Bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm cellulase ứng dụng trong sản xuất bioethanol từ bã mía

Tuy nhiên, sản xuất bioethanol từ các nguồn lignocellulose vấp phải khó khăn lớn về tính kinh tế do chi phí cho enzyme cellulase để thủy phân cellulose thành nguồn đường lên men được còn

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM

CELLULASE ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất tận tình của: Tiến Sĩ Lê Đức Trung – Viện Tài Nguyên Môi Trường, thuộc Đại Học Quốc Gia TPHCM – đã gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình về hướng đi cũng như các vấn đề có liên quan đến đề tài và hỗ trợ kinh phí để tôi có thể làm tốt luận văn này

Kỹ sư Lê Thị Quỳnh Trâm – Viện Tài Nguyên Môi Trường, thuộc Đại Học Quốc Gia TPHCM – đã hướng dẫn tận tình và luôn động viên tinh thần tôi trong suốt thời gian làm việc

PGS.TS Nguyễn Thúy Hương – Bộ môn Công nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa Tp HCM – đã hướng dẫn tận tình về các vấn đề có liên quan và tặng giống vi sinh vật dùng trong đề tài

TS Lê Phi Nga – Bộ môn Hóa Sinh, Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp HCM – đã nhiệt tình hướng dẫn và góp ý, chia sẻ những nội dung liên quan đến

đề tài

TS Lê Thị Thủy Tiên và cán bộ các phòng thí nghiệm 102, 108, 117 – Bộ môn Công nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa Tp HCM – đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể sử dụng các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm Cha mẹ, anh chị em tôi đã luôn bên cạnh và hỗ trợ tôi về vật chất và tinh thần khi cần thiết, giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này

Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Đại học Bách Khoa Tp HCM –

đã cùng học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc Xin gởi đến những người kể trên lời cảm ơn chân thành nhất và sâu sắc nhất!

900C, 1.5h Bã mía tiền xử lý với NaOH 2%, 900C, 1.5h cũng cho hiệu suất thủy phân cao nhất khi thủy phân với Cellusoft L 5% (v/v), do đó được chọn làm nguyên liệu cho các quá trình thủy phân Các chế phẩm cellulase phối trộn dạng lỏng thô, rắn qua quá trình sấy và hỗn hợp thu được sau lên men được tạo ra Tiến hành thủy phân bã mía

bằng hệ cellulase phối trộn thu được từ hai chủng T.reesei và A.niger tạo hàm lượng

đường khử cao hơn 1.5 - 4 lần so với thủy phân bằng hệ cellulase riêng rẽ thu được từ

mỗi chủng Điều này cho thấy tác động tương hỗ giữa hai hệ cellulase từ T.reesei và A.niger Thủy phân bã mía bằng chế phẩm cellulase phối trộn dạng lỏng thô và hỗn

hợp sau lên men cho kết quả thủy phân cao hơn dạng rắn qua quá trình sấy Tiến hành

thủy phân bã mía bằng cellulase dạng lỏng thô, tỉ lệ phối trộn T reesei/ A niger 4/6,

hàm lượng cellulase 3UI CMCase/g, 5% bã, 500C, pH 4.8 trong 72 giờ, tạo được 19.19 g/l đường khử, trong đó có 10.57 g/l glucose, đạt hiệu suất thủy phân 43.02% Kết quả này còn khá thấp so với 34.32g/l đường khử và 25.46 g/l glucose khi thủy phân bằng Cellusoft L 5% (v/v) và chưa đủ để lên men tạo ethanol hiệu quả Tuy nhiên, nếu được tiếp tục cải thiện về giống, điều kiện nuôi cấy… đây sẽ là một hướng đi tiềm năng có thể thay thế được các chế phẩm cellulase thương mại mắc tiền dùng trong sản xuất bioethanol từ bã mía

ABSTRACT

Crude unprocessed cellulase was produced by solid state fermentation of

Trichoderma reesei and Aspergillus niger on rice bran and three types of sugarcane

bagasse: non pretreated, pretreated with NaOH 0.1M, room temperature, 12h and pretreated with NaOH 2%, 900C, 1.5h The highest cellulase activities by T.reesei and

by A.niger with bagasse treated with NaOH 2%, 900C, 1.5 h as inducing substrate were: 16.28 UI/g and 23.45 UI/g, respectively Some types of cellulase preparations were created, which were crude unprocessed cellulase extract, dried-culture and

culture after fermentation The hydrolytic effectiveness of T.reesei –A.niger cellulase

blends on bagasse treated with NaOH 2%, 900C, 1.5 h was superior to the use of

unblended T reesei or A niger enzymes, the reducing sugar concentration increased 1.5- 4 fold This suggested that T reesei–A niger blends were enhanced

synergistically Crude unprocessed cellulase extract and culture after fermentation were more effective hydolysis yield than dried-culture Crude unprocessed cellulase extract hydolysis bagasse treated with NaOH 2%, 900C, 1.5 h resulted in 19.19 g reducing sugar/L, 10.57gglucose/L, hydrolysis yield 43.02 % after 72h under

corresponding conditions (T.reesei/ A.niger 4/6, 3 UI CMCase/g bagasse, 5% bagasse,

150 rpm, 500C, pH 4.8) The hydrolysate contained lower reducing sugar and glucose concentration compared with 34.32 g/l reducing sugar and 25.46 g glucose/L using Cellusoft 5% (v/v) in the same hydrolysis experiments and not suitable for subsequent fermentation process However, if further improvements in higher-cellulase species, cultured conditions…the simplified of cellulase production using solid-state fermentation proved its potential to be used on-site as part of a cellulase to ethanol conversion process, in lieu of expensive commercial enzyme preparations

− CP2 : Chế phẩm cellulase dạng rắn qua quá trình sấy

− CP3 : Chế phẩm hỗn hợp thu được sau nuôi cấy

− CP A : Chế phẩm cellulase từ Aspergillus niger

− CP T : Chế phẩm cellulase từ Trichoderma reesei

− AFEX : Ammonia Fiber Explosion_ Nổ hơi ammonia

MỤC LỤC

TÓM TẮT ii

KÍ HIỆU VIẾT TẮT iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ix

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU ix

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu chung về bioethanol và enzyme trong sản xuất bioethanol từ biomass 4

2.1.1 Bioethanol và sản xuất bioethanol từ lignocellulose 4

2.1.2 Enzyme là vấn đề mấu chốt trong sản xuất bioethanol từ lignocellulose 5

2.1.3 Một số công trình nghiên cứu về enzyme cellulase ứng dụng trong sản xuất bioethanol 8

2.2 Giới thiệu chung về nguồn nguyên liệu bã mía 10

2.2.1 Giới thiệu chung về cây mía và bã mía 10

2.2.2 Các thành phần chủ yếu trong bã mía 11

2.2.3 Các phương pháp tiền xử lý bã mía 16

2.3 Enzyme cellulase 20

2.3.1 Phân loại 20

2.3.2 Cấu trúc và tính chất enzyme cellulase 21

2.3.3 Cơ chế tác động của enzyme cellulase lên cellulose 22

2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân 24

2.4 Sản xuất chế phẩm cellulase 27

2.4.1 Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase 27

2.4.2 Phương pháp lên men bán rắn thu nhận chế phẩm enzyme 30

2.4.3 Cơ chất cảm ứng nấm sợi sinh tổng hợp cellulase 32

2.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của nấm sợi trên môi trường bán rắn 33

2.4.5 Chế phẩm cellulase 36

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 40

3.1 Vật liệu 40

3.1.1 Bã mía 40

3.1.2 Giống vi sinh vật 40

3.1.3 Cơ chất dùng trong lên men bán rắn 40

3.1.4 Enzyme thương mại 42

3.2 Nội dung tổng quát 43

3.2.1 Sơ đồ nội dung tổng quát 43

3.2.2 Các phương pháp nghiên cứu 43

3.2.2.1 Phương pháp tiền xử lý bã mía 43

3.2.2.2 Quan sát hình thái giống 44

3.2.2.3 Phương pháp tuyển chọn giống T reesei có hoạt tính cao 44

3.2.2.4 Phương pháp khảo sát lên men bán rắn sinh tổng hợp cellulase 45

3.2.2.5 Phương pháp thu nhận các loại chế phẩm cellulase 46

3.2.2.6 Phương pháp khảo sát quá trình thủy phân bã mía 47

3.3 Bố trí thí nghiệm 47

3.3.1 Khảo sát quá trình lên men bán rắn sinh tổng hợp cellulase 47

3.3.2 Khảo sát quá trình thủy phân bã mía 50

3.3.3 Khảo sát độ ổn định của enzyme 52

3.4 Phương pháp phân tích 52

3.4.1 Phương pháp xác định hoạt tính CMCase 52

3.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử bằng DNS 54

3.4.3 Phương pháp xác định các thành phần trong bã mía trong bã mía 55

3.2 Phương pháp xử lý số liệu 60

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 61

4.1 Khảo sát ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý đến thành phần và cấu trúc bã mía 61

4.2 Quan sát đặc điểm hình thái của các chủng nấm mốc 65

4.3 Tuyển chọn giống T.reesei có hoạt tính cellulase cao 68

4.4 Khảo sát các điều kiện nuôi cấy thích hợp với khả năng sinh tổng hợp

cellulase trên môi trường bán rắn 68

4.4.1 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp cellulase theo thời gian ứng với các loại bã mía tiền xử lý khác nhau 68

4.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất 71

4.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm 72

4.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ giống 73

4.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng nitrogen 74

4.5 Khảo sát quá trình thủy phân bã mía bằng các loại chế phẩm thu nhận được75 4.5.1 Khảo sát nguồn nguyên liệu thủy phân 75

4.5.2 Enzyme thương mại (Cellusoft L) 77

4.5.3 Chế phẩm cellulase dạng lỏng thô (CP1) 79

4.5.3.1 Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ phối trộn đến hoạt tính CMCase 79

