Bệnh tiểu đường tổng hợp insulin bằng ứng dụng công nghệ sinh học

Hiện nay, hầu hết những phương pháp sản xuất insulin thương mại đều dựa trên các chủng nấm men (Saccharomyces cerevisiae) hoặc vi khuẩn (E. coli) kết hợp với các kỹ thuật gene để sản xuất insulin người tổng hợp. Nói về các hệ thống tế bào dùng để biểu hiện insulin tái tổ hợp, người ta sử dụng rất đa dạng từ vi sinh vật tới tế bào động vật và cả thực vật. Trong số đó, tế bào vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất do chúng dễ thao tác, dễ đưa vào áp dụng ở quy mô sản xuất công nghiệp, nhiều nhất là E.coli và nấm men pichia. Gần đây, người ta đưa ra một hệ thống biểu hiện khác cho các loại protein tái tổ hợp đó là Bacillus brevis. Mục đích của những nghiên cứu, phát minh hiện tại là muốn phát triển một hệ thống biểu hiện và 1 phương pháp sản xuất insulin có năng suất cao và hiệu quả sản xuất phải ngang bằng hay vuợt trội hơn so với những hệ thống sản xuất insulin đã từ trước tới nay. Hay nói cách khác, các nghiên cứu trong giai đoạn này nhằm cải tiến phương pháp cổ điển chuyển các tiền chất của insulin thành insulin; nghiên cứu tìm ra môi trường tối ưu cho việc hình thành các cầu nối cần thiết cho việc biểu hiện hoạt tính của insulin; tìm ra một hệ thống biểu hiện insulin cho năng suất, sản luợng cao.

5.1 Tác đông của insulin đến trao đổi carbohydrate 9 5.2Tác động của insulin lên lipid 13 5.3Tác động của insulin lên protit 13

37

11.2Thuốc tiêm 37

*Insulin (dùng cho dạng typ1) 37

* Thuốc dùng cho dạng typ2 38

I MỞ ĐẦU

CNSH – ngành nâng cao chất lượng cuộc sống thế kỷ 21 Cùng với

sự phát triển của các ngành khoa học kỹ thuật khác như: vật lý, hóa học,điện hạt nhân, công nghệ thông tin CN9SH cũng được chú ý phát triển ởcác nước công nghiệp từ những năm đầu thập niên 80, ở các nước có nềncông nghiệp mới thì từ những năm 85 và các nước đang phát triển trongkhu vực thì chủ yếu từ những năm 90 trở lại đây Đến nay, hầu hết ở cácnước CNSH đều được coi là một hướng khoa học công nghệ ưu tiên, đầu tư

và phát triển trở thành một trong những ngành mũi nhọn của thế kỷ 21.Chính nhờ đó và được thừa hưởng một cách tổng hợp những thành quả củacác ngành khoa học cơ bản như: VSV học, di truyền học, sinh hóa học, sinh

lý học, sinh học phân tử, miễn dịch, VSV học ứng dụng, công nghệ sinhhóa học đồng thời xu hướng hội nhập, quốc tế hóa, toàn cầu hóa CNSH

đã phát triển và được ứng dụng trong nhiều ngành, nhiều lĩnh vực của cuộcsống: nông - lâm – ngư nghiệp, lĩnh vực y – dược, khoa học thực phẩm, bảo

vệ môi trường nhằm phục vụ cho mọi nhu cầu của cuộc sống: dinh dưỡng,giải trí, chăm sóc sức khỏe và mang lại lợi ích kinh tế to lớn cho các quốcgia

CNSH được chia làm 3 giai đoạn căn cứ vào sự phát triển của nó:

1

nước mắm theo phương pháp truyền thống, xử lý đất đai, phân bón đểphục vụ nông nghiệp.

