Ứng dụng asparaginase để giảm lượng acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh bích quy

Xác định được tỷ lệ asparaginase bổ sung để giảm asparagine trong bột nhào và lượng acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh bích quy.. Tỷ lệ asparaginase bổ sung để giảm asparagine tron

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-

 -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

ỨNG DỤNG ASPARAGINASE ĐỂ GIẢM LƯỢNG

ACRYLAMIDE TẠO THÀNH TRONG SẢN XUẤT

BÁNH BÍCH QUY

Người hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Hương Trà

Sinh viên thực hiện : Đỗ Thị Huệ

Lớp : 12-01

Hà Nội - 2016

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp ngành Công nghệ sinh học, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ từ phía thầy

cô, bạn bè và người thân

Với tấm lòng chân thành và biết ơn sâu sắc, em xin được gửi lời cảm ơn đặc biệt tới ThS Nguyễn Thị Hương Trà, cùng các cán bộ trong Bộ môn Nghiên cứu công nghệ sinh học sau thu hoạch – Viện Cơ điện Nông nghiệp

và Công nghệ Sau thu hoạch đã tạo điều kiện, giúp đỡ tận tình và hướng dẫn

em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học, các giáo viên phụ trách đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũng như dạy

dỗ và dẫn dắt em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Bên cạnh đó, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh ủng hộ, động viên và giúp đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu

Do thời gian thực hiện khóa luận có hạn nên bài khóa luận của em không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý, đánh giá chân thành của thầy cô và các bạn để bài khóa luận của em được hoàn chỉnh hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 23 tháng 05 năm 2016

Người thực hiện

Đỗ Thị Huệ

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về acrylamide 3

1.1.1 Khả năng gây bệnh của acrylamide 3

1.1.2 Cơ chế hình thành acrylamide 4

1.1.3 Mức độ nhiễm acrylamide trong thực phẩm 6

1.1.4 Phương pháp giảm acrylamide trong sản xuất bánh nướng 9

1 2 Giới thiệu chung về asparaginase 10

1.2.1 Sự phân bố của asparaginase trong tự nhiên 10

1.2.2 Đặc điểm cấu tạo và tính chất của asparaginase 11

1.2.3 Cơ chế xúc tác của asparaginase 13

1.3 Nghiên cứu ứng dụng của enzyme asparaginase 15

1.3.1 Ứng dụng trong y học 15

1.3.2 Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm 16

1.4 Nguyên liệu và quy trình công nghệ sản xuất bánh bích quy 19

1.4.1 Nguyên liệu 19

1.4.2 Quy trình công nghệ 22

1.5 Thông tin về chế phẩm asparaginase của đề tài 25

1.5.1 Công nghệ sản xuất asparaginase tái tổ hợp 25

1.5.2 Đặc điểm kĩ thuật của chế phẩm 26

1.5.3 Nghiên cứu sản xuất asparaginase để làm giảm lượng asparagine trong bột mì 26

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Vật liệu nghiên cứu 28

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.2 Hóa chất 29

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 29

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

SV: Đỗ Thị Huệ Lớp CNSH-1201 iii

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Sản xuất bánh bích quy 30

2.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzym bổ sung đến hiệu quả giảm acrylamide 32

2.2.3 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hiệu quả giảm acrylamide trong bánh bích quy 33

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng asparagine tự do 34

2.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng acrylamide 35

2.2.6 Phương pháp xác định độ ẩm 38

2.2.7 Đánh giá chất lượng cảm quan bánh bích quy 39

2.2.8 Xác định chỉ tiêu hóa lý của bánh bích quy 40

2.2.9 Xác định chỉ tiêu vi sinh vật 40

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Đường chuẩn xác định nồng độ acrylamide 41

3.2 Xác định được tỷ lệ asparaginase bổ sung để giảm asparagine trong bột nhào và lượng acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh bích quy 42 3.2.1 Tỷ lệ asparaginase bổ sung để giảm asparagine trong bột nhào và lượng acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh bích quy khi lên men ở 20oC 43

3.1.2 Tỷ lệ asparaginase bổ sung để giảm asparagine trong bột nhào và lượng acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh bích quy khi lên men ở 25oC 44

3.1.3 Tỷ lệ asparaginase bổ sung để giảm asparagine trong bột nhào và lượng acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh bích quy khi lên men ở 30oC 46

3.1.4 Tỷ lệ asparaginase bổ sung để giảm asparagine trong bột nhào và lượng acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh bích quy khi lên men ở 35oC 47

3.3 Xác định được thời gian lên men để giảm asparagine trong bột nhào và acrylamide tạo thành trong sản xuất bích quy 50

3.4 Đánh giá chất lượng bánh bích quy 50

3.4.1 Đánh giá chất lượng cảm quan bánh bích quy 51

3.4.2 Xác định chỉ tiêu hóa lí trong bánh bích quy 52

3.4.3 Xác định chỉ tiêu vi sinh vật trong bánh bích quy 53

3.5 Xây dựng quy trình sử dụng asparaginase để giảm lượng acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh bích quy 54

PHẦN IV: KẾT LUẬN 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

Cfu/g colony-forming unit/g (đơn vị hình thành khuẩn lạc/gam)

JECFA (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) Hội đồng chuyên gia chung của Tổ chức Nông lương (FAO) và Tổ chức Y

tế thế giới (WHO) vể phụ gia thực phẩm

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

SV: Đỗ Thị Huệ Lớp CNSH-1201 v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Hàm lượng acrylamide trong một số thực phẩm 8 Bảng 1.2 Đặc điểm sinh hóa của asparaginase từ vi sinh vật 13 Bảng 1.3 Phân loại bột mì 19 Bảng 2.1 Bảng mức chất lượng sản phẩm theo tổng số điểm trung bình của thành viên trong hội đồng cảm quan 35 Bảng 3.1 Kết quả diện tích píc theo nồng độ chất chuẩn acrylamide 42 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzym bổ sung đến hiệu quả giảm asparagine trong bột nhào và acrylamide trong bánh bích quy khi ủ bột ở 20oC 44 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzym bổ sung đến hiệu quả giảm asparagine trong bột nhào và acrylamide trong bánh bích quy khi ủ bột ở 25oC 45 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzym bổ sung đến hiệu quả giảm asparagine trong bột nhào và acrylamide trong bánh bích quy khi ủ bột ở 30oC 47 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzym bổ sung đến hiệu quả giảm asparagine trong bột nhào và acrylamide trong bánh bích quy khi ủ bột ở 35oC 48 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của asparaginase đến chỉ tiêu hóa lý của bánh bích quy 52 Bảng 3.7 Kết quả kiểm tra vi sinh vật trong sản phẩm 53

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cơ chế hình thành acrylamide trong thực phẩm (David et al.,

2003) 6

Hình 1.2 Cấu tạo của asparaginase chiết tách từ Escherichia coli (Chanches et al., 2007) 11

