2.4.5.1. Các dạng chế phẩm cellulase
Trong thực tế sản xuất, các chế phẩm enzyme có thể được sử dụng dưới các dạng khác nhau như: chế phẩm thô, chế phẩm kỹ thuật hoặc chế phẩm tinh khiết tùy theo mục đích và yêu cầu sử dụng.
Chế phẩm thô là chế phẩm bao gồm cả enzyme, protein phi enzyme, môi trường sau nuôi cấy, có thể còn cả vi sinh vật. Chế phẩm này có thể giữ lâu dài và sử dụng trong trong chăn nuôi, trong công nghiệp sản xuất cồn, công nghiệp giấy, công nghiệp dệt, trong xử lý môi trường…
Trang 37
Chế phẩm kỹ thuật là chế phẩm đã được tinh chế sơ bộ, trong đó một số protein và enzyme tạp đã được tách ra. Trong chế phẩm kỹ thuật thường chứa hỗn hợp một vài enzyme. Chế phẩm này thường được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm hay công nghiệp nhẹ để giữ màu sắc, hương vị và chất lượng sản phẩm.
Chế phẩm enzyme tinh khiết là chế phẩm đã loại hoàn toàn các protein và enzyme tạp, chỉ còn lại duy nhất một enzyme mong muốn. Các chế phẩm này chỉ dùng trong y học, nghiên cứu khoa học và phân tích.
Từ canh trường có thể thu nhận các chế phẩm enzyme có độ tinh khiết khác nhau qua các bước chính sau:
Phần lớn các enzyme thủy phân dễ tan trong nước cho nên việc tách chúng từ canh trường khá thuận lợi. Để chiết rút enzyme từ canh trường rắn, người ta thường dùng nước, dung dịch muối trung tính hay các dung dịch đệm thích hợp. Canh trường sau nuôi cấy được cho vào một trong các dung dịch trên theo tỷ lệ thích hợp, khuấy đều hoặc lắc trên máy lắc trong một thời gian xác định, lọc hay ly tâm để thu lấy dịch trong. Còn để thu enzyme từ canh trường lên men chìm thì trước hết cần lọc bỏ sinh khối vi sinh vật và các tạp chất không tan. Dịch lọc thu được chứa 1 – 3% chất khô hoà tan. Một số tác giả người Nhật cho rằng nên lọc chứ không nên ly tâm vì ly tâm thường làm giảm đáng kể hoạt độ enzyme.
Trong bước này cần lưu ý: tỷ lệ nước và canh trường nuôi cấy khác nhau sẽ trích được lượng enzym khác nhau, lượng nước dùng để ly trích thường gấp 5 lần so với lượng canh trường nuôi cấy. Thời gian ly trích thích hợp khoảng 30 – 40 phút. Nhiệt độ ly trích tối thích là 20 – 300C. Hơn nữa, để tăng cường khả năng thu enzyme thì canh trường phải được đánh tơi trước khi ly trích. Trong công nghiệp, thường sử dụng hệ thống thiết bị trích ly liên tục gồm nhiều thùng chứa canh trường, trong mỗi thùng enzyme sẽ trích được nhiều lần. Cách làm này giúp tăng hiệu suất thu enzyme, tăng nồng độ chất khô và hàm lượng protein trong dịch chiết thu được. Dịch chiết làm lạnh tiếp tục được cô đặc 3 – 5 lần dưới áp suất thấp trong để dịch cô đặc có hàm lượng chất khô đạt khoảng 50 – 55%. Điều quan trọng là phải chọn thời gian và nhiệt độ
Trang 38
thích hợp để tránh vô hoạt enzyme. Đem dịch cô đặc sấy khô ta thu được chế phẩm enzyme thô dạng bột loại kỹ thuật [7, 17].
