HOÀN THIỆN QUY TRÌNH kỹ THUẬT REALTIME PCR từ các BỆNH PHẨM SINH học để ĐỊNH DANH VI SINH vật hệ TIẾT NIỆU SINH dục

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUỲNH HOÀN THIỆN QUY TRÌNH KỸ THUẬT REALTIME PCR TỪ CÁC BỆNH PHẨM SINH HỌC ĐỂ ĐỊNH DANH VI SINH VẬT HỆ TIẾT NIỆU - SINH DỤC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA KHÓA 2013 – 2019 HÀ NỘI – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUỲNH HOÀN THIỆN QUY TRÌNH KỸ THUẬT REALTIME PCR TỪ CÁC BỆNH PHẨM SINH HỌC ĐỂ ĐỊNH DANH VI SINH VẬT HỆ TIẾT NIỆU - SINH DỤC Ngành đào tạo : Bác sĩ đa khoa Mã ngành : 52720101 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA KHÓA 2013 – 2019 Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ TRANG HÀ NỘI – 2019 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN .3 1.1 Khái niệm bệnh lây truyền qua đường tình dục 1.2 Dịch tễ học bệnh STD giới Việt Nam 1.3 Các phương pháp phát vi khuẩn hệ tiết niệu – sinh dục 1.3.1 Quan sát trực tiếp 1.3.2 Nuôi cấy 1.3.3 Giải trình tự gen 1.3.4 Phản ứng chuỗi polymerase 10 1.3.5 Realtime PCR 12 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 16 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ .16 2.2 Địa điểm nghiên cứu 16 2.3 Thời gian nghiên cứu 16 2.4 Phương pháp nghiên cứu 16 2.4.1 Thiết kế nghiên cứu .16 2.4.2 Cỡ mẫu cách chọn mẫu 17 2.4.3 Thu thập mẫu nghiên cứu 17 2.4.4 Quy trình nghiên cứu 18 2.5 Quy trình kỹ thuật định tính DNA 12 khuẩn đường tiết niệu – sinh dục 18 2.5.1 Hóa chất dụng cụ 18 2.5.2 Quy trình định tính DNA 12 khuẩn gây bệnh đường tiết niệu – sinh dục .19 2.6 Phân tích kết 23 2.7 Xử lý số liệu .24 2.8 Đạo đức nghiên cứu 24 Chương 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ 25 3.1 Kết hồn thiện quy trình tách DNA từ mẫu bệnh phẩm 25 3.1.1 Kết tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm 25 3.1.2 Hình ảnh kết Realtime PCR sau tách DNA 27 3.2 Đánh giá kết kỹ thuật Realtime PCR từ mẫu bệnh phẩm sinh học bệnh nhân nam giới nhiễm khuẩn tiết niệu – sinh dục 27 3.2.1 Kết Realtime PCR từ mẫu bệnh phẩm 27 3.2.2 Tỷ lệ nhiễm khuẩn tiết niệu – sinh dục nhóm nghiên cứu .27 Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN .28 4.1 Hoàn thiện kỹ thuật tách DNA từ mẫu bệnh phẩm 28 4.2 Đánh giá kết kỹ thuật Realtime PCR từ mẫu bệnh phẩm sinh học bệnh nhân nam giới nhiễm khuẩn tiết niệu – sinh dục 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách 12 khuẩn đường tiết niệu – sinh dục định danh 19 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Soi tươi bệnh phẩm dịch âm đạo nhận định nấm Trichomonas vaginalis Hình 1.2 Trichomonas vaginalis Hình 1.3: Quy trình giải trình tự gen theo phương pháp ddNTP 10 Hình 1.4 Các bước phản ứng PCR 11 Hình 1.5 Biều đồ khuếch đại Realtime PCR 13 Hình 1.6 Biểu đồ chuẩn Realtime PCR 14 Hình 2.1 Sơ đồ bước tiến hành nghiên cứu 18 Hình 2.2: Máy đo