+ CNSH cận đại: sử dụng công nghệ trong quá trình chế biến sảnphẩm như việc sử dụng các nồi lên men công nghệ để sản xuất ở quy môlớn các sản phẩm: mì chính, acid amin, acid hữu cơ, chất kháng sinh

+ CNSH hiện đại: công nghệ di truyền, công nghệ tế bào, công nghệEnzym và Protein, công nghệ VSV, công nghệ lên men, công nghệ môitrường Nhờ đó, loài người đã và đang có thể sửa chữa, trao đổi, cải tạo,tạo mới vật chất di truyền ở cấp độ phân tử Thực tế, phát triển và ứng dụngCNSH hiện đại trên cơ sở kế thừa và phát huy CNSH cổ truyền và cận đại.Những năm gần đây loài người đã có thể tuyển chọn và dần tạo thêm đượcgiống cây trồng, vật nuôi mới có năng suất, chất lượng cao, sức chống chịutốt tạo ra được các chủng, loài VSV mới hoặc chỉ định các VSV này tạo

ra các Enzym, Protein có hoạt tính cao hơn các sản phẩm khác mà trước đâychúng ta không làm được Đặc biệt là nhân loại đã và đang có thể chuẩnđoán, phòng ngừa hay cứu chữa các bệnh hiểm nghèo, bệnh di truyền: ungthư, thiếu máu, các bệnh nhiễm sắc thể thường và nhiễm sắc thể giới tính bằng kỹ thuật gen và ứng dụng các loại VSV trong việc tổng hợp các loạithuốc cũng như những chất dinh dưỡng cho con người Và bệnh tiểu đườngcũng là một trong những bệnh đã ứng dụng thành tựu của ngành CNSH quaviệc tổng hợp insulin làm giảm chi phí cho những bệnh nhân Điều này rấtquan trọng vì số bệnh nhân tiểu đường đang có xu hướng tăng trong tươnglai Chính vì những điêu đã phân tích ở trên mà nhóm chúng em đã chọn đềtài này Và cũng qua đó chúng em cùng các bạn có được cách nhìn vừa kháiquát vừa cụ thể về bệnh tiểu đường, cách phòng chữa bệnh Đặc biệt là quátrình sinh tổng hợp insulin – thuốc dành cho người mắc bệnh tiểu đường,bằng những con đường khác nhau Không chỉ có vậy, qua bài viết nàychúng em muốn cùng mọi người cùng đi sâu tìm hiểu thêm nhiều vấn đềmang tính xã hội liên quan đến những khía cạnh của cuộc sống

II NỘI DUNG

1 Giới thiệu về insulin

Insulin là một loại hormone có bản chất protein được tiết ra từ tuyếntụy trong cơ thể Đây là hormone quan trọng nhất cho quá trình lưu trữ, sửdụng đường, acid amin, acid béo và kiểm soát lượng đường trong máu

3

H1: Tuyến tụy nằm bên cạnh tá tràng.

2 Quá trình tìm ra insulin

Bệnh tiểu đường từng được biết đến từ thời cổ đại Những tài liệu cổcủa người Ai Cập từ 1.500 năm trước Công nguyên đã mô tả một bệnh suymòn với tình trạng nước tiểu của người bệnh có vị ngọt Từ những năm

1850 trở đi, các cuộc khám nghiệm tử thi trên bệnh nhân bị bệnh tiểu đường

đã gợi ý, bệnh xuất hiện là do tuyến tụy không bảo đảm được chức năngbình thường Nhiều bác sĩ cho rằng các tế bào biệt hóa, được gọi là tiểu đảoLangerhan, sản sinh ra một hóa chất giúp cơ thể điều hòa nồng độ đườngtrong máu Bệnh tiểu đường xuất hiện khi hóa chất này không được sảnsinh

Toronto (Canada) thông báo họ đã tìm ra insulin và ứng dụng thành côngchất này trong điều trị bệnh tiểu đường ở người Vào thời điểm đó, người bịbệnh tiểu đường phải vật lộn với căn bệnh để tồn tại và chưa có biện phápđiều trị hiệu quả nào Bệnh nhân nhanh chóng trở thành những bộ xương diđộng và thường chết sớm do bị sút cân nghiêm trọng.

Banting và Best đã cắt bỏ tuyến tụy của những chú chó, và hậu quả làchúng bị tiểu đường (thử nghiệm này nghe có vẻ tàn nhẫn, nhưng đã giúpcứu sống hàng triệu con người) Họ đã cố gắng tinh chế ra một hoóc mônhóa học từ tụy và chiết xuất nhiều thành phần từ tiểu đảo Langerhan Sau

đó, những chất này được tiêm vào chó bị bệnh tiểu đường để thử nghiệm và

họ nhận thấy bệnh tiểu đường đã bị đẩy lùi

Ban đầu, thuốc tiêm lẫn nhiều tạp chất và thường gây những tai biếnnguy hiểm Một đội ngũ các nhà khoa học đã phối hợp nghiên cứu và tạo rađược tinh chất chiết xuất từ tiểu đảo Langerhan, bảo đảm đủ độ tinh khiết