2.4.5.2. Một số chế phẩm cellulase có trên thị trường
Hiện nay có nhiều hãng sản xuất chế phẩm enzyme với sản lượng hàng năm 15.000 tấn, trị giá 10 triệu USD. Nhật Bản là nước có truyền thống lâu đời trong lĩnh vực sản xuất enzyme. Sau đó là một số nước khác như: Mỹ, Anh, Pháp, Đan Mạch, Thụy Điển. Các chế phẩm cellulase đã sản xuất và được bán trên thị trường đa số là hỗn hợp nhiều loại enzyme, trong đó có cellulase. Có thể điểm sơ qua một số chế phẩm được ứngdụng khá rộng rãi như sau:
ü CELLIC® CTec2 : chế phẩm cellulase của Novozyme sử dụng chuyên dùng cho sản xuất bioethanol từ lignocellulose, có khả năng thủy phân đến 20% bã với liều lượng 0.034-0.06 ml/g cellulose với thời gian 72h. Ngoài ra còn có một số sản phẩm cellulase dùng trong công nghiệp như : Cellusoft®AP, Cellusoft®CR , Carezyme®, Denimax® 601l…
ü OPTIMASH™ VR, OPTIMASH™ XL, OPTIMASH™ BG, Accelerase®1500, Accelerase® XC : chế phẩm cellulase, β-glucannase, xylanase của Genencor International chuyên dùng để sản xuất ethanol từ biomass.
ü Enzeco ® Cellulase CEs (dạng lỏng), Cellulase cep (dạng bột): thu được từ T. longibrachiatum, sử dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm.
ü Enzeco ® Cellulase CRX và Enzeco ® Cellulase PG thu nhận từ A. niger, sử dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm.
ü Chế phẩm “Biosim” được sản xuất ở Mỹ bằng phương pháp lên men bề mặt nấm A. oryzae chứa 26 loại enzym khác nhau, trong đó có cellulase, amylase, protease, pectinase…
ü Chế phẩm “Pancellase” có chứa cellulase, hemicellulase, amylase, protease. Chế phẩm “Onozuka” chứa cellulase và hemicellulase. Hoạt tính cellulase khoảng 450.000 đơn vị/g của các hãng hãng Nagaze, Amano, Kaseizeiulion (Nhật) dùng trong nông nghiệp.
Trang 39
ü Ở Việt Nam, Công ty TNHH Gia Tường (Bình Dương) có sản xuất một số chế phẩm cellulase dạng bột mịn từ canh trường nuôi cấy A. niger, chế phẩm có màu vàng sáng không tan, được dùng để hổ trợ tiêu hóa cho vật nuôi như:
− Feedadd NC1: hoạt tính cellulase là 17,5UI/g bổ sung vào thức ăn cho lợn con. − Feedadd NC1.2: hoạt tính cellulase là 15,5UI/g bổ sung vào thức ăn cho lợn thịt. − Feedadd NC2S: hoạt tính cellulase là 8,3UI/g bổ sung vào thức ăn cho gà.
− Feedadd NC3: hoạt tính cellulase là 24,1UI/g bổ sung vào thức ăn cho bò [30, 42, 43].
Trang 40
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Vật liệu
3.1.1. Bã mía
Bã mía được lấy từ công ty sản xuất mía đường NIVL, tỉnh Long An. Bã mía đem về có dạng sợi nhỏ, khô, màu nâu nhạt. Bã mía được cắt nhỏ bằng máy xay về kích thước vào khoảng 2- 4 mm và được rửa nước nóng để loại hết đường cũng như các tạp chất, sau đó được sấy ở 500C về độ ẩm 12% và bảo quản không cho thấm nước.
3.1.2. Giống vi sinh vật
Giống vi sinh vật được sử dụng trong nghiên cứu gồm có ba chủng giống
Trichoderma reesei A, B, C và chủng Aspergillus niger lấy từ bộsưu tập giống của Bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Bách Khoa TPHCM. Các chủng giống được trữtrên môi trường thạch PGA (Phụ lục 1) ở 40C và được cấy chuyền mỗi 4 tuần.
Phương pháp cấy chuyền : Sử dụng que cấy móc đã thanh trùng cấy chuyền theo từng điểm, hay gõ vào thành ống cho bào tử bung khắp bề mặt thạch. Giống sau khi cấy, nuôi ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong thời gian 5-7 ngày. Sau đó bảo quản ở 40C.
