1. Nuôi cấy và phân lập vi sinh vật Quá trình hư hỏng thực phẩm do nhiều loại VSV từ nhiều nguồn (không khí, gỗ, nước, nguyên liệu… ) theo nhiều con đường khác nhau nhiễm vào. Để có thể định danh chính xác loại VSV đó, cần phân lập được các loại VSV có trong mẫu. Từ đó có thể xác định được nguồn nhiễm và truy tìm nguyên nhân gây nhiễm. 1.1. Định nghĩa Phân lập VSV là quá trình tách riêng các loài VSV từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết được tạo ra từ một tế bào ban đầu. 1.2. Mục đích Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ có hình dạng đặc trưng từ quần thể VSV ban đầu. 1.3. Nguyên tắc - Tách rời các tế bào VSV - Nuôi cấy các tế bào trên/ trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau. 1.4. Kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn Để thu được các khuẩn lạc mọc riêng rẽ cần tiến hành các bước sau: -Bước 1: Pha loãng mẫu nhiều lần rồi chọn độ pha loãng thích hợp. -Bước 2: Cấy trên/trong môi trường dinh dưỡng.
KỸ THUẬT PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VI SINH VẬT Nuôi cấy phân lập vi sinh vật Quá trình hư hỏng sữa đậu nành nhiều loại VSV từ nhiều nguồn (không khí, gỗ, nước, nguyên liệu… ) theo nhiều đường khác nhiễm vào Để định danh xác loại VSV đó, cần phân lập loại VSV có mẫu Từ xác định nguồn nhiễm truy tìm nguyên nhân gây nhiễm 1.1 Định nghĩa Phân lập VSV trình tách riêng loài VSV từ quần thể ban đầu đưa dạng khiết tạo từ tế bào ban đầu 1.2 Mục đích Tạo khuẩn lạc riêng rẽ có hình dạng đặc trưng từ quần thể VSV ban đầu 1.3 Nguyên tắc - Tách rời tế bào VSV - Nuôi cấy tế bào trên/ môi trường dinh dưỡng đặc trưng khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt 1.4 Kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn Để thu khuẩn lạc mọc riêng rẽ cần tiến hành bước sau: - Bước 1: Pha loãng mẫu nhiều lần chọn độ pha loãng thích hợp - Bước 2: Cấy trên/trong môi trường dinh dưỡng 1.4.1 Pha loãng Tùy thuộc vào mật độ vi sinh vật mẫu phân tích mà tiến hành pha loãng thập phân liên tiếp chọn độ pha loãng thích hợp để nuôi cấy cho khuẩn lạc mọc riêng rẽ, dễ quan sát, nhận diện Cách pha loãng: tiến hành hình vẽ sau: Mẫu sản phẩm cần phân tích Mỗi ống nghiệm chứa 9ml môi trường pha loãng thích hợp 1.4.2 Kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn Chọn độ pha loãng thích hợp hút 0.1 ml mẫu, cấy theo phương pháp sau tùy loại VSV: a Đối với VSV hiếu khí kị khí tùy tiện a.1 Cấy ria - Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống - Ria đường đĩa petri chứa môi trường thích hợp hình vẽ Sau đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy làm nguội trước thực đường ria Hình ảnh: Các phương pháp ria theo vết cấy cạn dần - Lật ngược đĩa, bao gói đem ủ nhiệt độ thời gian thích hợp tủ ấm a.2 Cấy tràn - Dùng pipet vô trùng hút 0.1ml mẫu độ pha loãng thích hợp lên bề mặt môi