Bước đầu nghiên cứu tạo magnesi lactat bằng cố định tế bào lactobacillus acidophilus

Ngoài tác dụng chữa bệnh, Magnesi lactat còn có vai trò qua trọng trong sản xuất Calci lactat, Acid lactic, Polylactid PLA, nhựa sinh học là những sản phẩm thông dụng không chỉ sử dụng t

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Bộ môn Công Nghiệp Dược

Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2016

LỜI CẢM ƠN Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành ThS Kiều Thị Hồng, người đã trực tiếp hướng dẫn, động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

Em cũng chân thành gửi lời cảm ơn tới TS Đàm Thanh Xuân cùng toàn thể thầy cô giáo và anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công Nghiệp Dược đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình làm khóa luận

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn để có thể hoàn thiện hơn nghiên cứu của mình

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Võ Thị Thúy Ngân

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 Vi khuẩn sinh acid lactic 3

1.1.1 Đặc điểm nhóm vi khuẩn sinh acid lactic 3

1.1.2 Chi Lactobacillus 3

1.1.3 Loài Lactobacillus acidophilus 4

1.2 Magnesi lactat 5

1.2.1 Đặc điểm 5

1.2.2 Công dụng 6

1.2.3 Một số sản phẩm lưu hành trên thị trường 6

1.3 Các phương pháp sản xuất Magnesi lactat 7

1.3.1 Phương pháp tổng hợp hóa học 7

1.3.2 Phương pháp vi sinh vật 8

1.4 Phương pháp bất động tế bào và ứng dụng 8

1.4.1 Nguyên tắc 8

1.4.2 Các phương pháp bất động tế bào 9

1.4.3 Ứng dụng của phương pháp bất động tế bào 10

1.5 Alginat 12

1.5.1 Cấu trúc của alginat 12

1.5.2 Tính chất của alginat 13

1.6 Các nghiên cứu về Magnesi lactat 14

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên liệu, hoá chất và thiết bị máy móc 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

khi cố định trên gel Calci alginat 18

2.2.2 Đánh giá khả năng tái sử dụng các tế bào L acidophilus khi cố định trên gel Calci alginat để sản xuất Magnesi lactat 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 19

2.3.2 Phương pháp tạo hệ gel cố định tế bào 19

2.3.3 Phương pháp lên men sinh tổng hợp Magnesi lactat 20

2.3.4 Phương pháp tách Magnesi lactat từ dịch lên men 20

2.3.5 Phương pháp pha loãng liên tục – tính số lượng vi khuẩn được cố định và rửa trôi trong quá trình lên men 21

2.3.6 Phương pháp tính hiệu suất tiêu thụ đường của vi khuẩn 22

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Khảo sát khả năng tổng hợp Magnesi lactat của tế bào L acidophilus khi cố định trên gel Calci alginat 24

3.1.1 Xác định lượng hạt cố định để lên men sản xuất Magnesi lactat theo phương pháp lên men mẻ 24

3.1.2 Đánh giá khả năng tổng hợp Magnesi lactat của tế bào L acidophilus khi cố định trong gel Calci alginat so với tế bào tự do 25

3.2 Đánh giá khả năng tái sử dụng các tế bào L acidophilus khi cố định trên gel Calci alginate để sản xuất Magnesi lactat 32

3.2.1 Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn L acidophilus được cố định và lưu giữ trong hệ gel Calci alginat trong quá trình nuôi cấy 32

3.2.2 Đánh giá khả năng tái sử dụng các tế bào L acidophilus khi cố định trên gel Calci alginate để sản xuất Magnesi lactat 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38

Tài liệu tham khảo

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

(American Type Culture Collection)

(1H - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy)

ứng dụng (International Union of Pure and Applied Chemistry)

(de Man, Rogosa, Sharpe)

(Mass spectrometry)

Tên bảng Trang

Bảng 3.1 Lượng hạt chứa tế bào vi khuẩn L acidophilus tương đương với

số lượng tế bào trong 15ml dịch nhân giống sau 24h

25

Bảng 3.2 Lượng Magnesi lactat tạo thành sau khi lên men L acidophilus

ở trạng thái tế bào tự do và cố định trong gel Calci alginat (g)

