Enzyme được sử dụng là enzyme cellusoft L có nguồn gốc từ Novo Nordisk – Đan Mạch. Enzyme này được chúng tôi mua tại công ty TNHH Nam Giang, 133/11 Hồ Văn Huê, quận Phú Nhuận với tên thương mại là Cellusoft L, có dạng lỏng, màu nâu đỏ. Đây là một chế phẩm cellulase điều chế bằng phương pháp lên men chìm với hoạt tính biểu thị 1500 NCU/g. Hoạt tính biểu thịnày được xác định theo phương pháp phân tích của Novo Nordisk, AF 187.2.
Các thông số của enzyme Cellusoft L: − Nhiệt độ hoạt động tối ưu 500
C − pH hoạt động tối ưu 4.8
Trang 43 3.2. Nội dung tổng quát
3.2.1. Sơ đồ nội dung tổng quát
Hình 3.1 : Sơ đồ nội dung thí nghiệm
Hình 3.1 : Sơ đồ nội dụng thí nghiệm Trong đó:
CP 1T, 2T, 3T : Chế phẩm enzyme loại 1, 2, 3 từ chủng giống Trichoderma reesei. CP 1A, 2A, 3A : Chế phẩm enzyme loại 1, 2, 3 từ chủng giống Aspergillus niger.
3.2.2. Các phương pháp nghiên cứu
3.2.2.1. Phương pháp tiền xử lý bã mía
Aspergillus niger Tiền xử lý Phối trộn 3T+3A Thủy phân bã mía Cellusoft L Đệm, lắc Lọc, ly tâm Phối trộn 1T+ 1A CP 1T Lọc, ly tâm CP 3A CP 2A Sấy (12h, 400C) Đệm, lắc Nghiền Phối trộn 2T+ 2A
Khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp cellulase
Hỗn hợpsau nuôi cấy
CP 3T CP 1A
Sấy (12h, 400C)
CP 2T
Nghiền
Trichoderma reesei
Tuyển chọn chủng sinh cellulase mạnh Khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh tổng
hợp cellulase
Trang 44
Bã mía được tiền xử lý với hai chếđộở nhiệt độ phòng (tiết kiệm năng lượng) và ở nhiệt độ cao (tiêu tốn nhiều năng lượng hơn). Chế độ tiền xử lý ở nhiệt độ phòng được thực hiện theo Reeta Rani Singhania và cộng sự (2006) với 100g bã mía/1 lít NaOH 0.1 N, trong 12 giờ, nhiệt độ phòng. Chếđộ tiền xử lý ở nhiệt độcao được thực hiện theo Xuebing Zhaoa (2009) và cộng sự với 10% bã mía/dung dịch NaOH 2% trong 1.5h ở 900C. Bã mía sau khi tiền xửlý được rửa bằng nước cất nóng để rửa sạch hết lignin thu được bã có màu trắng vàng. Bã mía sau đó được rửa lại bằng nước cất và chỉnh về pH 5 bằng HCl 2N. Sấy khô bã mía sau tiền xử lý ở 50oC trong 16-18 giờ về độẩm 11-12% và bảo quản.
3.2.2.2. Quan sát hình thái giống
ü Quan sát đại thể
Nhằm xác định những đặc trưng về hình thái của hai chủng giống nấm mốc. Quan sát đại thể được tiến hành như sau : dùng que cấy móc vô trùng lấy một ít bào tử đơn và cấy vào tâm đĩa petri chứa thạch PGA. Ủở nhiệt độ phòng. Sau 3-7 ngày, quan sát hình dạng và màu sắc của khuẩn lạc.
ü Quan sát vi thể
Dùng phương pháp nuôi cấy phòng ẩm để quan sát hình dạng, cấu trúc sợi tơ và cơ quan sinh sản của nấm mốc.
Cho vào đĩa Petri một tờ giấy hoặc bông thấm, phía trên đặt một miếng lame, gói giấy và đem hấp khử trùng. Dùng môi trường PGA đã khử trùng, rót chảy dọc theo nửa miếng lame một lớp mỏng hình vuông hoặc chữ nhật và chờ đông lại.