Hình 1.3 Cơ chế chung của phản ứng xúc tác bởi asparaginase 15

Hình 1.4 Quy trình công nghệ sản xuất bánh bích quy 22

Hình 2.1 Quy trình sản xuất bánh bích quy 30

Hình 3.1 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ chất chuẩn acrylamide 42

Hình 3.2 Hiệu quả giảm hiệu quả giảm asparagine trong bột nhào và acrylamide trong bánh bích quy theo tỷ lệ bổ sung khi ủ bột ở 20oC 44

Hình 3.3 Hiệu quả giảm hiệu quả giảm asparagine trong bột nhào và acrylamide trong bánh bích quy theo tỷ lệ bổ sung khi ủ bột ở 25oC 46

Hình 3.4 Hiệu quả giảm hiệu quả giảm asparagine trong bột nhào và acrylamide trong bánh bích quy theo tỷ lệ bổ sung khi ủ bột ở 30oC 47

Hình 3.5 Hiệu quả giảm hiệu quả giảm asparagine trong bột nhào và acrylamide trong bánh bích quy theo tỷ lệ bổ sung khi ủ bột ở 35oC 49

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội

MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam, bánh bích quy là loại bánh nướng phổ biến và rất tiện dụng Đây là loại bánh có giá trị gluxit cao do đó luôn giữ vị trí quan trọng trong bảng xếp hạng những loại thực phẩm đáp ứng nhu cầu năng lượng cho cơ thể Các nhà khoa học cũng chỉ ra rằng, acrylamide có trong thực phẩm giàu carbohydrate được chế biến ở nhiệt độ cao sẽ hình thành acrylamide

(Hendriksen et al., 2009 ; Yener and Kalipci, 2009; Lingnert et al., 2002)

Nguyên nhân hình thành acrylamide trong thực phẩm là do phản ứng của asparagine và đường khử như glucose và fructose xảy ra ở nhiệt độ cao (nướng hay chiên ở nhiệt độ lớn hơn 120oC ) và độ ẩm thấp Đây là một phần của phản ứng Maillard (phản ứng tạo màu sắc, hương vị và mùi thơm cho sản

phẩm) (Mottram et al., 2002) Acrylamide được cơ quan Hóa chất Châu Âu

liệt vào danh sách các chất đặc biệt nguy hiểm cho sức khỏe, cần phải loại bỏ tối đa chúng ra khỏi thực phẩm nhằm ngăn chặn sự gia tăng ung thư Do vậy, việc giảm sự hình thành của acrylamide trong sản xuất bánh bích quy là điều

vô cùng cần thiết

Có nhiều phương pháp để giảm lượng acrylamide trong thực phẩm Phần lớn các phương pháp mặc dù có làm hạn chế sự hình thành acrylamide nhưng lại ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan của sản phẩm Bổ sung asparaginase trong quá trình sản xuất bánh là phương pháp đơn giản và hiệu quả để giảm lượng acrylamide mà không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Xuất phát

từ đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Ứng dụng asparaginase để giảm lượng acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh bích quy”

Mục tiêu đề tài:

Xây dựng được quy trình sử dụng asparaginase để giảm lượng

acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh bích quy

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Nội dung đề tài:

- Ảnh hưởng của tỉ lệ enzym bổ sung đến hiệu quả giảm acrylamide trong bánh bích quy khi lên men ở các nhiệt độ khác nhau

- Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hiệu quả giảm acrylamide trong bánh bích quy

- Đánh giá chất lượng bánh bích quy (cảm quan, chỉ tiêu hóa lí và chỉ tiêu vi sinh vật)

- Xây dựng được quy trình sử dụng asparaginase để giảm lượng acrylamide

tạo thành trong sản xuất bánh bích quy

- Ước tính giá thành cho sản xuất bánh bích quy có bổ sung asparaginase

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về acrylamide

1.1.1 Khả năng gây bệnh của acrylamide

Các nhà khoa học trên thế giới đã từng cảnh báo người tiêu dùng về nguy

cơ ung thư do ăn khoai tây chiên Trên thực tế, nhiều loại thực phẩm tưởng như vô hại khác như cà phê, bánh bích quy, bánh mì,…cũng có thể dẫn đến ung thư Nguyên nhân chính là do các thực phẩm trên có acrylamide Acrylamide hay còn gọi là 2-propenamide, ethylene carboxamide, acrylic acid amide, vinyl amide, propenoic acid amide Acrylamide là một monomer có công thức phân tử C3H5NO (CH2=CH-CO-NH2), trọng lượng phân tử 71,08g, phân cực, được tìm thấy cả trong người và động vật Quá trình trao đổi của acrylamide trong cơ thể như sau: Sau khi ăn, acrylamide trong thực phẩm sẽ nhanh chóng chuyển đi khắp cơ quan trong cơ thể thông qua hệ tuần hoàn Nó được phát hiện trên gan, tim, não, thận, tuyến ức và thậm chí cả trong sữa mẹ Acrylamide chuyển hóa thành glycidamide ở trong gan thông qua cytochrome P540 Khi nồng độ của acrylamide và glycidamide tăng cao, chúng có thể

tương tác với các đại phân tử như DNA, hemoglobin và các enzym (Claus et

al., 2008)

Những nghiên cứu trước đây đã chứng minh acrylamide có ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người nhứ: gây ung thư và ảnh hưởng đến hệ thần kinh

(Sumner et al., 1992) Thông thường chỉ ở nồng độ cao nó mới ảnh hưởng

đến hệ thần kinh (liều không độc ≤ 0,5mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày), tuy nhiên nồng độ này thường khó đạt được thông qua ăn uống Khả năng gây ung thư và đột biến gen của acrylamide và glycidamide đã được công bố ở nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cũng như trên động vật Những nghiên cứu trên tế bào chuột và người cho thấy acrylamide và glycidamide có thể làm gây nhiễm sắc thể, gây đột biến điểm dẫn đến sự khác thường trên nhiễm sắc

thể nên phá vỡ quá trình nguyên phân, tạo thể bội không chỉnh Acrylamide làm tăng tỉ lệ đột biến, đặc biệt là đột biến thay thế các nucleobase như denine bằng guanine và guanine bằng cytosine Đối với thí nghiệm trên chuột, acrylamide thúc đẩy quá trình hình thức khối u trên não, phổi, tính bản và tuyến vú Khi chuột được xử lý với liều 2 mg acrylamide trên 1kg trọng lượng

cơ thể sẽ làm tăng đáng kể u não, tuyến ức, tử cung và những tế bào khác Tuy nhiên acrylamide được sử dụng với liều cao trong các nghiên cứu trên động vật có thể không phản ánh trung thực những ảnh hưởng, tác động của acrylamide hấp thụ được trong thức ăn Do đó rất nhiều nghiên cứu về dịch tễ học đã được thực hiện để đánh giá nguy cơ gây ung thư bóng đái, ruột, thận, thanh quản, thực quản, vú và buồng trứng Mặc dù vậy, Tổ chức y tế thế giới (WHO), Tổ chức Nông nghiệp liên hiệp quốc (FAO), Tổ chức Hóa học Châu