4.5.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn 80

4.5.3.3 Khảo sát hàm lượng chế phẩm enzyme/ bã 82

4.5.4 Chế phẩm enzyme dạng bán rắn sấy khô (CP2) 84

4.5.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn 84

4.5.4.2 Khảo sát hàm lượng chế phẩm enzyme/ bã 85

4.5.5 Chế phẩm dạng bã rắn tươi (CP3) 86

4.5.5.1 Khảo sát tỉ lệ phối trộn thích hợp 87

4.5.5.2 Khảo sát tỉ lệ chế phẩm enzyme/ bã 88

4.5.6 Nhận định, đánh giá tiềm năng của các loại chế phẩm 90

4.5.7 Độ ổn định của cellulase thu được 93

CHƯƠNG 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 95

5.1 Kết luận 95

5.2 Đề nghị 96

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 99

PHỤ LỤC 102

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 : Thành phần hoá học của cám mì 41

Bảng 3.2 : Thành phần các khoáng chất, vitamin của cám gạo 41

Bảng 3.3 : Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của loại bã mía cảm ứng và thời gian lên men 48

Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất 49

Bảng 3.5 : Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường lên men 49

Bảng 3.6 : Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ giống 49

Bảng 3.7 : Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng nitrogen 50

Bảng 3.8: Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn glucose 53

Bảng 3.9 : Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn glucose (DNS) 55

Bảng 3.10: Thành phần NDS 56

Bảng 4.1: Đường kính phân giải của enzyme thu từ các chủng T.reesei A, B, C 68

Bảng 4.2 : So sánh hiệu quả thủy phân bã mía tạo đường của ba loại chế phẩm 91

Bảng 5.1 : Kết quả khảo sát các điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh tổng hợp cellulase trên môi trường bán rắn 95

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Sơ đồ sản xuất bioethanol từ biomass 6

Hình 2.2 : Cây mía 10

Hình 2.3 : Bã mía và bãi thải bã mía ở công ty mía đường NIVL (Long An) 10

Hình 2.4 : Cấu trúc của lignocelluloses 11

Hình 2.5 : Mối quan hệ cellulose – hemicellulose - lignin trong cấu trúc lignocellulose 12

Hình 2.6 : Cấu trúc của cellulose 12

Hình 2.7 : Kiểu Fringed fibrillar và kiểu Folding chain 13

Hình 2.8 : Cấu tạo hóa học của đại diện hemicellulose 14

Hình 2.9: Ba tiền chất phenyl – propane của lignin 15

Hình 2.10: Cấu trúc lignocellulose trước và sau khi tiền xử lý 16

Hình 2.11: Các amino acid liên kết CD và CBD 21

Hình 2.12: Quá trình tác động exo-glucanase lên đầu vùng kết tinh của cellulose 23

Hình 2.13: Cơ chế thủy phân cellulose của enzyme cellulase 24

Hình 2.14 : Ảnh hưởng của nồng độ enzyme 26

Hình 2.15: Nâm sợi Trichoderma reesei 29

Hình 2.16: Nấm sợi Aspergillus niger 30

Hình 3.1 : Sơ đồ nội dung thí nghiệm 43

Hình 3.2: CP1 (lỏng) và CP2 (sấy) với hai chủng tương ứng A niger và T reesei 47

Hình 3.3 :- Bộ dụng cụ soxhlet 58

Hình 3.4: - Hệ thống phân tích NDS và ADS……… …65

Hình 4.1: Phân tích thành phần bã mía trước khi tiền xử lý 61

Hình 4.2: Thành phần bã mía trước tiền xử lý theo nghiên cứu của Binod Parameswaran và cộng sự (2009) 61

Hình 4.3: Phân tích thành phần bã mía sau tiền xử lý 63

Hình 4.4 : Cấu trúc và màu sắc của bã mía chưa tiền xử lý, bã mía xử lý ở nhiệt độ phòng, 12 giờ và xử lý ở 900C, 1.5 giờ (từ trái qua) 65

Hình 4.5 : Bã mía tiền xử lý ở 900C, 1.5 giờ 65

Hình 4.6: Khuẩn ty T reesei và A niger phát triển trên môi trường PGA 66

Hình 4.7 : Quan sát hình thái và bào tử nấm T reesei dưới kính hiển vi 67 Hình 4.8 : Quan sát hình thái và bào tử nấm A niger dưới kính hiển vi 67 Hình 4.9 : Xác định hoạt tính CMCase của lần lượt ba chủng T.reesei A, B, C bằng

phương pháp khuyếch tán enzyme trên đĩa thạch 68

Hình 4.10: Khảo sát khả năng sinh cellulase của chủng T.reesei với các loại bã mía

cảm ứng khác nhau theo thời gian 69

Hình 4.11 : Khảo sát khả năng sinh cellulase của A niger với các loại bã mía cảm ứng

theo thời gian 71

Hình 4.12: Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất lên khả năng sinh tổng hợp cellulase 71 Hình 4.13: Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường bán rắn lên khả năng sinh tổng hợp

cellulase 73

Hình 4.14: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống lên khả năng sinh tổng hợp cellulase 74 Hình 4.15: Ảnh hưởng của nồng độ nitrogen lên khả năng sinh tổng hợp celluase 74 Hình 4.16: Hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân sử dụng các nguồn

nguyên liệu bã mía khác nhau (5% Cellusoft L, 5% bã mía ở 500C, pH 4.8) 76

Hình 4.17: Hiệu suất thủy phân (tính theo phụ lục 5) theo thời gian khi sử dụng những

nguồn nguyên liệu bã mía khác nhau ( 5% Cellusoft L, 5% bã mía, 500

C, pH 4.8) 76

Hình 4.18: Hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân sử dụng các tỉ lệ

Cellusoft L (ml enzyme/g bã) khác nhau ( 5% bã mía, 500C, pH 4.8) 77

Hình 4.19: Hiệu suất thủy phân theo thời gian khi sử dụng các hàm lượng Cellusoft L

khác nhau (5% bã mía, 500C, pH 4.8) 78

Hình 4.20: Hoạt tính CMCase (UI/L) ứng với các tỉ lệ phối trộn CP1 từ hai chủng

T reesei và A.niger 79

Hình 4.21 : Hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân bã mía với các tỉ lệ phối

trộn cellulase T reesei/ A niger khác nhau (bã 5%, enzyme 10%, 500

C, pH 4.8) 81

Hình 4.22: Hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân bã mía với các hoạt độ

cellulase tỉ lệ 4/6 khác nhau (5% bã, 500

C, pH 4.8) 82

Hình 4.23: Hiệu suất thủy phân theo thời gian khi sử dụng các tổng hoạt độ cellulase (

UI/g bã) tỉ lệ 4/6 khác nhau (5% bã mía, 500C, pH 4.8) 83

Hình 4.24: Hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân sử dụng các tỉ lệ phối

trộn cellulase khác nhau (g CP khô/g bã) (5% bã, 500C, pH 4.8) 84

Hình 4.25: Hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân sử dụng hàm lượng chế

phẩm tỉ lệ 0.025/0.075 khác nhau (bã 5%, 500C, pH 4.8) 85

Hình 4.26 : Hiệu suất thủy phân theo thời gian khi sử dụng hàm lượng chế phẩm tỉ lệ

0.025/0.075 khác nhau (bã 5%, 500C, pH 4.8) 86

Hình 4.27: Hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân sử dụng các tỉ lệ phối

trộn cellulase khác nhau (g CP (theo trọng lượng khô)/g bã) (5% bã, 500

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Các nguồn nguyên liệu hóa thạch, vốn đóng vai trò to lớn trong sự phát triển nền kinh tế thê giới Tuy nhiên, các nhà khoa học đã cảnh báo rằng các nguồn nhiên liệu hóa thạch sẽ cạn kiệt trong vài thập niên tới Thêm vào đó, việc sử dụng nhiên liệu hóa thạch đã gây ra những hậu quả nghiêm trọng về vấn đề môi trường như hiện tượng trái đất nóng lên do hiệu ứng nhà kính và ô nhiễm không khí Do vậy, công cuộc tìm kiếm các nguồn năng lượng sạch thay thế là vô cùng tất yếu đối với sự phát triển của con người hiện nay

Cùng với biodiesel, bioethanol là một nguồn năng lượng sinh học sạch và có khả năng tái tạo, đã và đang được chú ý phát triển để trở thành nguồn năng lượng đầy hứa hẹn trong tương lai Tuy nhiên, công nghệ sản xuất bioethanol từ nguyên liệu tinh bột hiện nay gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến an ninh lương thực, de dọa cuộc sống con người, do vậy đã thúc đẩy con người tìm kiếm những nguồn nguyên liệu thay thế Nhiều quốc gia trên thế giới đang nghiên cứu sâu phát triển công nghệ mới để sản xuất bioethanol từ phế phẩm nông nghiệp như bã mía, rơm rạ, lõi ngô, vỏ trấu, bã sắn… những nguồn nguyên liệu lignocellulose được cho là đầy triển vọng, rẻ tiền, khối lượng hàng năm rất lớn, không có tính cạnh tranh với lương thực thế giới và góp phần làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường do đốt bỏ hay thải bỏ các nguồn nguyên liệu này Tuy nhiên, sản xuất bioethanol từ các nguồn lignocellulose vấp phải khó khăn lớn về tính kinh tế do chi phí cho enzyme cellulase để thủy phân cellulose thành nguồn đường lên men được còn khá cao, chiếm đến 40% tổng chi phí cho quá trình sản xuất