để thử nghiệm trên người bệnh Vào tháng 5 năm 1922, LeonardThompson, 14 tuổi, đã được điều trị thành công ở Bệnh viện Toronto bằngtinh chất này (được gọi là insulin) Năm 1928, Oskar Wintersteiner đãchứng minh rằng insulin là một protein Tin tức về sự thành công củaBanting và Best đã nhanh chóng lan rộng và ngay sau đó phòng thí nghiệmcủa họ đã không thể đáp ứng đủ nhu cầu về loại thần dược mới này

Quy trình sản xuất thương mại insulin bắt đầu bằng việc chiết suấtchất này từ tụy của bò và lợn thịt (hiện vẫn là nguồn insulin quan trọng đốivới y học) Quá trình biến đổi hóa học đã làm cho insulin này giống vớihoóc môn của người và cũng tạo cho nó những đặc tính thuận tiện hơn choviệc sử dụng Ban đầu, insulin được tiêm 3-4 lần/ngày trước bữa ăn Sau đó,loại insulin có tác dụng kéo dài được ra đời, vì vậy số lần tiêm đã giảmxuống

3 Phân loại insulin

Theo nguồn gốc :

5

cấu trúc so với insulin của người Ngày nay, đã được tinh chế bằng phươngpháp sắc ký, có độ tinh khiết cao Phổ biến là 2 loại : Actrapid beef và Lentbeef.

+Insulin "người" : bằng các phương pháp

-Bán tổng hợp từ insulin lợn

-Tái tổ hợp gen : từ loại insulin trung tính đơn thành phần, được sảnxuất bằng kỹ thuật tái tổ hợp AND, sử dụng nấm men làm cơ thể sinh sảnđạt đến độ tinh khiết, chất lượng cao, có cấu trúc giống hệt như insulin tựnhiên của người Do vậy, ít tạo kháng thể và thời gian tác dụng ngắn hơn

+Theo kỹ thuật : tinh chế cao độ và tinh chế theo sắc ký

+Theo tác dụng : 3 loại : nhanh, trung bình, chậm

4 Cấu tạo của insulin

Phân tử insulin được sử dụng làm mô hình cho các nghiên cứu về cấutrúc và tính chất cơ bản của protein Nó cũng là protein đầu tiên được giải

mã trình tư sắp xếp chuỗi acid amin vào năm 1955 nhờ công trình nghiêncứu của Fred Sanger(nghiên cứu đã mang về cho ông giải thưởng Nobelnăm 1958) Phân tử protein insulin có khối lượng khoảng 6000 Dalton, cấutạo bởi hai chuỗi polypeptide A và B được liên kết với nhau bởi các cầudisulfur Chuỗi A với 21 acid amin và chuỗi B với 30 acid amin, có một cầunối disulfur trong chuỗi A(A6 – A11) và 2 cầu nối disufur nối giữa haichuỗi A và B(A7 – B7 và A20 – B19)

H2: Insulin nối bằng nối disulfide (S-S)

Vị trí của các cầu nối disulfur này không thay đổi theo loại insulincủa các loài đông vật có vú Insulin ban đầu được tổng hợp ở dạng

“preproinsulin” (tiền insulin) trên ribosome trong tế bào beta trong vùngLangerhans của tuyến tụy Preproinsulin là một phân tử dạng thẳng baogồm: một peptide tín hiệu chứa 24 acid amin (SP), chuỗi B, peptide C với

31 acid amin (C) và chuỗi A nối với nhau theo thứ tự SP-B-C-A Khi vậnchuyển qua lưới nội chất, peptide tín hiệu bị phân cắt tạo ra proinsulin (B-C-A) Proinsulin hình thành cầu nối disulfur trong lưới nội chất, hình thànhcấu trúc bậc ba Proinsulin bị phân cắt bởi enzyme PC1/3 tại liên kết giữachuỗi B và peptide C và sau đó bị phân cắt bởi enzyme PC2 ngay vị trí liênkết giữa chuỗi A và peptide C Hai acid amin đầu N của peptide nối với đầu

C của chuỗi B khi bị phân cắt bởi PC1/3 sẽ được phân cắt ra khỏi chuỗi Bbởi enzyme carboxypeptidase H Kết quả cuối cùng của quá trình phân cắttạo thành insulin

7

H3: Cấu trúc phân tử insulin người.