quang phổ Nanodrop 2000 .21 Hình 2.3 Hình minh họa đo OD DNA máy Nanodrop 2000 22 Hình 2.4 Kết Realtime PCR mẫu dương tính .24 Hình 2.5 Kết Realtime PCR mẫu âm tính .24 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh lây truyền qua đường tình dục (STD) nhóm bệnh truyền nhiễm phổ biến hầu hết quốc gia, đặc biệt nhóm tuổi 15-50, ảnh hưởng trầm trọng đến sức khỏe người, đặc biệt sức khỏe sinh sản Mặc dù có tiến quan trọng mặt chẩn đốn, điều trị phòng ngừa (ví dụ tiêm chủng), chúng bệnh truyền nhiễm nguy hiểm phổ biến [1] Tỷ lệ mắc STD toàn giới vi khuẩn virus ước tính 125 triệu trường hợp năm [2] Theo thống kê Tổ chức Y tế giới (WHO), hàng năm có 1/10 người độ tuổi hoạt động tình dục mắc bệnh nhóm STD Tại nước phát triển thuộc châu Phi, châu Á, STD năm bệnh thường gặp [3] Nhiễm trùng tiết niệu sinh dục số lý phổ biến khiến cho người phụ nữ định đến thăm khám bác sĩ phụ khoa chuyên gia tiết niệu [4] Ở Việt Nam, theo ước tính năm có gần triệu trường hợp mắc bệnh STD, bệnh STD phổ biến chlamydia, lậu, giang mai, trichomonas, HPV, HSV [5], [6] Thuật ngữ bệnh lây truyền qua đường tình dục (STD) đề cập đến loạt hội chứng lâm sàng mầm bệnh truyền từ người bị nhiễm sang người không nhiễm qua quan hệ tình dục đường âm đạo, hậu mơn qua đường miệng [7] Nhóm bệnh chủ yếu vi khuẩn, virus, vi nấm, ký sinh trùng gây ra, có triệu chứng lâm sàng đa dạng phương pháp điều trị khác [5] Tuy nhiên, có đến 90% bệnh lây truyền qua đường tình dục khơng có triệu chứng dẫn đến chẩn đoán điều trị chậm trễ [8] Nếu không điều trị kịp thời kỹ lưỡng, chúng gây biến chứng đe dọa đến tính mạng ung thư, vơ sinh, thai tử cung, phá thai tự phát, chết thai, trọng lượng sơ sinh thấp, tổn thương thần kinh chí tử vong [9] Khơng ảnh hưởng đến sức khỏe, tính mạng người nhiễm bệnh, STD gây nên hậu nghiêm trọng mặt kinh tế xã hội [10] Tại Hoa Kỳ, Trung tâm Kiểm sốt Phòng ngừa Dịch bệnh (CDC) ước tính chi phí cho hệ thống chăm sóc sức khỏe Mỹ để điều trị tám bệnh STD phổ biến khoảng 16 tỷ đô la Mỹ năm [11] Từ thực tế đặt vấn đề chẩn đoán sớm điều trị sớm bệnh STD Đã có nhiều phương pháp xét nghiệm để chẩn đoán tác nhân vi sinh vật ký sinh trùng gây STD nhuộm soi, nuôi cấy vi sinh, miễn dịch hầu hết phương pháp độ nhạy độ đặc hiệu thấp Trong năm gần đây, phát triển mạnh mẽ ngành sinh học phân tử cho đời nhiều phương pháp giúp cho việc chẩn đoán, phát nhanh chóng xác tác nhân gây nhiễm bệnh STD, kể đến kỹ thuật tách chiết điện di DNA, kỹ thuật PCR, kỹ thuật xác định trình tự nucleotid phân tử DNA, kỹ thuật lai acid nucleic kỹ thuật Realtime PCR kỹ thuật phổ biến trở thành công cụ chẩn đoán nhạy cảm mà chưa có thử nghiệm sánh kịp [12], [13] Realtime PCR tuân thủ thường quy chung PCR cho đường cong khuếch đại tương tự đường cong phát triển vi khuẩn gồm ba giai đoạn (kéo dài đến dấu hiệu sản phẩm PCR lớn dấu hiệu hệ thống, tăng gia