v Hóa chất sử dụng:
ü Dung dịch cơ chất (1% w/v CMC):
Cân chính xác 1g CMC, hòa tan trong 80 ml dung dịch đệm Na-acetate 50 mM, pH 5, chuyển vào bình định mức 100ml, thêm nước đến vạch và lắc đều.
ü Dung dịch acid 3,5-dinitrosalicylic (DNS):
− Cân 10 g DNS cho vào becher 1000 ml, thêm 400 ml nước cất, đặt becher trong chậu nước 500
C và khuấy đều.
− Thêm dung dịch NaOH (16 g NaOH trong 150 ml nước cất) từ từ vào dung dịch DNS, khuấy ở 500
C. Tiếp tục thêm 300g potassium sodium tartrate tetrahydrate vào dung dịch DNS và tiếp tục khuấy ở nhiệt độ 500
Trang 53
−
Làm lạnh dung dịch DNS đến nhiệt độ phòng. Chuyển dung dịch vào bình định mức 1000 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Bảo quản dung dịch DNS trong chai màu nâu có nắp.
ü Dung dịch lactose 0.12%:
Hòa tan 1,2 g lactose monohydrate với 80 ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Lấy 1ml dung dịch này chuyển sang một bình định mức 100ml khác. Thêm nước cho đủ 100ml.
ü Dung dịch DNS-lactose: trộn đều 150 ml DNS với 50 ml dung dịch lactose. Khi sử dụng mới pha dungdịch này.
ü Dung dịch enzyme: pha loãng dung dịch enzym với dung dịch đệm Na-acetate 50 mM pH 5 đến độ pha loãng thích hợp. (OD thử thật – OD thử không = 0.5-0.4).
ü Dựng đường glucose chuẩn:
Hòa tan 100 mg glucose monohydrate với 80ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Xây dựng đường glucose chuẩn theo bảng sau:
Bảng 3.8: Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn glucose
Ống số 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ glucose (mg/ ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Dung dịch glucose 1% (ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Dung dịch CMC 1% (ml) 1 1 1 1 1 1 1 Dung dịch DNS-lactose 4 4 4 4 4 4 4 Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
Mẫu 0: AW . Mẫu 1-6: AG. Mẫu nước cất làm đốichứng.
Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. So màu trên máy quang phổ với chương trình HPUV-Vis Chemstation ở bước sóng 540 nm (AG).
v Tiến hành phản ứng:
Hút 1ml dung dịch enzym cho vào ống nghiệm thử thật. Đặt vào bể ổn nhiệt ở 400C/5 phút. Đồng thời ta cũng đặt lọ chứa dung dịch CMC 1% ở 400C/5 phút. Thêm
Trang 54
1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzym và lắc đều. Cho phản ứng ở 400C trong thời gian chính xác 10 phút.Thêm 2ml dung dịch DNS-lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzym. Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. So màu ở bước sóng 540 nm. Dùng nước cất làm mẫu đối chứng. (AT)
v Phản ứng thử không
Hút 1ml dung dịch enzym cho vào ống nghiệm. Đặt vào bể ổn nhiệt ở 400 C/5 phút. Đồng thời ta cũng đặt lọ chứa dung dịch CMC 1% ở 400
C/5 phút. Thêm vào 4ml dug dịch lactose –DNS, lắc đều. Thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzym và lắc đều. Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. So màu ở bước sóng 540 nm. Dùng nước cất làm mẫu đối chứng. (AB)
v Tính toán:
Giá trị hệ số glucose: F = (0,1/AG 0,1+0,2/AG 0,2 + 0,3/AG 0,3 +……+0,6/AG 0,6)/6 CMCase (UI/g) = (AT –AB)xFx(1000/180)x(1/10 phút)x(1/1,0 ml)x(1/C) Với: AT : Độ hấp thụ của dung dịch có phản ứng enzym.
AB : Độ hấp thụ của dung dịch không có phản ứng enzym. F: Hệ số glucose (mg/ml).
1000: Chuyển mg thành µg.