trường đĩa petri - Dùng que gạt thủy tinh vô trùng nhúng vào cồn 70 o, hơ qua lửa để nguội không gian vô trùng lửa đèn cồn - Mở đĩa, dùng đầu que gạt, trang mẫu trải bề mặt thạch - Đậy đĩa, đĩa khô lật ngược đĩa, bao gói đem ủ nhiệt độ thời gian thích hợp tủ ấm a.3 Cấy trộn - Dùng pipet vô trùng hút 1ml mẫu độ pha loãng thích hợp vào đĩa petri vô trùng - Đổ 12 -15ml môi trường vô trùng làm nguội đến nhiệt độ 45 – 50 oC vào đĩa cấy mẫu - Xoay nhẹ đĩa petri theo chiều ngược chiều kim đồng hồ nhiều lần để mẫu phân tán vào môi trường - Đậy nắp, để thạch đông lật ngược đĩa, bao gói, ủ nhiệt độ thời gian thích hợp tủ ấm b Đối với VSV kị khí Dùng phương pháp thạch lớp trình bày chương 3, mục xác định vi khuẩn kị khí khử sunfit Chú ý: Nhiệt độ thời gian thích hợp tùy vào loại VSV có trong mẫu Làm đồng thời nhiều mẫu ủ chế độ nhiệt khác để khảo sát tính chịu nhiệt VSV 1.5 Định danh chủng nhiễm Sau nuôi cấy, thu đĩa có khuẩn lạc mọc riêng rẽ với hình dạng đặc trưng tiến hành bước để định danh VSV theo lưu đồ sau: Khuẩn lạc đơn Quan sát, miêu tả khuẩn lạc Quan sát hình thái tế bào Nhuộm Gram Thực test sinh hóa Định danh 1.5.1 Miêu tả khuẩn lạc VSV phát triển môi trường đặc trưng hình thành khuẩn lạc đặc trưng cho loài Vì vậy, việc miêu tả khuẩn lạc việc quan trọng cần thiết việc định danh VSV Khi miêu tả khuẩn lạc cần ghi nhận đặc điểm sau: - Hình dạng khuẩn lạc: tròn, dạng rễ cây, dạng mép viền cưa, dạng sợi, dạng đồng tâm… Đặc tính quang học: trong, bán trong, không trong, lóng lánh, đục, huỳnh quang - Màu sắc: ghi màu khuẩn lạc có tiết sắc tố vào môi trường hay không Bề mặt: bóng, xù xì, gấp nếp, gồ ghề, bề mặt ướt hay khô… Mặt cắt ngang: phẳng, lồi, lõm giữa, ăn sâu vào thạch… Mép khuẩn lạc: phẳng, lượn sóng, có thùy dạng rễ… Độ đặc: dạng mỡ, dạng bột nhão, dạng nhớt, dạng màng Hình ảnh: hình dạng, mép mặt cắt ngang khuẩn lạc Quan sát hình thái tế bào a Dụng cụ, thiết bị, hóa chất Kính hiển vi quang học Lam kính kính Xanh metylen 0.001% loại thuốc nhuộm khác Que cấy, cồn, đèn cồn, nước cất dụng cụ hỗ trợ khác b Tiến hành 1.5.2 - Thường sử dụng tiêu giọt ép để quan sát hình thái tế bào thao tác nhanh, đơn giản, quan sát trạng thái tế bào như: chuyển động tiên mao, sinh sản, hình thành bào tử… Có cách làm tiêu giọt ép: - Làm tiêu giọt ép có nhuộm màu • Nhỏ giọt thuốc nhuộm xanh metylen 0.001% lên lam kính • Hơ que cấy lửa đèn cồn đầu que cấy nóng đỏ để nguội không gian vô trùng lửa đèn cồn • Mở nắp đĩa petri, dùng que cấy lấy chút sinh khối VSV bề mặt thạch hòa vào giọt xanh metylen lam kính • Khử trùng lại que cấy lửa đèn cồn cất vào giá Đặt kính lên vết bôi lam kính thật nhẹ nhàng để tránh tạo bọt khí Đưa tiêu lên quan sát kính hiển vi vật kính (x10), (x40) vật kính dầu (x100) Đối với vật kính dầu, trước đưa lên kính hiển vi để quan sát, phải nhỏ giọt dầu lên kính Làm tiêu