26

Bảng 3.3 Hiệu suất tiêu thụ đường và hiệu suất quá trình lên men của tế

bào L acidophilus tự do và cố định

28

Bảng 3.5 Lượng vi sinh vật cố định trong hạt gel Calci alginat tại các thời

điểm

32

Bảng 3.7 Hiệu suất tiêu thụ đường và hiệu suất quá trình lên men của tế

bào cố định L acidophilus

36

Bảng 3.8 Khối lượng hạt tế bào cố định L acidophilus tại các thời điểm 37

Tên hình vẽ và đồ thị Trang

Hình 1.4 Cấu trúc của β – D – Mannuronic acid và α – L – Guluronic

Hình 3.1 Biểu đồ so sánh khối lượng Magnesi lactat tạo thành sau 96h

lên men giữa tế bào cố định trên gel Calci alginat và tế bào tự do

27

Hình 3.4 Lượng MgCO3 bổ sung vào môi trường lên men tại các thời

điểm

31

Hình 3.5 Số lượng tế bào L acidophilus cố định trong 1g vi nang Calci

alginat sau các lần lên men

33

ĐẶT VẤN ĐỀ Magnesi là một trong những khoáng chất phổ biến cần thiết cho sự phát triển của con người [27], [41], [42], [48] Thiếu hụt Magnesi dẫn đến những thay đổi sinh hoá nghiêm trọng, là nguyên nhân gây ra bệnh lý về tim mạch, loãng xương, hen suyễn… [24], [30], [39], [47] Ngoài việc bổ sung Magnesi thông qua khẩu phần ăn hằng ngày, ngày nay, một số bệnh cần phải bổ sung Magnesi dưới dạng thuốc Sinh khả dụng của thuốc ở dạng muối Magnesi vô cơ được đánh giá là thấp hơn so với muối Magnesi hữu cơ [25], [33], [40], muối Magnesi lactat có sinh khả dụng là 41% [38] Ngoài tác dụng chữa bệnh, Magnesi lactat còn có vai trò qua trọng trong sản xuất Calci lactat, Acid lactic, Polylactid (PLA, nhựa sinh học) là những sản phẩm thông dụng không chỉ sử dụng trong ngành dược mà còn trong các ngành công nghiệp khác như công nghiệp thực phẩm, công nghệ chất dẻo [23], [34] Qua

đó có thể thấy được tính ứng dụng cũng như giá trị kinh tế cao của Magnesi lactat Trong các sản phẩm của công nghệ lên men vi sinh vật, acid lactic và muối lactat là những sản phẩm ra đời từ rất sớm và ứng dụng rộng rãi, vì thế

Lactobacillus acidophilus, một đại diện điển hình của nhóm vi sinh vật sinh lactic

được quan tâm nghiên cứu nhiều [1], [7] Mặc dù Magnesi lactat có tầm quan trọng

là vậy nhưng hiện nay các loại muối lactat nghiên cứu tổng hợp chủ yếu ở dạng muối Calci Cũng đã có những đề tài liên quan đến Magnesi lactat song sinh tổng hợp bằng phương pháp bất động tế bào còn là một vấn đề khá mới mẻ mặc dù đã có những vượt trội của phương pháp này được ghi nhận như sản phẩm thu được tinh khiết hơn so với lên men các tế bào tự do, các tế bào vi sinh vật cố định sau khi lên men có thể thu hồi, tái sử dụng và đặc biệt là có thể sản xuất liên tục trong các quy trình tự động hoá [5]

Bởi tính ứng dụng cao của Magnesi lactat và ưu điểm của phương pháp bất động

tế bào, chúng tôi lựa chọn đề tài:

“Bước đầu nghiên cứu tạo Magnesi lactat bằng cố định tế bào Lactobacillus

acidophilus”

Với những mục tiêu sau:

- Khảo sát khả năng tổng hợp Magnesi lactat của tế bào Lactobacillus acidophilus

khi cố định trên gel Calci alginat

- Xem xét khả năng tái sử dụng các tế bào Lactobacillus acidophilus khi cố

định trên gel Calci alginat để sản xuất Magnesi lactat

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Vi khuẩn sinh acid lactic

1.1.1 Đặc điểm nhóm vi khuẩn sinh acid lactic

Vi khuẩn sinh lactic gồm các trực khuẩn hay cầu khuẩn Gram (+), tỉ lệ GC (guanin và cystein) thấp, chịu được acid, thường không sinh nha bào, kị khí hoặc vi hiếu khí, được phân nhóm dựa vào đặc điểm chung trong quá trình trao đổi chất và các đặc tính sinh lý Ban đầu, các vi khuẩn này được tìm thấy trong thực vật đã phân hủy và các sản phẩm của acid lactic Điểm chung lớn nhất của vi khuẩn nhóm này là sự lên men hydratcarbon sinh ra acid lactic là sản phẩm trao đổi chất cuối cùng [2], [32]

