HOÀN THIỆN QUY TRÌNH kỹ THUẬT REAL TIME PCR từ các BỆNH PHẨM SINH học để ĐỊNH DANH VI SINH vật hệ TIẾT NIỆU SINH dục

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUỲNH HOÀN THIỆN QUY TRÌNH KỸ THUẬT REAL - TIME PCR TỪ CÁC BỆNH PHẨM SINH HỌC ĐỂ ĐỊNH DANH VI SINH VẬT HỆ TIẾT NIỆU - SINH DỤC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA KHÓA 2013 - 2019 HÀ NỘI – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUỲNH HỒN THIỆN QUY TRÌNH KỸ THUẬT REAL - TIME PCR TỪ CÁC BỆNH PHẨM SINH HỌC ĐỂ ĐỊNH DANH VI SINH VẬT HỆ TIẾT NIỆU - SINH DỤC Ngành đào tạo : Bác sĩ đa khoa Mã ngành : 52720101 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA KHÓA 2013 - 2019 Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ TRANG HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Thị Trang, giảng viên Bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội, người hướng dẫn tận tình, quan tâm, động viên, giúp đỡ em trình nghiên cứu học tập để em hồn thành khố luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn thầy cô, anh chị kĩ thuật viên, anh chị nội trú Bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội giúp đỡ bảo cho em thời gian học tập nghiên cứu môn Em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, Thư viện trường Đại học Y Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện cho em hồn thành khố luận tốt nghiệp Lời cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình bạn bè bên cạnh ủng hộ, khích lệ chỗ dựa vững cho em khơng thời gian thực khóa luận mà cịn suốt q trình học tập làm việc Hà Nội, ngày 31 tháng 05 năm 2019 Nguyễn Thị Quỳnh LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan khóa luận “Hồn thiện quy trình kỹ thuật Real time PCR từ bệnh phẩm sinh học để định danh vi sinh vật hệ tiết niệu sinh dục” hướng dẫn TS Nguyễn Thị Trang hồn tồn tơi thực Các số liệu kết khóa luận trung thực chưa công bố trước Hà Nội, ngày 31 tháng 05 năm 2019 Nguyễn Thị Quỳnh DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A ATP C CDC CE Ct ddATP ddCTP ddGTP ddNTP ddTTP DNA G HIV HPV HSV IVD OD PCR PHEC PID RNA STD T WHO Adenine Adenosin triphosphate Cytosine The Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm Kiểm sốt Phịng ngừa Dịch bệnh) European Conformity Cycle threshold (Chu kỳ ngưỡng) Dideoxyadenosine triphosphate Dideoxycytidine triphosphate Dideoxyguanosine triphosphate Dideoxynucleotide triphosphate Dideoxythymidine triphosphate Deoxyribonucleic acid Guanine Human immunodeficiency virus Human papillomavirus Herpes simplex virus In Vitro Diagnostic Medical Devices Optical density (Mật độ quang) Polymerase chain reaction Punjab Higher Education Commission Pelvic Inflammatory Disease (Viêm vùng chậu) Ribonucleic acid Sexually Transmitted Diseases (Bệnh lây truyền qua đường tình dục) Thymine World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Khái niệm bệnh lây truyền qua đường tình dục 1.2 Dịch tễ học bệnh STD giới Việt Nam 1.3 Các phương pháp phát vi khuẩn hệ tiết niệu - sinh dục 1.3.1 Quan sát trực tiếp 1.3.2 Nuôi cấy 1.3.3 Giải trình tự gen 1.3.4 Phản ứng chuỗi polymerase 10 1.3.5 Real - time PCR 12 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 16 