Cellulase hiện nay được sản xuất chủ yếu từ các chủng Trichoderma và Aspergillus

bằng phương pháp lên men chìm và trải quá trình tinh sạch hết sức tốn kém, vì vậy giá thành cellulase còn khá cao Do vậy, hiện nay việc nghiên cứu các giải pháp công nghệ để giảm giá thành enzyme cellulase đang được chính phủ, các tổ chức năng lượng và các hãng enzyme nổi tiếng đẩy mạnh hơn bao giờ hết

Các hoạt động sản xuất nông nghiệp và các ngành công nghiệp sử dụng sản phẩm nông nghiệp hàng năm tại Việt Nam tạo ra hàng trăm tấn phế phẩm nông nghiệp Đặc

biệt là nguồn bã mía khổng lồ thải ra từ các nhà máy đường nhưng vẫn chưa có biện pháp hợp lý để xử lý nguồn rác thải to lớn đó một cách hiệu quả Đây là một nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất nhiên liệu sinh học trong tương lai Vì thế , vấn đề nghiên cứu tạo các chế phẩm cellulase ứng dụng trong sản xuất bioethanol từ lignocellulose là vấn đề hết sức cần thiết mang tính đi tắt đón đầu

Do vậy, em đã chọn thực hiện đề tài “ Bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm cellulase ứng dụng trong sản xuất bioethanol từ bã mía” Qua đó, đề tài cung cấp thêm

những cơ sở dữ liệu về tạo chế phẩm cellulase thô từ hai chủng giống Trichoderma reesei và Aspergillus niger bằng phương pháp lên men bán rắn với bã mía tiền xử lý là

cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp enzyme Đồng thời tiến hành nghiên cứu tỉ lệ phối trộn

hệ cellulase thu được từ hai chủng giống trên nhằm thu được hệ cellulase có thành phần cân đối nhất và tiến hành thủy phân bã mía tạo đường lên men được

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của đề tài là:

ü Khảo sát sơ bộ tìm điều kiện thích hợp để tiền xử lý bã mía dùng làm cơ chất cảm ứng trong lên men bán rắn và làm nguyên liệu thủy phân tạo đường lên men được

ü Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase với

hai chủng giống Trichoderma reesei và Aspergillus niger trên môi trường bán

rắn

ü Nghiên cứu tỉ lệ phối trộn các loại cellulase thô thu được từ hai chủng giống trên

ü Ứng dụng thủy phân bã mía bằng các chế phẩm cellulase thô thu nhận được

1.3 Các nội dung nghiên cứu

1 Khảo sát các chế độ tiền xử lý:

ü Nhiệt độ thấp, thời gian dài

ü Nhiệt độ cao, thời gian ngắn

2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase trên môi trường bán rắn với bã mía là cơ chất cảm ứng:

ü Ảnh hưởng của các loại bã mía cảm ứng

ü Ảnh hưởng của thành phần môi trường

ü Ảnh hưởng của độ ẩm

ü Ảnh hưởng của tỉ lệ giống

ü Ảnh hưởng của hàm lượng nitrogen

3 Khảo sát tỉ lệ phối trộn cellulase thích hợp từ hai chủng giống với các loại chế phẩm:

ü Lỏng thô (CP1)

ü Rắn qua quá trình sấy (CP2)

ü Hỗn hợp thu được sau khi lên men (CP3)

4 Khảo sát quá trình thủy phân bã mía tìm được

ü Tỉ lệ chế phẩm enzyme thích hợp

ü Loại chế phẩm thích hợp

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về bioethanol và enzyme trong sản xuất bioethanol từ

biomass

2.1.1 Bioethanol và sản xuất bioethanol từ lignocellulose

2.1.1.1 Bioethanol

Bioethanol là ethanol đi từ nguyên liệu biomass có thể dụng sử dụng trong các

sản phẩm như nhiên liệu, dung môi, chất kháng khuẩn Bioethanol có nhiều ưu điểm

hơn so với các nguồn nhiên liệu hiện tại và được đánh giá là một nguồn nhiên liệu

sạch đầy tiềm năng của tương lai Bioethanol là nguồn nhiên liệu có khả năng tái sinh

vì bioethanol được tạo ra từ nguồn gốc thực vật nên CO2 sinh ra khi đốt được cây cối

hấp thụ lại tạo nên sự cân bằng về lượng CO2 , do đó không gây hiệu ứng nhà kính

Nhiên liệu ethanol pha trộn cho thấy giảm 35 – 46% khí nhà kính [16]

2.1.1.2 Tình hình sản xuất bioethanol từ lignocellulose biomass

ü Lignocellulose

Lignocellulose là nguồn polymer sinh học dồi dào, phong phú nhất trên thế giới

và có thể được tận dụng để sản xuất xăng sinh học Thành phần cấu tạo của

lignocellulose bao gồm cellulose, hemicellulose, lignin, chất trích ly và một số hợp

chất vô cơ khác Một số nguồn lignocellulose phổ biến đang được nghiên cứu hiện

nay như:

− Chất thải nông nghiệp: bã mía, lõi ngô, thân ngô, rơm rạ, trấu, phân gia súc

− Vật liệu từ gỗ: gỗ thải trong xây dựng, mùn cưa, dăm bào…

− Các nguồn chất thải công nghiệp: công nghiệp giấy, công nghiệp chế biến lương

thực thực phẩm…

Lignocellulose là nguồn nguyên liệu đầy tiềm năng trong công nghệ sản xuất

bioethanol Sản xuất bioethanol từ lignocellulose có lợi ích về mặt kinh tế giúp giảm

sự lệ thuộc vào nguồn dầu mỏ, giảm lượng xăng dầu ngoại nhập bằng nguồn nhiên

liệu cung cấp trong nước, góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế nông nghiệp và giảm

thiểu ô nhiễm môi trường nhờ giải quyết được nguồn nguyên liệu rác thải công, nông

nghiệp Hơn nữa quá trình này sẽ thải ra một lượng lớn lignin có thể tận dụng như một

nguồn chất đốt giàu năng lượng [36]

ü Tình hình sản xuất bioethanol từ lignocellulose

Sản xuất bioethanol từ nguyên liệu lignocellulose đã xuất hiện quy mô pilot và

thương mại từ giữa năm 1900 Dự án pilot lớn nhất được thực hiện bởi Iogen – một

hãng sản xuất enzyme lớn ở Canada - với nguồn nguyên liệu là thân lúa mạch và yến

mạch Hiệu quả sản xuất ethanol đạt tới 340 lít/tấn nguyên liệu và có thể sản xuất hơn

3 triệu lít ethanol/ năm Công ty Poet, công ty sản xuất bioethanol lớn nhất nước Mỹ,

sản xuất ethanol từ hơn 18 loại lignocellulose với 3.8 tỉ lít/năm, đang trên tiến trình mở

rộng quy mô sản xuất với các loại nguyên liệu như lõi ngô, thân lúa mì, vụn gỗ

SunOpata (Pháp) đã xây dựng nhà máy sản xuất ethanol từ lignocellulose ở Pháp và

hiện đang chuyển giao công nghệ sang một số nước như Trung Quốc (sản xuất ethanol

từ lõi bắp, 2006), Tây Ban Nha (sản xuất ethanol từ thân lúa mì, 2007), Louisiana (sản

xuất ethanol từ bã mía, 2007)

Hiện nay, nhiều công ty và tổ chức năng lượng đang nghiên cứu để hoàn thiện

hơn nữa công nghệ sản xuất bioethanol từ lignocellulose (Service, 2007) Các hướng

nghiên cứu tập trung vào kỹ thuật enzyme, kỹ thuật di truyền ở vi sinh vật và thậm chí

ở các loại cây nhằm nhằm tăng hoạt tính, giảm giá thành enzyme, tìm được giống vi

sinh vật có khả năng lên men tốt các loại đường và tạo những chủng cây trồng sản sinh

cấu trúc lignocellulose kém bền vững hơn, ít thành phần lignin hơn [35]

Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu đề tài Biomass, xử lý phế phẩm nông nghiệp, do

TS Phan Đình Tuấn, trường đại học Bách khoa TP.HCM phụ trách Biomass là đề tài

của nghiên cứu công nghệ xử lý các phế phẩm trong sản xuất nông nghiệp như rơm,

rạ, bã mía, trấu… nhằm sản xuất bioethanol (cồn nguyên liệu), tiến tới xây dựng mô

hình “Thị trấn Biomass” tại xã Thái Mỹ, huyện Củ Chi, TP.HCM

2.1.2 Enzyme là vấn đề mấu chốt trong sản xuất bioethanol từ lignocellulose

Bã mía, lá mía, rơm rạ, lõi ngô, thân ngô là các nguồn nguyên liệu biomass

giàu carbohydrate được thải ra từ sản xuất nông nghiệp với số lượng lớn và giá thành

rẻ, đang là đối tượng nghiên cứu để sản xuất bioethanol hiện nay Các nguồn

lignocellulose này bao gồm các thành phần chủ yếu: cellulose (35-50%), hemicellulose

(20-35%) và lignin (10-25%) sắp xếp với nhau tạo cấu trúc hết sức chặt chẽ và phức

tạp, cản trở sự tấn công của enzyme, vi sinh vật, kể cả hóa chất ( Demirbas, 2005)

Theo Mosier và cộng sự (2005), để chuyển hóa nguồn lignocellulose này thành

bioethanol cần qua bốn giai đoạn:

Hình 2.1: Sơ đồ sản xuất bioethanol từ biomass

Đầu tiên, nguyên liệu được cắt/xay nhỏ về kích thước phù hợp Tiếp theo, nguyên

liệu sẽ được tiền xử lý nhằm giãn nở cấu trúc và loại bỏ một số thành phần Sau đó,

nguyên liệu sẽ được thủy phân bằng enzyme hoặc acid tạo nguồn đường lên men được

Sau cùng, nấm men sẽ dùng nguồn đường này lên men tạo bioethanol [14]