Vi khuẩn sinh lactic chủ yếu thuộc 4 chi: Lactobacillus, Pediococcus,

Streptococcus, Leuconostoc; ngoài ra có một số loài nấm thuộc chi Rhizopus [1]

Hình dạng và kích thước của vi khuẩn sinh lactic rất đa dạng và phức tạp: hình cầu, hình oval, hình que, mọc đơn, mọc đôi hoặc mọc thành chuỗi

Sinh lý của vi khuẩn lactic khá giống nhau, chúng là các vi khuẩn Gram (+), không tạo bào tử, hầu như không di động, ưa nhiệt, là vi khuẩn yếm khí hoặc vi hiếu khí, sử dụng năng lượng từ phân giải glucid và tiết ra acid lactic Chúng phát triển và tồn tại tốt ở pH thấp (4,5 – 6,8), nhiệt độ khoảng 10 – 500C [1], [2]

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn dị dưỡng nên môi trường dinh dưỡng tương đối phức tạp, giàu chất dinh dưỡng, gồm: các vitamin, các acid amin, các peptid ngắn… Chúng có khả năng đồng hóa nhiều loại đường: glucose, saccarose, lactose, mantose…, một vài loài cũng có khả năng sử dụng đường cao phân tử [1]

1.1.2 Chi Lactobacillus

Là chi lớn nhất trong các vi khuẩn sinh lactic với nhiều chủng đã được

nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất Chi Lactobacillus được phát hiện với hơn

125 loài, dựa vào sự chuyển hóa glucid trong tế bào và sản phẩm tạo ra trong quá trình lên men, chia thành 3 nhóm chính [2]:

 Nhóm 1: Nhóm vi khuẩn lên men đồng hình Đại diện: L acidophilus, L

bulgaricus, L delbrueckii…

 Nhóm 2: Nhóm vi khuẩn lên men dị hình không bắt buộc Đại diện: L

plantarum, L casei, L leichmenii…

 Nhóm 3: Nhóm vi khuẩn lên men dị hình bắt buộc Đại diện: L brevis, L

fermentum, L buchneri…

1.1.3 Loài Lactobacillus acidophilus

Loài L acidophilus thuộc giới vi khuẩn, ngành Fermicutes, lớp bacilli, bộ

lactobacilliales, họ lactobacillaceae, giống lactobacillus [2], [4]

L acidophilus là trực khuẩn Gram (+), dạng hình que, mọc đơn, mọc đôi hoặc tạo chuỗi ngắn, không sinh bào tử, không di động, phản ứng catalase âm tính; là vi

khuẩn ưa nhiệt, nhiệt độ tối ưu để phát triển là 37 – 450C, chịu được pH tương đối thấp (5 – 6); hô hấp hiếu khí và kị khí nhưng chủ yếu là kị khí; có khả năng chuyển hóa hydratcarbon cho sản phẩm là D (-), L (+) lactic [1], [2], [6]

L acidophilus là “probiotic”, chúng là các vi khuẩn có lợi trong hệ thống

tiêu hóa giúp chống lại vi khuẩn có hại gây bệnh, góp phần duy trì hệ vi khuẩn có

lợi L acidophilus được phân lập từ dịch ruột trẻ em và dịch ruột bê Hiện nay, L

acidophilus được sử dụng nhiều trong các chế phẩm men tiêu hóa như: Antibio,

Lactomin,… để điều trị các trường hợp rối loạn tiêu hóa ở trẻ mới ăn dặm hoặc do dùng kháng sinh dài ngày [7]

L acidophilus thuộc nhóm vi khuẩn lên men đồng hình, sản phẩm cuối cùng

là acid lactic được ứng dụng nhiều trong y – dược dưới các dạng muối như Calci lactat (dùng trong trường hợp thiếu calci hoặc nhu cầu cơ thể tăng như phụ nữ mang thai, phụ nữ cho con phú, trẻ em còi xương…), Magnesi lactat (tác nhân bảo vệ tim mạch, làm giảm nguy cơ tiểu đường ) ,… và cả trong ngành mỹ phẩm như dung dịch vệ sinh phụ nữ (Dạ hương, Lactacyd,…)