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ .16 2.2 Địa điểm nghiên cứu 16 2.3 Thời gian nghiên cứu 16 2.4 Phương pháp nghiên cứu 16 2.4.1 Thiết kế nghiên cứu .16 2.4.2 Cỡ mẫu cách chọn mẫu 16 2.4.3 Thu thập mẫu nghiên cứu 17 2.4.4 Quy trình nghiên cứu 18 2.5 Quy trình kỹ thuật định tính DNA 12 khuẩn đường tiết niệu - sinh dục18 2.5.1 Hóa chất dụng cụ 18 2.5.2 Quy trình định tính DNA 12 khuẩn gây bệnh đường tiết niệu - sinh dục 19 2.6 Phân tích kết 23 2.7 Xử lý số liệu .24 2.8 Đạo đức nghiên cứu 24 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1 Kết hồn thiện quy trình chiết tách DNA từ mẫu bệnh phẩm 25 3.2 Đánh giá kết kỹ thuật Real - time PCR từ mẫu bệnh phẩm sinh học bệnh nhân nam giới nhiễm khuẩn đường tiết niệu sinh dục .28 3.2.1 Thông tin chung đối tượng nghiên cứu 28 3.2.2 Tình trạng nhiễm khuẩn đường tiết niệu - sinh dục…………… 30 3.2.3 Tỷ lệ nguyên gây viêm đường tiết niệu - sinh dục 31 3.2.4 Tỷ lệ đơn nhiễm đồng nhiễm khuẩn đường tiết niệu - sinh dục.33 Chương 4: BÀN LUẬN 35 4.1 Về hoàn thiện kỹ thuật chiết tách DNA từ mẫu bệnh phẩm 35 4.2 Về đánh giá kết kỹ thuật Real - time PCR từ mẫu bệnh phẩm sinh học bệnh nhân nam giới nhiễm khuẩn tiết niệu sinh dục .38 4.2.1 Về đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 38 4.2.2 Về tỷ lệ nhiễm khuẩn đường tiết niệu - sinh dục 38 4.2.3 Về tỷ lệ nguyên gây bệnh đường tiết niệu - sinh dục .39 4.2.4 Về tỷ lệ đơn nhiễm đồng nhiễm khuẩn gây bệnh đường sinh dục - tiết niệu 41 KẾT LUẬN 42 KHUYẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách 12 khuẩn đường tiết niệu - sinh dục định danh 19 Bảng 3.1 Kết chiết tách DNA từ mẫu dịch âm đạo, dịch niệu đạo .25 Bảng 3.2 Kết chiết tách DNA từ mẫu nước tiểu .26 Bảng 3.3 Kết chiết tách DNA từ mẫu tinh dịch, dịch màng tinh hoàn .27 Bảng 3.4 Tỷ lệ đơn nhiễm đồng nhiễm khuẩn đường tiết niệu - sinh dục.33 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Soi tươi bệnh phẩm dịch âm đạo nhận định nấm Trichomonas vaginalis Hình 1.2 Trichomonas vaginalis Hình 1.3: Quy trình giải trình tự gen theo phương pháp ddNTP Hình 1.4 Các bước phản ứng PCR 11 Hình 1.5: Phương pháp Real - time PCR với tác nhân phát huỳnh quang SYBR Green I .12 Hình 1.6: Phương pháp Realtime - PCR với mẫu dò Taqman 13 Hình 1.7 Biều đồ khuếch đại Real - time PCR .15 Hình 1.8 Biểu đồ chuẩn Real - time PCR .16 Hình 2.1 Sơ đồ bước tiến hành nghiên cứu 18 Hình 2.2: Máy đo quang phổ Nanodrop 2000 .21 Hình 2.3 Hình minh họa đo OD DNA máy Nanodrop 2000 22 Hình 2.4 Kết Real - time PCR mẫu dương tính 24 Hình 2.5 Kết Real - time PCR mẫu âm tính 24 Hình 3.1 Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân theo lứa tuổi 29 Hình 3.2 Tỷ lệ nhiễm khuẩn đường tiết niệu - sinh dục từ mẫu bệnh phẩm sinh học (2018) 30 Hình 3.3 Tỷ lệ nguyên gây viêm đường tiết niệu - sinh dục từ mẫu bệnh phẩm sinh học (2018) 32 34 Nhận xét: Ở mẫu dịch niệu đạo, tỷ lệ đơn nhiễm cao tỷ lệ đồng nhiễm khuẩn đường tiết niệu - sinh dục (57,8% 42,2%) Trong nhóm đồng nhiễm, bệnh nhân nhiễm khuẩn chiếm tỷ lệ cao (23,6%), nhóm bệnh nhân nhiễm khuẩn xếp thứ (9,7%), bệnh nhân nhiễm nhiều khuẩn số lượng có 1,2% bệnh nhân nhiễm khuẩn Ở mẫu nước tiểu, tỷ lệ đồng nhiễm cao tỷ lệ đơn nhiễm khuẩn đường