Âu và Tổ chức Nghiên cứu ung thư thế giới (IARC) đều coi acrylamide là

chất có khả năng gây ung thư cho người, thuộc nhóm 2A (Vinei et al., 2011; Hendrksen et al., 2009) Vì vậy, nồng độ của acrylamide trong thực phẩm

phải được kiểm soát ở mức độ cho phép (nguyên tắc của ALARA) Con đường hình thành acrylamide cần phải được xác định để kiểm soát lượng acrylamide hấp thu vào cơ thể Tổ chức Bảo vệ môi trường Mỹ (EPA) và WHO đã đưa ra hàm lượng acrylamide tối đa trong đồ uống là 0,5ppb hoặc 0,05µg/lít Hiện nay, số liệu về lượng acrylamide vào cơ thể từ thức ăn và liều gây chết còn hạn chế (Simonne and Archer, 2002)

1.1.2 Cơ chế hình thành acrylamide

Bột mì là nguyên liệu chính giàu cacbonhydrate được sử dụng trong quá

trình sản xuất các loại bánh nướng như bánh bích quy, bánh mỳ,… Các công đoạn chính trong quá trình sản xuất bánh bích quy như trộn và nhào bột với các nguyên phụ liệu (muối, nước, nấm men,…), tạo hình bánh, ủ bột, nướng, làm nguội, phân loại và đóng gói sản phẩm Nướng bánh là một công đoạn

quan trọng trong quá trình sản xuất bánh bích quy Khi nướng, dưới tác dụng

hóa Nướng bánh làm chín nguyên liệu, tạo cho bánh bích quy có màu, mùi và hương thơm đặc trưng đồng thời tiêu diệt vi sinh vật Quá trình nướng bánh trải qua ba giai đoạn với ba nhiệt độ nướng là: 169oC, 190oC, 225oC, từ 10 đến 20 phút tùy theo yêu cầu về màu sắc và độ giòn của sản phẩm

(Hendriksen et al., 2009)

Tuy nhiên, nghiên cứu của các nhà khoa học Na Uy, Thụy Sĩ, Mỹ, Anh

đã cho thấy các loại thực phẩm có nguồn gốc thực vật giàu carbohydrate khi được chế biến bằng những phương pháp đòi hỏi nhiệt độ cao (≥ 120oC) đều

sản sinh acrylamide (Hendriksen et al., 2009 ; Yener and Kalipci, 2009; Lingnert et al., 2002) Nguyên nhân hình thành acrylamide trong thực phẩm

là do phản ứng của asparagine và đường khử như glucose và fructose xảy ra ở nhiệt độ cao (nướng hay chiên ở nhiệt độ lớn hơn 120oC ) và độ ẩm thấp

(phản ứng Maillard) tạo thành hợp chất có màu vàng nâu (Mottram et

al., 2002)

Đầu tiên, nhóm R-amin của asparagine tự do phản ứng với một gốc cacbonyl, tạo thành một Chiff Base Dưới tác dụng của nhiệt độ tạo ra quá trình decarboxyldecarboxylates Schiff Base tạo thành decarboxyllates Schiff Base Chất này tiếp tục tham gia phản ứng theo một trong hai cách: (1) thủy phân để tạo thành 3-aminopropionamide, sau đó loại bỏ ammoniac để tạo thành acrylamide ở nhiệt độ cao (2) Decarboxylated Schiff Base có thể phân hủy trực tiếp tạo thành acrylamide bằng cách loại bỏ một amin (hình 1.1)

(David et al., 2003) Một số cơ chế hình thành acrylamide khác cũng đã được

đưa ra Tuy nhiên, các cơ chế này chưa được đánh giá một cách đầy đủ (Claus

et al., 2008) Cơ chế này cho thấy sự hình thành acrylamide là từ tiền chất như axit acrylic, acrolein hay do phản ứng giữa axit amin khác (ví dụ: alanine, arginine, cysteine,…) với các loại dường khác (galactose, lactose, sucrose)

Hình 1.1 Cơ chế hình thành acrylamide trong thực phẩm

(David et al., 2003)

1.1.3 Mức độ nhiễm acrylamide trong thực phẩm

Sự lo ngại về acrylamide trong thực phẩm đã thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới Acrylamide trong các loại thực phẩm với hàm lượng khác nhau Các nhà nghiên cứu đã đưa ra số liệu về hàm lượng acrylamide trong một sồ loại thực phẩm như sau: khoai tây chiên 600 - 4300 µg/kg, bánh bích quy 100 - 750 µg/kg, bánh mì 50 - 4000 µg/kg, ngũ cốc 50 -

1350 µg/kg; tuy nhiên hàm lượng dao động trong khoảng không phát hiện đến 3,5 mg/kg sản phẩm Mức độ nhiễm acrylamide trong trong một số sản phẩm thương mại cũng đã được Ủy ban Châu Âu báo cáo: bánh mì gừng lên tới

7834 µg/kg, trung bình là 303 µg/kg; trong bánh bích quy 3324 µg/kg, trung bình là 145 µg/kg và ở bánh mì 2838 µg/kg, trung bình là 244 µg/kg

(Hendriksen et al., 2009)

Các nhà nghiên cứu nhận thấy acrylamide trong thực phẩm giàu protein được chế biến ở nhiệt độ cao là thấp (5 - 50 µg/kg); phát hiện với liều cao ở thực phẩm giàu carbohydrat (trung bình 150 - 4000 µg/kg) và không được tìm thấy trong các loại thực phẩm chưa qua chế biến và thực phẩm luộc (Lingnert

et al., 2002) Các phát hiện này đã gây nên một làn sóng lo lắng và tranh luận trong cộng đồng y tế cũng như toàn thể người tiêu dùng Một loạt các hoạt động nghiên cứu quốc tế về phạm vi phơi nhiễm acrylamide, nguồn gốc của acrylamide trong thực phẩm, mức độ nguy hại của acrylamide tới sức khỏe con người và cách thức giảm liều lượng acrylamide trong thực thẩm đã được triển khai

Bảng 1.1 Hàm lượng acrylamide trong một số thực phẩm

(Gharbia et al., 2004)