1.2 Magnesi lactat

1.2.1 Đặc điểm

 Công thức tổng quát: C6H10MgO6

 Tên khoa học (theo IUPAC): Magnesi 2 – hydroxyl propanoate

 Thành phần: C 35,60%, H 4,98%, Mg 12,01%, O 47,42%

 Khối lượng phân tử: 202,45g/mol

 Công thức cấu tạo: gồm cation Mg2+ và 2 anion lactat

Magnesi lactat là muối kết tinh của acid lactic với ion Mg2+, tồn tại trong tự nhiên dạng dihydrat (C6H10MgO6.2H2O) và trihydrat (C6H10MgO6.3H2O)

Cấu trúc không gian

Hình 1.3 Cấu trúc không gian của Magnesi (L-) lactat

 Tính chất: Magnesi lactat tồn tại dạng kết tinh màu trắng, không mùi, vị cay đắng, khó tan trong nước lạnh, tan tốt trong nước nóng (1g bột tan trong 25ml nước lạnh; 3,5ml nước nóng) và hơi tan trong ethanol 960 [26]

do thiếu hụt Nó tác động lên quá trình tăng trưởng, giống như vitamin D, giúp calci

và phospho cố định trên xương [12], [44]

- Magnesi lactat được kê cho phụ nữ có thai dùng một cách có hệ thống để điều trị đau tử cung trong thai kỳ [22]

- Magnesi lactat là tác nhân bảo vệ tim mạch, được sử dụng trong bệnh viện nhiều nhất trong các khoa cấp cứu bệnh nhồi máu [13], [18], [35]

- Magnesi lactat đóng vai trò quan trọng trong hoạt động chống lại các hiện tựợng được kết hợp với lão hóa [16], [43]

- Magnesi lactat cũng cần thiết cho quá trình phát triển và hoạt động bình thường của

tổ chức, đặc biệt liên quan đến chuyển hóa [49] và các hoạt động của não [45], [46], làm giảm nguy cơ mắc tiểu đường typ II, loãng xương, tăng huyết áp và tim mạch [50]

 Trong các ngành công nghiệp khác:

Trong sản xuất dược phẩm, Magnesi lactat là một tá dược trơn dùng trong dập viên,

tá dược điều chỉnh pH, điều vị… Magnesi lactat là tiền sản phẩm trong công nghiệp lên men sản xuất acid lactic, các muối lactat như Calci lactat Magnesi lactat còn được sử dụng rộng rãi để chế tạo các linh kiện điện tử, thiết bị kỹ thuật (máy tính xách tay, máy tính bảng…) [34]

1.2.3 Một số sản phẩm lưu hành trên thị trường

Bảng 1.1 Một số sản phẩm chứa Magnesi lactat trên thị trường

Magnesi lactat, Pyridoxin

Lek-AM, Poland Lek-AM,

Ba Lan

Magnesi lactat, Magnesi citrat

Recip, Thụy Điển

 Ưu điểm [5]: Dễ thu sản phẩm từ nhiều nguồn khác nhau (như Thủy phân α – halogenid acid từ acid α – cloropropionic, khử hóa ceton acid bằng hydro mới

sinh đi từ acid pyruvic, cộng hợp ái nhân với tác nhân HCN từ nguồn acetaldehyd), chi phí rẻ, sản phẩm có độ tinh khiết cao, thời gian ngắn

 Nhược điểm: Tổng hợp Magnesi lactat theo phương pháp này thường tạo dạng racemic Magnesi lactat, dung môi hóa chất sử dụng gây ô nhiễm môi trường Phương pháp được áp dụng rộng rãi tạo Magnesi lactat cho các ngành công nghiệp khác: tổng hợp chất phụ gia thực phẩm, chất dẻo, sản phẩm khác [34] 1.3.2 Phương pháp vi sinh vật

Cơ sở của phương pháp vi sinh vật là tiến hành lên men trong điều kiện kị khí hoặc vi hiếu khí với các chủng vi sinh vật sinh acid lactic Trong quá trình chuyển hóa các vi sinh vật nhờ có hệ enzym lactat dehydrogenase chuyển pyruvat thành acid lactic

