Bước đầu nghiên cứu tạo liposom doxorubicin gắn PEG

Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của gắn PEG lên bề mặt liposom tới thời gian tuần hoàn trong máu của liposom doxorubicin 25 2.3.3.1.. Ưu điểm của liposom là tính tương hợp sinh học và k

NGUYỄN VĂN THẮNG

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TẠO LIPOSOM DOXORUBICIN

GẮN PEG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013

NGUYỄN VĂN THẮNG

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TẠO LIPOSOM DOXORUBICIN

GẮN PEGKHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

được rất nhiều điều bổ ích và thực sự đó là những hành trang quý báu giúp tôi thêm vững bước trên con đường đi sắp tới của mình.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Hà Phương Thư, phòng Nano Y

Sinh, viện Khoa học vật liệu Cô đã cho tôi những lời khuyên bổ ích, tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn PGS.TS Lê Quang Huấn, ThS Lê Thị Thùy Dương cùng các

cán bộ công tác tại phòng Công nghệ tế bào động vật – Viện công nghệ sinh học, những người đã nhiệt tình giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành khóa luận

Tôi xin cảm ơn các thầy cô và các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa sinh, Bào chế, Dược lực – Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa phân tích, Khoa hóa học –Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ tôi Chính bố mẹ là nguồn động lực lớn nhất giúp tôi hoàn thành được khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người bạn, đặc biệt là bạn Hồ Trọng Toàn, chị Nguyễn Thị Bích Trân đã sát cánh bên tôi, hỗ trợ, động viên tôi rất nhiều trong quá trình

thực hiện khóa luận

SV Nguyễn Văn Thắng

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1.1.4 Các phương pháp tạo liposom5

1.2 Doxorubicin và liposom doxorubicin6

1.2.1 Doxorubicin6

1.2.2 Liposom doxorubicin8

1.3 Số phận của liposom sau khi tiêm tĩnh mạch9

1.4 Những nỗ lực cải thiện thời gian tuần hoàn trong máu của liposom11

1.5 PEG và một số dẫn chất PEG-lipid ứng dụng trong chế tạo liposom12

1.6 Cơ chế PEG làm tăng thời gian tuần hoàn của liposom trong máu14

1.7 Các phương pháp tạo liposom gắn PEG16

1.7.1 Gắn PEG trong quá trình tạo liposom (phương pháp truyền thống, modification)16

pre-1.7.2 Gắn PEG sau quá trình tạo liposom (phương pháp post-modification)17

1.8 Ứng dụng của liposom gắn PEG18

1.8.1 Ứng dụng trong điều trị ung thư18

1.8.2 Ứng dụng trong điều trị một số bệnh lý khác 18

1.8.3 Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh19

1.8.4 Kết hợp để tối ưu hóa hệ mang thuốc liposom19

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU20

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị và động vật thí nghiệm20

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất20

2.1.2 Thiết bị20

2.1.3 Động vật thí nghiệm21

2.2 Nội dung nghiên cứu21

2.3 Phương pháp nghiên cứu21

2.3.1 Phương pháp tạo liposom doxorubicin gắn PEG và liposom doxorubicin không gắn PEG21

2.3.2 Phương pháp đánh giá liposom tạo thành23

2.3.2.1 Phương pháp đánh giá kích thước tiểu phân và phân bố kích thước

tiểu phân 23

2.3.2.2 Phương pháp xác định thế zeta24 2.3.2.3 Phương pháp định lượng doxorubicin24 2.3.2.4 Xác định hiệu suất liposom hóa doxorubicin25

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của gắn PEG lên bề mặt liposom tới thời gian tuần hoàn trong máu của liposom doxorubicin 25

2.3.3.1 Chuẩn bị các điều kiện tiến hành thí nghiệm25 2.3.3.2 Tiêm chuột và lấy máu26

2.3.3.3 Phương pháp chiết doxorubicin toàn phần trong huyết tương26 2.3.3.4 Phương pháp định lượng doxorubicin trong huyết tương28

2.3.3.5 Tính giá trị AUC0-24h của các dạng thuốc của doxorubicin29

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu29

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN30

3.1 Kết quả30

3.1.1 Chế tạo liposom doxorubicin gắn PEG30

3.1.2 Đánh giá liposom gắn PEG tạo thành30

3.1.2.1 Kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân 30 3.1.2.2 Thế zeta32

3.1.2.3 Hiệu suất liposom hóa doxorubicin 32

3.1.3 Bước đầu tìm hiểu ảnh hưởng của gắn PEG lên bề mặt liposom tới thời gian tuần hoàn trong máu của liposom 35

3.1.3.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn doxorubicin trong huyết tương35 3.1.3.2 Khảo sát nồng độ doxorubicin trong huyết tương36