giọt ép không nhuộm màu: tiến hành bước tương tự làm tiêu có nhuộm màu, thay dùng thuốc nhuộm xanh metylen, dùng giọt nước cất • • - Dựa vào khả bắt màu VSV với thuốc nhuộm mà thường sử dụng cách làm tiêu có nhuộm màu để quan sát tế bào rõ ràng Để đảm bảo tế bào VSV sống hoạt động sau nhuộm màu, yêu cầu phải sử dụng thuốc nhuộm không độc VSV pha loãng nồng độ thích hợp c Một số hình thái tế bào thường gặp c.1 Cầu khuẩn Cầu khuẩn(coccus) vi khuẩn mà tế bào có dạng hình cầu, phổ biến tự nhiên Tùy theo kiểu phân chia tế bào mà chúng chia thành số nhóm sau: - Đơn cầu khuẩn (Monococcus), kích thước nhỏ, có nhiều đất, nước không khí - Song cầu khuẩn (Diplococcus), chủ yếu vi khuẩn gây bệnh - Tứ cầu khuẩn (Tetracoccus), có tự nhiên - Bát cầu khuẩn (Sarcina) sống hoại sinh đất, số sống ký sinh thực vật gây hư hỏng rau - Liên cầu khuẩn (Streptococcus), có nhiều tự nhiên, đặt biệt rau quả, thực phẩm - Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), dạng chum nho, có nhiều tự nhiên c.2 Trực khuẩn Trực khuẩn vi khuẩn hình que, hai đầu tròn vuông, phình to đầu hai đầu Đa số trực khuẩn đứng riêng rẽ, có số loại liên kết với gọi Diplobacterium xếp thành chuỗi gọi Streptobacterium hay Streptobacillus Căn vào khả tạo bào tử trực khuẩn, chia trực khuẩn thành nhóm: - Trực khuẩn có bào tử số giống Clostridium Bacillus Khi quan sát bào tử loại VSV cần quan sát vị trí bào tử tâm hay lệch tâm, làm tế bào phình to hay không… Dựa vào đặc điểm khác mà phân biệt loại VSV - Trực khuẩn bào tử: E.Coli, Lactobacillus… c.3 Xoắn khuẩn Xoắn khuẩn vi khuẩn mà tế bào có dạng hình lò xo hay nửa vòng xoắn, có khả di động tiên mao cách uốn vặn vòng xoắn Chúng chia thành loại: - Phẩy khuẩn (Vibrio) loại tế bào có nửa vòng xoắn Spirillium loại có vài vòng xoắn 1.5.3 Nhuộm Gram 1.5.3.1 Mục đích Giúp trình định danh vi khuẩn dễ dàng 1.5.3.2 Nguyên tắc Do khác cấu trúc tế bào, nên dựa khả bắt màu tế bào chất màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh iot mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau: - - Loại giữ nguyên màu thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi xử lý cồn Đó vi khuẩn Gram dương Loại không giữ màu thuốc nhuộm nên màu xử lý cồn bắt màu thuốc nhuộm bổ sung Đó vi khuẩn Gram âm 1.5.3.3 Tiến hành Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ thạch (sau cấy 24 giờ) hoà vào giọt nước cất phiến kính, làm khô không khí Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi lửa đèn cồn 2-3 lần Nhuộm dung dịch Tím kết tinh phút, rửa nước, thấm khô Nhuộm lại dung dịch Iod phút, rửa nước, thấm khô - Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến vừa thấy màu), rửa nước, thấm khô Nhuộm bổ sung dung dịch Safranin 2-3 phút, rửa nước, để khô không khí Soi kính: dùng vật kính dầu 100 Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ 1.5.4 Test sinh