tiết niệu - sinh dục (58,3% so với 41,7%), tỷ lệ đồng nhiễm khuẩn chiếm tỷ lệ cao (35,4%), bệnh nhân đồng nhiễm tối đa khuẩn (6,2%) Ở mẫu tinh dịch, tỷ lệ đồng nhiễm (71,4%) lớn đáng kể so với tỷ lệ đơn nhiễm (28,6%) Bệnh nhân chủ yếu nhiễm khuẩn (42,9%), tối đa nhiễm khuẩn (28,5%) Ở mẫu dịch màng tinh hoàn, tỷ lệ đơn nhiễm đồng nhiễm khuẩn tương đương (đều chiếm 50%) Khơng có bệnh nhân đồng nhiễm từ khuẩn trở lên 35 Chương BÀN LUẬN 4.1 Về hoàn thiện kỹ thuật chiết tách DNA từ mẫu bệnh phẩm (dịch âm đạo, dịch niệu đạo, nước tiểu, tinh dịch, dịch màng tinh hoàn) Khâu khâu quan trọng kỹ thuật sinh học phân tử phải tách chiết DNA có chất lượng tốt làm vật liệu di truyền cho bước quy trình kỹ thuật chất lượng DNA ảnh hưởng trực tiếp tới kết kỹ thuật sinh học phân tử DNA sau tách chiết phải đảm bảo yêu cầu: đảm bảo độ tinh không đứt gãy, nồng độ đảm bảo thực bước cho kết tốt Trong kỹ thuật Real - time PCR mà thực hiện, nồng độ DNA phải đảm bảo để thực phản ứng PCR Trong khóa luận này, mẫu DNA tách chiết kit tách DNA - express đạt chuẩn IVD CE Châu Âu công ty Lytech (Nga) Ưu điểm phương pháp khơng chứa hóa chất độc hại phenol, chloroform; dễ dàng nhanh chóng phân lập DNA đồng thời từ nhiều mẫu, quy trình tách đơn giản tiết kiệm thời gian Bước tiếp theo, sản phẩm tách chiết DNA tiến hành kiểm tra nồng độ độ tinh phương pháp đo độ hấp thụ quang OD (Optical Density) máy Nanodrop 2000 bước sóng 260nm (A260)và 280nm (A280) Giá trị OD bước sóng 260nm mẫu DNA cho biết nồng độ DNA dung dịch Tỷ số A260/A280 cho biết độ tinh mẫu DNA tách chiết DNA gọi tinh tỷ số A 260/A280 khoảng 1,8 - 36 [29] Các thông số nồng độ độ tinh DNA tách chiết từ bảng 3.1, 3.2 3.3 cho thấy: - Tất mẫu DNA tách chiết đạt nồng độ cao, từ 379 716 ng/µl (mẫu dịch âm đạo dịch niệu đạo), 145 - 308 ng/µl (mẫu nước tiểu), 127 - 416 ng/µl (mẫu tinh dịch dịch màng tinh hoàn); đảm bảo đủ nồng độ cho phản ứng PCR thành công (yêu cầu kit Real - time PCR nồng độ DNA chiết tách phải 100 ng/ µl) - Tỷ số A260/A280 mẫu DNA tách chiết nằm khoảng từ 1,77 - 1,98 (mẫu dịch âm đạo dịch niệu đạo), 1,7 - 1,9 (mẫu nước tiểu), 1,7 - 1,95 (mẫu tinh dịch dịch màng tinh hoàn), chứng tỏ mẫu tách tương đối tinh sạch, không bị nhiễm protein hay RNA, đảm bảo cho phản ứng Real time PCR Tóm lại, lượng DNA thu từ mẫu bệnh phẩm tương đối cao ổn định Các mẫu DNA có đường biểu diễn độ hấp thụ quang tr ơn tru, không gãy khúc, gập góc, đỉnh hấp thụ quang tương ứng bước sóng 260 nm Như vậy, mẫu DNA tách chiết tương đối tinh n ồng độ đạt yêu cầu cho phản ứng PCR Do đó, kit Real - time PCR xác định 12 khuẩn đường tiết niệu - sinh dục công ty Lytech (Nga) khuyến cáo sử dụng cho dịch niệu đạo dịch âm đạo, chúng tơi nhận thấy hồn tồn có khả áp dụng tốt cho mẫu nước tiểu, tinh dịch dịch màng tinh hoàn Năm 2003, Justin Hardick cộng ứng dụng kỹ thuật Real time PCR để phát DNA Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae Trichomonas vaginalis 253 mẫu nước tiểu thu thập từ nam nữ trẻ tuổi (dưới 25 tuổi) học sinh trung học có hoạt động tình dục Kết tổng thể cho thấy xét nghiệm giúp phát nhanh chóng, xác khuẩn đường tiết niệu - sinh dục mẫu bệnh phẩm với độ nhạy 37 độ đặc hiệu lên đến 90,1 100% Định danh