Trong bốn giai đoạn kể trên thì giai đoạn thủy phân lignocellulose tạo nguồn

đường lên men được đánh giá là giai đoạn quan trọng và gặp nhiều khó khăn nhất Có

hai phương pháp thủy phân lignocellulose thủy phân bằng acid và thủy phân bằng

enzyme Tuy nhiên, phương pháp thủy phân bằng enzyme (cellulase, hemicellulase )

tỏ ra chiếm ưu thế do hiệu quả thủy phân cao, có thể đạt đến 100% mà phương pháp

acid dù bất kì nồng độ nào cũng không thể đạt được Hơn nữa, phương pháp enzyme

đòi hỏi điều kiện nhiệt độ, pH ôn hòa, ngược lại phương pháp acid cần điều kiện nhiệt

độ cao và pH thấp do vậy đòi hỏi cần có thiết bị chịu được acid và nhiệt độ Tuy

Ethanol

Cắt, nghiền, xay nhỏ Tiền xử lý Thủy phân (acid, enzyme)

Lên men Lignocellulose

phương pháp acid có lợi thế về thời gian nhanh hơn nhưng trong quá trình thủy phân

lại sản sinh ra các hợp chất ức chế sự phát triển của nấm men Do vậy, phương pháp

thủy phân lignocellulose thông dụng nhất hiện nay là phương pháp thủy phân bằng

enzyme [35]

Tuy nhiên, cellulase là một trong những enzyme thương mại có giá thành cao

hiện nay, khoảng từ 0.3 – 0.81 USD/gam Việc thủy phân cellulose cần một lượng lớn

cellulase (1kg cellulase cho 50 kg cellulose), do vậy chi phí cho enzyme chiếm 40 -

45% tổng chi phí trong công nghệ sản xuất bioethanol từ lignocellulose Do đó việc

nghiên cứu giảm giá thành của enzyme cellulase là một vấn đề mấu chốt trong việc

ứng dụng enzyme cellulase vào công nghiệp sản xuất bioethanol từ lignocellulose Vấn

đề nghiên cứu giảm giá thành enzyme cellulase hiện nay tập trung vào các hướng như:

− Tăng hiệu suất sinh enzyme cellulase trong sản xuất enzyme cellulase thương

mại (cải thiện hệ gen vi sinh vật )

− Sản xuất enzyme cellulase với các nguồn cơ chất rẻ tiền

− Sản xuất enzyme cellulase có độ ổn định cao, có thể tái sử dụng được

− Sản xuất enzyme cellulase có hoạt tính cao bằng phương pháp lên men bán rắn

− Sản xuất chế phẩm cellulase thô nhằm giảm chi phí khâu tinh chế enzyme

Với việc ứng dụng vào công nghệ sản xuất bioethanol từ lignocellulose, thị

trường về enzyme cellulase dự kiến sẽ tăng ít nhất 33% Với một thị trường rộng lớn

và vai trò vai trọng của cellulase trong công nghệ sản xuất bioethanol từ

lignocellulose, đòi hỏi phải có bước cải tiến những chế phẩm enzyme cellulase về các

mặt như : khả năng xúc tác hiệu quả trên nguồn cơ chất cellulose không tan, ổn định ở

nhiệt độ cao và pH thích hợp, ít bị ức chế bởi sản phẩm cuối…

Hiện nay, công ty Genencor International and Novozymes Biotech đã công bố

công nghệ sản xuất cellulase ứng dụng trong công nghệ sản xuất bioethanol với giá

thành giảm từ 5.4 USD/gallon còn 0.25 USD/ gallon bằng cách sử dụng cơ chất rẻ

tiền hơn và cải thiện hiệu suất thủy phân bằng cách phối trộn hỗn hợp enzyme

cellulase Tuy nhiên, phương pháp này vẫn chưa được chấp nhận rộng rãi do chưa áp

dụng được trên nhiều nguồn lignocellulose khác nhau [28]

2.1.3 Một số công trình nghiên cứu về enzyme cellulase ứng dụng trong sản

xuất bioethanol

Ở các nước đang phát triển như Việt Nam, việc nghiên cứu sản xuất enzyme

cellulase theo các hướng sử dụng cơ chất rẻ tiền, sản xuất enzyme cellulase có hoạt

tính cao bằng phương pháp lên men bán rắn, và sản xuất chế phẩm cellulase thô được

đánh giá là thích hợp nhất về mặt kinh tế và công nghệ Hiện nay một số nước tiên tiến

trên thế giới cũng đã và đang thực hiện theo hướng nghiên cứu này Một số công trình

nghiên cứu gần đây về enzyme cellulase thô sử dụng trong sản xuất bioethanol trên thế

giới và ở Việt Nam như:

Xia và Cen (1999) đã nghiên cứu tạo cellulase thô bằng phương pháp lên men

bán rắn với chủng T reesei ZU-02 trên cơ chất cám mì và lõi bắp Hỗn hợp sau khi

nuôi cấy được ly trích bằng nước cất, lắc trong 3 giờ, lọc thu lấy dịch chiết xem như là

cellulase thô với hoạt tính 158 FPU/g CT Bã sau khi lọc được giữ lại để tiến hành lên

men tiếp mà không bổ sung thêm cơ chất hay vi sinh vật và quá trình này có thể lặp lại

đến ba lần Cellulase thô thu được đem thủy phân lõi ngô với hoạt tính 20 FPU/g lõi

ngô, đạt hiệu suất thủy phân 84% [38]

Năm 2004, Xia và Sheng tiếp tục áp dụng phương pháp lên men bán rắn với hai

chủng T.reesei ZU-02 và A.niger ZU-07(chủng giống mạnh về hoạt tính β-glucosidase)

và phối trộn hệ cellulase thu được từ hai chủng này 8% thủy phân rơm rạ tiền xử lý

bằng kiềm, tạo 56.7 g/l glucose có thể tiến hành lên men tạo ethanol mà không cần bổ

sung thêm bất kì nguồn đường nào [39]

Ở Brazil, Nhóm nghiên cứu Gottschalk và cộng sự (2010) đã tiến hành phối trộn

hệ enzyme cellulase thô thu được từ hai chủng T reesei và A.awamori và tiến hành

thủy phân bã mía được xử lý nổ hơi Enzyme T.reesei thu được có hoạt tính (UI/L) :

1700 FPU, 20 000 CMCase, 340 β-glucosidase, hệ enzyme A.awamori thu được

(UI/L) : 420 FPU, 4900 CMCase, 45600 β-glucosidase Enzyme cellulase sau khi

phối trộn từ hai chủng có hoạt tính FPU và CMCase tăng lên gấp đôi, đem 10 FPU/g

enzyme sau phối trộn thủy phân 20 g/l bã mía ở 500C, 72 giờ, hiệu quả thủy phân

cellulose đạt 81% và hemicellulose đạt 91% [22]

Ở Australia, Mitchell Lever và cộng sự (2010) đã nghiên cứu sử dụng cellulase

thô thu nhận bằng phương pháp lên men bán rắn với chủng T reesei trên môi trường

cám mì nhằm tiết kiệm chi phí về enzyme thương mại Nhóm đã tiến hành thủy phân

thân lúa mì bằng enzyme thô thu nhận được và lên men đồng thời với chủng

S cerevisiae thu được 21g/l cồn với nồng độ enzyme 0.053 FPU/ml, hiệu suất chuyển

hóa là 56% [26]

Ở Việt Nam, Trần Thạnh Phong (2004) đã khảo sát khả năng sinh tổng hợp

enzyme cellulase từ T.reesei và A.niger trên môi trường bán rắn [9] Năm 2007, Trần

Thạnh Phong tiếp tục nghiên cứu thu nhận cellulase từ chủng T reesei VTT-D-80133

(giống từ Phần Lan) sinh trưởng trên môi trường bán rắn với cơ chất bã mía kết hợp

với cám mì Kết quả thu được tỷ lệ BM:CM (7:3), 8 lần nồng độ dinh dưỡng Mandel,

độ ẩm ban đầu 60%, thời gian nuôi cấy 7 ngày là tối ưu cho T reesei VTT-D-80133

sinh tổng hợp cellulase trên môi trường lên men bán rắn Hoạt tính và hiệu suất sinh

tổng hợp cellulase ở điều kiện trong bình tam giác là CMCase 280,64 UI/g và FPU 5

UI/g; thấp hơn 3,2 và 37 lần so với chế phẩm Amano T (cellulase được sản xuất từ T

reesei) của Hãng AMANO Cellulase thu nhận được có khả năng đường hóa 21% giấy

in đã qua sử dụng (10%) và qua phân tích trên gel polyacrylamide có các vạch protein

có trọng lượng phân tử bằng với các vạch protein có trong chế phẩm Amano T [10]

Năm 2009, Nguyễn Chí Dũng (Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TPHCM)

đã tiến hành lên men riêng rẽ hai chủng giống T.reesei và A.niger trên các loại bã phế

liệu nông nghiệp như rơm, bã mía, lõi ngô Kết quả cellulase thu được từ chủng

A.niger trên môi trường tỉ lệ cám/rơm/lõi ngô: 3/5/2 đạt hoạt tính cao nhất : 9.81

UI/gCT, chủng T reesei trên môi trường cám gạo/lõi ngô/bã mía : 5/3/2 đạt hoạt tính

cao nhất : 8.12 UI/gCT Tiến hành phối trộn hai hệ cellulase trên thì khả năng thủy

phân các loại phế phẩm nông nghiệp cũng tăng lên Hiệu quả cao nhất đạt được với tỉ

lệ A niger/ T reesei 4/6, tiến hành thủy phân 10% lõi ngô được hấp ở 1210C, 20 phút

đạt lượng đường khử 2.31 g/l, hiệu suất thủy phân đạt 20.79 % [2]