Việc bổ sung các chất đệm Magnesi vào môi trường lên men dần dần hoặc ngay từ ban đầu sẽ tạo ra muối Magnesi lactat tan trong môi trường lên men Sau khoảng thời gian thích hợp tiến hành thu dịch lên men, xử lý dịch lên men, kết tinh

và tinh chế để thu sản phẩm Thực chất phương pháp lên men vi sinh vật tạo Magnesi lactat là quá trình lên men tạo acid lactic

Phương pháp sinh tổng hợp Magnesi lactat từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp tổng hợp hóa học như:

- An toàn với môi trường do các dư phẩm của quá trình được tận dụng để làm nguyên liệu cho thức ăn gia súc hoặc phân bón

- Nhiệt độ sản xuất thấp, năng lượng sản xuất thấp, thiết bị và quy trình sản xuất đơn giản, dễ áp dụng trong điều kiện kinh tế Việt Nam

- Tận dụng được các sản phẩm thừa của ngành thực phẩm, vậy nên giá thành sản phẩm rẻ

- Tạo được sản phẩm tinh khiết dạng Magnesi L – lactat [36]

1.4 Phương pháp bất động tế bào và ứng dụng

1.4.1 Nguyên tắc

Là phương pháp giữ hoặc cố định tế bào ở những vị trí xác định về mặt không gian mà không làm thay đổi hoạt tính xúc tác của chúng

Các tế bào này có thể sử dụng nhiều lần và sử dụng liên tục

1.4.2 Các phương pháp bất động tế bào

Có thể chia phương pháp bất động tế bào ra thành bốn phương pháp: phương pháp liên kết với chất mang, phương pháp liên kết ngang, phương pháp bẫy và kết

hợp các phương pháp trên [17]

 Phương pháp liên kết với chất mang

Bản chất của phương pháp liên kết với chất mang là phương pháp liên kết giữa các chất xúc tác sinh học với các chất mang không tan được trong nước thông qua liên kết đồng hóa trị, liên kết ion, hấp phụ vật lý hoặc liên kết sinh học đặc biệt Đặc tính của vật liệu làm chất mang là có độ cứng cơ học, tính chất vật lý - hóa học

ổn định và có sự ổn định về mặt sinh học, đặc biệt là chúng không gây độc với tế bào vi khuẩn Chất mang thường dùng các polysaccharid không tan trong nước (cellulose, dextran, dẫn xuất agarose…), các protein (gelatin, albumin…), các polymer nhân tạo (polystyrene, nhựa trao đổi ion, polyurethane…) và các vật liệu

vô cơ (thủy tinh, ceramic…)

Phương pháp đồng hóa trị được sử dụng thường xuyên để bất động các enzym, tuy nhiên ít dùng trong cố định tế bào vì tác nhân cần cho sự hình thành liên kết đồng hóa trị thường là các chất độc với tế bào [17]

 Phương pháp tạo liên kết ngang

Phương pháp này không sử dụng chất mang để cố định tế bào mà mỗi tế bào được liên kết với tế bào khác bằng các liên kết ngang tạo thành dạng pellet, tác nhân tạo liên kết ngang như glutaraldehyd, các diisocyanat…Các nhóm amino của glutaraldehyd tạo các liên kết ngang liên kết các tế bào với nhau, các tác nhân nhóm diisocyanat (toluen diisocyanat…) tạo liên kết ngang bằng cách liên kết nhóm urea

với các nhóm amino Trong các chủng vi sinh vật thì Escherichia coli (là chủng vi khuẩn có enzym aspertase hoạt tính cao) và Bacillus coagulans được cố định theo

phương pháp này [16]

 Phương pháp bẫy

Dựa vào tính chất vật liệu dùng để bẫy các tế bào vi khuẩn mà phương pháp này được phân chia thành bốn dạng, đó là: dạng lưới, dạng nang nhỏ (microcapsule), dạng liposome và dạng màng

