Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Phương pháp này có đặc điểm là cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và điều kiện nuôi cấy. Phương pháp đếm khuẩn lạc có thể được thực hiện bằng kỹ thuật hộp trải hay hộp đổ.
Bài ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT TỔNG SỐ I Nguyên tắc Định lượng vi sinh vật phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật sống diện mẫu Tế bào sống tế bào có khả phân chia tạo thành khuẩn lạc môi trường chọn lọc Phương pháp có đặc điểm cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường điều kiện nuôi cấy Phương pháp đếm khuẩn lạc thực kỹ thuật hộp trải hay hộp đổ Trong phương pháp này, cần thực pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất khuẩn lạc riêng lẻ bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số đếm tính toán Mật độ tế bào lớn làm khuẩn lạc chồng chéo lên tạo thành màng sinh khối Ngược lại, số lượng khuẩn lạc đĩa nhỏ giá trị thống kê Số lượng khuẩn lạc tối ưu đề nghị quan có uy tín FDA, AOAC 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa Số lượng khuẩn lạc xuất đĩa phụ thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi trường điều kiện ủ Các tế bào đĩa không tăng trưởng hình thành khuẩn lạc với tốc độ nhau, nhiều tế bào chưa kịp hình thành khuẩn lạc thời gian ủ không đủ dài Thông thường, điều kiện nuôi cấy (môi trường, nhiệt độ, thời gian) cần đảm bảo cho số khuẩn lạc xuất tối đa Phương pháp đếm khuẩn lạc dễ cho sai số lớn nên cần thực lặp lại đĩa Ngoài ra, có khả nhiều tế bào hình thành chung khuẩn lạc nên số đếm khuẩn lạc không thiết trùng lặp với số tế bào ban đầu đưa lên môi trường nên kết đếm mật độ tế bào ban đầu đưa lên môi trường nên kết đếm mật độ tế bào thường trình bày số đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU/ml thay số tế bào/ml Mặc dù có số nhược điểm phương pháp đếm khuẩn lạc phương pháp tốt để xác định mật độ tế bào sống Ngoài ra, phương pháp có ưu điểm độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật mật độ thấp mẫu Phương pháp sử dụng rộng rãi kiểm nghiệm vi sinh vật nước, thực phẩm, bệnh phẩm, mỹ phẩm II Nguyên liệu - Dụng cụ - Thiết bị - Mẫu mỹ phẩm: Phấn phủ Pond’s magic power Đĩa petri - Ống nghiệm Que cấy trải Micropipette Đầu típ (100μl, 1000μl) Đèn cồn Bộ kít bọc thức ăn Cốc thủy tinh Ống đong Bình tam giác Cân điện tử Box cấy Máy hấp Bếp hồng ngoại III Môi trường - Hóa chất - - Môi trường PCA nuôi cấy vi khuẩn: Trypton 5g Cao nấm men 2,5g Glucose 1g Agar 16g Nước cất 1000ml Môi trường PGA nuôi cấy nấm mốc: Khoai tây 200g (khoai tây cắt lát, đun nhừ, chắt dịch chiết) Glucose 20g Agar 20g Nước cất 1000ml IV Cách tiến hành - Thu mẫu: Thu mẫu phấn phủ Pond’s magic power khu vực chợ D, thành phố Buôn Ma Thuột, tỉnh Đắk Lắk Mẫu mỹ phẩm qua sử dụng Hình Phấn phủ Pond’s magic