vi khuẩn từ mẫu nước tiểu so với mẫu dịch niệu đạo dịch âm đạo không đem lại lợi ích việc vận chuyển lưu trữ bệnh phẩm dễ dàng mà tạo thuận lợi muốn sử dụng phần nước tiểu thu thập cho xét nghiệm khác Hơn hết, phương pháp chứng minh có tiềm lớn việc cải thiện đáng kể số lượng bệnh nhân mắc bệnh điều trị Nghiên cứu tính ưu việt kỹ thuật Real - time PCR so với phương pháp soi tươi, nuôi cấy hay PCR truyền thống Bằng cách tiết kiệm thời gian lao động, Real - time PCR chứng minh tính hữu ích mơi trường lâm sàng cho chương trình sàng lọc quy mô lớn cộng đồng [32] Rõ ràng, tiến hành kỹ thuật Real - time PCR, bước quy trình tinh gọn đơn giản giải trình tự Khi giải trình tự, cần phải thực kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen đích lên số lượng đủ lớn, điện di xem có hay khơng có sản phẩm PCR, sản phẩm PCR đạt chất lượng chưa, sau tinh sản phẩm PCR để đoạn gen tinh khiết làm nguyên liệu cho giải trình tự Như vậy, kỹ thuật Real - time PCR tinh gọn bước thực thủ cơng so với giải trình tự, giúp cho người thực tiết kiệm nhiều thời gian hóa chất, đồng thời giảm sai sót nguyên nhân chủ quan trình thực giảm chi phí thời gian chờ đợi cho bệnh nhân Mặt khác, giải trình tự cần đầu tư chi phí lớn cho máy giải trình tự gen hóa chất, thiết bị kèm cần chi phí cho đào tạo kỹ thuật viên thực lớn so với máy Real - time PCR, đó, kỹ thuật Real - time PCR có khả ứng dụng cao sở thực hành lâm sàng máy giải trình tự nước ta hầu hết đầu tư cho sở nghiên cứu đầu ngành 38 4.2 Về đánh giá kết kỹ thuật Real - time PCR từ mẫu bệnh phẩm sinh học bệnh nhân nam giới nhiễm khuẩn tiết niệu sinh dục 4.2.1 Về đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu Độ tuổi trung bình bệnh nhân đến khám STD 33,4 ± 9,87 tuổi Tỷ lệ bệnh nhân đến khám nhiều nhóm tuổi từ 20 - 29 (41,6%), lứa tuổi hoạt động tình dục mạnh Kết tương đồng với nghiên cứu Phạm Thị Lan năm 2005, "Khảo sát tỷ lệ mắc số bệnh nhiễm trùng đường sinh dục đối tượng có hành vi nguy cao thành phố Hà Nội" nghiên cứu Nguyễn Minh Thu năm 2017, "Khảo sát tình hình nhiễm khuẩn hệ sinh dục - tiết niệu bệnh nhân nam giới Bộ môn Y sinh học - Di truyền năm 2016", độ tuổi phổ biến nhóm đối tượng nghiên cứu 20 - 29 tuổi với tỷ lệ 61,5% [30] 42,7% [31] 4.2.2 Về tỷ lệ nhiễm khuẩn đường tiết niệu - sinh dục Bệnh lây truyền qua đường tình dục (STD) nhóm bệnh truyền nhiễm phổ biến hầu hết quốc gia Số liệu tỷ lệ nhiễm khuẩn tiết niệu - sinh dục WHO cơng bố khu vực Tây Thái Bình Dương năm 2008 13% [33], thống kê PHEC vương quốc Anh năm 2014 626/100.000 dân [34] kết N Fournet Hà Lan năm 2006 - 2012 18% [35] Nghiên cứu loại mẫu bệnh phẩm khác nhau, kết nghiên cứu chúng tơi cho thấy phân tích mẫu dịch niệu đạo nhóm bệnh nhân nam giới đến khám STD, tỷ lệ nhiễm khuẩn đường tiết niệu - sinh dục 66%, cao nhiều so với số liệu tỷ lệ mẫu dịch niệu đạo nhiễm M genitalium người đàn ơng có triệu chứng nhiễm STD (25%) 39 khơng có triệu chứng STD (7%) tham dự phòng khám bệnh lây truyền qua đường tình dục New Orleans năm 2002 [36] Tỷ lệ nhiễm khuẩn tiết niệu - sinh dục phân tích mẫu nước tiểu nghiên cứu 83%, cao đáng kể so với số liệu cơng bố tỷ lệ dương tính với Chlamydia trachomatis tiến hành PCR mẫu nước tiểu thu