Năm 2009, Trần Thị Thanh Thuần ( Đại Học Bách Khoa TPHCM) nghiên cứu về

tạo chế phẩm cellulase từ T viride trên môi trường có thành phần 75% cám gạo, 18%

trấu, 6% carot, 1% (NH4)2SO4 ; độ ẩm 58-60%, nhiệt độ 36-400C, pH 5, 8% giống, lên

men trong 4 ngày thu được chế phẩm có hoạt tính cellulase 4 UI/gCT [11]

Qua đó cho thấy, vấn đề nghiên cứu tạo chế phẩm cellulase phục vụ cho sản xuất

bioethanol là một vấn đề tất yếu đã và đang được đẩy mạnh

2.2 Giới thiệu chung về nguồn nguyên liệu bã mía

2.2.1 Giới thiệu chung về cây mía và bã mía

Mía là tên gọi thông thường của một loại cây thân thảo thuộc họ cỏ Mía có thân

to mập, chia nhiều đốt, chứa nhiều đường, cao từ 2-6 m, đường kính khoảng 2-5 cm

Mía được trồng chủ yếu để sản xuất đường saccharose, đóng vai trò quan trọng trong

ngành công nghiệp thực phẩm

Bã mía là một loại phế phẩm thu được trong công nghiệp sản xuất đường từ cây

mía Mía cây sau khi tách hết nước mía bằng các qui trình nghiền/ép và rửa, mía trở

thành bã, một loại vật liệu có chứa nhiều thành phần cellulose [33, 41]

Hình 2.3 : Bã mía và bãi thải bã mía ở công ty mía đường NIVL (Long An)

Mía là một loại cây trồng có khả năng chuyển hóa năng lượng mặt trời rất cao,

minh chứng là mía có thể thu hoạch được tới 80 tấn/hecta so với 1 tấn/hecta (lúa mì),

20 tấn/hecta (cây) Mặt khác mía có khả năng trồng trọt, canh tác hàng năm Do đó

lượng bã mía thải ra hằng năm là rất lớn và là một trong những nguồn phế thải lớn

nhất thế giới Hiện nay mỗi năm nước ta có khoảng 1,3 triệu tấn đường được sản xuất

( quy mô công nghiệp và dân tự chế biến), tức khoảng 3 triệu tấn bã mía được thải ra

nhưng lại chưa được tận dụng hiệu quả Do vậy, việc tận dụng bã mía để sản xuất

bioethanol, một nguồn nhiên liệu sạch cho tương lai là một hướng đi vừa giúp giảm

thiểu ô nhiễm môi trường vừa có giá trị về mặt kinh tế [33]

2.2.2 Các thành phần chủ yếu trong bã mía

2.2.2.1 Giới thiệu về cấu trúc lignocellulose của bã mía

Bã mía là một dạng vật liệu lignocellulose bao gồm các thành phần chính là:

cellulose, hemicellulose và lignin Các thành phần trong lignocellulose liên kết với

nhau chặt chẽ tạo nên một cấu trúc hết sức vững chắc, do đó lignocellulose rất khó để

phân huỷ Hàm lượng mỗi thành phần phụ thuộc vào từng loại giống mía, trung bình

vào khoảng 50% cellulose, 25% hemicellulose và 25% lignin Ngoài ra trong bã mía

còn có tro và một số chất trích ly với hàm lượng thấp Bã mía với hàm lượng tro và

lignin thấp là một điều kiện hết sức thuận lợi để nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp

enzyme và hàm lượng cellulose cao rất thuận lợi cho việc chuyển hóa cellulose thành

bioethanol [33]

Về cơ bản trong lignocellulose, cellulose tạo thành khung chính và được bao

bọc bởi những chất có chức năng tạo mạng lưới như hemicellulose và kết dính như

lignin Cellulose, hemicellulose và lignin sắp xếp gần nhau và liên kết cộng hóa trị với

nhau Các loại đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và acid

4-Omethylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin [27]

Hình 2.4 : Cấu trúc của lignocelluloses [18]

Các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản Các sợi này được gắn lại với nhau

nhờ hemicellulose tạo thành cấu trúc vi sợi, với chiều rộng khoảng 25nm Các vi

sợi này được bao bọc bởi hemicellulose và lignin, giúp bảo vệ cellulose khỏi sự

tấn công của enzyme cũng như các hóa chất trong quá trình thủy phân [16]

Hình 2.5 : Mối quan hệ cellulose – hemicellulose - lignin trong cấu trúc lignocellulose

[25]

2.2.2.2 Cellulose

Cellulose là một polymer mạch thẳng của D-glucose được liên kết với nhau bởi

liên kết β -1,4-glycoside Cellulose là loại polymer phổ biến nhất trên trái đất, có độ

trùng hợp đạt được khoảng 3500 – 10000 DP Mạch đại phân tử cellulose có cấu trúc

dạng thẳng và cấu hình dạng ghế Các nhóm hydroxyl ở mỗi đầu mạch cellulose có

đặc điểm khác nhau C1 ở đầu mạch cellulose chứa nhóm aldehyde có tính khử,

trong khi đó nhóm hydroxyl ở vị trí C4 cuối mạch không có tính chất của rượu [8]

Hình 2.6 : Cấu trúc của cellulose

Ở trạng thái tự nhiên, mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro

và liên kết Van Der Waals hình thành hai vùng cấu trúc chính là kết tinh và vô định

hình Trong vùng kết tinh, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau một cách có

định hướng tạo cấu trúc trật tự cao, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như

hóa chất hoặc dung môi Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết không

chặt chẽ với nhau tạo cấu trúc lộn xộn xen lẫn với vùng kết tinh, do đó dễ bị tấn công

bởi các tác nhân thủy phân Có khoảng 65 -73% phần cellulose là ở trạng thái kết tinh

Ngoài ra, cellulose được bao bọc bởi hemicellulose và lignin, điều này làm cho

cellulose khá bền vững với tác động của enzyme cũng như hóa chất [16]

Có hai dạng cấu trúc của cellulose được đưa ra để mô tả vùng kết tinh và vùng vô

định hình của cellulose :

v Dạng Fringed fibrillar: phân tử cellulose được kéo thẳng và định hướng

theo chiều dài sợi Vùng tinh thể có chiều dài 500 và xếp xen kẽ với vùng vô định

hình

v Dạng Folding chain: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi Mỗi đơn vị

lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm a và b như trên hình 2.7

Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này

rất dễ bị thủy phân Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào

giữa, tính chất kết tinh càng cao Ở vùng vô định hình, các liên kết b - glucoside giữa

các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer

sắp xếp tạo sự thay đổi 180o cho toàn mạch [26]

Hình 2.7 : Kiểu Fringed fibrillar và kiểu Folding chain

2.2.2.3 Hemicellulose

Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp

khoảng 70 đến 200 đơn phân Hemicellulose là một polysaccharide phức tạp có thể tan

được trong cả kiềm và acid Hemicellulose chứa cả đường hexose (glucose,

D-mannose, D-galactose) hoặc đường pentose (D-xylose, L-arabinose, và D-arabinose),

deoxyhexose Thành phần cơ bản của hemicellulose trong các loại phụ phẩm nông

nghiệp như bã mía là β – D – xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β -(1,4)

glucoside Arabinose là thành phần có số lượng lớn thứ hai, các thành phần còn lại

thường chỉ chiếm với số lượng ít [16,36]

Độ bền hóa học và bền nhiệt của hemicellulose thấp hơn so với cellulose vì

chúng có độ kết tinh và trùng hợp thấp hơn So với cellulose, nó dễ bị thủy phân hơn

rất nhiều do hemicellulose thường tồn tại ở dạng mạch nhánh với cấu trúc ngẫu nhiên,

vô định hình, do đó dễ bị tấn công hơn Cấu tạo của hemicellulose phức tạp tùy theo

dạng nguyên liệu, nhưng có một số điểm chung:

ü Cấu tạo gồm hai phần: Mạch chính gồm các b - D xylopyranose liên kết với

nhau bằng liên kết b-(1,4)-xylanase Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông

thường là disaccharide hoặc trisaccharide Sự liên kết của hemicellulose với các

polysaccharide khác và với lignin là nhờ các mạch nhánh này

ü Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3 [26]

Hình 2.8 : Cấu tạo hóa học của đại diện hemicellulose

2.2.2.4 Lignin

Lignin là một polymer phân nhánh tìm thấy trong thành tế bào thực vật, có khả

năng chống lại sự phát triển của vi sinh vật Cấu trúc phức tạp, ngẫu nhiên, lộn xộn, và

chứa chủ yếu là các vòng thơm của lignin sẽ làm tăng tính đàn hồi, mềm dẻo cho việc

kết dính cellulose và hemicellulose, tạo nên một hàng rào phòng thủ mạnh mẽ nhằm

chống lại sự tấn công của enzyme và các hoá chất khác, bằng cách gắn chặt và làm

cứng các sợi cellulose lại với nhau

Thành phần chủ yếu của lignin là các đơn vị phenylpropane ( C9).Vòng thơm

chứa trong lignin rất nhiều, do bởi enzyme xúc tác phản ứng polymer hoá 3 đơn vị

phenyl-propane là: guaiacylpropane, syringylpropane, p-hydroxyphenylpropane, với

các tiền chất tương ứng là rượu coniferyl, rượu sinapyl, và rượu p-coumaryl Hàm

lượng tiền chất của lignin phụ thuộc vào nguồn gốc lignin

Hình 2.9: Ba tiền chất phenyl – propane của lignin

Toàn bộ phân tử lignin là một cơ cấu phức tạp, ba chiều, chứa đựng hàng ngàn

đơn vị phenyl-propane, được tạo nên bởi sự polymer hoá không có hệ thống của các

C6-C3, dẫn tới sự vững chắc của thành tế bào thực vật, và gây khó khăn cho sự thuỷ

phân sau này Tuy nhiên, cấu trúc hóa học của lignin rất dễ bị thay đổi trong điều kiện

nhiệt độ cao và pH thấp như điều kiện trong quá trình tiền xử lý bằng hơi nước Ở

nhiệt độ cao hơn 2000C, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi

cellulose [16, 27, 36]