power Chuẩn bị: - Pha nước muối sinh lý vô trùng: Pha nước muối NaCl 0,9% Phân phối vào ống nghiệm với thể tích 9ml/ống Nút bông, báo đem hấp khử trùng 1,5 - atm/20 – 30 phút Pha chế môi trường khử trùng: Pha chế môi trường PCA PGA sau nút - báo lại đem hấp khử trùng Chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường vô trùng: hấp khử trùng đĩa Chuẩn bị hộp đầu típ vô trùng: Cho đầu típ vào hộp petri, gói báo đem hấp khử trùng Chuẩn bị que cấy trải: Cho que cấy vào giấy bạc, gói lại đem hấp khử trùng Lưu ý: Để tiết kiệm thời gian, cần bố trí hấp lần cho phần chuẩn bị - Đổ đĩa: Đĩa môi trường phải đổ điều kiện vô trùng box cấy (lau cồn 70o, UV 30 phút) Đổ đĩa phải thực lửa đèn cồn Thao tác nhanh, xác, tránh mở nắp đĩa lâu, chạm tay vào bên đĩa để bình môi trường đứng không đậy nút Đĩa đổ xong cần đậy nắp lại - ghi tên môi trường sau chờ môi trường đông hẳn sử dụng Các dụng cụ cho vào box cấy trình bật UV: que cấy trải, ống nghiệm chứa nước muối sinh lý, đĩa petri chứa môi trường, đầu típ, cốc thủy tinh đựng đầu típ, kít bọc thức ăn, diêm, cốc thủy tinh đựng cồn 70o Tiến hành: Cân mẫu: cân 1g phấn phủ Pha loãng mẫu thành dãy nồng độ thập phân: 10 -1, 10-2, 10-3 Mỗi bậc pha loãng 1/10 thực cách dùng 1g mẫu thêm vào 9ml nước muối sinh lý Sau lắc kỹ độ pha loãng 1/10 Tiếp tục tiến hành độ pha loãng cuối - Hình Phương pháp pha loãng mẫu Dùng micropipette đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1ml dịch chứa vi sinh vật độ pha loãng 10 -1, 10-2, 10-3 trải lên đĩa petri chứa môi trường PCA - PGA Nhúng đầu que cấy trải vào cồn 70 o, hơ qua lửa đèn cồn để khử trùng Để đầu que cấy nguội không gian vô trùng lửa - Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng que cấy trải lên bề mặt thạch đĩa petri Dùng đầu que cấy xoay, trải dịch giống lên bề mặt thạch Trong trải, thực xoay đĩa vài lần, lần khoảng ½ chu vi đĩa tạo điều kiện cho que cấy trải dịch - giống khắp bề mặt môi trường Đậy nắp đĩa petri, sử dụng kít bọc thức ăn bọc kỹ đĩa, để đông tự nhiên Ủ đĩa petri tủ ấm 30oC 24 – 48h xuất khuẩn lạc Lưu ý: Các thao tác pha loãng mẫu cấy mẫu thực điều kiện vô trùng box cấy, khử trùng tay cồn 70 o Cần ghi tên người thao tác, tên chủng vi sinh vật, tên môi trường, ngày tháng tiến hành thí nghiệm lên tất đĩa petri, ống nghiệm môi trường, bình nuôi cấy,… V Kết Ở môi trường nuôi cấy vi khuẩn PCA Hình Khuẩn lạc mọc trên môi trường PCA - Ở đĩa petri có độ pha loãng 10-1 xuất khuẩn lạc đơn: Đĩa 1: 11 khuẩn lạc/đĩa Đĩa 2: khuẩn lạc/đĩa Ở đĩa petri có độ pha loãng 10-2 xuất khuẩn lạc đơn: + Đĩa 1: khuẩn lạc/đĩa + Đĩa 2: khuẩn lạc/đĩa Ở đĩa petri có độ pha loãng 10-3 không xuất khuẩn lạc đơn Ở môi trường nuôi cấy vi khuẩn PGA + + Hình Khuẩn lạc mọc môi trường PGA - - Ở đĩa petri có độ pha loãng 10-1 xuất khuẩn lạc đơn: + Đĩa 1: khuẩn lạc/đĩa + Đĩa 2: khuẩn lạc/đĩa Ở đĩa petri có độ pha loãng 10-2 không xuất khuẩn lạc đơn Ở đĩa petri có độ pha loãng 10-3 không xuất khuẩn lạc đơn VI Kết luận Hiện chưa có tiêu chuẩn nhà nước vi sinh vật mỹ phầm Một số tiêu vi sinh vật thường kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí, tổng số nấm men, nấm mốc, kiểm tra diện vi sinh vật Staphylococcus aureus, E coli, Candida albicans,… Dựa vào số khuẩn lạc đếm sau nuôi cấy, tính mật độ VSV (vi khuẩn, nấm mốc) theo công thức sau: A (CFU/g hay CFU/ml) = Trong đó: A: Tổng số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) 1g 1ml mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn ni: tổng số đĩa có số khuẩn lạc chọn độ pha loãng v: dung tích mẫu (ml) cấy vào đĩa fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc chọn đĩa đếm Tuy nhiên, thí nghiệm định lượng vi sinh vật tổng số mẫu mỹ phẩm (phấn phủ Pond’s magic power) số lượng khuẩn lạc xuất môi trường nuôi cấy nên giá trị thống kê (Số lượng khuẩn lạc tối ưu đề nghị quan có uy tín FDA, AOAC 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa) Do đó, áp dụng công thức để xác định mật độ vi sinh vật Vì vậy, kết luận mẫu mỹ phẩm phấn phủ Pond’s magic power mẫu mỹ phẩm sạch, xuất vi sinh vật không đáng kể Bài MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA CỦA VI SINH VẬT I Thử nghiệm catalase Nguyên tắc Các vi sinh vật hiếu khí kỵ khí tùy ý chứa chuỗi truyền điện tử có cytochrome có enzyme catalase (trừ Streptococcus spp.) Enzyme thành viên hệ thống enzyme có vai trò bảo vệ tế bào khỏi tổn thương dẫn xuất độc tính cao oxi phân tử tế bào hiếu khí kỵ khí tùy ý Các vi sinh vật có khả biến dưỡng lượng theo phương thức hô hấp với oxi chất nhận điện tử cuối chuỗi truyền điện tử tạo H 2O2 Catalase thủy phân H2O2 thành H2O O2, ngăn cản tích tụ phân tử có độc tính cao tế bào Tuy nhiên, catalase, nhiều enzyme peroxidase khác hệ thống enzyme bảo vệ tế bào khỏi stress oxi hóa có khả thủy phân H 2O2 Các enzyme diện tế bào, vi sinh vật hiếu khí kỵ khí tùy ý có khả biến dưỡng lượng theo phương thức hô hấp hiếu khí Sự thủy phân H 2O2 giải phóng O2 ghi nhận qua tượng sủi bọt khí 2H2O2 Catalase 2H2O + O2↑ Nguyên liệu - Dụng cụ - Hóa chất - Khuẩn lạc từ môi trường PCA (bài 1) Lam kính Que cấy vòng Đèn cồn Micropipette Đầu típ (100μl, 1000μl) H2O2 Cốc thủy tinh Cách tiến hành Cần khử trùng que cấy, đầu típ, micropipette, lam kính cần khử trùng cồn 70o Khử trùng đầu que cấy lửa đèn cồn nóng đỏ Dùng que cấy lấy sinh khối từ khuẩn lạc đặt lên lam kính sạch, chà nhẹ Dùng micropipette nhỏ giọt H2O2 lên sinh khối vi sinh vật phiến kính Ghi nhận sủi bọt Kết nhận xét Hình Hoạt tính catalase chủng vi sinh vật Phản ứng dương tính nhận thấy thí nghiệm phân tử oxy sinh làm xuất bọt khí, điều chứng tỏ chủng vi sinh vật có hoạt tính catalase phân hủy H2O2 