Với dạng lưới các chất xúc tác sinh học được bẫy trong các khuôn gel của nhiều loại polymer khác nhau Ở dạng microcapsule tế bào được gói trong các màng polymer thẩm thấu nhân tạo tạo thành các nang nhỏ và dạng liposom các tế bào vi sinh vật được bẫy trong các màng chất lỏng tạo ra từ hợp chất amphiphatic Với dạng màng chất xúc tác sinh học tách riêng khỏi môi trường bằng các màng siêu lọc, màng lọc hoặc bằng các sợi rỗng [17] Nguồn vật liệu tự nhiên là các polysaccharide như: alginat, k-carrageenan, agar… trong đó alginat được sử dụng phổ biến Một số nghiên cứu gần đây về gel Calci-pectat cũng là một sự lựa chọn mới cho cố định tế bào

1.4.3 Ứng dụng của phương pháp bất động tế bào

 Sản xuất kháng sinh

Kháng sinh là nhóm thuốc rất cần thiết cho cuộc sống con người và hầu hết các kháng sinh thu được bằng con đường lên men vi sinh vật Theo các phương pháp truyền thống, các kháng sinh thường được sản xuất bằng phương pháp lên men mẻ trong các bình lên men Tuy nhiên, để nâng cao hiệu suất sản xuất kháng sinh người ta đã tìm cách chuyển từ lên men mẻ sang lên men liên tục Điều này khó có thể thực hiện được với các tế bào tự do, khi đó bất động tế bào trở thành giải pháp hiệu quả nhất Bằng phương pháp cố định tế bào nhiều kháng sinh đã được sản xuất trên quy mô công nghiệp như: oxytetracylin, neomycin, cephalosporin, pencicillin…

Ví dụ: để tổng hợp ampicilin và amoxicillin [hai kháng sinh được bán tổng hợp từ hợp chất acid 6 - amino penicillanic (6-APA)] người ta tiến hành như sau:

cho penicillin G chảy qua các tế bào E coli hoặc B megatherium (có hoạt tính

enzym penicillinamidase cao) cố định trên các chất mang khác nhau, các vi sinh vật này sẽ thủy phân penicillin G tạo hợp chất 6 – APA và từ 6 – APA tổng hợp nên

amoxicilin và ampicilin [8]

 Sản xuất các acid hữu cơ

Bên cạnh phương pháp tổng hợp hóa học, thì hiện nay một số acid hữu cơ được sản xuất bằng phương pháp bất động tế bào như: acid citric, acid lactic, acid acetic… Ví dụ, để sản xuất acid citric hiện nay chủ yếu sử dụng các tế bào

Aspergillus niger trên các cơ chất khác nhau là alginat, agarose, polyacryamid, hoặc

có thể cho hấp phụ lên cột bọt polyurethane, bẫy vào các sợi rỗng và dùng các chất mang cellulose xốp.… theo phương pháp lên men mẻ Tuy nhiên, điểm bất lợi của phương pháp này là khó có thể cung cấp đầy đủ oxy cho tế bào nên các tế bào tạo ra dịch có tính nhớt trong quá trình phát triển, còn khi sử dụng phương pháp bất động

tế bào, việc vận chuyển oxy thuận lợi hơn nên hoạt động của bình lên men không bị

ảnh hưởng bởi tính nhớt này và làm tăng đáng kể hiệu suất sản xuất acid citric

Lên men bất động tế bào còn được ứng dụng để sản xuất một số acid hữu cơ khác như: acid propionic, acid gluconic, acid fumaric, acid succinic và acid butyric

gluco-tế bào vi sinh vật được bẫy vào trong polyacrylamid, Ca-alginat, agar và vài

polymer khác Ví dụ, để sản xuất α – amylase người ta sử dụng tế bào Bacillus

cereus được bất động vào cơ chất Ca-alginat, sau đó các hạt được nhồi vào thiết bị

phản ứng tầng sôi để sản xuất liên tục α-amylase, với cách làm này hiệu suất phản ứng tăng gấp 24 lần so với lên men mẻ bằng tế bào tự do Ngoài ra, có thể sản xuất

α-amylase từ các tế bào biến đổi của Escherichia coli bất động trong k-carrageenan

có bổ xung thêm glycin Ngoài 2 enzym trên các enzym quan trọng khác cũng được nghiên cứu sản xuất bằng phương pháp bất động tế bào như: invertase, lipase, protease, Cyclodextrin-glycosyl-transferase (CGTase), cellulose, β- galactadase,

xylanase, dextron sucrase [20]