3.2 Bàn luận39

3.2.1 Về quy trình tạo liposom doxorubicin gắn PEG39

3.2.1.1 Lựa chọn nguyên liệu và công thức39

3.2.1.2 Quy trình chế tạo liposom doxorubicin gắn PEG và các chỉ tiêu chất

lượng của chế phẩm tạo thành 39

3.2.2 Về quy trình chiết doxorubicin trong huyết tương42

3.2.3 Về ảnh hưởng của gắn PEG lên bề mặt liposom tới thời gian tuần hoàn

của liposom trong máu42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ44

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AUC Area under the curve (Diện tích dưới đường cong)

ECG Electro-Cardio Gram (Điện tâm đồ)

MPEG Monomethoxy polyethylen glycol

mPEG-DSPE

1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylen glycol)]

MPS Mononuclear Phagocytic System (Hệ thực bào đơn nhân)PDI Polydispersity Index (Chỉ số đa phân tán)

PHEPC Partially hydrogenated egg phosphatidylcholine

(Phosphatidyl cholin trứng hydro hóa một phần)

TMPEG Tresylat monomethoxy polyethylen glycol

US-FDA Cục Quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại liposom theo kích thước và số lớp4

Bảng 2.1. Nguyên liệu tạo liposom gắn PEG và liposom không gắn PEG21

Bảng 3.1. Kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân của các mẫu liposom

gắn PEG và liposom không gắn PEG31

Bảng 3.2. Thế zeta và độ di chuyển của các mẫu liposom gắn PEG và liposom không

gắn PEG32

Bảng 3.3. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ của doxorubicin hydroclorid trong

môi trường NaCl 0,9% và Triton X-100 1% (tt/tt).33

Bảng 3.4. Hiệu suất liposom hóa doxorubicin của mẫu liposom gắn PEG và liposom

không gắn PEG34

Bảng 3.5. Sự phụ thuộc của mật độ huỳnh quang vào nồng độ dung dịch doxorubicin

hydroclorid35

Bảng 3.6. Nồng độ tương đương doxorubicin trong huyết tương chuột nhắt tại các thời

điểm 5 phút, 4 giờ, 24 giờ sau khi tiêm tĩnh mạch đuôi 37

Bảng 3.7. Giá trị AUC 0-24h của các dạng thuốc doxorubicin trên chuột nhắt (tiêm tĩnh

mạch đuôi, liều 10 mg/kg) 38

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Công thức cấu tạo của doxorubicin6

Hình 1.2. Các giai đoạn sinh lý trong sự thải trừ của liposom9

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của polyethylen glycol12

Hình 1.4. Một số dẫn chất lipid của polyethylen glycol13

Hình 1.5. Cơ chế PEG kéo dài thời gian tuần hoàn của liposom trong máu 15

Hình 1.6. Các phương pháp tạo liposom gắn PEG16

Hình 2.1. Quy trình chiết doxorubicin toàn phần từ huyết tương27

Hình 3.1. Đồ thị thể hiện sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ doxorubicin

hydroclorid trong môi trường NaCl 0,9% và Triton X-100 1%33

Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn tương quan giữa mật độ huỳnh quang và nồng độ

doxorubicin hydroclorid36

Hình 3.3. Nồng độ tương đương doxorubicin trong huyết tương chuột nhắt tại thời

điểm 5 phút, 4 giờ, 24 giờ sau khi tiêm tĩnh mạch đuôi37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kể từ khi được phát hiện vào những năm 1960 bởi Bangham, liposom đã được nghiên cứu rộng rãi và ứng dụng làm hệ mang nhiều thuốc khác nhau Ưu điểm của liposom là tính tương hợp sinh học và khả năng mang được cả các thuốc tan trong nước và không tan trong nước khác nhau như thuốc điều trị ung thư, các kháng sinh, kháng sinh chống nấm, glucocorticoid…Tuy nhiên, một trong những nhược điểm lớn nhất của liposom khi sử dụng đường tiêm chính là bị thải trừ nhanh chóng khỏi vòng tuần hoàn do sự tóm bắt của các tế bào thuộc hệ thực bào đơn nhân (MPS) [13],[30] Một trong những biện pháp hiệu quả để khắc phục nhược điểm này là gắn lên bề mặt liposom các polyme thân nước, phổ biến là polyethylen glycol (PEG) với khối lượng phân tử từ 1000 đến 5000 Da [11],[13] Sự tăng thời gian tuần hoàn của liposom gắn PEG mang lại nhiều lợi ích: giảm

sự rò rỉ thuốc trong tuần hoàn, giảm các tác dụng không mong muốn của thuốc, làm tăng

cơ hội thoát mạch vào khoảng gian bào của liposom, tăng sự tích lũy của các thuốc chống ung thư tại khối u và tăng hiệu quả điều trị [23],[30],[43],[55]

Những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành ở trường Đại học Dược