Thực phẩm

Hàm lượng acrylamide (µg/kg) Trung

bình

Trung vị Mức thấp -

cao nhất

Số lượng mẫu

1.1.4 Phương pháp giảm acrylamide trong sản xuất bánh nướng

Do việc loại bỏ acrylamide khỏi thực phẩm đã được xử lý nhiệt là không thực tế, do vậy các nhà nghiên cứu thường quan tâm đến hướng làm giảm sự hình thành acrylamide trong quá trình chế biến thực phẩm có hàm lượng tinh

bột cao (Vinci el al., 2011; Claus el al., 2008; Friedman and Levin, 2008), cụ

thể như sau:

a, Lựa chọn giống khoai tây, nhũ cốc có hàm lượng tiền chất của acrylamide như asparagine và glucose thấp Hàm lượng asparagine trong ngũ cốc cũng biến đổi phụ thuộc vào độ màu của đất, chế độ chăm bón…Bột lúa mì của cây trồng trong điều kiện đất thiếu sulfat có hàm lượng asparagine cao 2600-5200 µg/kg

b, Loại bỏ các tiền chất trước khi chế biến: Sodium bicarbonate (NH4HCO3) tăng lượng acrylamide hình thành trong bánh ngọt Lượng acrylamide giảm khi thay thế chất này bằng NaHCO3

c, Lựa chọn phương pháp chế biến (pH, nhiệt độ, thời gian chế biến và môi trường bảo quản) Tránh nướng bánh quá lâu ở nhiệt độ cao vì lượng acrylamide hình thành có mối tương quan với thời gian và nhiệt độ nướng bánh PH thấp trong bột nướng bánh cũng làm giảm sự hình thành acrylamide Kéo dài thời gian lên men bột nướng cũng làm giảm lượng acrylamide (77-87%) vì trong quá trình lên men asparagine bị chuyển hóa thành các sản phẩm khác Bảo quản lạnh thường tăng hàm lượng đường trong

củ nên lượng acrylamide tăng

d, Bổ sung các thành phần thực phẩm (axit hữu cơ, axit amin, chất chống oxy hóa, cacbonhydrat không khử, chitosan, hợp chất từ tỏi, protein và muối kim loại) Axit min giúp giảm lượng acrylamide như lysine (88), glycine (91), glutamine (70), alanine (50)…Đường khử là tiền chất cho acrylamide (mật ong, fructose, glucose) do đó thay thế chúng bằng đường không khử như

sucrose và trehalose Muối kim loại: Ca2+, Fe3+, Na+ ngăn cản sự hình thành

các chất trung gian dẫn tới hình thành acrylamide (Kukurová et al., 2009)

e, Vi khuẩn lactic

Các nhà nghiên cứu Thụy Điển đã tìm ra phương pháp hạn chế sự hình thành acrylamide trong quá trình sản xuất khoai tây và cà phê bằng cách sử dụng vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic sẽ loại bỏ các hợp chất đường nên ức

chế sự hình thành acrylamide (Blom et al., 2002) Bằng hàng loạt các thí

nghiệm, các nhà nghiên cứu chỉ ra rằng, chỉ cần ngâm thực phẩm vào môi trường chứa vi khuẩn lactic 10-15 phút trước khi chiên, nướng có thể giảm sự hình thành acrylamide đến 90% trong sản phẩm cuối cùng

f, Sử dụng asparaginase để thủy phân asparagine thành axit aspartic và amoni

Có nhiều phương pháp để giảm lượng acrylamide trong thực phẩm Phần lớn các phương pháp mặc dù có làm hạn chế sự hình thành acrylamide nhưng lại ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan của sản phẩm Bổ sung asparaginase trong quá trình sản xuất bánh là phương pháp đơn giản và hiệu quả để giảm lượng acrylamide mà không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Bên cạnh

đó, chế phẩm sinh học là asparaginase hoàn toàn không gây độc cho người sử dụng vì nó sẽ bị mất hoạt tính trong quá trình chế biến (DSM Food

Specialties, 2006; Hendriksen et al., 2009)

1 2 Giới thiệu chung về asparaginase

1.2.1 Sự phân bố của asparaginase trong tự nhiên

Asparaginase (L- asparaginase amidohydrolase) là enzym thủy phân L- asparagine thành axit aspartic và amoniac Asparaginase có mặt trong giới thực vật, động vật và vi sinh vật Ở thực vật, phần lớn các nghiên cứu về asparaginase từ cây đậu Ở động vật, enzym này được tìm thấy trong gan gà

(Clemanti et al., 2009) Việc sản xuất asparaginase từ vi sinh vật đã được

nghiên cứu từ năm 1972 Asparaginase được sinh ra từ rất nhiều loại vi sinh

vật khác nhau như Escherichia coli, Serretia marcescens, Pseudomonas

aeruginosa, Aerobacter aerogens, Aeromanas hydrophila, Erwinia amylovora, Bacillus subtinis (John et al., 1970; Mukherjee et al., 2000;

Sarhan et al., 2004) Nấm mốc và nấm men cũng có khả năng sinh

asparaginase như Aspergillus niger, A oryzae, A tamari, A terreus,

Penicillium granulatum, P digitatum, Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae (Broome et al., 1965; Wriston et al.,1964)

1.2.2 Đặc điểm cấu tạo và tính chất của asparaginase

1.2.2.1 Đặc điểm cấu tạo của asparaginase

Với mỗi nguồn gốc khác nhau, asparaginase có cấu trúc phân tử và tính chất đặc hiệu cơ chất khác nhau Tuy nhiên, chỉ có L - asparaginase chiết xuất

từ Escherichia coli, Erwinia chrysanthemy được sử dụng trong điều trị ung thư, nhất là asparaginase chiết tách từ Escherichia coli

Hình 1.2 Cấu tạo của asparaginase chiết tách từ Escherichia coli

(Chanches et al., 2007) Escherichia coli gồm có 2 loại asparaginase Asparaginase loại I được

định vị trong cytosol Asparaginase loại II được định vị trong vùng periplasmic của vi khuẩn và có tính đặc hiệu với L - asparaginase cao hơn

asparaginase loại I Do vậy, asparaginase loại II được sử dụng để điều trị ung thư bạch cầu cấp dòng lympho Asparaginase loại II có khối lượng phân tử khoảng 140 kDa, là một homotetramer gồm có 4 tiểu phân có cấu trúc khác nhau (A, B, C, D) và có 222 cấu trúc đối xứng, mỗi tiểu phân có khoảng 330 acid amin Các tiểu phân tương tự về mặt cấu trúc L - asparaginase loại II có

4 trung tâm hoạt động hoạt động độc lập với nhau Hai tiểu phân A, C và B, D tạo thành 1 dimer, mỗi dimer của tetramer và cấu trúc tetramer là một điều kiện thiết yếu để enzym hoạt động

1.2.2.2 Tính chất của asparaginase

Asparaginase có thể được tổng hợp nội bào hoặc ngoại bào, hầu hết chủng các sản sinh ra asparaginase ngoại bào thuộc nấm sợi Asparaginase sinh ra từ vi sinh vật khác nhau có khối lượng phân tử khác nhau: từ 40 - 200 kDa Tính chịu nhiệt của asparaginase khác nhau thường khác nhau

Asparaginase của một số vi khuẩn như là P earuginosa 50071, P stutzeri

MB - 405, Erwinia carotovoca và P aeruginosa hoạt động tối ưu ở 37oC,

trong khi asparaginase của Chrombacteriaceae có nhiệt độ tối ưu chỉ là 20oC

Asparaginase từ A oryzae hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ từ 15oC đến

