhất định − Khả năng... 2.12: GC- IR 2.5 PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG Trước khi phân tích định tính hoặc định lượng, phải khảo sát các thông số kỹ thuật của hệ thống sắc ký 2.5.1 Khảo sát chương trình nhiệt độ Trong sắc ký khí, nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong việc làm bay hơi và tách các cấu tử ra khỏi nhau Việc chương trình hóa nhiệt độ sẽ ảnh hưởng đến sự phân bố của các cấu tử trong hai pha [lỏng (tĩnh) – khí. .. này, người ta không cần phải thu nhận các cấu tử riêng biệt từ cột sắc ký điều chế nữa Các cấu tử được tách khỏi cột sắc ký sẽ lần lượt được đưa vào nguồn ion của máy khối phổ Tại đó chúng được phân mảnh và được tách khỏi nhau nhờ một từ trường rồi đi vào bộ nhân quang để chuyển hóa thành tín hiệu điện Ứng với mỗi một peak trên sắc ký đồ, người ta nhận được một khối phổ đồ riêng biệt Hiện nay có hai