Người ta cũng đã xác định được cấu trúc không gian ba chiều củainsulin và thấy rằng cấu trúc phân tử insulin được giử vững bởi nhiều liênkết: liên kết hydro và liên kết cầu disulfua giữa chuỗi A và chuỗi B

H4: cấu trúc không gian của insulin

(mammalian species) khác với cấu trúc insulin của loài người ở chổ nào?Điều đó cũng giải thích là ta ít dùng insulin của các động vật có vú dùngthay cho người đươc (W.F Ganong, 2004) Sự khác nhau, nếu so sánh vớiinsulin của con người, được nhìn thấy sau theo bản dưới đây Nói chung thì40% giống nhau, còn khác nhau ở các vị trí 8,9,10 và 30 và tên của cácamino acids (Katzung, 2000)

Sự thay đổi chuổi cấu trúc amino acid của con người

8 - 9 - 10

Chuỗi B các vị trí 30

Heo, chó, tinh dịch cá voi

Ala Ser Ala Ala Ala Ala

(Source W.F ganong, 2004

5 Vai trò sinh học của insulin

5.1 Tác đông của insulin đến trao đổi carbohydrate.

Tác động của insulin đến chức năng dữ trữ đường tại gan:

+Sau một bữa ăn nhiều tinh bột và đường, hàm lượng glocose trongmáu tăng sẽ kích thích tế bào beta của đảo tuỵ tiết insulin Insulin sẽ tácđộng đến các quá trình giữ, dự trữ và sử dụng glucose bởi các loại mô trong

cơ thể đặc biệt là tại gan, cơ và mô mỡ

9

H5: insulin vận chuyển glucose trong máu

Khi nồng độ glucose trong máu tăng cao (sau khi ăn, uống đồ uống

có nhiều đừớng, truyền glucose v.v.), glucose sẽ được dự trữ trong gan dướidạng glycogen Khi hàm lượng đường trong máu giảm (khi đói, giữa haibữa ăn ) glycogen sẽ biến đổi trở lại thành glucose để đi vào máu giữ cholượng đường trong máu (gọi tắt là đường huyết) không hạ quá thấp

Insulin tác động đến quá trình này như sau:

- Insulin ức chế phosphorylase, một enzyme biến đổi glycogen thànhglucose

- Insulin làm tăng cường hấp thu glucose của các tế bào gan thôngqua tác động của enzyme glucokinase (enzyme này tăng cường phosphorylhoá giữ glucose không qua được màng tế bào để đi ra ngoài)

- Tăng cường hoạt tính của enzyme tổng hợp glycogen bao gồmphosphofructokinase dẫn đến giai đoạn hai của quá trình phosphoryl hoáphân tử glucose và glucose synthetase có tác dụng tạo chuỗi từ cácmonosaccharide để hình thành phân tử glycogen

chiếm 5-6% khối lượng của gan hay khoảng 100gram glycogen)

Khi đường huyết giảm:

- Tế bào beta giảm tiết insulin

- Thiếu insulin sẽ dẫn đến diễn tiến ngược của quá trình trên bao gồmgiảm thu nhận glucose và giảm tổng hợp glycogen tại gan

- Thiếu insulin (song song với tăng glucagon) hoạt hoáphosphorylase có tác dụng chuyển glycogen thành glucose phosphate

- Enzyme glucose phosphatase xúc tác giải phóng gốc tự dophosphate khỏi glucose cho phép glucose quay trở lại hệ tuần hoàn (vàomáu)

Như vậy, dưới tác động của insulin, gan "lấy " glucose từ máu và dựtrữ dưới dạng glycogen Khi cần thiết (hạ đường huyết), sẽ giải phóngglucose trở lại

11

H6: insulin điều hoà glucoz trong máu

Tác động khác của insulin tại gan:

Insulin còn có khả năng biến đổi glucose thành các acid béo tạigan Acid béo sau đó sẽ đến các mô mỡ Insulin còn ức chếgluconeogenesis bằng cách giảm số lượng và hoạt tính các enzyme cần thiếtcho quá trình này hoặc thông qua tác động làm giảm quá trình giải phóng

tiền chất cho gluconeogenesis.