thập từ bệnh nhân đến khám phòng khám bệnh STD Ấn Độ năm 2003 (25,2%) [37] Kết Real - time PCR mẫu tinh dịch dịch màng tinh hoàn nghiên cứu chúng tơi cho tỷ lệ dương tính với STD 87% 67% Hiện giới chưa thấy nghiên cứu tỷ lệ STD hai mẫu dịch nhóm đối tượng tương ứng Sự chênh lệch lớn kết nghiên cứu so với nghiên cứu nước nguyên nhân sau: Thứ nhất, đề tài tính 779 mẫu dịch niệu đạo, nhiên có 58 mẫu nước tiểu, mẫu tinh dịch mẫu dịch màng tinh hồn, nên kết khơng thể đại diện cho cộng đồng Thứ hai, chúng tơi thực quy trình định tính DNA 12 khuẩn đường tiết niệu - sinh dục thường gặp nghiên cứu giới đa số tập trung vào khuẩn định Thứ ba, giới sử dụng kỹ thuật PCR thông thường, dùng Real - time PCR với độ nhạy độ đặc hiệu cao nhiều 4.2.3 Về tỷ lệ nguyên gây bệnh đường tiết niệu - sinh dục Ở mẫu dịch niệu đạo, số nguyên gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu - sinh dục, Chlamydia trachomatis nguyên nhân hay gặp (48,4%) Tiếp sau nguyên khác như: Gardnerella vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma genitalium Ở mẫu nước tiểu, 40 nguyên Gardnerella vaginalis chiếm ưu (70,8%) Kết phân tích dịch niệu đạo chúng tơi tương đồng với kết nghiên cứu tác giả N.Fournet tiến hành 3053 mẫu dịch niệu đạo nước tiểu nhóm bệnh nhân nam giới Hà Lan từ năm 2006 đến năm 2012 Kết N Fournet cho Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae ngun có tỷ lệ nhiễm cao [35] Nhiễm trùng Chlamydia trachomatis bệnh lây truy ền qua đường tình dục phổ biến Hoa Kỳ [38] Một số nghiên cứu 40% phụ nữ bị nhiễm Chlamydia trachomatis không điều trị gặp phải bệnh viêm vùng chậu (PID) Trong số này, 20% trở thành vô sinh, 18% trải qua suy nhược, đau vùng chậu mãn tính 9% chửa ngồi tử cung đe dọa tính mạng người mẹ Nhiễm C trachomatis trình mang thai dẫn đến viêm kết mạc viêm phổi trẻ sơ sinh đồng thời gây viêm nội mạc tử cung sau sinh người mẹ Ở nam giới, viêm niệu đạo bệnh phổ biến nhiễm C trachomatis [39] Nhiễm C trachomatis biết làm tăng nguy nhiễm virus gây suy giảm miễn dịch người [40] Năm 2001, Neisseria gonorrhoeae đứng thứ hai tần số so với Chlamydia trachomatis số bệnh truy ền nhiễm báo cáo Hoa Kỳ Nhiễm N gonorrhoeae thường khơng có triệu chứng nữ gi ới không điều trị, tương tự C trachomatis, dẫn đ ến viêm phổi, chửa tử cung, vơ sinh đau vùng chậu mạn tính N gonorrhoeae thường gây viêm niệu đạo có triệu chứng nam giới dẫn tới viêm mào tinh hồn Ngồi ra, ngun nhân có th ể dẫn đến viêm kết mạc nghiêm trọng trẻ sơ sinh, gây mù khơng điều trị kịp thời [39] 41 Khi phân tích mẫu tinh dịch, chúng tơi nhận thấy rằng, Candida albicans, Chlamydia trachomatis, Gardnerella vaginalis Toxoplasma gondii nguyên thường gặp (đều chiếm 42,9%) Ở mẫu dịch màng tinh hoàn, bệnh phổ biến thường gặp nhóm đối tượng nghiên cứu Gardnerella vaginalis (66,7%) Trên giới chưa tìm thấy nghiên cứu nguyên gây bệnh STD mẫu dịch Một vài không tương đồng kết nghiên cứu tác giả khác ra, nguyên nhân khác hệ khuẩn đường tiết niệu - sinh dục đối tượng thuộc vùng địa chí khác cịn có ngun nhân khác kỹ thuật tiến hành, tác giả nước sử dụng kỹ thuật PCR, nghiên cứu chúng tơi lại sử dụng kỹ thuật Real - time PCR 4.2.4 Về tỷ lệ đơn nhiễm đồng nhiễm khuẩn gây bệnh đường