2.2.2.5 Chất trích ly

Có rất nhiều chất thuộc nhóm thành phần này, chủ yếu là các chất dễ hòa tan

Các chất trích ly là những chất hoặc có khả năng hòa tan trong những dung môi hữu cơ

(như dietyl ether, methyl terbutyl ether, ether dầu hỏa, diclormethene, acetone,

ethanol, methanol, hexan, toluen, chiếm tỉ lệ ưu thế trong chất trích ly, nên

thường chất trích ly hay được gọi là nhựa (resin) [8]

2.2.2.6 Chất tro

Về thành phần hóa học, bã mía chứa khoảng 2,4% chất tro Do có chứa ít chất

tro nên bã mía là một nguồn nguyên liệu lý tưởng có nhiều triển vọng được sử dụng

trong các quá trình chuyển hóa sinh học bằng vi sinh vật [33]

2.2.3 Các phương pháp tiền xử lý bã mía

2.2.3.1 Mục đích của tiền xử lý

Để chuyển hóa các carbohydrate trong lignocellulose thành bioethanol, các

polymer phải được thủy phân thành các monomer để vi sinh vật sử dụng, lên men tạo

bioethanol Nhưng do bản chất của nguyên liệu lignocellulose rất bền vững trước sự

tấn công của enzyme và vi sinh vật, do vậy quá trình tiền xử lý là bắt buộc để phá vỡ

cấu trúc lignocellulose, chuẩn bị cho quá trình thủy phân bởi enzyme Quá trình tiền

xử lý lignocellulose cũng hết sức cần thiết trong lên men bán rắn nhằm loại bớt một số

thành phần (lignin, tro) ảnh hưởng không tốt lên sự phát triển của vi sinh vật Mục

đích cụ thể của quá trình tiền xử lý là:

− Phá bỏ cấu trúc bao bọc của lignin và hemicellulose đối với cellulose

− Giảm cấu trúc kết tinh của cellulose, tăng cấu trúc vô định hình

− Tăng trạng thái xốp của nguyên liệu, qua đó tăng diện tích tiếp xúc bên ngoài và

bên trong của nguyên liệu, thuận lợi cho sự xâm nhập của các tác nhân thủy phân

− Phân tách hemicellulose/ lignin khỏi cellulose tùy theo mục đích tiền xử lý [36]

Hình 2.10: Cấu trúc lignocellulose trước và sau khi tiền xử lý [18]

2.2.3.2 Yêu cầu quá trình tiền xử lý

− Nâng cao hiệu quả tạo thành đường khi thuỷ phân bằng enzyme

− Tránh sự thoái hoá hoặc thất thoát carbonhydrate

− Tránh sự hình thành các chất kiềm hãm quá trình thuỷ phân và lên men sau này

− Có hiệu quả về mặt kinh tế và thời gian

2.2.3.3 Các phương pháp tiền xử lý hóa học

Các phương pháp thuộc nhóm này sử dụng tác động của hóa chất trong quá trình

Phương pháp hóa học là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay Gồm có

các quá trình chính:

a Với acid

Mục đích của phương pháp là phá bỏ phần lớn cấu trúc bao bọc hemicelullose và

thay đổi cấu trúc lignin và loại bỏ một phần nhỏ lignin dẫn đến tăng khả năng tiếp cận

của các tác nhân thủy phân cellulose Phương pháp này sử dụng acid nồng độ cao và

nồng độ thấp ở nhiệt độ cao (1800C ), nồng độ bã rắn thấp (5-10%) , trong thời gian

ngắn hoặc ở nhiệt độ thấp, nồng độ bã rắn cao (10-40%) trong thời gian dài (30-90

phút) Các loại acid thường sử dụng là acid vô cơ như HCl, H2SO4, H3PO4… với nồng

độ khoảng 0.3 – 2% Tùy thuộc vào điều kiện tiến hành, sản phẩm phân hủy

carbohydrate có thể gây kiềm hãm đối với hoạt động của vi sinh vật

Ưu điểm: Nhanh, dễ dàng về mặt công nghệ với nhiều loại thiết bị phản ứng, có

thể tiền xử lý vật liệu có độ bền cao

Nhược điểm: Tốn kém chi phí về thiết bị chịu acid và hóa chất (đặc biệt với acid

nồng độ cao), khả năng hình thành các chất ức chế hoạt động vi sinh vật trong quá

trình tiền xử lý [14]

b Với kiềm

Mục đích của phương pháp là loại bỏ và thay đổi cấu trúc thành phần lignin dẫn

đến tăng khả năng tiếp cận của các tác nhân thủy phân cellulose và giảm độ hấp

phụ của enzyme lên thành phần lignin Phương pháp này có thể thực hiện ở nhiệt độ

phòng trong 1-2 ngày hoặc ở nhiệt độ cao trong thời gian ngắn Các loại kiềm thường

dùng là NaOH, KOH, Ca(OH)2, và NH4OH… NaOH có thể làm phồng nở cấu trúc

cellulose, tăng diện tích tiếp xúc của cellulose và làm giảm độ trùng hợp cũng như độ

kết tinh của cellulose NaOH đã được chứng minh tăng hiệu suất thủy phân gỗ cứng từ

14% lên 55% bằng cách giảm hàm lượng lignin từ 24-55% xuống còn 20% (Kumar và

cộng sự, 2009) Ngoài ra Ca(OH)2 cũng đang được nghiên cứu rộng rãi vì nó có giá

thành rẻ, không tốn kém thiết bị yêu cầu độ an toàn cao và có thể tái phục hồi bằng

phản ứng với CO2.

Ưu điểm : Hiệu quả cao, ít hòa tan cellulose và hemicellulose hơn so với xử lý

bằng acid hoặc bằng nhiệt, ít hình thành chất kìm hãm hoạt động của vi sinh vật, ít bị

thất thoát lượng đường lên men được

Nhược điểm: Tiền xử lý tốt với các loại vật liệu phế thải nông nghiệp tuy nhiên

khả năng tiền xử lý kém với các loại gỗ cứng [14]

c Phương pháp khác

Ngoài ra còn có những phương pháp như xử lý với dung môi hữu cơ: dùng dung

môi như ethanol, methanol, acetone để hòa tan lignin; hay sử dụng các loại hóa

chất khác: ozone, ure, KMnO4, dioxane, EDTA … [14]

2.2.3.4 Các phương pháp tiền xử lý vật lý và kết hợp hóa lý

Các phương pháp thuộc nhóm này không sử dụng hóa chất trong quá trình xử lý

Gồm các phương pháp như: nghiền nát, rọi bằng những bức xạ năng lượng cao, xử lý

thủy nhiệt và nổ hơi…

a Nổ hơi

Quá trình nổ hơi nước là một quá trình cơ – hóa – nhiệt Đó là phá vỡ cấu trúc

các hợp phần với sự giúp đỡ của nhiệt ở dạng hơi (nhiệt), lực cắt do sự giãn nở của ẩm

(cơ), và thủy phân các liên kết glycosidic (hóa)

Trong thiết bị phản ứng, nước dưới áp suất cao thâm nhập vào cấu trúc

lignocellulose bởi quá trình khuếch tán và làm ẩm nguyên liệu Ẩm trong

biomass sẽ hóa hơi đột ngột ra khi áp suất trong thiết bị phản ứng được giải phóng

và hạ đột ngột từ rất cao khoảng vài chục atm xuống còn áp suất khí quyển Nguyên

liệu được tống mạnh khỏi thiết bị qua một lỗ nhỏ bởi lực ép Nhiệt độ càng cao thì áp

suất càng cao, do đó càng làm gia tăng sự khác nhau giữa áp suất trong thiết bị phản

ứng so với áp suất khí quyển Sự chênh lệch về áp suất tỷ lệ với lực cắt của ẩm hóa

hơi

Phương pháp này tăng độ xốp của nguyên liệu, phá hủy phần lớn cấu trúc

hemicellulose và lignin Tuy nhiên, tiêu tốn nhiều năng lượng và hình thành các chất

gây kiềm hãm là những hạn chế lớn của phương pháp này [37]

b Nghiền cơ học

Mục đích của phương pháp này là giảm kích thước và độ kết tinh của vật liệu dẫn

đến tăng bề mặt tiếp xúc và giảm độ trùng hợp của cellulose Phương pháp này có thể

kết hợp các biện pháp như cắt, bào mỏng, xay hoặc nghiền dựa vào kích thước mong

muốn đạt được của vật liệu, thường là 10-30 mm sau quá trình cắt, 0.2-2 mm sau quá

trình nghiền hoặc xay (Sung và Cheng, 2002) Nhược điểm của phương pháp này là

tiêu tốn năng lượng cho quá trình xay nghiền, do vậy chưa đáp ứng được yêu cầu về

mặt kinh tế, cần nghiên cứu phát triển thêm

c Các phương pháp khác

Ngoài ra còn các phương pháp khác như nổ CO2, nổ SO2, xử lý với nước nóng

160-2400C, nổ NH3(AFEX), xử lý với tác nhân oxy hóa ẩm, xử lý bằng vi sóng, sóng

siêu âm…và kết hợp các phương pháp trên [14, 36]

2.2.3.5 Phương pháp tiền xử lý sinh học

Trong các phương pháp khác nhau kể trên thì các phương pháp hóa học và nhiệt

hóa học hiện nay là có hiệu quả nhất và có tính khả thi hơn cả về công nghệ trong việc