5.2 Tác động của insulin lên lipid

Với quá trình chuyển hoá lipid: tăng tổng hợp và dự trữ lipid ở gan,ngăn cản phân giải mỡ và ức chế tạo các chất cetonic nhờ ức chế hoạt tínhcủa lipase nhạy cảm với hoomon,làm giảm nồng độ axit béo và glyxeroltrong huyết tương

5.3 Tác động của insulin lên protit

Không nằm ngoài sự tác động của insulin đối với chuyển hoá protit:

nó thúc đẩy đồng hoá protit bằng cách làm các acid amin dễ xâm nhập vào

tế bào để tổng hợp protein Đặc biệt ở thành mạch, insuline tham gia vàotạo glycoprotein cấu trúc,do đó nếu thiếu insuline thành mạch dễ bị tổnthương

Ngoài ra, insulin làm tăng tính thấm các ion kali, magie và photphat

vô cơ tạo điều kiện cho quá trình photphoryl hoá và sử dụng glucoz

13

H7: Insulin làm tăng tính thấm các ion kali, magie và photphat vô cơ

Và gần đây có rất nhiều nghiên cứu mới có liên quan đến insulin vềnhững tác dụng mới của nó cũng như mối liên hệ của nó với một số bệnh.Chẳng hạn như insulin có thể bảo vệ trí nhớ Các nhà nghiên cứu thuộc Đạihọc Northwestern đã điều trị các tế bào thần kinh vùng hải mã, trung tâmđiều khiển trí nhớ của não, bằng insulin và thuốc Avandia, thuốc dùng trongđiều trị đái tháo đường type 2 Họ đã phát hiện ra rằng insulin bảo vệ các tếbào chống các khối protein độc được gọi là ADDLs (amyloid beta-deriveddiffusible ligands), các khối protein này liên kết với các khớp thần kinh ởnão.Khám phá cho thấy insulin có thể làm chậm hoặc ngăn ngừa bệnhAlzheimer – căn bệnh liên quan đến việc mất các dữ liệu ghi nhớ, có giảthuyết cho rằng căn bệnh này có thể có nguyên nhân là bệnh đái tháo đườngtype 3

6 Quá trình tổng hợp insulin

Insulin được tổng hợp trong tế bào β của tuyến tụy Insulin được tạo

ra từ một phần của một protein lớn hơn để đảm bảo sự gấp nếp đúng

mARN dịch mã protein preproinsulin Preproinsulin gồm một trình

tự đầu aa để tiền chất này đi qua lưới nội chất tham gia vào quá trình saudịch mã

Tại quá trình sau dịch mã preproinsulin bị thủy phân tạo thành dạngproinsulin Sau khi hình thành 3 cầu đisulfua một số peptitdaza cắtproinsulin thành insulin hoàn chỉnh và hoạt động insulin được đóng gói vàchứa trong các hạt tiết tích tụ trong tế bào chất đến khi đươc kích hoạt đểgiải phóng

15

H9: Các bước cải biến sau dịch mã của phân tử insulin

6.2 Tổng hợp insulin từ vi sinh vật

Cơ sở lý luận của phương pháp

Hiện nay, hầu hết những phương pháp sản xuất insulin thương mại

đều dựa trên các chủng nấm men (Saccharomyces cerevisiae) hoặc vi khuẩn (E coli) kết hợp với các kỹ thuật gene để sản xuất insulin người tổng hợp.

Nói về các hệ thống tế bào dùng để biểu hiện insulin tái tổ hợp, người ta sửdụng rất đa dạng từ vi sinh vật tới tế bào động vật và cả thực vật Trong số

đó, tế bào vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất do chúng dễ thao tác, dễ đưa

vào áp dụng ở quy mô sản xuất công nghiệp, nhiều nhất là E.coli và nấm

men pichia Gần đây, người ta đưa ra một hệ thống biểu hiện khác cho các

loại protein tái tổ hợp - đó là Bacillus brevis

Mục đích của những nghiên cứu, phát minh hiện tại là muốn pháttriển một hệ thống biểu hiện và 1 phương pháp sản xuất insulin có năng

những hệ thống sản xuất insulin đã từ trước tới nay Hay nói cách khác, cácnghiên cứu trong giai đoạn này nhằm cải tiến phương pháp cổ điển chuyểncác tiền chất của insulin thành insulin; nghiên cứu tìm ra môi trường tối ưucho việc hình thành các cầu nối cần thiết cho việc biểu hiện hoạt tính củainsulin; tìm ra một hệ thống biểu hiện insulin cho năng suất, sản luợng cao.