Hà Nội nhằm đánh giá khả năng ứng dụng liposom làm chất mang thuốc Trong đó, liposom doxorubicin được nghiên cứu nhiều nhất và đã đạt được nhiều kết quả đáng khích

lệ Các nghiên cứu đã bước đầu đưa ra được quy trình sản xuất thuốc tiêm liposom doxorubicin với hiệu suất liposom hóa doxorubicin lớn hơn 80% Tuy nhiên, hầu hết các

nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc chế tạo liposom từ nguyên liệu là phospholipid và cholesterol, chưa có nghiên cứu nào sử dụng các dẫn chất polyme để làm tăng thời gian tuần hoàn của liposom doxorubicin Với mong muốn tạo ra các liposom doxorubicin có khả năng tuần hoàn kéo dài, góp phần cải thiện tính hiệu quả của hệ mang thuốc liposom,

chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Bước đầu nghiên cứu tạo liposom doxorubicin gắn

PEG”

Đề tài gồm có hai mục tiêu chính:

1 Chế tạo và đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của hỗn dịch liposom doxorubicin gắn PEG

2 Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của gắn PEG lên bề mặt liposom tới thời gian tuần hoàn trong máu của liposom doxorubicin

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về liposom

1.1.1 Khái niệm

Liposom là các túi nhỏ hình cầu có cấu tạo gồm lớp vỏ phospholipid bao bọc lấy nhân nước ở giữa, có kích thước trong khoảng từ vài chục nanomet đến hàng chục micromet [3],[18]

1.1.2 Thành phần cấu tạo của liposom

Hầu hết các hệ mang thuốc liposom được sử dụng hiện nay đều cấu tạo bởi các phospholipid và cholesterol

Phospholipid được dùng để chế tạo liposom có thể có nguồn gốc tự nhiên (như phosphatidyl cholin, phosphatidyl serin ) hoặc tổng hợp (như dimyrisitoyl phosphatidyl cholin (DMPC), distearoyl phosphatidyl cholin (DSPC)…[3] Một thông số quan trọng đặc trưng cho phospholipid cần phải quan tâm trong chế tạo liposom chính là nhiệt độ chuyển pha Nhiệt độ này phụ thuộc chủ yếu vào độ dài và độ bão hòa của chuỗi acyl Nhìn chung, chuỗi acyl dài hơn và bão hòa hơn thì nhiệt độ chuyển pha sẽ cao hơn [53]

Phosphatidyl cholin là phospholipid được sử dụng nhiều nhất để tạo liposom Các phosphatidyl cholin có nguồn gốc tự nhiên như từ lòng đỏ trứng hoặc từ đậu nành thường chưa bão hòa, nhiệt độ chuyển pha thấp nên lớp lipid kép tạo thành có tính thấm cao, kém

ổn định Trong khi đó, các phospholipid tổng hợp chứa các mạch acyl dài, bão hòa sẽ tạo

ra cấu trúc lớp kép chắc và khó thấm hơn [8],[46]

Phosphatidyl cholin thường được sử dụng phối hợp với các lipid khác, đặc biệt là

cholesterol để cải thiện độ ổn định in vitro và in vivo của liposom Cholesterol có vai trò

điều chỉnh độ lỏng của màng phospholipid, góp phần làm tăng tính bền vững của liposom, giảm tính thấm của màng lipid với các chất tan, bất kể phospholipid tạo liposom bão hòa hay chưa bão hòa [53]

Ngoài hai thành phần trên, liposom có thể chứa thêm các polyme thân nước để tăng thời gian tuần hoàn, các yếu tố hướng đích: kháng thể, acid folic, transferrin hoặc các chất chống oxy hóa như alfa-tocoferol…

1.1.3 Phân loại

Có nhiều cách phân loại liposom khác nhau

Dựa vào kích thước và số lớp, liposom có thể được chia thành 3 loại chính: liposom đơn lớp, liposom đa lớp và liposom nhiều túi (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Phân loại liposom theo kích thước và số lớp.

Loại liposom Ký hiệu Kích thước

(nm)

Số lớp lipid kép

2 Liposom đa lớp

Dựa vào thành phần và ứng dụng, liposom có thể được phân chia thành các loại:

(1) Liposom truyền thống (conventional liposomes): liposom được tạo thành từ các

phospholipid khác nhau, cholesterol và có thể có các lipid khác nhưng không có bất kỳ sự thay đổi nào trên bề mặt liposom [20]

(2) Liposom nhạy cảm với pH (pH-sensitive liposomes): sử dụng các phospholipid

nhạy cảm pH như dioleyl phosphatidyl ethanolamin, ứng dụng để tăng giải phóng thuốc ở những vùng có pH acid nhẹ như các khối u tiên phát, các vị trí viêm [10]