 Sản xuất alcol

Vi sinh vật được sử dụng phổ biến để sản xuất alcol bằng phương pháp bất

động tế bào là nấm men Saccharomyces cerevisiae và Zymomonas mobilis

Phương pháp sử dụng là phương pháp bẫy, các tế bào nấm men S cerevisiae

được bẫy trong gel Calci alginat, chúng được giữ trong mạng lưới gel để không bị khuếch tán vào môi trường, trong khi đó glucose vẫn xâm nhập được vào trong gel

để biến đổi thành alcol etylic và CO2 đi ra ngoài Ưu điểm của phương pháp này là: hiệu xuất lên men đạt được cao hơn do duy trì được xúc tác tự nhiên của các enzym trong tế bào, tế bào ít bị ảnh hưởng có hại của môi trường và quá trình lên men diễn

ra nhanh với dung dịch đường ở nồng độ cao [8], [9]

1.5 Alginat

Alginat là thuật ngữ thường để chỉ acid alginic, muối và các dẫn chất của acid này Alginat thường có nhiều ở các loài tảo nâu, rong mơ dưới dạng muối Ca2+,

Mg2+ và Na+, tham gia vào cấu trúc thành và màng tế bào

1.5.1 Cấu trúc của alginat [37]

Acid alginic là một heteropolyme saccharid mạch thẳng cấu tạo từ hai gốc uronic là acid α- L- guluronic (G) và acid β- D- mannuronic (M)

Hình 1.4 Cấu trúc của β – D – Mannuronic acid và α – L – Guluronic acid

Hai gốc uronic này có cấu tạo dạng ghế nhưng cấu hình khác nhau, acid mannuronic có cấu hình C4 , còn acid guluronic có cấu hình C1

Hình 1.5 Cấu trúc của β – D – Mannuronic acid và α – L – Guluronic acid

Hai monome gắn với nhau bằng liên kết 1 – 4 glycosid nhưng các liên kết này không phải ngẫu nhiêu mà thành block:

Block homopolyguluronic: GGGG

Block homopolymannuronic: MMMM

Block liên hợp: MGMG

Hình 1.6 Hình thể của block GGGG, MMMM, MGMG 1.5.2 Tính chất của alginat

 Độ hòa tan

Các muối kim loại hóa trị I (Na+, K+…), muối amoni, muối của các amin phân

tử lượng thấp của acid alginic tan được trong nước Các muối của acid alginic với các kim loại đa hóa trị ( Ca2+, Ba2+,… trừ Mg2+) không tan được trong nước Các muối alginat hòa tan được trong các dung môi thân nước như alcol, ceton…và dễ

hòa tan hơn khi đun nóng

 Độ nhớt

Natri alginat khi tan trong nước sẽ tạo dung dịch có độ nhớt trong khoảng từ

10 – 3500 cps Độ nhớt này tỷ lệ thuận với khối lượng phân tử trung bình của alginat và nồng độ alginat sử dụng và giảm khi tăng nhiệt độ Độ nhớt của dung

dịch alginat còn bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các ion kim loại trong dung dịch

 Quá trình tạo gel của alginat

Khi phản ứng với các ion kim loại hóa trị II và III dung dịch alginat sẽ tạo gel, các gel được hình thành ở các mức nhiệt độ dưới 1000C, chúng không tan chảy khi đun nóng Do có cấu hình dặc biệt nên đoạn mạch GGGG tạo thành dạng gấp nếp như một cái vỉ trứng, khoảng không gian giữa các vỉ khi xếp lên nhau tương tự như

chỗ đặt quả trứng Các ion Ca2+ khớp vào khoảng trống này liên kết với các nhóm

chức carboxyl và các nguyên tử oxy để hình thành gel Calci alginat

Hình 1.7 Liên kết của ion Ca2+ với alginat

Độ bền của gel phụ thuộc:

- Chiều dài của các chuỗi tham gia liên kết (khối lượng phân tử

- Tỷ lệ G/M và trình tự sắp xếp các gốc urat: block G càng nhiều thì gel càng bền

- Ái lực liên kết polymer càng lớn thì gel càng bền

1.6 Các nghiên cứu về Magnesi lactat

Peter Johannes Marie Baets và các cộng sự (2013) đã sản xuất Magnesi

lactat bằng cách lên men vi khuẩn sinh lactic B coagulans trong môi trường chứa nguồn nguyên liệu thực vật, lá cây Cọ dầu nhiệt đới (Elaeis guineen-sis và Elaeis

oleifera), có chứa 0,5% đến 9,5% carbohydrat và Magnesi hydroxyd để thu được

9,5% Magnesi lactat [38]