giải phóng O2 chủng vi sinh vật kỵ khí hiếu khí tùy ý 2H2O2 Catalase 2H2O + O2↑ Hầu hết vi sinh vật hiếu khí kỵ khí tùy ý có hệ enzyme catalase Enzyme thành viên hệ thống enzyme có vai trò bảo vệ tế bào khỏi tổn thương dẫn xuất độc tính cao oxi phân tử tế bào hiếu khí kỵ khí tùy ý Ngoài ra, enzyme có khả biến dưỡng lượng theo phương thức hô hấp hiếu khí tạo lượng cho tế bào II Thử nghiệm amylase Nguyên tắc Enzyme ngoại bào α – amylase xúc tác phân hủy tinh bột thành đường maltose Phân tử đường có tính tan tốt hơn, vào tế bào vi sinh vật dùng làm nguồn lượng carbon Hoạt tính phân hủy tinh bột phát dựa theo nguyên tắc sau Tinh bột polysaccharide có cấu trúc không gian tương đối phức tạp Khi môi trường chứa tinh bột nhuộm iod, iod bị giữ lại cấu trúc mạng không gian tinh bột làm môi trường có màu xanh đậm Nếu vi sinh vật có khả phân giải tinh bột cấu trúc bị phá vỡ, xuất vòng phân giải suất bao quanh khuẩn lạc Nguyên liệu - Dụng cụ - Thiết bị - Khuẩn lạc từ môi trường PCA (bài 1) Đĩa petri Que cấy vòng Đèn cồn Bộ kít bọc thức ăn Cốc thủy tinh Ống đong Bình tam giác Cân điện tử Box cấy Máy hấp Bếp hồng ngoại Môi trường - Hóa chất - Môi trường tinh bột: Cao thịt 10g Tinh bột 20g Agar 20g Nước cất 1000ml Cách tiến hành - Chuẩn bị: Pha chế môi trường khử trùng: Pha chế môi trường PCA môi trường tinh bột - sau nút báo lại đem hấp khử trùng Chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường vô trùng: hấp khử trùng đĩa Lưu ý: Để tiết kiệm thời gian, cần bố trí hấp lần cho phần chuẩn bị - Đổ đĩa: Đĩa môi trường phải đổ điều kiện vô trùng box cấy (lau cồn 70o, UV 30 phút) Đổ đĩa phải thực lửa đèn cồn Thao tác nhanh, xác, tránh mở nắp đĩa lâu, chạm tay vào bên đĩa để bình môi trường đứng không đậy nút Đĩa đổ xong cần đậy nắp lại - ghi tên môi trường sau chờ môi trường đông hẳn sử dụng Các dụng cụ cho vào box cấy trình bật UV: que cấy vòng, đĩa petri chứa môi trường, kít bọc thức ăn, diêm, cốc thủy tinh đựng cồn 70o Tiến hành: Cấy ria vi khuẩn phân lập môi trường PCA để tạo giống Khử trùng đầu que cấy lửa đèn cồn nóng đỏ Mở nắp đĩa petri chứa vi khuẩn, làm nguội que cấy lấy giống, khử trùng lại đĩa - Dùng tay mở nắp đĩa petri chứa môi trường làm thuần, tay ria đầu que cấy bề mặt thạch Ria bề mặt thạch theo đường zigzac khoảng - ¼ đĩa thạch Tránh trường hợp đầu que cấy đâm vào môi trường làm lủng thạch Khử trùng que cấy lửa đèn cồn Xoay đĩa petri ¼ vòng tròn Mở nắp đĩa petri chứa môi trường làm đợi que cấy nguội cách áp đầu - que cấy lên nắp đĩa Bắt đầu ria đường thứ hai từ vị trí đường ria Tiếp tục ria đường tương tự ria kín bề mặt thạch Khử - trùng lại que cấy sau ria xong Đậy nắp đĩa petri, dùng kít bọc thực ăn bọc kỹ đĩa, để đông tự nhiên Ủ đĩa petri tủ ấm 30oC 24 – 48h xuất khuẩn lạc Lưu ý: Các thao tác cấy mẫu thực điều kiện vô trùng box cấy, khử