Làm ẩm giấy hoặc bông thấm bằng nước cất vô trùng. Cấy một ít bào tử nấm mốc lên phần thạch trên miếng lame, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 3-5 ngày, lấy phần nấm mốc mọc lan ra ngoài phần thạch trên lame, nhuộm Xanh-methylene để quan sát hình thái khuẩn ty và bào tử bằng kính hiển vi quang học ở vật kính 40X, 100X [6].
3.2.2.3. Phương pháp tuyển chọn giống T. reesei có hoạt tính cao
ü Nguyên tắc
Giống T. reesei có hoạt tính cellulase mạnh được tuyển chọn bằng phương pháp khuếch tán thạch đĩa. Phương pháp này dựa theo nguyên tắc là cellulase sẽ thủy
Trang 45
phân cơ chất CMC có trong đĩa thạch, do đó vùng bị thủy phân sẽ cho môi trường trong suốt khi nhuộm màu với Iod. Độ lớn của vòng trong suốt này phản ánh khả năng thủy phân cellulose của các chủng.
ü Cách tiến hành
Các chủng giống T. reesei được nuôi cấy riêng biệt trong ống nghiệm thạch nghiêng trên môi trường PGA, ở nhiệt độ phòng từ 5 - 7 ngày. Thêm vào mỗi ống giống 10 ml nước cất vô trùng có bổ sung 0,1% Tween 80. Dùng que cấy vòng lướt nhẹ trên bề mặt thạch, đánh nhẹ cho bào tử ở dạng huyền phù, thu dịch huyền phù của từng chủng.
Hút 2ml huyền phù bào tử T. reesei với mật độ 8.107
CFU/ml cho vào erlen 250ml chứa 100ml môi trường CMC nuôi cấy lỏng (Phụ lục 1), ủ ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút. Dịch nuôi cấy vào ngày thứ ba được ly tâm 5000/phút trong 20 phút để loại hết tế bào, thu nhận phần dịch trong chứa enzyme bên trên và đem xác định hoạt tính cellulase bằng phương pháp khuếch tán thạch đĩa.
Dùng khoan đục các lỗ tròn trên đĩa thạch chứa môi trường CMC (Phụ lục 1) với các lỗ có đường kính 8 mm. Nhỏ vào mỗi lỗ 0,1 ml dịch enzyme riêng đĩa đối chứng nhỏ 0,1 ml nước cất. Ủ ở 400C. Sau 24 giờ, cho hiện màu với dung dịch Lugol. Đo đường kính vòng phân giải. Hoạt tính thủy phân CMC của dịch enzym được biểu thị bằng giá trị (D– 8) mm [5].
3.2.2.4. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp cellulase trên môi trường bán rắn
ü Quá trình nhân giống
Nấm mốc được nuôi cấy riêng biệt trong ống nghiệm thạch nghiêng trên môi trường PGA, ở nhiệt độ phòng từ 5 -7 ngày. Thêm vào mỗi ống giống10 ml nước cất vô trùng có bổ sung 0,1% Tween 80. Dùng que cấy vòng lướt nhẹ trên bề mặt thạch, đánh nhẹ cho bào tử ở dạng huyền phù, thu dịch huyền phù của từng chủng.
Môi trường nhân giống được tiến hành dựa theo nghiên cứu Tiến sĩ của PGS.TS Nguyễn Đức Lượng như sau : 75% cám gạo: 24% trấu, 1% (NH4)2SO4, độ ẩm 60% . Nhằm tạo điều kiện cho nấm mốc thích nghi với điều kiện với môi trường lên men sau
Trang 46
này, môi trường nhân giống sẽ được bổ sung thêm 5% bã mía và một số chất khoáng. Do vậy, thành phần môi trường nhân giống bao gồm : 75% cám gạo: 20% trấu : 5% bã mía. . Các loại cơ chất dùng nuôi cấy được trộn đều, bổ sung 2 lần nồng độ dinh dưỡng Mandels đã chỉnh về pH 5 (phụ lục 1) , chỉnh độ ẩm môi trường về 60%. Chuyển 10 g môi trường nhân giống vào bình tam giác và đem hấp khử trùng môi trường ở 1210
C trong 20 phút, để nguội. Cho 2ml huyền phù bào tử nấm mốc với mật độ 7.107 - 8.107CFU/ml vào các bình môi trường trên (mật độ giống được xác định bằng phương pháp buồng đếm hồng cầu). Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày để bào tử nấm mốc mọc đều trên môi trường.