tiết niệu sinh dục Từ việc phân tích mẫu dịch niệu đạo, nước tiểu, tinh dịch, nhận thấy bệnh nhân nhiễm nhiều khuẩn số lượng Bệnh nhân nhiễm khuẩn chiếm đa số, cịn nhóm đồng nhiễm, bệnh nhân nhiễm khuẩn chiếm tỷ lệ cao đến nhóm đồng nhiễm khuẩn Kết tương đồng với kết nghiên cứu N Foumet 3053 mẫu dịch niệu đạo nước tiểu nhóm bệnh nhân nam giới Hà Lan từ năm 2006 đến năm 2012 ông thu kết bệnh nhân nhiễm nhiều khuẩn số lượng Cụ thể, tỷ lệ nhiễm 1, khu ẩn đồng thời xác nhận 15,1%, 2,9% 0,2% [35] Ở mẫu dịch màng tinh hoàn, tỷ lệ đơn nhiễm đồng nhiễm khuẩn tương đương (đều chiếm 50%) Khơng có bệnh nhân đồng nhiễm từ khuẩn 42 trở lên Tuy nhiên, đề tài tiến hành mẫu dich màng tinh hoàn nên kết đại diện cho cộng đồng 43 KẾT LUẬN Hoàn thiện kỹ thuật chiết tách DNA từ mẫu bệnh phẩm (dịch âm đạo, dịch niệu đạo, nước tiểu, tinh dịch, dịch màng tinh hoàn) - Lượng DNA thu từ mẫu bệnh phẩm tương đối cao ổn định Tất mẫu DNA tách chiết đạt nồng độ cao, từ 379 - 716 ng/µl (mẫu dịch âm đạo dịch niệu đạo), 145 - 308 ng/µl (mẫu nước tiểu), 127 - 416 ng/µl (mẫu tinh dịch dịch màng tinh hoàn); đảm bảo đủ nồng độ cho phản ứng PCR thành công.　 - Tỷ số A260/A280 mẫu DNA tách chiết nằm khoảng từ 1,77 - 1,98 (mẫu dịch âm đạo dịch niệu đạo), 1,7 - 1,9 (mẫu nước tiểu), 1,7 - 1,95 (mẫu tinh dịch dịch màng tinh hoàn), chứng tỏ mẫu tách tương đối tinh sạch, không bị nhiễm protein hay RNA, đảm bảo cho phản ứng Real time PCR Mô tả kết kỹ thuật Real - time PCR từ mẫu bệnh phẩm sinh học bệnh nhân nam giới nhiễm khuẩn tiết niệu - sinh dục - Bệnh nhân độ tuổi hoạt động tình dục (từ 20 - 29 tuổi) chiếm tỷ lệ lớn nhóm nam giới đến khám STD (41,6%), tỷ lệ thấp nhóm 20 tuổi (1,1%) Từ sau 30 tuổi, tỷ lệ bệnh nhân khám giảm dần - Tỷ lệ tìm nguyên vi sinh vật ký sinh trùng nhóm đối tượng nghiên cứu bốn loại mẫu bệnh phẩm sinh học (dịch niệu đạo, nước tiểu, tinh dịch, dịch màng tinh hoàn) cao nhiều so với nhóm đối tượng có kết định danh hệ khuẩn đường tiết niệu - sinh dục âm tính (lần lượt chiếm 66%, 83%, 87% 67% tổng số bệnh nhân đến khám) - Căn nguyên gây bệnh đường tiết niệu - sinh dục phổ biến Chlamydia trachomatis với mẫu dịch niệu đạo (48,4%), Gardnerella vaginalis với mẫu nước tiểu (70,8%), Candida albicans, Chlamydia trachomatis, Gardnerella vaginalis Toxoplasma gondii với mẫu tinh dịch (đều chiếm 42,9%) Gardnerella vaginalis với mẫu dịch màng tinh hoàn (66,7%) 44 KHUYẾN NGHỊ Sử dụng kit Real - time PCR xác định 12 khuẩn đường tiết niệu sinh dục công ty Lytech (Nga) cho mẫu nước tiểu, tinh dịch dịch màng tinh hoàn bên cạnh mẫu dịch âm đạo dịch niệu đạo theo khuyến cáo nhà sản xuất Nên tiến hành nghiên cứu xác định vi khuẩn chí đường tiết niệu sinh dục mở rộng đối tượng như: tiền nhân, tiền sản, ngồi cộng đồng Ứng dụng kỹ thuật xét nghiệm rộng rãi Bệnh viện Truyền nhiễm, Da liễu, Trung tâm Di truyền, Vi sinh đơn vị có liên quan TÀI LIỆU THAM KHẢO World Health Organization (2014) Report on global sexually transmitted infection surveillance 2013 De Schryver A., Meheus A (1990) Epidemiology of sexually transmitted diseases: the global picture Bull World Health Organ 68(5), 639-54 World Health Organization (2016) Sexually transmitted infections (STIs), Fact sheet