70oC, đạt cực đại ở 60oC Tính bền của asparaginase từ A oryzae chỉ đạt được

trong 2 giờ ở 37oC, pH 4 - 8, hầu như không bị bất hoạt ở nồng độ muối cao

Asparaginase từ A niger có hoạt tính trong dải nhiệt độ từ 20 - 65, nhiệt độ

tối ưu khoảng 50oC và bị bất hoạt rất nhanh khi nhiệt độ trên 70oC

Bảng 1.2 Đặc điểm sinh hóa của asparaginase từ vi sinh vật

(Devarai and Kota, 2012; Hendriksen et al., 2009; DSM Food Specialties,

2006)

Khối lượng phân tử (kDa)

Km : hằng số Michaelis-Menten

1.2.3 Cơ chế xúc tác của asparaginase

Các nhà khoa học trên thế giới đã giải thích tác động của enzym asparaginase để giảm lượng acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh bích

quy là do sự thủy phân axit amin asparagine Enzym asparaginase sẽ xúc tác thủy phân axit amin asparagine thành axit aspartic và amoni, do đó không cho asparagine tham gia vào phản ứng Maillard để hình thành acrylamide Việc

bổ sung chế phẩm sinh học này không làm ảnh hưởng đến tính chất cảm quan của bánh bích quy vì vẫn còn những axit amin khác tham gia phản ứng Maillard để tạo màu vàng cho bánh mà không sinh ra các hợp chất gây ung thư như acrylamide Phản ứng thủy phân L-asparagine được xúc tác bởi asparaginase gồm 2 bước như sau:

• Bước 1: Ban đầu, một nucleophile được kích hoạt thông qua một cầu nối liên kết hydro OH…B với gốc base liền kề Sau đó, nguyên tử C của amide bị tấn công dẫn đến hình thành một chất trung gian là acyl-enzym (chuyển tiếp tứ diện) Sự ổn định tích điện âm trên nguyên tử O trong nhóm amide là do lỗ hổng oxyanion hình thành nhờ tương tác với chất cho liên kết hydrogen liền kề (các nhóm N-H chuỗi chính) Kết thúc bước 1, một phân tử NH3 được tạo ra

• Bước 2: Phản ứng xảy ra như bước 1, tuy nhiên có điểm khác là nguyên tử

C ở nhóm ester asparagine bị tấn công bởi một nucleophile ưa nước Kết thúc phản ứng, một phân tử L-aspartate được tạo ra

Hình 1.3 Cơ chế chung của phản ứng xúc tác bởi asparaginase

1.3 Nghiên cứu ứng dụng của enzyme asparaginase

1.3.1 Ứng dụng trong y học

Asparaginase được ứng dụng trong sản xuất thuốc điều trị bệnh bạch cầu cấp (kể cả trường hợp bệnh bạch cầu mãn chuyển sang cấp), đặc biệt là bệnh bạch cầu cấp dòng lympho Asparaginase thủy phân asparagine là một acid amin thiết yếu trong huyết thanh, do đó làm mất đi một yếu tố cần thiết

để tổng hợp protein của các tế bào lympho ác tính Trong bệnh bạch cầu cấp, đặc biệt bệnh bạch cầu cấp dòng lympho, tế bào ác tính phải phụ thuộc vào nguồn asparagine từ bên ngoài để tồn tại; còn các tế bào bình thường lại có thể tổng hợp được asparagine và do đó bị ảnh hưởng ít hơn khi thiếu asparagine do điều trị asparaginase Sự suy giảm asparagine dẫn đến thiếu dinh dưỡng và làm ức chế sinh tổng hợp protein, dẫn đến tế bào bạch cầu limpho T bị chết (Avramis and Tiwari, 2006)

Tính chất ức chế khối u của asparaginase được phát hiện vào những năm 1950 khi các nhà khoa học quan sát thấy khối u limpho trong chuột đã suy thoái sau khi điều trị với huyết thanh trong chuột lang Sau đó người ta phát hiện do asparaginase chứ không phải là huyết thanh tác động làm suy thoái khối u Những nghiên cứu sử dụng asparaginase trong điều trị ung thư bạch cầu ác tính đã giúp kéo dài sự sống của bệnh nhân trong 20-30 năm qua Asparaginase là nền tảng của tất cả các phương pháp điều trị kể từ cuối những năm 1970 Hiện nay, asparaginase đã được nghiên cứu và sản xuất bằng công nghệ DNA tái tổ hợp đã cho hiệu suất cao hơn và tương đương sinh học với asparaginase tự nhiên

1.3.2 Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Asparaginase được ứng dụng trong sản xuất thuốc điều trị bệnh bạch cầu cấp (kể cả trường hợp bệnh bạch cầu mãn chuyển sang cấp), đặc biệt là bệnh bạch cầu cấp dòng lympho Ung thư bạch cầu cấp dòng lympho là căn bệnh phổ biến nhất trong tất cả các loại ung thư ở trẻ em Hàng năm ở Hoa

Kỳ có khoảng 2400 trẻ em và thiếu niên dưới độ tuổi 20 được chẩn đoán mắc căn bệnh này Ở Việt Nam, năm 2009 có khoảng 1163 ca mắc bệnh Số lượng bệnh nhân đang tăng nhanh trong những năm gần đây ở trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng Asparaginase thủy phân asparagine là một acid amin thiết yếu trong huyết thanh, do đó làm mất đi một yếu tố cần thiết để tổng hợp protein của các tế bào lympho ác tính Trong bệnh bạch cầu cấp, đặc biệt bệnh bạch cầu cấp dòng lympho, tế bào ác tính phải phụ thuộc vào nguồn asparagine từ bên ngoài để tồn tại; còn các tế bào bình thường lại có thể tổng hợp được asparagine và do đó bị ảnh hưởng ít hơn khi thiếu asparagine do điều trị asparaginase Sự suy giảm asparagine dẫn đến thiếu dinh dưỡng và làm ức chế sinh tổng hợp protein, dẫn đến tế bào bạch cầu limpho T bị chết (Avramis and Tiwari, 2006)

Tính chất ức chế khối u của asparaginase được phát hiện vào những năm 1950 khi các nhà khoa học quan sát thấy khối u limpho trong chuột đã suy thoái sau khi điều trị với huyết thanh trong chuột lang Sau đó người ta phát hiện do asparaginase chứ không phải là huyết thanh tác động làm suy thoái khối u Những nghiên cứu sử dụng asparaginase trong điều trị ung thư bạch cầu ác tính đã giúp kéo dài sự sống của bệnh nhân trong 20-30 năm qua Asparaginase là nền tảng của tất cả các phương pháp điều trị kể từ cuối những năm 1970 Hiện nay, asparaginase đã được nghiên cứu và sản xuất bằng công nghệ DNA tái tổ hợp đã cho hiệu suất cao hơn và tương đương sinh học với asparaginase tự nhiên