180: Phân tử lượng của glucose, chuyển µg thành µmol. 10: Thời gian phản ứng (phút)
1.0: Thể tích dung dịch enzym (ml) C: Nồng độ dung dịch mẫu (g/ml)
3.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng đường khửbằng 3,5- dinitrosalycylic acid (DNS)
Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS (3,5- Dinitrosalycylic acid ). Thuốc thử DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3- amino-5-nitrosalycylic có màu đỏcam. Cường độ màu của hỗn hợp tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định được đo bằng máy
Trang 55
quang phổ so màu ở bước sóng 540nm. Dựa vào đường chuẩn giữa nồng độ glucose tinh khiết với thuốc thử ta sẽxác định được lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
v Cách dựng đường chuẩn
Cân chính xác 1g glucose hòa tan trong 100ml nước cất, định mức về 200ml tạo dung dịch đường glucose 0.5%. Hút 1, 2, 3, 4, 5 ml dung dịch đường glucose 0.5%, định mức về 50 ml thành các dung dịch có nồng độ lần lượt là 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mg/ml. Mẫu 0 là mẫu nước cất.
Bảng 3.9 : Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn glucose (DNS)
Ống số 0 1 2 3 4 5
Nồng độ glucose (mg/ ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Thể tích dung dịch glucose (ml) 3 3 3 3 3 3
Thể tích DNS (ml) 1 1 1 1 1 1
Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 5 phút. Dùng nilon bịt kín đầu ống nghiệm, đặt vào nước sôi trong 5 phút. Làm lạnh về nhiệt độ phòng, đo độ hấp thu ở bước sóng 540nm.
v Tiến hành phản ứng
Hút 3ml dung dịch mẫu có chứa đường vào ống nghiệm sạch và khô (mẫu đã được pha loãng về nồng độ thích hợp). Thêm vào 1ml thuốc thử DNS. Với mẫu trắng thay 3ml dịch mẫu bằng 3ml nước cất. Dùng nilon bịt kín đầu ống nghiệm, đặt vào nước sôi trong 5 phút. Làm lạnh về nhiệt độ phòng, đo độ hấp thu ở bước sóng 540nm.
3.4.3. Phương pháp xác định các thành phần trong bã mía trong bã mía 3.4.3.1. Nguyên lý 3.4.3.1. Nguyên lý
Xử lý biomass với lần lượt với các loại hóa chất khác nhau nằm loại bỏ lần lượt các thành phần trong biomass. Thông qua đó, giúp xác định các thành phần xơ sợi chính trong biomass gồm cellulose, hemicellulose và lignin.
3.4.3.2. Hóa chất sử dụng
a) Tách chất béo : Dung dịch ethanol/benzene với tỷ lệ 1:2 b) Dung dịch NDS ( Neutral detergent solution)
Trang 56
Bảng 3.10: Thành phần NDS.
STT Hóa chất Lượng
1 Nước cất 1L
2 EDTA 18.61g
3 Natri tetraborat decahydrate 6.81g
4 Natri dodecyl Sulfate 30g
5 2_ethoxyethanol 10ml
6 Dinatri hydrophosphate 4.56g
Trước tiên hòa tan 2 và 3 vào 1; sau đó hòa tan 4 và 5 vào dung dịch vừa pha, cuối cùng hòa tan 6 vào dung dịch. Dung dịch thu được có pH trung tính (6.9-7.1). c) Dung dịch ADS :
─ Acid sulfuric (96∼98%) : 49,04g
─ CTAB (cetyl trimethylammonium bromide) : 20g
Hòa tan hai chất trên vào nước, sau đó định mức đến 1L, sử dụng bình định mức. d) Các hóa chất khác
─ Decahydronaphtalene (hỗn hợp của cis và trans)
─ Natri sulfite
─ Acetone
3.4.3.3. Trình tự tiến hành a) Chuẩn bị mẫu
─ Sấy khô biomass trong tủ sấy ở nhiệt độ 1050C.