ü Quá trình lên men
Cơ chất dùng cho quá trình lên men bán rắn gồm có cám gạo, bã mía (tiền xử lý và chưa tiền xử lý) và (NH4)2SO4. Các cơ chất được trộn đều với nhau, bổsung nước cất có pH thích hợp (pH 5 đối với T. reeseivà pH 4.8 đối với A.niger) để chỉnh độẩm môi trường. Môi trường sau khi hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút, làm nguội và được bổ sung giống (sau khi đã được nhân giống ở trên) và ủ lên men ở nhiệt độ phòng.
Enzyme trong canh trường sau nuôi cấy được trích ly bằng dung dịch đệm Na- acetate 50 mM, pH 5 theo tỷ lệ enzym:đệm là 1:9, khuấy trộn và đem lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong khoảng 1giờ, lọc thu dịch. Đem dịch lọc ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút, thu phần dịch bên trên đem xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp CMCase.
Các yếu tố về thành phần môi trường, độẩm, tỉ lệ giống, hàm lượng nitrogen và thời gian được khảo sát nhằm tìm ra thông số thích hợp nhất cho quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase.
3.2.2.5. Phương pháp thu nhận các loại chế phẩm cellulase
ü Chế phẩm cellulase thô dạng lỏng (CP1)
Enzyme trong hỗn hợp sau nuôi cấy được trích ly bằng dung dịchđệm Na-acetate 50 mM, pH 5 (đối với T. reesei) hoặc pH 4.5 (đối với A. niger) theo tỷ lệ enzyme: đệm là 1: 9, khuấy trộn và đem lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong 1 giờ, lọc thu dịch. Đem
Trang 47
dịch lọc ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút, thu phần dịch bên trên được xem là enzyme thô dạng lỏng. Enzyme được bảo quản ở 40
C.
ü Chế phẩm cellulase thô dạng rắn, sấy có chứa vi sinh vật (CP2)
Hỗn hợp thu được sau nuôi cấy có chứa cả enzyme lẫn vi sinh vật với độẩm vào khoảng 60-65% được đem sấy ở 400C trong 12 giờ về độ ẩm 11-12%. Chế phẩm thu nhận được đem bảo quản ở 40C.
ü Chế phẩm cellulase thô dạng hỗn hợp thu được sau khi lên men (CP3)
Hỗn hợp bao gồm môi trường và sinh khối vi sinh vật sau khi lên men được thu nhận và xem như một loại chế phẩm trực tiếp bổ sung vào quá trình thủy phân bã mía. CP3 được bảo quản ở 40C.
Hình 3.2: CP1 (lỏng) và CP2 (sấy) với hai chủng tương ứng A. niger và T. reesei.
3.2.2.6. Phương pháp khảo sát quá trình thủy phân bã mía
Thực hiện phản ứng thủy phân bã mía tiền xửlý và chưa tiền xử lý ở điều kiện cố định nhiệt độ 500C, pH = 4.8, tỷ lệ bã 5% trong dung dịch đệm Na-acetate 50 mM, tốcđộ lắc 150 vòng/ phút (theo kết quả của Leda Gottschlk và cộng sự, 2010) và thay đổi tỉ lệ phối trộn chế phẩm enzyme và hàm lượngenzyme bổ sung. Lấy khoảng 1.5 ml mẫu dung dịch ở các thời điểm 1, 2, 24, 48, 72 giờvà đem phân tích hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS. Mẫu cho kết quả đường khử cao sẽ được gởi mẫu định lượng glucose bằng HPLC.
3.3. Bố trí thí nghiệm
Trang 48
Mục đích: Khảo sát các yếu tố về thành phần môi trường, độẩm, tỉ lệ giống, hàm lượng nitrogen và thời gian nhằm tìm ra thông số thích hợp nhất cho quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase.