Jan Van Krieken và các cộng sự (2007) đã điều chế Magnesi lactat bằng cách

sử dụng một trong các hợp chất của Magnesi là Magnesi hydroxyd, Magnesi oxyd, Magnesi carbonat duy trì môi trường lên men các carbohydrat ở pH 5 – 7 với chủng vi khuẩn thích hợp [29]

Jan Van Krieken và các cộng sự (2005) đã thu được Magnesi lactat rất tinh khiết từ dịch lên men sử dụng các nguồn carbohydrat tương đối thô như sucrose, tinh bột (lỏng), rỉ đường, sử dụng Magnesi hydroxyd làm tác nhân trung hòa [28]

Ben - Yoseph Eliahu, Kogan Leni, Wajc Samuel (2000) sản xuất Magnesi lactat từ vi sinh vật bằng phương pháp lên men đường, điều chỉnh pH về 6,5 bằng cách thêm Magnesi hydroxyd, nhiệt độ 50°C [19]

Aharon Meir Eyal, Rod Fisher (1998) sản xuất Magnesi lactat thông qua việc sinh tổng hợp acid lactic trong quá trình lên men của một chủng vi khuẩn thuộc chi

Lactobacillus, loài Lactobacillus delbrueckii, hoặc Lactobacillus acidophilus Nguyên liệu chính là các carbohydrat cùng với các nguồn dinh dưỡng

phù hợp, độ pH của dịch lên men thường được duy trì trên 4,5, tốt nhất trong khoảng 6,0 - 6,5 bằng các muối cacbonat, bicacbonat của các kim loại kiềm thổ Calci hoặc Magnesi [15]

Kolomaznik và các cộng sự (1995) nghiên cứu sản xuất Magnesi lactat bằng cách bổ sung Magnesi oxyd, Magnesi hydroxyd hoặc Magnesi carbonat trong quá trình lên men lactose tại pH 4,5 – 5,03 [31]

Ngoài các nghiên cứu về sinh tổng hợp, Magnesi lactat còn được tổng hợp bằng phương pháp hóa học dùng làm nguyên liệu trong công nghệ thực phẩm, tổng hợp Magie lactat từ acid lactic và Magnesi hydroxyd [14], [21]

Ở Việt Nam đã có các nghiên cứu được Nội sản xuất Magnesi lactat được tiến hành tại trường Đại học Dược Hà Nội bằng cách lên men các vi khuẩn lactic từ nguồn nguyên liệu hydratcarbon và bổ sung MgCO3 vào môi trường nuôi cấy Nghiên cứu đã lựa chọn được pH thích hợp và phương thức bổ sung MgCO3 trong

quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus acidophillus để điều chế Magnesi lactat,

đồng thời kiểm tra tiêu chuẩn, định tính, định luợng sản phẩm Magnesi lactat tạo thành [11]

Mặc dù các nghiên cứu cố định tế bào vi khuẩn L acidophilus trong gel

Calci alginat cũng như tổng hợp Magnesi lactat bằng cách lên men vi khuẩn sinh lactic đã được thực hiện ở cả Việt Nam cũng như trên thế giới, song ứng dụng phương pháp bất động tế bào vào lĩnh vực này thì ở Việt Nam chưa có công bố liên quan nào Vì vậy các nghiên cứu được thiết kế với mục đích bước đầu ứng dụng tế

bào cố định vào lên men vi khuẩn L acidophilus để tổng hợp Magnesi lactat

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, hoá chất và thiết bị máy móc

 Chủng giống: Lactobacillus acidophilus (ATCC 4653) – Bộ môn Công

Nghiệp Dược

 Nguyên liệu, hoá chất

Bảng 2.1 Nguyên liệu và hoá chất sử dụng

Tủ sấy Daihan (Hàn Quốc)

Đĩa petri, buret, bình định mức, pipet, pipetman, ống nghiệm, đầu côn, dụng cụ pha chế…

- Môi trường lên men

Bảng 2.4: Môi trường lên men

- Môi trường MRS đặc = MRS lỏng + thạch (2%)

 Các dung dịch sử dụng

Các dung dịch được pha theo hướng dẫn của Dược Điển Việt Nam IV