─ Cắt nhỏ mẫu, sử dụng máy nghiền. Trong đề tài này, bã mía được cắt nhỏđến kích thước cần thiết bằng cối xay thịt.
─ Chiết tách các chất béo có trong mẫu, sử dụng soxhlet với hệ dung môi ethanol/benzene.
─ Làm khô dung môi.
Trang 57 b) Tách chất béo bằng dung môi ethanol/benzene
─ Cân 10g mẫu đã được cắt nhỏ và sấy khô, cho vào Glass fiber filter (GFF), cân khối lượng GFF có mẫu W’1 = (các thành phần khác của biomass + GFF + chất béo)
─ Chuẩn bị 300 ml hệ dung môi Ethanol/Benzene với tỷ lệ 1:2. Cho vào bình cầu có dung tích 500ml
─ Đặt bộ lọc sợi thủy tinh vào soxhlet, lắp bộ soxhlet (như hình 3.3)
─ Đun cho dung môi sôi (800
C) trong vòng 6 giờ.
─ Lấy GFF ra khỏi soxhlet, sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 1050C trong vòng 8 giờ.
─ Cân lại khối lượng GFF, W’2 = (các thành phần khác của biomass + GFF)
─ Tính lượng chất béo đã tách ra
W’ = W’1 – W’2
c) Phân tích thành phần NDS
Bước phân tích này nhằm đo tổng lượng xơ sợi (hemcellulose, cellulose và lignin) trong biomass. Bằng cách cho biomass phản ứng với NDS, NDS là một hệ chất có tác dụng tẩy rửa, hòa tan các chất trích ly, còn lại xơ sợi và tro.
Các bước thực hiện:
─ Cho 100ml dung dịch NDS, 2ml decahydronaphtalene và 0,5g natri sulfite vào 0,5g mẫu. (cân chính xác khối lượng mẫu m1)
─ Lắp hệ thống gồm sinh hàn như hình 3.4
Trang 58
Hình 3.3 :- Bộ dụng cụ soxhlet Hình 3.4: - Hệ thống phân tích NDS và ADS
─ Đun hỗn hợp sôi (thường cần 5 – 10 phút ban đầu để chỉnh bếp đun) giữ cho hỗn hợp sôi trong vòng 60 phút.
─ Lọc dung dịch bằng phễu Gooch Crucible, sau đó rửa bằng nước sôi (vài lần) và bằng acetone (2 lần).
─ Sấy khô Crucible ở nhiệt độ 1050C trong 8h sau đó cân khối lượng crucible (W1) W1 = xơ sợi (cellulose + cellulose + lignin) + tro + crucible
─ Nung Crucible trong lò nung (500∼5500 C) trong 3 giờ, sau đó để nguội lò nung và cân lại khối lượng Crucible (W2)
W2 = tro + crucible.
─ Tính khối lượng xơ sợi: xơ sợi (cellulose + hemicellulose + lignin) = W1 – W2 d) Phân tích thành phần ADS
─ Bước này nhằm xác định phần cellulose và lignin trong biomass. Bằng cách cho biomass phản ứng với dung dịch ADS, acid trong ADS sẽ thủy phân hemicellulose, CTAB và acid sẽ hòa tan các chất trích ly, phần còn lại là cellulose, lignin, tro.
─ Cho 100ml dung dịch ADS, 2ml decahydronaphtalene vào 1g mẫu. Cân chính xác lại khối lượng mẫu m2.
Trang 59
─ Lắp dụng cụ giống với bước làm NDS.
─ Đun nóng hỗn hợp đến sôi , giữở trạng thái sôi trong 60 phút.
─ Lọc hỗn hợp bằng phễu Gooch Crucible, đồng thời nghiền bã trên phễu lọc bằng đũa thủy tinh và rửa bã bằng nước sôi 2 lần. Sau đó rửa bằng acetone đến khi acetone sau rửa không màu.