Cách thực hiện : Thực hiện như mục 3.2.2.4 ( Phương pháp khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp cellulase).
Tìm điều kiện thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase với chủng
T. reesei và A. niger bằng phương pháp luân phiên từng biến. Điểm gốc thí nghiệm được xác định dựa vào nghiên cứu của Nguyễn Đức Lượng (1996) và Nguyễn Thị Thanh Thuần (2009) : Môi trường cám gạo/ trấu = 7.5/2.5, độ ẩm 60%, tỉ lệ giống 8%, (NH4)2SO41%. Hàm mục tiêu Y ở đây là hoạt tính cellulase, là hàm giá trị của các yếu tố kể trên. Các điểm cho kết quả tốt hơn điểm gốc được tìm thấy khi thay đổi một yếu tố và cố định các yếu tố còn lại. Cứ tiếp tục như vậy đến khi tìm được giá trị thích hợp của tất cả các yếu tố.
3.3.1.1. Khảo sát khảnăng sinh tổng hợp cellulase của chủng giống T. reesei và A. niger theo thời gian ứng với các loại bã mía tiền xử lý khác nhau
Bảng 3.3 : Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của loại bã mía cảm ứng và thời gian lên men Thời gian (h) Loại bã Chưa XL 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 XL T phòng,12h 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 XL 900C, 2h 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 CG/BM 7.5/2.5 Độ ẩm (%) 60% Giống (%) 8% (NH4)2SO4(%) 1%
Loại bã mía B và thời gian A lên men thích hợp được xác định tại điểm mà hoạt tính cellulasemạnh nhất và được dùng cho thí nghiệm tiếp theo.
Trang 49
Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất
Thời gian (h) A (h) Loại bã B CG/BM 8/2 7.5/2.5 7/3 6.5/3.5 6/4 5/5 4/6 3/7 2/8 Độ ẩm (%) 60 Giống (%) 8 (NH4)2SO4(%) 1
Tỉ lệ thành phần môi trường C lên men thích hợp được xác định tại điểm mà hoạt tính cellulase mạnh nhất và được dùng cho thí nghiệm tiếp theo.
3.3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của độẩm
Bảng 3.5 : Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường lên men
Thời gian (h) A (h) Loại bã B CG/BM C Độ ẩm (%) 54 58 60 62 64 68 70 Giống (%) 8 (NH4)2SO4(%) 1
Độ ẩm môi trường D% lên men thích hợp được xác định tại điểm mà hoạt tính cellulase mạnh nhất và được dùng cho thí nghiệm tiếp theo.
3.3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ giống
Bảng 3.6 : Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ giống
Thời gian (h) A (h) Loại bã B CG/BM C Độ ẩm (%) D Giống (%) 2 4 6 8 10 12 14 (NH4)2SO4(%) 1
Trang 50
Tỉ lệ giống E% lên men thích hợp được xác định tại điểm mà hoạt tính cellulase mạnh nhất và được dùng cho thí nghiệm tiếp theo.
3.3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng nitrogen (muối amoni sunfat)
Bảng 3.7 : Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng nitrogen
Thời gian (h) A (h) Loại bã B CG/BM C Độ ẩm (%) D Giống (%) E (NH4)2SO4(%) 0.5 1 1.5 2 2.5
Hàm lượng (NH4)2SO4 F% lên men thích hợp được xác định tại điểm mà hoạt tính cellulase mạnh nhất.
Hoạt tính cellulase cao nhất được xác định ở điểm Y( A, B, C, D, E, F).
3.3.2. Khảo sát quá trình thủy phân bã mía
Khảo sát hiệu quả thủy phân của ba loại chế phẩm cellulase thô thu được (CP1, 2, 3) và Cellusoft L. Thực hiện như mục 3.2.2.6 (Phương pháp khảo sát quá trình thủy phân bã mía).