Trong công nghiệp thực phẩm, asparaginase được sử dụng như là chất phụ gia bổ sung vào quá trình chế biến thực phẩm nhằm giảm sự hình thành acrylamide

Hãng Novozymes (Đan Mạch) và DSM đã sản xuất và thương mại hóa thành công asparaginase tái tổ hợp từ các chủng nấm sợi biến đổi gen tương ứng A oryzae và A niger để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm nhằm giảm sự hình thành acrylamide trong thực phẩm Tên thương mại của sản

phẩm asparaginase từ A oryzae là Acrylaway@, còn asparaginase từ A niger

là PreventASeTM Hiện nay các sản phẩm này được cấp phép sử dụng ở Mỹ,

Úc, New Zealand, Đan Mạch, Canada,…Asparaginase tái tổ hợp được tiết ra ngoài môi trường ở quy mô nhỏ với hoạt tính ezym là 14,28 APSU/g, còn ở quy mô công nghiệp là 3500 APSU/g

Nghiên cứu của các nhà khoa học tại Đại học Unide, Italya hợp tác với các nhà khoa học tại Ireland (2010) đã cho kết quả hết sức khả quan về việc

sử dụng asparaginase để giảm sự hình thành acrylamide trong bánh bích quy Hàm lượng bổ sung enzym vào công thức làm bánh từ 100 ASPU/kg đến 900 ASPU/kg bột mì Sau khi trộn tất cả các thành phần với nhau, khối bột được để ổn định nhằm tạo điều kiện cho enzym hoạt động Kết quả cho

thấy, mẫu bích quy có hàm lượng 500 ASPU/kg bột mỳ được nướng ở nhiệt

độ vừa phải (tức là thấp hơn nhiệt độ nướng bánh thông thường là 180oC)

làm giảm acrylamide tốt nhất (Monica et al., 2011) Nghiên cứu ứng dụng

chế phẩm trong mô hình chế biến bánh quy cho thấy với liều enzym bổ sung

là 100 APSU/kg bột mì và 500 APSU/kg bột mì đã cho hiệu quả giảm asparagine trong bội nhào lên tới 96% và 97% so với mẫu đối chứng

(Kukurová et al., 2009) Liều sử dụng asparaginase đối với một số thực

phẩm đã được hãng Novozymes (Novozymes, 2006) đưa ra như sau: Đối với khoai tây (khoai tây chiên, khoai tây chiên cắt nát mỏng) cần liều lượng xấp xỉ 2000 APSU/kg; sản phẩm có nguồn gốc từ bột cần liều sử dụng từ

200 - 2000 APSU/kg bột mì, tương ứng 60 - 700 mg chế phẩm Acrylaway@trên 1 kg bột mì Công ty DSM đã khuyến cáo lượng enzym cần sử dụng phụ thuộc vào chất lượng của từng loại nguyên liệu, hàm lượng asparagine, thời gian và nhiệt độ áp dụng trong quá trình làm bánh Đối với bánh làm từ bột mì thì cần sử dụng asparaginase với liều từ 77 - 385 U/kg bột mì, còn bánh làm từ bột ngũ cốc như bột ngô thì cần liều dùng 20 - 850 U/kg bột và

từ bột khoai tây thì liều dùng cần là 500 - 15000 U/kg Khi bổ sung asparaginase vào bột mì ướt đã cho thấy hàm lượng acrylamide trong vỏ bánh mì giảm từ 36% đến 75% Ngoài ra sự hình thành acrylamide từ các sản phẩm bánh bích quy, bánh nướng, bánh đậu phộng đã giảm tới trên 80% sau khi bổ sung asparaginase vào bột nguyên liệu trước khi nướng bánh Hơn thế nữa, các sản phẩm từ bột khoai tây đã được phát hiện có hàm lượng acrylamide rất cao, lên tới 2500 ppb, nhưng sau khi bổ sung asparaginase vào bột khoai tây ướt đã giảm trên 80% lượng asparagine tự do Sau quá trình nướng, asparaginase bị mất hoàn toàn hoạt tính, dư lượng chất rắn hữu

cơ trong sản phẩm thực phẩm sau cùng là từ 2 - 13 mg/kg (0,0002 - 0,00013%) đối với bánh mì; 0,2 - 30 mg/kg (0,00002 - 0,003%) đối với các sản phẩm có nguồn gốc từ ngũ cốc; 4 - 526 mg/kg (0,0004 - 0,0562%) đối

các loại gia vị Asparaginase có mặt trong thực phẩm ở hàm lượng thấp được xem như là các protein không hoạt động và không gây hại cho người

sử dụng (DMS Food specialties)

1.4 Nguyên liệu và quy trình công nghệ sản xuất bánh bích quy

1.4.1 Nguyên liệu

* Bột mì

Bột mì là nguyên liệu chính để sản xuất bánh bích quy, chiếm cao nhất

87,5% (Thomas et al., 2004) và được chế biến từ hạt lúa mì Bột mì được

phân ra thành nhiều hạng bột khác nhau: bột mì hảo hạng, bột mì hạng 1, hạng 2 và hạng 3

Bảng 1.3 Phân loại bột mì Loại bột Chỉ tiêu cảm quan Hàm lượng gluten

(%)

Loại thượng hạng Màu trắng hoặc trắng

ngà, vị hơi ngọt

30

sản sinh ra acrylamide (Kukurová et al., 2009; Claus et al., 2008; Zyzak et al., 2003; Lingnert et al., 2002) Tiền chất chủ yếu tạo thành acrylamide là asparagine và các đường khử, mạnh mẽ nhất là glucose và fructose (Claus et

al , 2008; Lingnert et al., 2002) Trong công thức làm bánh bích quy thì bột

mì là nguồn asparagine chính, chiếm cao nhất 87,5% (Thomas et al., 2004)

Hàm lượng asparagine trong các loại bột mì là khác nhau, phụ thuộc giống và

quá trình xay xát (Kukurová et al., 2009) Lượng asparagine trong bột mì đen

từ 319 đến 791 mg/kg (Hamlet et al., 2008), trong bột mì trắng là 56,14 đến

664 mg/kg (Kumar et al., 2014; Kukurová et al., 2009; Hamlet et al., 2008; Thomas et al., 2004; Fredriksson et al., 2004; Prieto et al., 1990; Tkachuk,

1979)

* Đường

Trong sản xuất bánh, đường được dùng chủ yếu là saccarose Đường có ảnh hưởng tới tính chất lý hóa của bột nhào, làm cho bột nhào trở lên ướt, mềm Ngoài việc tạo vị ngọt, đường còn góp phần tạo cấu trúc, màu sắc, hương vị thơm cho sản phẩm bánh nướng Đường là nguồn cung cấp nguyên liệu cho phẩn ứng Maillard, phản ứng caramel, là nguồn dưỡng chất và cơ chất cho nấm men và enzym lên men tạo khí CO2