Có nhiều phương pháp để tổng hợp insulin Chúng em sẽ điểm quamột vài phương pháp đang được áp dụng trên thế giới:

Phương pháp 1

Tạo ra các chuỗi riêng biệt, kết hợp hoá học hoặc tạo một tiền chấtchuỗi đơn proinsulin người, sau đó phân cắt để tạo thành insulin hoànchỉnh

Bước 1: Trước hết, bằng kỹ thuật tách gen sử dụng trong sinh học

phân tử tách được gen mã hoá proinsulin người trên nhiễm sắc thể số 11.Sau đó, tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tụy củangười

17

H10:Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ của người

Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại gen Do hầuhết các mARN của người đều có đuôi polyA nên sử dụng chuỗi polyT đểbắt cặp với đuôi polyA đó Trong quá trình đó người ta sử dụng sử dụng sắc

kí ái lực với polyT giữ lại mARN cần thiết cho quá trình dịch mã; còn lạiloại bỏ ADN và các ARN khác rồi cắt bỏ cầu nối A - T thu được mARN

Bước 2: Tách và thiết kế plasmit tái tổ hợp.

+Cắt gen mã hoá proinsulin và plasmit bằng một loại enzym giới hạn.Nối bằng ADN ligase của phageT4

+Thiết kế các trình tự mã hoá cho các protein tín hiệu giúp vậnchuyển insulin ra ngoài tế bào chất

+Sao mARN tinh khiết thành cADN nhờ enzym phiên mã ngược vànhờ các dNTP (trong phản ứng RT - PCR)

một promoter mạnh Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli.

Bước 3: Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp trộn

với dung dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung điện Sau quá trình biến nạp, cầnchọn lọc được những dòng vi khuẩn mang gen mong muốn

H11: Tách và biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli

Bước 4: Các vi khuẩn chuyển gen sau đó được đưa vào lên men.

Nuôi chúng trong nồi lên men sử dụng phương pháp nuôi cấy liêntục, các chất dinh dưỡng được bổ xung thường xuyên để đảm bảo sự tăngtrưởng của vi khuẩn theo hàm số mũ Sau 20 phút có hàng triệu vi khuẩnđược nhân lên qua nguyên phân Chỉ sau một thời gian ngắn, sinh khối tănglên rất nhanh và gen insulin được tổng hợp

19

H12: Đưa các vi khuẩn chuyển gen vào nồi lên men.

Bước 5: Tiền tinh sạch

Sau khi lên men cần tách tế bào và khử trùng nhiệt

Dùng enzym lizozyme phá vỡ màng tế bào, sau đó dùng hỗn hợp chấttẩy rửa để tách lớp màng lipit

Bằng phương pháp ly tâm và lọc tách được proinsulin

H13: Proinsulin được lọc tách

Bước 6: Hoạt hoá

Do hệ thống E.coli có khả năng biểu hiện gen insulin nhưng không

có khả năng hoạt hoá insulin Nên người ta phải hoạt hoá proinsulin invitrobằng cách xử lý dung dịch đệm, giúp nó đạt cấu trúc bậc 4, sau đó dùngenzym đặc hiệu trypsin để phân cắt proinsulin Khi đó sản phẩm thu được

mới có hoạt tính cần thiết

21

H14: Hoạt hoá proinsulin thành insulin hoàn chỉnh

Bước 7: bằng phương pháp sắc ký, tách và phương pháp miễn dịch

gắn enzyme người ta đã thu được hỗn hợp tinh sạch chỉ có insulin Độ tinhsạch của insulin được đánh giá qua mỗi giai đoạn trung gian của quá trìnhsản xuất nhờ phòng thí nghiệm chuyên hoá Cuối cùng insulin được tinh thểhoá

H15: Tinh thể insulin

Phương pháp 2: tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B

+Để thực hiện quá trình này người ta phải xác định được trình tựADN của từng chuỗi để tiến hành sản xuất chuỗi A và B Qua đó tổng hợp

H16:Sản xuất insulin bằng cách tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B

Phương pháp này có hiệu quả sản xuất thấp Do đó, Eli Lilly pháttriển một phương pháp cải tiến hơn, phương pháp này biểu hiện proinsulinthay vì biểu hiện chuỗi A và B riêng biệt như phương pháp cũ, tạo cầu nốidisulfur in vitro, sau đó phân cắt peptide C khỏi hai chuỗi A và B bằngtrypsin và carboxypeptidase, tạo thành insulin