3.1.3. Cơ chất dùng trong lên men bán rắn
3.1.3.1. Cám mì
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng cám gạo được mua từ Chợ Lớn, chọn loại còn mới không bị mối mọt và màu tươi, không có mùi hôi, sấy khô về độ ẩm 11% và bảo quản.
Cám là một trong những cơ chất thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật, đặc biệt là các loại nấm sợi, có khả năng cảm ứng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme, trong đó có cellulase. Do đó chất lượng của cám ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp enzyme. Cám được sử dụng trong thí nghiệm là cám gạo, thường chiếm 6- 8% khối lượng hạt thóc. Tùy theo loại hạt giống lúa, điều kiện canh tác, máy móc thiết
Trang 41
bị xay xát mà lượng cám sẽ có chất lượng và thành phần thay đổi khác nhau. Có thể tóm tắt các thànhphần theo bảng sau:
Bảng 3.1 : Thành phần hoá học của cám mì
Thành phần trong cám gạo Đơn vị phần trăm (%)
Độ ẩm 9.1-14.3 Protein 9.8-15.1 Lipid 7.7-19.8 Tro 7.1-15.2 NFE 34.2-46.1 Xơ thô 5.7-20.9 Pentosan 8.7-11.4 Cellulose 5.0-12.0
Ngoài ra cám gạo còn chứa nhiều khoáng chất và vitamin đặc biệt đó là vitamin nhóm B và E. Những khoáng chất và vitamin tiêu biểu được trình bày theo bảng sau:
Bảng 3.2 : Thành phần các khoáng chất, vitamin của cám gạo
Thành phần khoáng/vitamin cám gạo Đơn vị tính γ/g
Na 0.11-0.32 K 8.07-15.12 Ca 0.14-0.37 Fe 0.06-0.28 Zn 0.04-0.10 Mn 0.05-0.14 Thiamin (B1) 10.6 Ribofllavin (B2) 5.7 Piridoxin (B6) 12.2 Niacin ( vitamin nhóm B) 30.9
Trang 42 3.1.3.2. Trấu
Trấu dùng trong đề tài được lấy từ nhà máy xay xát gạo ở Long An, có độ ẩm 10 %, có chất lượng tốt, chúng được rửa sạch, sấy khô và bảo quản không cho thấm nước và không bị mục nát. Trấu được bổ sung vào môi trường với mục đích làm tăng độ xốp, tạo nên những khoảng trống để không khí có thể lưu thông trong lòng môi trường, cung cấp không khí giúp cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển thuận lợi. Theo một số nghiên cứu cho thấy trấu là cũng là một yếu tố kích thích tốt cho sinh tổng hợp hệ enzyme cellulase ở nhiều loài nấm mốc.
3.1.3.3. Muối amoni sunfat (NH4)2SO4
Để nấm mốc phát triển bình thường không thể thiếu nguồn đạm (nitơ), đây là một chất quan trọng có mặt trong hầu hết các đại phân tử sinh học (protein, acid nucleic, enzyme..) và trong cấu tạo tế bào. Người ta có thể dùng nhiều nguồn nitơ khác nhau như : cao ngô, bột đậu tương, bột lạc, các loại dầu, pepton...hay từ nguồn vô cơ như urea, amoni sunfat... Theo nhiều nghiên cứu, các nguồn nitơ vô cơ tốt cho việc sinh tổng hợp cellulase còn các nguồn nitơ hữu cơ lại tốt cho quá trình sinh trưởng của nấm sợi. Trong nghiên cứu này dùng amoni sunfat là sản phẩm được thương mại hóa, rẻ và dễ sử dụng, xuất xứ từ hãng Huankai, Trung Quốc.
3.1.4. Enzyme thương mại
Enzyme được sử dụng là enzyme cellusoft L có nguồn gốc từ Novo Nordisk – Đan Mạch. Enzyme này được chúng tôi mua tại công ty TNHH Nam Giang, 133/11 Hồ Văn Huê, quận Phú Nhuận với tên thương mại là Cellusoft L, có dạng lỏng, màu nâu đỏ. Đây là một chế phẩm cellulase điều chế bằng phương pháp lên men chìm với hoạt tính biểu thị 1500 NCU/g. Hoạt tính biểu thịnày được xác định theo phương pháp phân tích của Novo Nordisk, AF 187.2.