hóa Mỗi loài VSV có cấu tạo tính chất sinh hóa khác Dựa vào phản ứng sinh hóa định danh loại VSV Dưới test sinh hóa quan trọng thường sử dụng kiểm nghiệm VSV 1.5.4.1 Test oxidase a Nguyên tắc Phát khả sinh enzyme cytochrom oxidase Vi khuẩn Hệ thống cytochrom có vi khuẩn hiếu khí, hiếu kỵ khí tùy tiện Hệ thống hoạt động chất liên kết trình hô hấp, vận chuyển H+ → O2 tạo thành nước - Phản ứng sử dụng thuốc thử tetramethyl p – phenylenediamine dihydrochloride b Phương pháp tiến hành - Dùng que cấy đũa thủy tinh lấy khuẩn lạc miết giấy tẩm sẵn thuốc thử nhỏ giọt nước muối sinh lý - Quan sát kết 10 giây đầu Phản ứng dương tính cho kết màu xanh tím - 1.5.4.2 Test catalase a Nguyên tắc - - Phát enzym catalase gây xúc tác phản ứng thủy phân : H2O2 → O2 + H2O Enzym có mặt vi sinh vật hiếu khí, kỵ khí tùy tiện Sự thủy phân hydrogen peroxide giải phóng O ghi nhận qua tượng sủi bọt khí (dương tính +) b Phương pháp tiến hành Dùng đũa thủy tinh que cấy lấy vi khuẩn chọn khuẩn lạc nghi ngờ lên mặt lam kính Nhỏ H2O2 3% Quan sát sau - 2s: có bọt khí xuất > phản ứng (+) bọt khí xuất > phản ứng (-) 1.5.4.3 Test coagulase a Nguyên tắc Một số VSV, đặc biệt loài thuộc giống Staphylococcus có khả tiết môi trường enzyme coagulase có tác dụng làm đông tụ huyết tương b Phương pháp tiến hành Có cách: - - Thử nghiệm lam kính: nhỏ lên lam kính giọt nước cất nước muối sinh lý Dùng que cấy lấy khuẩn lạc dịch nuôi cấy hòa vào giọt nước lam kính Thêm vào huyết tương người pha hòa Phản ứng (+) vòng 20 giây xuất đông tụ Phản ứng (-) không xuất đông tụ sau phút kết cần khẳng định tiếp thử nghiệm ống nghiệm Thử ống nghiệm: cho vào ống nghiệm 0.5ml huyết tương người thỏ không pha loãng, dùng que cấy lấy khuẩn lạc cho vào ống nghiệm trộn VSV Ủ ống thử nghiệm 37oC Trong xuất đông tụ, thử nghiệm (+) Sau 24 không xuất đông tụ, thử nghiệm (-) 1.5.4.4 Test khả sinh indol a Nguyên tắc Vi khuẩn có enzyme tryptophanase có khả thủy phân acid amin tryptophan sinh indol, acid pyruvic NH3 + Indol sinh kết hợp với nhóm (CHO) p– dimetthylaminobenzaldehyd có thuốc thử Kovac hình thành nên phức hợp màu đỏ b Phương pháp tiến hành - Vi khuẩn cấy vào môi trường canh thang tryptophan, để 35° - 37°C 18 - – 24h Nhỏ – giọt thuốc thử Kovac vào ống nghiệm Quan sát kết Phản ứng (+) xuất vòng màu đỏ phía dung dịch nuôi cấy ống nghiệm chưa cấy VK ống nghiệm cho phản ứng (+) ống nghiệm cho phản ứng (-) 1.5.4.5 1.5.4.6 1.5.4.7 [...]... xuất hiện đông tụ, thử nghiệm là (-) 1.5.4.4 Test khả năng sinh indol a Nguyên tắc Vi khuẩn có enzyme tryptophanase có khả năng thủy phân acid amin tryptophan sinh indol, acid pyruvic và NH3 + Indol sinh ra sẽ kết hợp với nhóm (CHO) của p– dimetthylaminobenzaldehyd có trong thuốc thử Kovac hình thành nên phức hợp màu đỏ b Phương pháp tiến hành - Vi khuẩn được cấy vào trong môi trường canh thang tryptophan,