tốc kéo dài tạo hình phẳng), đó, q trình PCR hồn thiện rõ khơng phải sản phẩm cuối phản ứng sau số chu kỳ định [14] Vì vậy, với mục đích sàng lọc, phát điều trị sớm bệnh STD, tơi tiến hành đề tài nghiên cứu “Hồn thiện quy trình kỹ thuật Realtime PCR từ bệnh phẩm sinh học để định danh vi sinh vật hệ tiết niệu - sinh dục” với hai mục tiêu: Hoàn thiện kỹ thuật tách DNA từ mẫu bệnh phẩm (nước tiểu, tinh dịch, dịch niệu đạo, dịch âm đạo, dịch màng tinh hoàn ) Đánh giá kết kỹ thuật Realtime PCR từ mẫu bệnh phẩm sinh học bệnh nhân nam giới nhiễm khuẩn tiết niệu – sinh dục Chương TỔNG QUAN 1.1 Khái niệm bệnh lây truyền qua đường tình dục (STD) Bệnh lây lan qua đường tình dục (STD) nhóm bệnh lây truyền nam nữ giới, đường tiếp xúc tình dục đồng gi ới hay khác giới, bao gồm giao hợp qua âm đạo, qua miệng hay qua hậu môn Khả lây truyền loại bệnh cao bất c ứ mắc bệnh có đời sống tình dục khơng lành mạnh [5], [15] Có thể chia bệnh STD thành nhóm lớn theo nguyên gây bệnh: vi khuẩn (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma), vi nấm (nấm Candida), ký sinh trùng (Toxoplasma, Trichomonas vaginalis) Cho đến phát 40 tác nhân vi sinh vật gây bệnh STD, tác nhân gây bệnh có bệnh cảnh lâm sàng đặc trưng riêng [16] 1.2 Dịch tễ học bệnh STD giới Việt Nam STD bệnh phổ biến giới, có tác động sâu sắc đến vấn đề sức khỏe sinh dục sinh sản Theo WHO, triệu ca STD ghi nhận ngày Mỗi năm, có khoảng 357 triệu ca nhi ễm m ới ch ỉ tính riêng bệnh STD phổ biến: chlamydia (131 triệu), bệnh lậu (78 triệu), giang mai (5,6 triệu) trichomonas (143 triệu) [3] Tại Việt Nam, STD bệnh hay g ặp độ tu ổi hoạt động tình dục Theo báo cáo Viện Da liễu Quốc gia, h ằng năm nước ta ghi nhận khoảng 200.000 trường hợp m ắc STD Tuy nhiên theo ước tính chuyên gia số vào lên đ ến 800 nghìn đến triệu người, có khoảng 500.000 trường hợp nhiễm chlamydia đường sinh dục, 150.000 trường hợp nhiễm lậu [5] Mặc dù tỷ lệ nhiễm bệnh cao gây nhiều biến chứng nguy hi ểm, mức độ quan tâm cộng đồng tới vấn đề ch ưa th ật s ự tương xứng Một số nghiên cứu cho thấy kiến th ức người dân bệnh STD, hậu bệnh phương pháp điều tr ị bệnh thấp Tỷ lệ người biết bệnh chiếm 60%, hiểu biết đối tượng hậu cách điều trị phòng bệnh STD mức 50% [17] Điều tra Quốc gia Vị thành niên niên Việt Nam (2004) cho kết quả: có 0,3% thi ếu niên nói mắc bệnh STD Phần lớn thiếu niên điều tr ị t ại sở y tế công, số nhỏ tới điều trị phòng khám t ư, s ố t ự mua thuốc điều trị vài người nói khơng điều trị [18] 1.3 Các phương pháp phát vi khuẩn hệ tiết niệu – sinh dục 1.3.1 Quan sát trực tiếp (soi tươi, nhuộm soi) - Soi tươi Xét nghiệm soi trực tiếp (direct examination) tìm vi sinh vật gây bệnh phương pháp đơn giản triển khai rộng rãi từ tuyến huyện trở lên Đây phương pháp đòi hỏi trang thiết bị đơn giản, rẻ tiền, thao tác nhanh, thường dùng để quan sát trạng thái sống vi khuẩn Soi