Các thông số của enzyme Cellusoft L: − Nhiệt độ hoạt động tối ưu 500
C − pH hoạt động tối ưu 4.8
Trang 43 3.2. Nội dung tổng quát
3.2.1. Sơ đồ nội dung tổng quát
Hình 3.1 : Sơ đồ nội dung thí nghiệm
Hình 3.1 : Sơ đồ nội dụng thí nghiệm Trong đó:
CP 1T, 2T, 3T : Chế phẩm enzyme loại 1, 2, 3 từ chủng giống Trichoderma reesei. CP 1A, 2A, 3A : Chế phẩm enzyme loại 1, 2, 3 từ chủng giống Aspergillus niger.
3.2.2. Các phương pháp nghiên cứu
3.2.2.1. Phương pháp tiền xử lý bã mía
Aspergillus niger Tiền xử lý Phối trộn 3T+3A Thủy phân bã mía Cellusoft L Đệm, lắc Lọc, ly tâm Phối trộn 1T+ 1A CP 1T Lọc, ly tâm CP 3A CP 2A Sấy (12h, 400C) Đệm, lắc Nghiền Phối trộn 2T+ 2A
Khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp cellulase
Hỗn hợpsau nuôi cấy
CP 3T CP 1A
Sấy (12h, 400C)
CP 2T
Nghiền
Trichoderma reesei
Tuyển chọn chủng sinh cellulase mạnh Khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh tổng
hợp cellulase
Trang 44
Bã mía được tiền xử lý với hai chếđộở nhiệt độ phòng (tiết kiệm năng lượng) và ở nhiệt độ cao (tiêu tốn nhiều năng lượng hơn). Chế độ tiền xử lý ở nhiệt độ phòng được thực hiện theo Reeta Rani Singhania và cộng sự (2006) với 100g bã mía/1 lít NaOH 0.1 N, trong 12 giờ, nhiệt độ phòng. Chếđộ tiền xử lý ở nhiệt độcao được thực hiện theo Xuebing Zhaoa (2009) và cộng sự với 10% bã mía/dung dịch NaOH 2% trong 1.5h ở 900C. Bã mía sau khi tiền xửlý được rửa bằng nước cất nóng để rửa sạch hết lignin thu được bã có màu trắng vàng. Bã mía sau đó được rửa lại bằng nước cất và chỉnh về pH 5 bằng HCl 2N. Sấy khô bã mía sau tiền xử lý ở 50oC trong 16-18 giờ về độẩm 11-12% và bảo quản.
3.2.2.2. Quan sát hình thái giống
ü Quan sát đại thể
Nhằm xác định những đặc trưng về hình thái của hai chủng giống nấm mốc. Quan sát đại thể được tiến hành như sau : dùng que cấy móc vô trùng lấy một ít bào tử đơn và cấy vào tâm đĩa petri chứa thạch PGA. Ủở nhiệt độ phòng. Sau 3-7 ngày, quan sát hình dạng và màu sắc của khuẩn lạc.
ü Quan sát vi thể
Dùng phương pháp nuôi cấy phòng ẩm để quan sát hình dạng, cấu trúc sợi tơ và cơ quan sinh sản của nấm mốc.
Cho vào đĩa Petri một tờ giấy hoặc bông thấm, phía trên đặt một miếng lame, gói giấy và đem hấp khử trùng. Dùng môi trường PGA đã khử trùng, rót chảy dọc theo nửa miếng lame một lớp mỏng hình vuông hoặc chữ nhật và chờ đông lại.
Làm ẩm giấy hoặc bông thấm bằng nước cất vô trùng. Cấy một ít bào tử nấm mốc lên phần thạch trên miếng lame, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 3-5 ngày, lấy phần nấm mốc mọc lan ra ngoài phần thạch trên lame, nhuộm Xanh-methylene để quan sát hình thái khuẩn ty và bào tử bằng kính hiển vi quang học ở vật kính 40X, 100X [6].