─ Sấy khô Crucible ở 1050C, sau 8h, cân khối lượng bã W4 W4 = cellulose + lignin + tro + crucible. e) Phân tích thành phần ADL
─ Bước này nhằm xác định thành phần lignin trong biomass. Bằng cách xử lý bã sau ADS bằng H2SO4 72%, acid này sẽ hòa tan cellulose, chỉ còn lại lignin và tro.
─ Sau khi xác định khối lượng phần ADF (W4), thêm 10ml H2SO4 72% khối lượng vào phễu crucible, đảo trộn và nghiền bằng đủa thủy tinh tạo dạng paste.
─ Sau đó tiếp tục khuấy trộn trong vòng 1 giờ. Để acid và dung dịch H2SO4 và các chất hòa tan chảy tự do xuống, nếu tất cả acid đều chảy xuống trước 1 giờ, cho thêm 10ml acid.
─ Sau khi tất cả acid đã chảy xuống sau 1 giờ, cho thêm 10ml H2SO4. Tiếp tục bước trên 3 lần nữa (3 giờ).
─ Sau đó rửa bã trên crucible với lượng dư nước sôi.
─ Sấy khô crucible trong tủ sấy ở 1050C trong vòng 8 giờ, sau đó cân khối lượng crucible W6
W5 = lignin + tro + crucible
─ Đun crucible trong lò nung, nhiệt độ 500 – 5500C, trong 3 giờ, sau đó cân lại Crucible
W6 = tro + crucible
Trang 60
─ Cân 1g mẫu đã qua cắt nhỏ, rây, sấy khô ở 1050C đến khối lượng không đổi. Cân chính xác khối lượng mẫu và ghi lại (m3)
─ Cho mẫu vào cốc nung và cân khối lượng cốc nung m4.
─ Đem cốc nung ở 500 – 5500C trong 3 giờ, sau đó cân lại khối lượng cốc m5
3.4.3.4. Tính kết quả
% chất béo = mW′
Æẫ × 100%
(với m mẫu là khối lượng mẫu chính xác cân được)
%lignin = ADL = 1 − % béo × W − Wm × 100%
%cellulose = ADF − ADL = Ê1 − % chất béo × W − Wm × 100%
% hemicellulose = NDF − ADF
= 1 − % béo × W − Wm × 100% − %cellulose − %lignin
%tro = m − mm × 100%
% chất trích ly = 100% − % xơ sợi − %tro
3.2. Phương pháp xử lý số liệu
Mỗi thí nghiệm trong luận văn đều được thực hiện ba mẫu giống nhau, do đó số liệu được trình bày trong luận văn đều được lấy giá trị trung bình từ ba lần lặp. Riêng số liệu thu được ở mục 3.3.3 (khảo sát độ ổn định của enzyme) được tính độ lệch chuẩn và hệ số biến thiên bằng phần mềm Excel.
CHƯƠNG 4: K
4.1. Khảo sát ảnh hưởng của quá trình timía mía
4.1.1. Bã mía trước khi tiề
Hình 4.1: Phân tích thành phần bã mía trước khi
Hình 4.2: Thành phần bã mía trước tiền xử lý theo nghiên Parameswaran
So sánh kết quả phân tích thành phần bã mía được trình bày ở hình quả của Binod Parameswaran
24 21 4.4 0.6 Thành ph 25 25 Thành ph Trang 61
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN a quá trình tiền xửlý đến thành phần và c
ền xử lý
Phân tích thành phần bã mía trước khi tiền xử lý
hành phần bã mía trước tiền xử lý theo nghiêncứu của Binod Parameswaran và cộng sự (2009).
So sánh kết quả phân tích thành phần bã mía được trình bày ở hình
Binod Parameswaran và cộng sự (2009) về thành phần trung bình của nhiều
47 3 nh phần bã mía chưa tiền xử lý Cellulose Hemicellulose Lignin Chất béo Chất trích ly Tro 50 nh phần bã mía theo A và cộng sự Cellulose Hemicellulose Lignin n và cấu trúc bã
cứu của Binod
So sánh kết quả phân tích thành phần bã mía được trình bày ở hình 4.1 với kết về thành phần trung bình của nhiều
Trang 62
loại bã mía được trình bày ở hình 4.2 cho thấy có sự sai khác không đáng kể về các thành phần cellulose, hemicellulose, lignin của bã mía. Qua đó, ta có thể suy luận các thành phần xơ sợi không khác nhau nhiều giữa các loại bã mía khác nhau.