N°110 Andreu A (2004) Lactobacillus as a probiotic for preventing urogenital infections Reviews in Medical Microbiology 15(1), 1-6 Trần Hậu Khang (2015) Tổng quan nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục Tạp chí Nghiên cứu Y học, 22-24, 89 Nguyễn Duy Ánh (2010), Nghiên cứu số yếu tố nguy viêm nhiễm đường sinh dục phụ nữ Hà Nội từ 18-49 tuổi có chồng, Luận án Tiến sỹ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội Workowski K.A., Bolan G.A (2015) Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015 MMWR Recomm Rep 64(RR-03), 1-137 Wagenlehner F.M., et al (2016) The Presentation, Diagnosis, and Treatment of Sexually Transmitted Infections Dtsch Arztebl Int 113(102), 11-22 Eng T.R., Butler W.T (1997) The Hidden Epidemic: Confronting Sexually Transmitted Diseases The National Academy of Sciences: Washington DC 10 Carmona-Gutierrez D., Kainz K., Madeo F (2016) Sexually transmitted infections: old foes on the rise Microb Cell 3(9), 361-362 11 Centers for Disease Control and Prevention (2014) CDC fact sheet: incidence, prevalence, and cost of sexually transmitted infections in the United States Atlanta, GA: US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention; 2013 12 Tạ Thành Văn (2010), PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất Y học, Hà Nội 13 Phạm Hùng Vân (2009), PCR Realtime PCR - Các vấn đề ứng dụng thường gặp, Nhà xuất Y học, Thành phố Hồ Chí Minh 14 Bộ Y Tế (2000), Xét nghiệm chẩn đoán virus, Nhà xuất Y học, Hà Nội 15 Trường Đại học Y Hà Nội (2004), Bài giảng Sản phụ khoa, Nhà xuất Y học, Hà Nội 16 Lê Thị Kim Trâm (2005) Xác định nguyên vi khuẩn ký sinh trùng gây viêm đường sinh dục phụ nữ đến khám Bệnh viện Phụ sản Trung Ương năm 2005, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 34-37, 48 17 Kim Bảo Giang, Hoàng Văn Minh (2011) Sự cải thiện kiến thức số bệnh lây truyền qua đường tình dục công nhân số nhà máy may công nghiệp tỉnh Bình Dương thành phố Hồ Chí Minh sau năm can thiệp truyền thơng Tạp chí y học thực hành, 4, 20-23 18 Nguyễn Đức Thanh, Đỗ Huy Bình (2013) Kiến thức học sinh trung học phổ thơng bệnh lây truyền qua đường tình dục Tạp chí Y học Thực hành, 5, 95-98 19 Bộ Y Tế (2015), Kỹ thuật soi lam chẩn đoán bệnh lây truyền qua đường tình dục, Nhà xuất Y học, Hà Nội 20 Howard L., Elaine L., Jame O (1970) Diagnostic Procudures for Bacterial, Mycotic, and parasitic infections, 5th Bodily American Public Health Association 21 Maxam A.M and Gilbert W (1977) A new method for sequencing DNA Proc Natl Acad Sci USA 74(2), 4-560 22 Sanger F., Coulson A.R (1975) A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase Journal of molecular biology 94(3), 441-448 23 Smith L.M., et al (1986) Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis Nature 321(6071), 674 24 Trịnh Văn Bảo (2008), Giáo trình di truyền, Nhà xuất Y học, Hà Nội 25 Chu Hoàng Mậu (2014), Cơ sở phương pháp sinh học phân tử, Nhà xuất Đại học Sư phạm, Hà Nội, 83 26 Holland P.M., Abramson R.D., Watson R., et al (1991) Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5’ - 3’ exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase Proc Natl Acad Sci USA 88 (16): 7276–7280 27 Caliendo A.M., Jordan