3.2.2.3. Phương pháp tuyển chọn giống T. reesei có hoạt tính cao
ü Nguyên tắc
Giống T. reesei có hoạt tính cellulase mạnh được tuyển chọn bằng phương pháp khuếch tán thạch đĩa. Phương pháp này dựa theo nguyên tắc là cellulase sẽ thủy
Trang 45
phân cơ chất CMC có trong đĩa thạch, do đó vùng bị thủy phân sẽ cho môi trường trong suốt khi nhuộm màu với Iod. Độ lớn của vòng trong suốt này phản ánh khả năng thủy phân cellulose của các chủng.
ü Cách tiến hành
Các chủng giống T. reesei được nuôi cấy riêng biệt trong ống nghiệm thạch nghiêng trên môi trường PGA, ở nhiệt độ phòng từ 5 - 7 ngày. Thêm vào mỗi ống giống 10 ml nước cất vô trùng có bổ sung 0,1% Tween 80. Dùng que cấy vòng lướt nhẹ trên bề mặt thạch, đánh nhẹ cho bào tử ở dạng huyền phù, thu dịch huyền phù của từng chủng.
Hút 2ml huyền phù bào tử T. reesei với mật độ 8.107
CFU/ml cho vào erlen 250ml chứa 100ml môi trường CMC nuôi cấy lỏng (Phụ lục 1), ủ ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút. Dịch nuôi cấy vào ngày thứ ba được ly tâm 5000/phút trong 20 phút để loại hết tế bào, thu nhận phần dịch trong chứa enzyme bên trên và đem xác định hoạt tính cellulase bằng phương pháp khuếch tán thạch đĩa.
Dùng khoan đục các lỗ tròn trên đĩa thạch chứa môi trường CMC (Phụ lục 1) với các lỗ có đường kính 8 mm. Nhỏ vào mỗi lỗ 0,1 ml dịch enzyme riêng đĩa đối chứng nhỏ 0,1 ml nước cất. Ủ ở 400C. Sau 24 giờ, cho hiện màu với dung dịch Lugol. Đo đường kính vòng phân giải. Hoạt tính thủy phân CMC của dịch enzym được biểu thị bằng giá trị (D– 8) mm [5].
3.2.2.4. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp cellulase trên môi trường bán rắn
ü Quá trình nhân giống
Nấm mốc được nuôi cấy riêng biệt trong ống nghiệm thạch nghiêng trên môi trường PGA, ở nhiệt độ phòng từ 5 -7 ngày. Thêm vào mỗi ống giống10 ml nước cất vô trùng có bổ sung 0,1% Tween 80. Dùng que cấy vòng lướt nhẹ trên bề mặt thạch, đánh nhẹ cho bào tử ở dạng huyền phù, thu dịch huyền phù của từng chủng.
Môi trường nhân giống được tiến hành dựa theo nghiên cứu Tiến sĩ của PGS.TS Nguyễn Đức Lượng như sau : 75% cám gạo: 24% trấu, 1% (NH4)2SO4, độ ẩm 60% . Nhằm tạo điều kiện cho nấm mốc thích nghi với điều kiện với môi trường lên men sau
Trang 46
này, môi trường nhân giống sẽ được bổ sung thêm 5% bã mía và một số chất khoáng. Do vậy, thành phần môi trường nhân giống bao gồm : 75% cám gạo: 20% trấu : 5% bã mía. . Các loại cơ chất dùng nuôi cấy được trộn đều, bổ sung 2 lần nồng độ dinh dưỡng Mandels đã chỉnh về pH 5 (phụ lục 1) , chỉnh độ ẩm môi trường về 60%. Chuyển 10 g môi trường nhân giống vào bình tam giác và đem hấp khử trùng môi trường ở 1210
C trong 20 phút, để nguội. Cho 2ml huyền phù bào tử nấm mốc với mật độ 7.107 - 8.107CFU/ml vào các bình môi trường trên (mật độ giống được xác định bằng phương pháp buồng đếm hồng cầu). Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày để bào tử