tươi bệnh phẩm dịch âm đạo, niệu đạo phát nấm men, trùng roi Trichomonas vaginalis, Gradnerella vaginallis nhận định mật độ tế bào âm đạo bạch cầu [19] 18 - Khám lấy bệnh phẩm: Bệnh nhân khám để phát tình trạng bệnh lý đường sinh dục lâm sàng: tình trạng viêm, tổn thương phát khối u Bệnh phẩm thu được chuyển Bộ môn Y sinh học – Di truyền, Đại học Y Hà Nội, bảo quản 4oC để phục vụ cho xét nghiệm Mẫu nghiên cứu sau thu thập tiến hành phân tích Bộ mơn Y sinh học - Di truyền Trường Đại học Y Hà Nội 19 2.4.4 Quy trình nghiên cứu Thu thập thông tin bệnh nhân (họ tên, tuổi) Thu thập, bảo quản (2-8°C) phân loại mẫu Tách chiết DNA Kiểm tra độ tinh đo nồng độ DNA Realtime PCR định danh vi sinh vật hệ tiết niệu – sinh dục Phân tích đánh giá kết Hình 2.1 Sơ đồ bước tiến hành nghiên cứu 2.5 Quy trình kỹ thuật định tính DNA 12 khuẩn đường tiết niệu – sinh dục 2.5.1 Hóa chất dụng cụ  Hóa chất: - Hóa chất tách chiết DNA: Kit tách DNA- express đạt chuẩn IVD CE Châu Âu công ty Lytech (Nga) 20 - Hóa chất cho Realtime PCR: Bộ kit Realtime PCR xác định 12 chủng khuẩn công ty Lytech (Nga) định tính DNA 12 khuẩn đường tiết niệu – sinh dục (gồm 12 kit riêng lẻ)  Trang thiết bị: Máy realtime PCR, máy ly tâm, máy vortex, máy ủ nhiệt khô, tủ thao tác vô trùng, tủ lạnh, pipet, đầu tip, găng tay cao su 2.5.2 Quy trình định tính DNA 12 khuẩn gây bệnh đường tiết niệu – sinh dục Bảng 2.1 Danh sách 12 khuẩn đường tiết niệu – sinh dục định danh Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Gardnerella vaginalis Treponema pallidum Vi khuẩn Mycoplasma hominis Mycoplasma genitalium Ureaplasma urealyticum Ureaplasma pavum Ureaplasma spp Ký sinh trùng Vi nấm Toxoplasma gondii Trichomonas vaginalis Candida albicans  Bước 1: Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm  Nước tiểu Lấy 10 – 15 ml nước tiểu cho vào ống falcon 15 ml đem ly tâm 15-20 phút/ 3000 vòng/ phút nhiệt độ thường Cẩn thận loại bỏ dịch (không đụng vào lớp cặn) Hút 500 UL dịch cặn vào eppendorf 1.5 ml, đóng chặt nắp ly tâm 12000 vòng/ phút 15 giây 21 Hút bỏ cận thận lớp dịch Hút hóa chất tách cho sang ống chứa lớp cặn (khơng vứt ống eppendorf đựng hóa chất), dùng pipet mix Chuyển toàn dung dịch sang ống đựng hóa chất thực thao tác (từ bước b – f bên dưới)  Với mẫu tinh dịch, dịch màng tinh hoàn, dịch niệu đạo, dịch âm đạo a Que bệnh phẩm cho vào eppendorf chứa sẵn dung dịch tách, trộn đều, sau vứt bỏ que, đóng chặt nắp, dùng băng quấn chặt nắp Lắc tay 10 lần b Ly tâm nhẹ 10 giây với tần số 500 vòng/ phút c Ủ 98 oC 20 phút d Ly tâm 12000 vòng/ phút 15 giây nhiệt độ 18-25 oC e Hút dịch chứa DNA sang eppendorf vô trùng f Bảo quản 2-8 oC tuần, -20 oC tháng  Đo mật độ quang học kiểm tra chất lượng DNA Mục đích: định lượng kiểm tra độ tinh DNA Nguyên lý: - Dựa vào hấp thụ cực đại chất bước sóng định Acid nucleic hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại bước sóng 260nm Vì vậy, giá trị mật độ quang học bước sóng 260nm cho phép xác định nồng độ DNA Đồng thời bước sóng 280nm protein hấp thụ cực đại, dựa vào để kiểm tra độ tinh DNA DNA gọi tinh tỷ số OD 260nm/280nm= 1,8 – [28] - Tiến hành: Sử dụng máy quang phổ Nanodrop 2000 để đo nồng độ tính tốn độ tinh DNA tách (hình 2.2) 22 Hình 2.2: Máy đo quang phổ Nanodrop 2000 + Chọn bước sóng 260nm, bước sóng hấp thụ cực đại acid nucleic + Nhỏ 2µl dung dịch TE nước cất lên đầu đo cảm ứng (chứng blank) + Lau khô bề mặt đầu đo cảm ứng giấy thấm + Lấy 2µl dung dịch DNA/ mẫu để đo + Kết quả: kết đo kết nối với hệ thống máy vi tính thể đồ thị độ hấp thụ thông số bước sóng 260nm, 280nm Các mẫu đo bước sóng 260 nm 280nm, mẫu DNA đo hai lần lấy giá trị trung bình để xác định nồng độ DNA mẫu 23 Hình 2.3 Hình minh họa đo OD DNA máy Nanodrop 2000  Bước 2: Sử dụng kỹ thuật Realtime PCR xác định có mặt tác nhân gây bệnh - Đánh dấu tube eppendorf vơ trùng kí hiệu mẫu - Cho 10 µl chứng (+) dịch DNA tách chiết 10 µl chứng (-) vào tube PCR Mix, ly tâm chuyển tube vào máy Realtime PCR - Bật máy Realtime PCR trước chạy 15 phút, bật máy tính cài đặt chương trình: + Gọi chương trình Realtime PCR; đặt tên chứng dương, chứng âm, tên mẫu số tương ứng với ký hiệu mẫu + Chọn màu "FAM", "HEX" cho mẫu, chứng dương chứng âm + Màu "FAM": phát trình tự mục tiêu DNA đặc hiệu, màu "HEX" phát trình tự chứng nội 24 + Cài đặt chu trình luân nhiệt (protocol) cho máy Realtime PCR hoạt động: chu kỳ: 95oC - 1,5 phút, 40 chu kỳ: 95oC - 15 giây, 60oC – 30 giây (chọn đọc kết bước này) + Lưu file liệu vào máy tính - Cho máy Realtime PCR chạy chương trình đọc kết 2.6 Phân tích kết Chọn chế độ huỳnh quang tương ứng với trình tự phát DNA 12 khuẩn gây bệnh đường sinh dục - tiết niệu HPV (màu FAM) đến tín hiệu huỳnh quang tương ứng trình tự chứng nội (màu HEX) Thí nghiệm đạt u cầu nếu: chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyến tính vượt tín hiệu (đường biểu diễn dương tính) đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính (< 40 chu kỳ), chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính ( 40 chu kỳ, kết luận “Mẫu âm tính” - Mẫu có đường biểu diễn dương tính khơng rõ ràng kết luận “Mẫu nghi ngờ” đề nghị lấy mẫu lại để thực xét nghiệm tiến hành theo dõi thực lại xét nghiệm sau 1- tháng 25 Hình 2.4 Kết Realtime PCR Hình 2.5 Kết Realtime PCR mẫu dương tính mẫu âm tính 2.7 Xử lý số liệu Số liệu sau thu thập nhập vào máy phân tích phần mềm Microsoft Excel 2007 2.8 Đạo đức nghiên cứu - Tất thông tin liên quan đến bệnh nhân giữ bí mật - Các kết dùng nghiên cứu khoa học, khơng dùng với mục đích khác - Đề tài Bộ môn Y sinh học - Di truyền thông qua đề cương đồng ý thực 26 Chương DỰ KIẾN KẾT QUẢ 3.1 Kết hồn thiện quy trình tách DNA từ mẫu bệnh phẩm 3.1.1 Kết tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm Sau tách chiết, mẫu DNA kiểm tra nồng độ độ tinh phương pháp đo OD máy Nanodrop 2000 (Bảng 3.1, 3.2, 3.3) - Từ mẫu nước tiểu STT Mẫu bệnh phẩm Nồng độ DNA Độ tinh (ng/µl) A260/280 01 02 10 Nồng độ DNA trung bình (ng/ µl) Nhận xét Độ tinh trung bình A260/A280 27 - Từ mẫu dịch âm đạo, dịch niệu đạo STT Mẫu bệnh phẩm Nồng độ DNA Độ tinh (ng/µl) A260/280 01 02 20 Nồng độ DNA trung bình (ng/ µl) Độ tinh trung bình A260/A280 Nhận xét - Từ mẫu tinh dịch, dịch màng tinh hoàn STT Mẫu bệnh phẩm Nồng độ DNA Độ tinh (ng/µl) A260/280 01 02 20 Nồng độ DNA trung bình (ng/ µl) Nhận xét: 3.1.2 Hình ảnh kết Realtime PCR sau tách DNA - Từ mẫu dịch nước tiểu Độ tinh trung bình A260/A280 28 - Từ mẫu dịch âm đạo, dịch niệu đạo - Từ mẫu tinh dịch, dịch màng tinh hoàn 3.2 Đánh giá kết kỹ thuật Realtime PCR từ mẫu b ệnh phẩm sinh học bệnh nhân nam giới nhiễm khu ẩn ti ết niệu – sinh dục 3.2.1 Kết Realtime PCR từ mẫu bệnh phẩm Mẫu bệnh STT phẩm Kết 50 3.2.2 Tỷ lệ nhiễm khuẩn tiết niệu – sinh dục nhóm nghiên cứu 29 Chương DỰ KIẾN BÀN LUẬN 4.1 Hoàn thiện kỹ thuật tách DNA từ mẫu bệnh phẩm (nước tiểu, tinh dịch, dịch niệu đạo, dịch âm đạo, dịch màng tinh hoàn ) 4.2 Đánh giá kết kỹ thuật Realtime PCR từ m ẫu bệnh phẩm sinh học bệnh nhân nam giới nhiễm khu ẩn ti ết niệu – sinh dục TÀI LIỆU THAM KHẢO WHO (2014), Report on global sexually transmitted infection surveillance 2013 De Schryver A., Meheus A (1990) Epidemiology of sexually transmitted diseases: the global picture Bull World Health Organ, 68(5), 639-54 WHO, (2016), Sexually transmitted infections (STIs) Fact sheet N°110 Andreu A (2004) Lactobacillus as a probiotic for preventing urogenital infections Reviews in Medical Microbiology, 15(1), 1-6 Trần Hậu Khang (2015) Tổng quan nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục Tạp chí Nghiên cứu Y học, 22-24, 89 Nguyễn Duy Ánh (2010), Nghiên cứu số yếu tố nguy viêm nhiễm đường sinh dục phụ nữ Hà Nội từ 18-49 tuổi có chồng, Luận án Tiến sỹ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội Workowski K.A., Bolan G.A (2015) Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015 MMWR Recomm Rep, 64(RR-03), 1-137 Wagenlehner F.M., et al (2016) The Presentation, Diagnosis, and Treatment of Sexually Transmitted Infections Dtsch Arztebl Int, 113(102), 11-22 Eng T.R., Butler W.T (1997), The Hidden Epidemic: Confronting Sexually Transmitted Diseases, the National Academy of Sciences: Washington DC 10 Carmona-Gutierrez D., Kainz K., Madeo F (2016) Sexually transmitted infections: old foes on the rise Microb Cell 3(9), 361-362 11 Centers for Disease Control and Prevention (2014), CDC fact sheet: incidence, prevalence, and cost of sexually transmitted infections in the United States Atlanta, GA: US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention; 2013 12 Tạ Thành Văn (2010), PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất Y học, Hà Nội 13 Phạm Hùng Vân (2009), PCR Realtime PCR- Các vấn đề ứng dụng thường gặp, Nhà xuất Y học, Thành phố Hồ Chí Minh 14 Bộ Y Tế (2000), Xét nghiệm chẩn đoán virus, Nhà xuất Y học, Hà Nội 15 Trường Đại học Y Hà Nội (2004), Bài giảng Sản phụ khoa, Nhà xuất Y học, Hà Nội 16 Lê Thị Kim Trâm (2005) Xác định nguyên vi khuẩn ký sinh trùng gây viêm đường sinh dục phụ nữ đến khám Bệnh viện Phụ sản Trung Ương năm 2005, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 34-37, 48 17 Kim Bảo Giang, Hoàng Văn Minh (2011) Sự cải thiện kiến thức số bệnh lây truyền qua đường tình dục cơng nhân số nhà máy may cơng nghiệp tỉnh Bình Dương thành phố Hồ Chí Minh sau năm can thiệp truyền thơng Tạp chí y học thực hành, 4, 20-23 18 Nguyễn Đức Thanh, Đỗ Huy Bình (2013) Kiến thức học sinh trung học phổ thông bệnh lây truyền qua đường tình dục Tạp chí Y học Thực hành, 5, 95-98 19 Bộ Y Tế (2015), Kỹ thuật soi lam chẩn đoán bệnh lây truyền qua đường tình dục, Nhà xuất Y học, Hà Nội 20 Howard L., Elaine L., Jame O (1970) Diagnostic Procudures for Bacterial, Mycotic, and parasitic infections, 5th Bodily American Public Health Association 21 Maxam A.M and Gilbert W (1977) A new method for sequencing DNA Proc Natl Acad Sci USA, 74(2), 4-560 22 Sanger F., Coulson A.R (1975) A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase Journal of molecular biology, 94(3), 441-448 23 Smith L.M., et al (1986) Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis Nature, 321(6071), 674 24 Trịnh Văn Bảo (2008), Giáo trình di truyền, Nhà xuất Y học, Hà Nội 25 Chu Hoàng Mậu (2014), Cơ sở phương pháp sinh học phân tử, Nhà xuất Đại học Sư phạm, Hà Nội, 83 26 Caliendo A.M., Jordan J.A., Green A.M., et al (2005) Real-time PCR improves detection of Trichomonas vaginalis infection compared with culture using self-collected vaginal swabs Infect Dis Obstet Gynecol, 13(3), 50-145 27 Zhang M.J., et al (2013) Development and application of a real-time polymerase chain reaction method for Campylobacter jejuni detection World J Gastroenterol, 19(20), 5-3090 28 Weiss E.J., et al (1996) A polymorphism of a platelet glycoprotein receptor as an inherited risk factor for coronary thrombosis New England Journal of Medicine, 334(17), 1090-1094 ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUỲNH HOÀN THIỆN QUY TRÌNH KỸ THUẬT REALTIME PCR TỪ CÁC BỆNH PHẨM SINH HỌC ĐỂ ĐỊNH DANH VI SINH VẬT HỆ TIẾT NIỆU - SINH DỤC Ngành... .28 4.1 Hoàn thiện kỹ thuật tách DNA từ mẫu bệnh phẩm 28 4.2 Đánh giá kết kỹ thuật Realtime PCR từ mẫu bệnh phẩm sinh học bệnh nhân nam giới nhiễm khuẩn tiết niệu – sinh dục 28 TÀI LIỆU... kỳ định [14] Vì vậy, với mục đích sàng lọc, phát điều trị sớm bệnh STD, tơi tiến hành đề tài nghiên cứu “Hồn thiện quy trình kỹ thuật Realtime PCR từ bệnh phẩm sinh học để định danh vi sinh vật