Qua kết quả phân tích thành phần bã mía trình bày ở hình 4.1 cho thấy bã mía là nguyên liệu giàu cellulose (gần 50%), do đó có thể thấy bã mía lànguyên liệu rất tiềm năng cho công nghệ sản xuất bioethanol từ lignocellulose. Ngoài ra, bã mía chứa ít tro và không nhiều lignin, ít gây cản trở đến quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, do vậy có thể sử dụng nguồn bã mía rẻ tiền như là cơ chất cảm ứng vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase thay cho các cơ chất đắt tiền khác (Avicel, lactose, sophorose..)
Hàm lượng hemicellulose là thành phần nhiều thứ hai trong bã mía. Nó tồn tại ở trạng thái vô định hình, dễ thấm nước, cản trở sự tiếp xúc của enzyme với cellulose nên đây là thành phần cần loại bỏ. Tuy nhiên với hàm lượng hemicellulose khá cao (24%) và là một loại polysaccharide khi thủy phân tạo các đường C5, vì vậy, ta có thể tận dụng nguồn nguyên liệu này để sản xuất bioethanol thông qua các loại nấm men lên men đường C5 ( như Pichia stipitis).
Bã mía chứa không nhiều lignin (21%) và chiếm tỉ lệ tương đối thấp so với các loại phế phẩm nông nghiệp khác. Tuy nhiên, lignin ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật trên lignocellulose, do vậy đây là thành phần cần loại bỏ. Loại bỏ lignin cũng giúp tăng khảnăng tiếp xúc pha của cellulose với enzyme trong quá trình đường hóa, tránh tổn thất enzyme mắc tiền do quá trình enzyme hấp phụ lên bề mặt lignin.
Dựa vào kết quả phân tích thành phần bã mía cho thấy phương pháp tiền xử lý bã mía thích hợp nhất là alkaline nhằm loại bỏ lignin, tro và tăng độ phồng nở của cellulose, tăng hiệu quả thủy phân và hiệu quả cảm ứng sinh cellulase của vi sinh vật. Do có thể xem sự sai khác về yếu tố thành phần nguyên liệu là không nhiều, nên đề tài đã áp dụng hai chế độ tiền xử lý cho kết quả lên men bán rắn thu cellulase và kết quả đường hóa cao được công bố bởi nhóm nghiên cứu Reeta Rani Singhania và cộng sự (2006) với NaOH 0.1 N, nhiệt độ phòng, trong 12 giờ và của nhóm Xuebing Zhaca (2009)và cộng sự (2009) với NaOH 2%, 900C, 1.5 giờ.
Nhìn chung, qua kết quả phân tích cho thấy bã mía là một nguồn nguyên liệu có tiềm năng cho quá trình sản xuất bioethanol và
sản xuất cellulase, đặc biệt là sản xuất cellulase bằng phương pháp lên men bán rắn
4.1.2. Bã mía sau khi tiền x 4.1.2.1. So sánh về thành phần
Hình 4.3: Phân tích thành phần bã mía sau tiền xử lý Dựa vào hình 4.3, cho th
hemicellulose và tro có giảm nhưng không nhiều trong khi đó hàm lượng cellulose chất trích ly tăng lên với cả hai phương pháp t
trình tiền xử lý được tiến hành trong môi kiềm loãng tương đối bền đối với kiềm ở n
lignin dễ bị phân hủy trong mạnh.
Hàm lượng chất trích ly sau tiền xử lý tăng lên trong quá trình phân hủy lignin trong môi trường kiềm thành nên sinh ra các hợp chất ch
trên bã mía. Mặt khác, do khi lignin b 0 10 20 30 40 50 60