%) nên được coi là tác nhân tạo độ cứng chắc, chúng góp phần làm hình thành gluten và hồ hóa tinh bột

Lòng trắng trứng tạo bọt, hỗ trợ tạo gel làm tăng độ nở xốp của sản phầm, tạo độ cứng chắc khá rõ nét bởi protein trứng (albumin) sẽ biến tính ở nhiệt độ cao, tạo cấu trúc cứng chắc cho sản phẩm bánh nướng

Lòng đỏ trứng có tác dụng làm mềm bánh bởi lượng chất béo có trong

nó Màu đỏ trứng phụ thuộc hàm lượng carotenoid trong trứng, màu của lòng

đỏ trứng cũng có ảnh hưởng tới màu sản phẩm khi nướng

* Bơ

Bơ được thu nhận từ váng sữa và có hàm lượng béo cao (trên 80%) Bơ

là thực phẩm có chứa hàm lượng đạm cao và cơ thể dễ hấp thụ Trong thành phần của bơ có nhiều chất cần thiết giúp nó ở lại lâu trong dạ dày và từ từ cung cấp năng lượng cho cơ thể

* Dầu

Tạo mùi vị đặc trưng cho bánh nướng làm mềm bánh nướng và tạo cảm giác tan trong miệng, thúc đẩy phản ứng Maillard, tạo cấu trúc nở xốp cho bánh do tạo màng mỏng bao trùm và bôi trơn các hạt tinh bột làm bền bọt khí

* Sữa

Trong sản xuất bánh thường dùng sữa bột hay sữa đặc có đường Sữa có

vai trò tạo mùi đặc trưng cho bánh, thúc đẩy phản ứng Maillard và tăng giá trị dinh dưỡng cho bánh

* Bột nở

Bột nở là nhóm các muối vô cơ được cho thêm vào trong bánh, làm cho

những chiếc bánh nở phồng và hấp dẫn hơn Khi nướng bánh ở nhiệt độ cao, thuốc nở bị phân hủy sinh ra khí CO2 thoát ra nên tạo lỗ hổng trong ruột bánh Bột nở thường dùng là natri bicarbonat (NaHCO3) và amoni carbonat (NH4)2CO3

2NaHCO3 Na2CO3 + H2O + CO2

(NH4)2CO3 2NH3 + H2O + CO2

Để tạo bột nhào ta sử dụng máy nhào trộn bột Đây là khâu quan trọng vì

không đảm bảo đúng công thức thì ảnh hưởng đến độ xốp và chất lượng của bánh cookie Vì vậy, khi cân đong nguyên liệu không được nhầm lẫn đồng thời trong quá trình nhào phải đảm bảo chế độ kỹ thuật nhào như nhiệt độ, độ

ẩm Độ ẩm bột nhào bánh bích quy là 26%, nhiệt độ bột nhào: nhiệt độ thường 32 - 40oC

Mục đích nhào bột là tạo nên khối bột nhào đồng nhất về cấu trúc, màu

sắc và sự phân bố Bột trước khi đem nhào phải được rây trước để tách tạp chất, sau đó trộn đều với bột nổi, muối Bơ sau khi đánh chảy ra cho đường vào đánh nổi, cho trứng gà đã đánh nổi vào tạo thành một dịch nhũ tương Sau

đó đổ dịch nhũ tương vào đống bột nhào, nhào bằng máy yêu cầu chỉnh máy chế độ ổn định, bột mịn là được Đóng vai trò chính tạo ra bột nhào là nhờ

protein của bột mì, đó chính là glyadin và glutenin Protein là hợp chất cao phân tử ưa nước Do có các nhóm carboxyl và amin trong phân tử nên protein

có đặc tính lưỡng tính nghĩa là có thể tạo ra muối với acid và muối với kiềm Protein có khả năng trương nở trong nước lạnh và giữ ẩm lượng nước khá lớn Khi nhào bột mì, nếu đủ lượng nước thì glyadin và glutenin sẽ tạo ra những sợi chỉ mỏng và màng mỏng dính các hạt tinh bột thấm nước lại với nhau Khung gluten này làm cho bột nhào có tính dẻo, đàn hồi

Sau khi nhào, tiến hành ủ bột, mục đích là để gluten trương nở triệt để

3 Nặn tạo hình

Cho bột nhào thiết bị nặn tạo hình bánh Vòi nặn của dụng cụ tạo hình có

hoa văn để tạo hình Bột nhào được nặn tạo hình lên trên một cái khay, trên khay có đặt sẵn lớp giấy đã phết dầu, giúp cho bánh không bị dính trong quá trình nướng

4 Nướng

Bật lò nướng bánh, để khay vào lò trước cho nóng khay Chuyển bánh đã

định hình vào khay nướng Nhiệt độ nướng: 140 -160oC Thời gian nướng: 10 -15 phút Do định hình bánh bằng tay không đều nên trong quá trình nướng phải chú ý trở khay bánh, điều chỉnh nhiệt độ tránh bánh bị cháy khét

5 Làm nguội

Sau khi ra khỏi lò nướng, nhiệt độ của bánh còn cao, bánh đang mềm

Phải để nguội đến khi nhiệt độ còn 70oC, tách bánh ra khỏi khay và làm nguội đến nhiệt độ bình thường Bánh có cấu trúc xốp mao quản, do đó chúng hút

ẩm của không khí xung quanh, nên cần phải chuyển ngay vào bao gói

6 Bao gói

Có thể bao gói trong bao bì polyetylen Sau đó dùng máy ghép mí dàn

kín bao lại Đóng thùng carton với trọng lượng 4 kg Bảo quản ở nhiệt độ phòng, nơi khô ráo

1.5 Thông tin về chế phẩm asparaginase của đề tài

1.5.1 Công nghệ sản xuất asparaginase tái tổ hợp

Khả năng làm tăng protein ngoại lai (asparaginase) trong P pastoris

SMD1168 được tiến hành theo hai hướng: (1) tối ưu một phần mã hiếm trong

gen mã hóa asparaginase của A oryzae để phù hợp hơn với chủng nấm men Gen này được ký hiệu là asp1 Theo đó, chỉ ba nucleotide trên trình tự gen

được thay đổi mà vẫn giữ nguyên trình tự axit amin (2) tối ưu toàn bộ gen asparaginase để phù hợp với chủng nấm men, chỉ số phù hợp CAI (codon

adaptation index) đạt 80% Gen này được ký hiệu là asp2 Sau khi biểu hiện trong nấm men P pastoris SMD1168 và Saccharomyces cerevisiae KY117, chúng tôi đã lựa chọn được P pastoris SMD1168 mang gen asp2 (ký hiệu là