ứng dụng vào quá trình sản xuất ethanol công nghiệp Tuy nhiên xử lý bằng phương

pháp hóa học gây nhiều tốn kém và ảnh hưởng nặng đến môi trường, do đó hiện nay

phương pháp sinh học đang dần được được hoàn thiện để thay thế toàn phần hay sử

dụng kết hợp với các phương pháp hóa học Bằng cách sử dụng loại nấm mục nâu,

trắng và mềm như Phanerochaete chrysosporium, Ceriporia lacerate, Pycnoporus

cinnarbarinus, Streptomyces viridosporus, Phelebia tremellosus, Pleurotus florida và

Peurotus cornucopiae, Cyathus sp có khả năng thủy phân lignin và hỗ trợ một phần

thủy phân nguồn nguyên liệu cellulose Phương pháp này không sử dụng thêm hóa

chất nào nên thân thiện môi trường, tiêu tốn ít năng lượng, giảm chi phí đầu tư Tuy

nhiên, thời gian xử lý kéo dài và hiệu quả thủy phân thấp là hạn chế lớn của phương

pháp này [14, 16]

2.3 Enzyme cellulase

Cellulase là phức hệ enzyme có tác dụng xúc tác cho quá trình thủy phân cơ chất

cellulose thông qua việc thủy phân liên kết β-1,4- glucoside trong cellulose Enzyme

cellulase đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới Đây là enzyme có ứng dụng rất

rộng rãi, chỉ đứng sau protease và amylase Enzyme cellulase có thể được thu nhận từ

vi khuẩn, nấm mốc, protozoan và một số động, thực vật Enzyme cellulase thu nhận từ

các nguồn khác nhau sẽ có thành phần khác nhau [21, 28]

2.3.1 Phân loại

Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzyme cellulase được chia

làm ba loại chủ yếu:

2.3.1.1 Exoglucanase (EC 3.2.1.9.1)

Enzyme này còn có các tên gọi khác như: exo-β-1,4-glucanase, avicelase,

cellobiohydrolase, exo-cellobiohydrolase, exo-β-glucancellobiohydrolase, cellulase

C1, CBH I, β -1,4-glucan cellobiosidase…

Exoglucanase thủy phân liên kết β -1,4-glucoside từ đầu không khử của chuỗi

cellulose tạo thành cellobiose hoặc glucose Exoglucanase từ một số vi sinh vật còn có

thể thủy phân từ cả đầu khử và không khử của cellulose (CBHI và CBHII từ

Trichoderma) Exoglucanase không thủy phân cellulose dạng kết tinh và dạng hòa tan

mà chỉ làm thay đổi tính chất lý hoá của chúng nhưng có tác dụng thủy phân

cellulose đã được cắt ngắn mạch ( như Avicel 150-500 DP) Do vậy, vai trò chính

của enzyme này là giúp cho endoglucanase tác động lên cellulose kết tinh

2.3.1.2 Endoglucanase (EC.3.2.1.4)

Enzyme này còn có các tên gọi khác như: endo- β -1,4-glucanase, avicelase,

Cx, CMCase ,endocellulase,β-1,4-glucanase,β-1,4-endoglucan hydrolase, pancellase

SS, celludextrinase, cellulase A alkali cellulase

Endocellulase thủy phân liên kết β -1,4 glucoside một cách ngẫu nhiên bên

trong chuỗi cellulose để giải phóng cellodextrin và cellobiose Enzyme này tác động

mạnh đến cellulose vô định hình nhưng tác động yếu đến cellulose kết tinh

2.3.1.3 β -glucosidase (EC.3.2.1.21)

Enzyme này còn có các tên gọi khác như: cellobiase β Dglucosidase, β

-1,6-glucosidase, p-nitrophenyl β -glucosidase, salicilinase… Enzym này thủy phân

cellobiose và các cello-oligosaccharide mạch ngắn tạo thành glucose; β-glucosidase

không tấn công cellulose hoặc các cellodextrin khác [7,16]

2.3.2 Cấu trúc và tính chất enzyme cellulase

2.3.2.1 Cấu trúc enzyme cellulase

Abuja và cộng sự (1980) đề nghị cấu trúc bậc 3 của T reesei CBH I và CBH II:

Trung tâm xúc tác (CD: catalytic domain): có kích thước lớn

Trung tâm tạo liên kết với cellulose (CBD: cellulose binding domain): có

kích thước nhỏ hơn Nghiên cứu cấu trúc của trung tâm tạo liên kết với cellulose

CBD của CBH I cho thấy đây là một chuỗi polypeptide gồm có 36 amino acid và có

một mặt thể hiện tính chất kỵ nước mạnh Về mặt lý thuyết, có thể kết luận rằng CBD

có vai trò quan trọng trong việc ổn định sự liên kết tạm thời giữa cellulase và

bề mặt cellulose Trên bề mặt cellulose có vùng kỵ nước là do sự sắp xếp chặt chẽ và

do liên kết hydrogen mạnh giữa các mạch cellulose, góp phần ngăn cản, không cho các

phân tử lớn như nước xâm nhập vào cấu trúc này Chính tương tác giữa hai vùng có

tính chất kỵ nước của cellulose và CBD mà enzyme được liên kết với cellulose

Cầu nối peptide: có tác dụng liên kết hai trung tâm này lại với nhau Đối với

enzyme cellulase, cầu nối peptide là một vùng ái đường, được cấu tạo bởi các amino

acid serine, threonin và proline

Hình 2.11: Các amino acid liên kết CD và CBD 2.3.2.2 Tính chất của enzyme cellulase

Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl

cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC) Cellulase cắt liên kết β

-1,4-glucoside trong cellulose, lichenin và các β -D-glucan của ngũ cốc

Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau Cellulase hoạt động ở

pH từ 3 – 7, nhưng pH tối thích trong khoảng 4 và 5 Nhiệt độ tối ưu vào khoảng 40

– 500C Hoạt tính cellulase bị phá hủy hoàn toàn ở 800C trong 10 - 15 phút

Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose và

bị ức chế hoàn toàn bởi Hg Ngoài ra, cellulase còn bị ức chế bởi các ion kim loại khác

như Mn, Ag, Zn nhưng ở mức độ nhẹ [16,21]

2.3.3 Cơ chế tác động của enzyme cellulase lên cellulose

Quá trình enzyme cellulase xúc tác thủy phân cơ chất cellulose có thể chia thành

ba giai đoạn sau:

− Quá trình enzyme hấp phụ lên xơ sợi

− Quá trình tạo liên kết giữa cellulase và cellulose

− Quá trình thủy phân phối hợp của phức hệ enzyme cellulose

2.3.3.1 Quá trình enzyme hấp phụ lên xơ sợi

Có hai yếu tố quyết định năng lượng hấp phụ của protein lên bề mặt phân pha

rắn/lỏng là bản chất của bề mặt và lực liên kết giữa các phân tử Những tương tác này

thường tạo thành do liên kết hydro, lực tĩnh điện hoặc là tương tác giữa các nhóm

kỵ nước Tùy thuộc vào tính chất của protein và bề mặt hấp phụ mà tương tác tĩnh điện

hay tương tác của các nhóm kỵ nước sẽ đóng vai trò quyết định cho quá trình

Bề mặt cellulose mang bản chất kỵ nước do không còn nhóm chức tự do ( các

nhóm chứa đã tạo liên kết hydro giữa các mạch) Các nghiên cứu về quá trình tiền xử

lý – nổ hơi cho thấy sau quá trình này, tính chất kỵ nước của cơ chất tăng Trong khi

đó, protein là một polymer lưỡng cực Phần kỵ nước trong phân tử protein là những

nhóm chứa nhân thơm như trong tryptophane, phenylalanine và tyrosine Thông

thường, khi phân tử protein bị gấp khúc, các amino acid mang nhóm kỵ nước sẽ được

giấu vào bên trong Tuy nhiên, cũng có một vài phần kỵ nước được sắp xếp tại bề

mặt ngoài của phân tử protein Chính các phần này tạo liên kết với các cơ chất mang

bản chất kỵ nước (cellulose)

Cellulose tinh khiết không chứa nhóm mang điện Trong thực tế, điện tích bề

mặt của các chất sẽ được tạo thành khi có sự phân bố các ion từ bề mặt đó Ví dụ các

bề mặt tiếp xúc với nước thường mang điện âm Các phân tử protein hay các ion khối

lượng phân tử thấp đã hấp phụ trước trên bề mặt sẽ có ảnh hưởng đến sự hấp phụ

mới Điện tích của cellulase và sự hiện diện của nhóm không phân cực có thể dẫn

đến sự hấp phụ không chọn lọc lên cả cellulose và lignin Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra

rằng, cellulase hấp phụ lên cả lignin trong vật liệu lignocellulose [16, 21]

2.3.3.2 Quá trình tạo liên kết giữa cellulase và cellulose

Cellulase tương tác với bề mặt cellulose thông qua trung tâm liên kết cellulose

CBD và trung tâm hoạt động chính CD.Trung tâm tạo liên kết của cellulase CBD

làm phá hủy một phần cấu trúc chặt chẽ của các mạch cellulose Sau đó, các mạch

này sẽ được dẫn vào vùng trung tâm hoạt động CD của cellulase Quá trình dẫn

này xảy ra nhờ sự hiện diện của mạch peptide ưa nước, khu vực này sẽ tạo các liên

kết hydro bao bọc sợi cellulose, nhằm tránh sự xâm nhập quá sâu của CBD vào bề mặt

cellulose

Hình 2.12: Quá trình tác động exo-glucanase lên đầu vùng kết tinh của cellulose

2.3.3.3 Quá trình thủy phân phối hợp của phức hệ enzyme cellulase

Từ những năm 1954, Gilligan và Reese đã chỉ ra rằng việc pha trộn cellulase từ

các nguồn nấm mốc khác nhau có thể làm tăng lượng đường khử tạo thành trong

quá trình thủy phân Từ đó, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm mô tả quá trình

tác động tương trợ của các enzyme endo-glucanase, glucanase Enzyme

exo-glucanase thường tấn công vào những cellulose đã bị cắt mạch (cellodextrin) có đầu là

nhóm khử hoặc không khử Trong khi đó, enzyme endo-glucanase lại tấn công ngẫu

nhiên vào giữa mạch cellulose, tạo thành các cellodextrin, là các cơ chất thích hợp của

enzyme exo-glucanase Do vậy, sự tác động tương trợ của endo-exo có thể nói là

nhằm mục đích tạo bề mặt tấn công mới cho exoglucanse Dựa trên các nghiên cứu

này, enzyme cellulase có thể được pha trộn với các thành phần từ các nguồn khác

nhau nhằm tạo được một hệ enzyme có tác động mong muốn Sự tương trợ của hệ

enzyme thủy phân cellulose có thể được tóm tắt như sau:

ü Quá trình thủy phân sơ cấp ( xảy ra trên bề mặt của cơ chất rắn) :

− Enzyme endo-cellulase tấn công ngẫu nhiên vào mạch cellulose nhờ tạo liên

kết bằng tương tác giữa CBD với cellulose, tạo thành các oligosaccharide

− Enzyme exo – cellulase tấn công vào cellulose và cả oligomer từ đầu đường khử

và không khử thông qua tương tác của CBD với cellulose, tạo thành

cellobiose và glucose giải phóng vào pha lỏng

ü Quá trình thủy phân thức cấp (pha lỏng) :

− β-glucosidase tấn công cellobiose và oligosaccharide tan trong pha lỏng, tạo

glucose [21]

Hình 2.13: Cơ chế thủy phân cellulose của enzyme cellulase [21]

2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

2.3.4.1 Ảnh hưởng của cấu trúc nguyên liệu

Hiệu suất quá trình thủy phân bị ảnh hưởng mạnh bởi tính chất của nguồn

nguyên liệu Cấu trúc tự nhiên của lignocellulose tạo ra nhiều cản trở đến quá trình tấn

công của các tác nhân thủy phân Nếu lignocellulose không được tiền xử lý, hiệu quả

thủy phân thấp Xử lý loại bỏ hemicelluose và lignin sẽ làm tăng cấu trúc xốp đồng

thời tăng bề mặt cellulose, làm cho enzyme dễ tấn công hơn, do vậy làm tăng khả năng

thủy phân cellulose [36]

2.3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Tốc độ phản ứng thủy phân tăng theo nhiệt độ, tuy nhiên đến một nhiệt độ nhất

định, tốc độ phản ứng sẽ giảm dần và đến mức triệt tiêu Phần lớn enzyme hoạt động

mạnh nhất ở nhiệt độ 40 – 500C Riêng đối với enzyme cellulase, nhiệt độ tối ưu là

500C Những enzyme khác nhau đều có nhiệt độ tối ưu khác nhau [7]

Khi ở nhiệt độ 00C, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt

độ lên từ từ, hoạt tính của enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu Nếu đưa nhiệt độ

cao hơn nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi đó enzyme không có khả

năng phục hồi hoạt tính Phản ứng vô hoạt của enzyme dưới tác dụng của nhiệt thường

biểu diễn là phản ứng bậc một [6]

Trong đó:

k : hằng số vận tốc phản ứng

E : nồng độ enzyme hoạt động ở thời điểm t

Eo : nồng độ ban đầu của enzyme hoạt động

2.3.4.3 Ảnh hưởng của pH

pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc

biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến

phản ứng của enzyme Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính Tuy nhiên

cũng có nhiều enzyme hoạt động ở môi trường acid yếu Một số enzyme khác lại hoạt

động mạnh ở pH kiềm và cả pH acid Đối với enzyme cellulase, khoảng pH thích hợp

là 4-5, trong đó tốt nhất là 4.8 [7]

2.3.4.4 Nồng độ enzyme

Khi nồng độ enzyme tăng, tốc độ phản ứng tăng theo đường thẳng Tuy nhiên,

khi nồng độ enzyme đạt đến một ngưỡng nào đó, nồng độ cơ chất sẽ trở thành yếu tố

hạn chế tốc độ phản ứng Khi đó, tốc độ phản ứng sẽ không tăng nữa mà là một đường

nằm ngang [7]

Hình 2.14 : Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

2.3.4.5 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng enzyme tăng, vì sẽ có nhiều cơ chất

va chạm với enzyme tiến hành phản ứng Khi nồng độ cơ chất đủ lớn, các enzyme bị

bão hòa cơ chất, vì vậy, tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng sẽ không thay đổi

đáng kể [7]

2.3.4.6 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm

Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các

phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay

đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng Các chất gây kìm

hãm hoạt động của enzyme bao gồm các ion, các phần tử vô cơ, các chất hữu cơ và cả

protein Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi ở

tế bào sinh vật

Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận

nghịch Trong trường hợp các chất kìm hãm thuận nghịch, phản ứng giữa enzyme và

chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt được cân bằng

Trong đó: E – enzyme, I – chất kìm hãm k1, k2 hằng số vận tốc phản ứng thuận nghịch

Trong trường hợp phản ứng ức chế là không thuận nghịch, hằng số k2 sẽ rất nhỏ

và không đáng kể Các chất kìm hãm liên kết cộng hóa trị với enzyme tạo thành phức

hợp EI Phức hợp này bị phân rã rất chậm Tùy thuộc vào bản chất phức EI, bản chất

chất kìm hãm người ta chia ra những chất kìm hãm :

Chất kìm hãm cạnh tranh: là những chất có cấu trúc tương tự như cơ chất và có

khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme Do đó, chúng sẽ chiếm vị trí

của cơ chất trong trung tâm hoạt động và vì vậy, cơ chất không còn cơ hội tiếp cận với

trung tâm này Chúng thường là những chất kìm hãm thuận nghịch

Chất kìm hãm không cạnh tranh: chất kìm hãm không chiếm trung tâm hoạt động

của enzyme mà là ở một vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzyme Kết quả sự kết

hợp này, chất kìm hãm làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo

chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác Các chất kìm hãm không cạnh tranh thường

gồm hai loại: kìm hãm do sản phẩm phản ứng và kìm hãm do thừa cơ chất [6, 7]

Đối với enzyme cellulase, người ta nhận thấy, sản phẩm của phản ứng thủy phân,

bao gồm cả cellobiose và glucose đều có tác động kìm hãm hoạt tính của cellulase, đặc

biệt là cellobiose [35]

2.4 Sản xuất chế phẩm cellulase

2.4.1 Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase

2.4.1.1 Một số loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase

Trong tự nhiên không có một loài vi sinh vật nào có khả năng sinh tổng hợp tất

cả các enzyme trong phức hệ enzyme cellulase Số lượng vi sinh vật tổng hợp cellulase

rất phong phú Chúng thuộc nấm sợi, vi khuẩn, xạ khuẩn…Một số loài phổ biến được

nghiên cứu như:

Nấm mốc (Fungi): Trichoderma, Aspergillus, Phanerochaete , Schizophyllum,

Fusarium, Acremonium, Myrothecium, Penicillium, Humicola …

Vi khuẩn (Bacteria) : Clostridium, Thermonospora, Cellumonas, Ruminococcus,

Bacillus, Bacteriodes, Erwinia, Acetovibrio, Microbispora và Streptomyces

Trong đó hai giống Trichoderma và Aspergillus là các chủng giống được các

nhà khoa học nghiên cứu sản xuất cellulase (Bothast và Saha, 1997) và hầu hết các

chế phẩm cellulase thương mại hiện nay đều được sản xuất từ hai chủng giống này

Một số nghiên cứu cho thấy Trichoderma tổng hợp một lượng lớn endoglucanase và

exoglucanase, nhưng chỉ một lượng rất nhỏ β-glucosidase, trong khi đó, các chủng

thuộc giống Aspergillus sinh ra một lượng tương đối lớn endoglucanase và

β-glucosidase nhưng chỉ một lượng ít exoglucanase Do vậy, nếu dùng cellulase từ

Trichoderma bổ sung thêm β-glucosidase hoặc phối trộn cellulase từ hai chủng này

cho thấy hiệu quả rất cao [21, 28, 36]

Manonmari và cộng sự (1987) thủy phân bã mía với hệ cellulase phối trộn từ hai

chủng A.ustus và T.viride đạt hiệu suất thủy phân đến 90% Gottschalk và cộng sự

(2010) đã tiến hành phối trộn hệ enzyme cellulase thô thu được từ hai chủng T

reesei và A awamori cho hiệu quả thủy phân bã mía xử lý nổ hơi cao gấp hai lần so

với từng chủng riêng rẽ Xia và Sheng (2004) thực hiện lên men bán rắn với hai

chủng T reesei ZU-02 và A niger ZU-07 trên môi trường gồm lõi ngô và cám mì, hệ

cellulase phối trộn thủy phân lõi ngô tạo 56.7 g/l glucose đủ để lên men tạo ethanol Ở

Việt Nam, Nguyễn Chí Dũng (2009) đã tiến hành lên men riêng rẽ hai chủng giống T

reesei và A niger trên các loại bã phế liệu nông nghiệp như rơm, bã mía, lõi ngô chưa

tiền xử lý Tiến hành thủy phân 10% lõi ngô được hấp ở 1210

C, 20 phút bằng hệ

cellulase phối trộn tỉ lệ A niger/ T reesei 4/6 đạt lượng đường khử 2.31 g/l, hiệu suất

thủy phân đạt 20.79 %

Trong khuôn khổ luận văn này đã sử dụng hai chủng giống T reesei và A niger

lên men bán rắn thu cellulase với bã mía tiền xử lý với kiềm là cơ chất cảm ứng sinh

tổng hợp cellulase và sử dụng hệ cellulase phối trộn từ hai chủng giống thủy phân bã

mía tạo đường lên men được