trùng tay cồn 70 o Cần ghi tên người thao tác, tên chủng vi sinh vật, tên môi trường, ngày tháng tiến hành thí nghiệm lên tất đĩa petri, ống nghiệm môi trường, bình nuôi cấy,… - Cấy ria vi khuẩn từ môi trường PCA qua môi trường tinh bột đĩa petri: Các bước tiến hành tương tự bước làm giống Kết nhận xét Sau ủ tủ ấm thời gian đĩa petri chứa môi trường tinh bột có xuất khuẩn lạc Sự xuất khuẩn lạc chứng tỏ vi sinh vật có khả tiết enzyme amylase để phân giải tinh bột thành đường Vi sinh vật sử dùng lượng đường để tạo nguồn dinh dưỡng lượng giúp vi sinh vật sinh trưởng, phát triển 10 Hình Khuẩn lạc mọc môi trường tinh bột III Thử nghiệm gelatinase Nguyên tắc Một số vi sinh vật tổng hợp nhóm enzyme gelatinase ngoại bào xúc tác thủy phân gelatin thành polypeptide acid amin Để nhận biết khả làm tan gelatine vi sinh vật, chất bổ sung làm đông đặc môi trường nuôi cấy Sau cấy chủng, vi sinh vật có khả tiết gelatinase làm môi trường tan chảy thành dạng lỏng Nguyên liệu - Dụng cụ - Thiết bị - Khuẩn lạc từ môi trường PCA (bài 1) Đĩa petri Que cấy vòng Đèn cồn Bộ kít bọc thức ăn Cốc thủy tinh Ống đong Bình tam giác Cân điện tử Box cấy Máy hấp Bếp hồng ngoại Môi trường - Hóa chất - Môi trường gelatine: NaCl 3g K2HPO4 1,5g KH2PO4 1,5g Gelatine 4g Glucose 0,05g Pepton 0,1g Cao thịt 5g Agar 15g Nước cất 1000ml Cách tiến hành - Chuẩn bị: Pha chế môi trường khử trùng: Pha chế môi trường PCA môi trường gelatine - sau nút báo lại đem hấp khử trùng Chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường vô trùng: hấp khử trùng đĩa 11 Lưu ý: Để tiết kiệm thời gian, cần bố trí hấp lần cho phần chuẩn bị - Đổ đĩa: Đĩa môi trường phải đổ điều kiện vô trùng box cấy (lau cồn 70o, UV 30 phút) Đổ đĩa phải thực lửa đèn cồn Thao tác nhanh, xác, tránh mở nắp đĩa lâu, chạm tay vào bên đĩa để bình môi trường đứng không đậy nút Đĩa đổ xong cần đậy nắp lại - ghi tên môi trường sau chờ môi trường đông hẳn sử dụng Các dụng cụ cho vào box cấy trình bật UV: que cấy vòng, đĩa petri chứa môi trường, kít bọc thức ăn, diêm, cốc thủy tinh đựng cồn 70o Tiến hành: Cấy ria vi khuẩn phân lập môi trường PCA để tạo giống Khử trùng đầu que cấy lửa đèn cồn nóng đỏ Mở nắp đĩa - petri chứa vi khuẩn, làm nguội que cấy lấy giống, khử trùng lại đĩa Dùng tay mở nắp đĩa petri chứa môi trường làm thuần, tay ria đầu que cấy bề mặt thạch Ria bề mặt thạch theo đường zigzac khoảng - ¼ đĩa thạch Tránh trường hợp đầu que cấy đâm vào môi trường làm lủng thạch Khử trùng que cấy lửa đèn cồn Xoay đĩa petri ¼ vòng tròn Mở nắp đĩa petri chứa môi trường làm đợi que cấy nguội cách áp đầu - que cấy lên nắp đĩa Bắt đầu ria đường thứ hai từ vị trí đường ria Tiếp tục ria đường tương tự ria kín bề mặt thạch Khử - trùng lại que cấy sau ria xong Đậy nắp đĩa petri, dùng giấy bọc thực ăn bọc kỹ đĩa, để đông tự nhiên Ủ đĩa petri