P pastoris SMD1168-pPIC9asp2) cho kết quả biểu hiện cao nhất Đã nghiên cứu biểu hiện asparaginase trên 3 cặp môi trường (môi trường nhân giống/môi trường cảm ứng): MGY/MM; BMG/BMM; BMGY/BMMY Chọn được cặp môi trường BMGY/BMMY cho kết quả ổn định Đã nghiên cứu biểu hiện asparaginase trên cặp môi trường trên với thành phần YNB của hãng và YNB cải biến (sử dụng hóa chất có sẵn để pha YNB cải biến dựa trên thành phần YNB của hãng) Kết quả cho thấy thành phần YNB cải biến không ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của chủng, protein biểu hiện trong môi trường có YNB cải biến cho hoạt tính cao hơn so với môi trường YNB của hãng Đã nghiên cứu

biểu hiện asparaginase trong P pastoris với các nồng độ chất cảm ứng

methanol 0,5%/ngày, 1%/ngày, 1,5%/ngày, cảm ứng liên tục 4 giờ/lần Kết quả cho thấy cảm ứng liên tục 4 giờ/lần có protein asparaginase được biểu hiện cao nhất Đã nghiên cứu thu hồi asparaginase từ dịch lên men bằng phương pháp thẩm tích, tủa protein bằng amonium sulphate + thẩm tích loại muối và lọc tiếp tuyến + cô đặc mẫu Đã lựa chọn lọc tiếp tuyến cô đặc mẫu cho thu hồi asparaginase

Đề tài đã nghiên cứu sản xuất asparaginase tái tổ hợp từ P pastoris

SMD1168-pPIC9asp2 trên hệ thống lên men chìm sục khí quy mô 5 lít và 100

lít

1.5.2 Đặc điểm kĩ thuật của chế phẩm

Chế phẩm enzym asparaginase được sản xuất từ P pastoris pPIC9asp2 tái tổ hợp với chỉ tiêu chất lượng sau:

SMD1168 Hoạt độ aspaginase 3800 ASPU/g

- Tổng số vi khuẩn hiếu khí (cfu/g): < 5×104

1.5.3 Nghiên cứu sản xuất asparaginase để làm giảm lượng asparagine trong bột mì

Chế phẩm đã được đánh giá hiệu quả giảm asparagine tự do trong bột

mì Kết quả cho thấy hiệu quả giảm asparagine tự do trong bột mì phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như tỷ lệ enzym bổ sung, độ ẩm của khối bột, nhiệt độ và thời gian ủ

- Độ ẩm của bột mì là 20% thì hiệu quả giảm asparagine rất thấp, đạt 22,3% Hiệu quả giảm asparagine tăng lên đáng kể đạt 41,3% khi tăng độ ẩm bột

mì lên 30% Hiệu quả giảm asparagine đạt cao hơn cả, đạt 65,1 – 83,9% tại độ ẩm bột mì là 40 - 60%

- Với liều enzym bổ sung là 200, 500, 1000, 1500 và 2000 U/kg bột mì, hiệu quả giảm asparagine tăng dần, từ 47,4% - 88,1% Tuy nhiên, giữa các liều enzym 1000 U/kg bột mì, 1500 U/kg bột mì và 2000 U/kg bột mì, hiệu quả giảm asparagine khác nhau không đáng kể, theo thứ tự là: 83,1%; 86,2%; 88,1%

- Hiệu quả giảm asparagine tăng nhanh khi kéo dài thời gian ủ từ 10 phút đến 30 phút, cụ thể: sau 10 phút, 20 phút và 30 phút ủ ở 40oC, lượng asparagine giảm 28,6%; 525 và 83% theo thứ tự so với đối chứng Khi kéo dài thời gian ủ thì hiệu quả giảm asparagine không có sự khác biệt nhiều

so với thời gian ủ 30 phút

- Bổ sung asparaginase vào bột mì và ủ ở các nhiệt độ khác nhau thì hiệu quả giảm asparagine không giống nhau Hiệu quả giảm asparagine tăng dần từ 32,5% đến 87,8% khi nhiệt độ ủ tăng từ 20oC đến 45oC, đạt cực đại tại 45oC và có xu hướng giảm khi vượt quá 45oC

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Chế phẩm enzym asparaginase được sản xuất từ P pastoris

SMD1168-pPIC9asp2 tái tổ hợp do Bộ môn Công nghệ sinh học sau thu hoạch - Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch cung cấp Chế phẩm enzym có

hoạt độ aspaginase 3800 ASPU/g, độ ẩm < 7% Asparaginase hoạt động tốt

và bền ở pH 6-9, nhiệt độ 20-60oC và đạt cực đại tại 45oC, hoạt độ giảm đáng

kể khi nhiệt độ vượt quá 60oC và gần như bất hoạt khi nhiệt độ cao hơn

70oC.Chế phẩm đáp ứng chỉ tiêu vi sinh vật và kim loại nặng phù hợp với quy định đối với chế phẩm enzym sử dụng trong chế biến thực phẩm của Hội đồng chuyên gia về phụ gia thực phẩm (JECFA), FAO/WHO 2006 và Food Chemicals Codex, 2006)

- Nguyên liệu cho quá trình gồm có:

+ Bột mì La Bàn LP-1 (protein 8-10%, công ty TNHH Xay lúa mì VFM- WILMAR, Hạ Long)

+ Đường (Việt Nam)

+ Mạch nha (nhà máy đường Yên Hòa)

+ Muối (Công ty muối Thành Phát)

+ Sữa (New Zealand)

+ Bơ White Hawk (Malaysia)

+ Dầu Tường An (Việt Nam)

+ Bột nở (sodium bicarbonate, Tân Thuận Lợi)

2.1.2 Hóa chất

- Hóa chất cho xác định hàm lượng asparagine tự do: asparagine, đệm AccQ-Fluor Borate, thuốc thử AccQ-Fluor, methanol, acetonitrile, do hãng Sigma Aldrich (Mỹ) cung cấp

- Hóa chất cho xác định hàm lượng acrylamide: n-hexane, acetonitrile, MgSO4 khan, NaCl, chất chuẩn acrylamide, primary secondary amine (PSA), methanol,…do hãng Merck (Đức) cung cấp

- Máy li tâm (Hertich, Đức)

- Máy lắc Vortex (Labnet, Mỹ)

- Hệ thống máy sắc ký lỏng cao áp Alliance (Waters, Mỹ)

- Máy lắc Vortex (Labnet, Mỹ)

- Các dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm: hạt kê, ống hình trụ, đĩa peptri, ống nghiệm, ống eppendorf, pipet, cuvet, bình tam giác, ống đong, giấy lọc, đèn cồn, que cấy

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sản xuất bánh bích quy

Trong nghiên cứu này, bánh bích quy được sản xuất theo quy trình công

nghệ của Công ty TNHH Thực phẩm Thiên Thảo (Minh Khai – Hoài Đức –

Hà Nội) Mẫu thí nghiệm, enzym asparaginase được bổ sung vào bột nhào với

tỷ lệ 2000 – 3000 ASPU/kg bột mì Tóm tắt quy trình như sau:

Hình 2.1 Quy trình sản xuất bánh bích quy

Chuẩn bị nguyên liệu