J.A., Green A.M., et al (2005) Real-time PCR improves detection of Trichomonas vaginalis infection compared with culture using self-collected vaginal swabs Infect Dis Obstet Gynecol 13(3), 50-145 28 Zhang M.J., et al (2013) Development and application of a real-time polymerase chain reaction method for Campylobacter jejuni detection World J Gastroenterol 19(20), 5-3090 29 Weiss E.J., et al (1996) A polymorphism of a platelet glycoprotein receptor as an inherited risk factor for coronary thrombosis New England Journal of Medicine 334(17), 1090-1094 30 Phạm Thị Lan (2012) Khảo sát tỷ lệ mắc số bệnh nhiễm trùng đường sinh dục đối tượng có hành vi nguy cao thành phố Hà Nội Tạp Chí Y học Việt Nam, Phụ trương 80 (3C), 339-345 31 Nguyễn Minh Thu (2017), Khảo sát tình hình nhiễm khuẩn hệ sinh dục - tiết niệu bệnh nhân nam giới Bộ môn Y sinh học - Di truyền năm 2016, Luận văn tốt nghiệp Bác sĩ đa khoa, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội 32 Justin Hardick, Samuel Yang, Shin Lin, et al (2003) Use of the Roche LightCycler Instrument in a Real-Time PCR for Trichomonas vaginalis in Urine Samples from Females and Males Journal of Clinical Microbiology 41(12): p 5619-5622 33 World Health Organization (2008) Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections 34 PHEC (2014) Annual spotlight on sexually transmitted infections in the South East PHE centre - 2014 data 35 Fournet N., Koedijk D.H., Van Leeuwen A.P., et al (2015) Young male sex workers are at high risk for sexually transmitted infections, a crosssectional study from Dutch STI clinics, the Netherlands, 2006–2012 BMC infectious diseases 16(1): p 63 36 Mena, Leandro, Tomasz F., et al (2002) Mycoplasma genitalium Infections in Asymptomatic Men and Men with Urethritis Attending a Sexually Transmitted Diseases Clinic in New Orleans Clinical Infectious Diseases 35(10): p 1167-1173 37 George J.A., Panchatcharam T.S., Paramasivam R., et al (2003) Evaluation of diagnostic efficacy of PCR methods for Chlamydia trachomatis infection in genital and urine specimens of symptomatic men and women in India Jpn J Infect Dis 56(3): p 88-92 38 Paavonen J and Eggert-Kruse W (1999) Chlamydia trachomatis: impact on human reproduction Human Reproduction Update 5(5): p 433-447 39 Johnson R.E., Newhall W.J., Papp J.R., et al (2002) Screening tests to detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae infections 2002 MMWR Recomm Rep 51(RR-15): p 1-38 40 Black C.M (1997) Current methods of laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infections Clinical Microbiology Reviews 10(1): p 160-184 ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUỲNH HOÀN THIỆN QUY TRÌNH KỸ THUẬT REAL - TIME PCR TỪ CÁC BỆNH PHẨM SINH HỌC ĐỂ ĐỊNH DANH VI SINH VẬT HỆ TIẾT NIỆU - SINH DỤC Ngành... kỹ thuật Real - time PCR từ bệnh phẩm sinh học để định danh vi sinh vật hệ tiết niệu - sinh dục? ?? với hai mục tiêu: Hoàn thiện kỹ thuật chiết tách DNA từ mẫu bệnh phẩm (dịch âm đạo, dịch niệu đạo,... 35 4.1 Về hoàn thiện kỹ thuật chiết tách DNA từ mẫu bệnh phẩm 35 4.2 Về đánh giá kết kỹ thuật Real - time PCR từ mẫu bệnh phẩm sinh học bệnh nhân nam giới nhiễm khuẩn tiết niệu sinh dục