tủ ấm 30oC 24 – 48h xuất khuẩn lạc Lưu ý: Thao tác cấy mẫu thực điều kiện vô trùng box cấy, khử trùng tay cồn 70o Cần ghi tên người thao tác, tên chủng vi sinh vật, tên môi trường, ngày tháng tiến hành thí nghiệm lên tất đĩa petri, ống nghiệm môi trường, bình nuôi cấy,… - Cấy ria vi khuẩn từ môi trường PCA qua môi trường gelatine đĩa petri: Các - bước tiến hành tương tự bước làm giống Khi đĩa petri chứa môi trường gelatine xuất khuẩn lạc, kiểm tra hoạt tính gelatinase vi khuẩn cách ấn nhẹ đầu que cấy lên bề mặt môi trường Kết nhận xét 12 Hình Khuẩn lạc mọc môi trường gelatine Sau ủ tủ ấm thời gian đĩa petri chứa môi trường gelatin có xuất khuẩn lạc, môi trường không chuyển màu không bị biến đổi từ dạng rắn sang dạng lỏng Sở dĩ môi trường gelatine không bị biến đổi từ dạng rắng sang dạng lỏng vi khuẩn khả tiết enzyme gelatinase 13 Bài ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS TỔNG SỐ I Nguyên tắc Coliforms trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí kỵ khí tùy ý, có khả lên men lactose sinh acid sinh 37 oC 24 – 48 Trong thực tế phân tích, Coliforms định nghĩa vi khuẩn có khả lên men sinh khoảng 48 ủ 37 oC môi trường Lauryl Sulphate Broth LSB Brilliant Green Lactose Bile Salt Số lượng Coliforms mẫu nước, thực phẩm chứa mật độ thấp nhóm vi khuẩn xác định phương pháp MPN (Most Protable Number) Phương pháp dựa vào nguyên tắc mẫu pha loãng thành dãy thập phân (hai nồng độ khác 10 lần); mẫu độ pha loãng thập phân liên tiếp ủ ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống Durham Mỗi nồng độ pha loãng ủ từ đến ống lặp lại Theo dõi sinh để định tính diện ống nghiệm, ống dương tính Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính nồng độ pha loãng dựa vào bảng MPN để suy số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng diện 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu II Nguyên liệu - Dụng cụ - Thiết bị - Mẫu pate Ống nghiệm Ống Durham Micropipette Đầu típ (100μl, 1000μl) Que cấy vòng Đèn cồn Bộ kít bọc thức ăn Cốc thủy tinh Ống đong Bình tam giác Cân điện tử Box cấy Máy hấp Bếp hồng ngoại III Môi trường – Hóa chất - Môi trưởng Lauryl Sulphate Broth LBS (Môi trường phát hiện): Triptose 20g Lactose 5g 14 NaCl 5g KH2PO4 2,75g K2HPO4 2,75g Lauryl sunfate 0,1g Nước cất - 1000ml Môi trường Brilliant Green Bile Lactose Broth BGBL (Môi trường khẳng định): Peptone 10g Lactose 10g Mật heo 20g Brilliant green 0,0133g Nước cất 1000ml IV Cách tiến hành - Thu mẫu: Thu mẫu pate khu vực chợ D, thành phố Buôn Ma Thuột, tỉnh Đắk Lắk Chuẩn bị: Pha nước muối sinh lý vô trùng: Pha nước muối NaCl 0,9% Phân phối vào ống nghiệm với thể tích 9ml/ống Nút bông, báo đem hấp khử trùng 1,5 - atm/20 – 30 phút Pha chế môi trường khử trùng: Pha chế môi trường LSB BGBL, phân phối vào ống nghiệm, ống nghiệm 10ml môi trường Thả ống