ü Khảo sát nguyên liệu bã mía thích hợp quá trình thủy phân
ü Khảo sát tỉ lệ phối trộn hệ cellulase từ hai chủng T.reesei và A.niger
ü Khảo sát hàm lượng cellulase/ bã thích hợp
3.3.2.1. Khảo sát nguồn nguyên liệu thủy phân
Thực hiện phản ứng thủy phân bã mía theo mục 3.2.2.6 với tỉ lệ 5% (v/w) Cellusoft L. Thực hiện với phản ứng thủy phân với cả ba loại bã mía : chưa tiền xử lý, tiền xử lý ở nhiệt độ phòng, 12 giờvà tiền xử lý ở 900C, 1.5 giờ. Loại bã nào cho thủy phân tạo nhiều đường khử nhất sau 72 giờ phản ứng sẽ được chọn làm nguyên liệu thủy phân cho các thí nghiệm tiếp theo.
Trang 51
Tiến hành phản ứng thủy phân bã mía được chọn ở 3.3.2.1 theo mục 3.2.2.6 với hàm lượng Cellusoft L/bã thay đổi lần lượt : 3%, 5%, 7%, 9%.
3.3.2.3. Khảo sát tỉ lệ phối trộn cellulase lỏng thô CP 1A+1T
Tiến hành phối trộn CP1A và CP1T theo tỉ lệ CP1A/CP1T (v/v) như sau : 10/0, 7.5/2.5, 6/4, 5/5, 4/6, 2.5/7.5, 0/10. Xác định hoạt tính CMCase (UI/ml) theo từng tỉ lệ phối trộn.
Tiến hành phản ứng thủy phân bã mía được chọn ở 3.3.2.1 theo mục 3.2.2.6 với các tỉ lệ phối trộn trên và tỉ lệ enzyme/bã 9% (v/w). Dựa vào lượng đường sinh ra xác định được tỉ lệ phối trộn X thích hợp nhất.
3.3.2.4. Khảo sát hàm lượng chế phẩm cellulase CP 1A+ 1T / bã
Tiến hành phản ứng thủy phân bã mía được chọn ở 3.3.2.1 theo mục 3.2.2.6 với tỉ lệphối trộn X được chọn ở mục 3.3.2.3 và tỷ lệ enzyme/bã thay đổi lần lượt 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4 (UI/g) trong thời gian 72 giờ.
3.3.2.5. Khảo sát tỉ lệ phối trộn enzyme thô dạng rắn, sấy CP 2A+2T
Tiến hành phối trộn CP2A và CP2T theo tỉ lệ CP2A /CP2T (w/w) theo khối lượng khô như sau : 0/0.1, 0.025/0.075, 0.04/0.06, 0.05/0.05, 0.06/0.04, 0.075/0.025, 0.1/0.
Tiến hành phản ứng thủy phân bã mía được chọn ở 3.3.2.1 theo mục 3.2.2.6 với các tỉ lệ phối trộn trên và tỉ lệ enzyme/bã 10% (w/w). Dựa vào lượng đường sinh ra xác định được tỉ lệ phối trộn Y thích hợp nhất.
3.3.2.6. Khảo sát hàm lượng chế phẩm cellulase CP 2A+2T / bã
Tiến hành phản ứng thủy phân bã mía được chọn ở 3.3.2.5 theo mục 3.2.2.6 với tỉ lệ phối trộn Y được chọn ở mục 3.3.2.5 và tỷ lệ enzyme/bã thay đổi lần lượt 0, 5%, 10%, 15%, 20% (g/g) trong thời gian 72 giờ.
3.3.2.7. Khảo sát tỉ lệ phối trộn enzyme dạng hỗn hợp sau lên men CP3A+3T
Tiến hành phối trộn CP3A và CP3T theo tỉ lệ CP3A /CP3T (w/w) theo khối lượng khô như sau : 0/0.1, 0.025/0.075, 0.04/0.06, 0.05/0.05, 0.06/0.04, 0.075/0.025,
Trang 52
0.1/0.
Tiến hành phản ứng thủy phân bã mía được chọn ở 3.3.2.1 theo mục 3.2.2.6 với các tỉ lệ phối trộn trên và tỉ lệ enzyme/bã 10% (w/w). Dựa vào lượng đường sinh ra