Durham vào - ống nghiệm sau nút báo lại đem hấp khử trùng Chuẩn bị hộp đầu típ vô trùng: Cho đầu típ vào hộp petri, gói báo đem hấp khử trùng Lưu ý: Để tiết kiệm thời gian, cần bố trí hấp lần cho phần chuẩn bị - Các dụng cụ cho vào box cấy trình bật UV: que cấy vòng, ống nghiệm chứa nước muối sinh lý, ống nghiệm chứa môi trường, micropipette, đầu típ, cốc thủy tinh đựng đầu típ, kít bọc thức ăn, diêm, cốc thủy tinh đựng cồn 70o Tiến hành: Cân mẫu: cân 1g pate Pha loãng mẫu thành dãy nồng độ thập phân:10 -1, 10-2, 10-3 Mỗi bậc pha loãng 1/10 thực cách dùng 1g mẫu thêm vào 9ml nước muối sinh lý Sau lắc kỹ độ pha loãng 1/10 Tiếp tục tiến hành độ - pha loãng cuối Dùng micropipette đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 1ml dịch mẫu - pha loãng vào ống môi trường LSB Mỗi độ pha loãng lặp lại lần Ủ ống LSB 37oC 48 15 - Các ống nghiệm xuất khí ống Durham xếp dương tính Ghi - nhận số ống dương tính độ pha loãng Dùng que cấy vòng chuyển dịch từ ống LSB dương tính sang môi trường BGBL Ủ ống BGBL 37oC 48 Ghi nhận ống BGBL dương tính Đếm số ống dương tính độ pha loãng tra bảng MPN để suy số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng diện 1g mẫu ban đầu Lưu ý: Các thao tác pha loãng mẫu cấy mẫu thực điều kiện vô trùng box cấy, khử trùng tay cồn 70 o Cần ghi tên người thao tác, tên chủng vi sinh vật, tên môi trường, ngày tháng tiến hành thí nghiệm lên tất đĩa petri, ống nghiệm môi trường, bình nuôi cấy,… V Kết Phát Coliforms mẫu pate Hình Thí nghiệm phát Coliforms mẫu pate Trong môi trường LSB, ống nghiệm có độ pha loãng 10 -1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 có xuất bọt khí ống Durham, môi trường LSB có màu vàng đục so với ban đầu Những ống nghiệm độ pha loãng lại xuất bọt khí màu môi trường không thay đổi so với ban đầu Khẳng định có mặt Coliforms mẫu pate 16 Hình Thí nghiệm khẳng định có mặt Coliforms mẫu pate Trong môi trường BGBL, tất ống nghiệm có độ pha loãng 10 -1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 không thấy xuất bọt khí ống Durham màu môi trường không bị thay đổi VI Nhận xét Môi trường LSB môi trường phát Coliforms môi trường chọn lọc nên số vi sinh vật khác có khả sử dụng lactose tạo acid lactic sinh dẫn tới tượng dương tính giả Điều nghĩa ống Durham có xuất bọt khí lại xuất Coliforms Môi trường BGBL môi trường khẳng định có mặt Coliforms môi trường chọn lọc Coliforms Trong ống Durham không xuất bọt khí chứng tỏ Coliforms không diện mẫu thực phẩm Mẫu thực phẩm (pate) Lưu ý: Trong môi trường BGBL, sử dụng mật heo ức chế hầu hết vi khuẩn Gram (+) vi khuẩn Gram (-) Coliforms Môi trường BGBL có nồng độ đặc hiệu nhằm ngăn cản vi khuẩn kỵ khí lên men lactose sinh trưởng 44 oC, tránh tượng dương tính giả Lúc này, Coliforms phát triển làm đục môi trường sinh khí ống Durham lên men lactose 17