(3) Liposom điện tích dương (cationic liposomes): liposom có chứa các lipid tích

điện dương, thường được sử dụng cho hệ mang ADN hoặc ứng dụng hướng đích [49]

(4) Liposom tuần hoàn kéo dài (Long-circulating liposomes): Là các liposom được

phủ lên bề mặt các polyme trơ, tương thích sinh học tạo thành một lớp bảo vệ bên ngoài liposom, kéo dài thời gian tuần hoàn của liposom như: poly [N-(2-hydroxypropyl) methacrylamid], poly-N-vinylpyrrolidon, polyvinyl alcol…và phổ biến nhất vẫn là polyethylen glycol [49]

(5) Liposom hướng đích hay liposom miễn dịch (immunoliposomes): là liposom

được gắn thêm các ligand trên bề mặt, các ligand này có khả năng nhận biết, gắn vào tế bào đích tạo điều kiện cho liposom tích lũy tại đích [49]

1.1.4 Các phương pháp tạo liposom

Có nhiều quy trình khác nhau để chế tạo liposom nhưng tựu chung lại đều trải qua các giai đoạn sau:

Giai đoạn hydrat hóa hình thành liposom

Ở giai đoạn này, phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để tạo liposom quy mô phòng thí nghiệm là phương pháp hydrat hóa màng lipid mỏng Phospholipid và các thành phần khác tạo vỏ liposom được hòa tan vào dung môi hữu cơ Dung môi được bốc hơi dưới áp suất giảm trong bình cất quay chân không tạo thành lớp màng mỏng trên thành bình Lớp màng mỏng được hydrat hóa bằng một dung dịch nước ở nhiệt độ trên nhiệt độ chuyển pha của phospholipid tạo thành các liposom [3],[8]

Ngoài ra, một số phương pháp khác có thể sử dụng để tạo liposom bao gồm: phương pháp bốc hơi pha đảo, phương pháp siêu âm, tiêm ethanol, tiêm ether, loại bỏ các chất diện hoạt…[3],[8]

Giai đoạn điều chỉnh kích thước liposom

Liposom sau khi tạo thành từ giai đoạn hydrat hóa thường có kích thước lớn, kém đồng nhất Để khắc phục điểu này người ta có thể sử dụng một số phương pháp để làm giảm kích thước tiểu phân như: siêu âm, đông chảy, vi dòng chảy, đồng nhất hóa dưới áp suất cao, đẩy qua màng [8]

Giai đoạn liposom hóa thuốc (tải thuốc vào khoang nước của liposom)

Giai đoạn này có thể tiến hành đồng thời với giai đoạn hydrat hóa tạo liposom hoặc tiến hành sau khi liposom đã tạo thành

Giai đoạn loại thuốc tự do (không được liposom hóa)

Nhiều thuốc thân dầu có ái lực cao với lớp kép và được gói hoàn toàn vào liposom Tuy nhiên, với nhiều hợp chất khác, hiệu suất liposom hóa thường nhỏ hơn 100% Phần thuốc không được liposom hóa có thể gây ra các tác dụng không mong muốn vượt giới hạn cho phép hoặc làm mất ổn định về mặt vật lý của liposom Để loại bỏ chúng, có thể sử dụng các kỹ thuật như: thẩm tách, siêu li tâm, sắc ký lọc gel hoặc trao đổi ion…[8]

1.2 Doxorubicin và liposom doxorubicin

Sau khi tiêm tĩnh mạch, doxorubicin nhanh chóng thải trừ khỏi máu và phân bố vào

mô bao gồm phổi, gan, tim, lá lách và thận Doxorubicin bị chuyển hóa nhanh tại gan tạo thành các dẫn chất chuyển hóa, bao gồm cả doxorubicinol là một chất còn hoạt tính Khoảng 40 – 50% lượng doxorubicin bắt đầu được thải trừ qua mật trong vòng 7 ngày; chỉ khoảng 5% được thải trừ qua nước tiểu trong vòng 5 ngày [48]

Tác dụng không mong muốn:

Một số tác dụng không mong muốn phổ biến của doxorubicin là buồn nôn, nôn, rụng tóc, ức chế tủy xương, viêm miệng, viêm thực quản có thể tiến triển đến loét, độc tính trên tim, tổn thương thoát mạch dẫn đến hoại tử mô [48] Trong các tác dụng này, độc tính trên tim là nghiêm trọng nhất Độc tính trên tim của doxorubicin chia thành 2 loại: cấp tính, thường thấy là rối loạn chức năng tim thoáng qua biểu hiện bằng sự thay đổi ECG có thể hồi phục, loạn nhịp tim và muộn là các bệnh cơ tim không hồi phục, phụ thuộc vào liều, dẫn đến suy tim sung huyết Tỷ lệ tử vong là khoảng 60% ở những bệnh nhân có những biểu hiện của độc tính muộn Thời điểm khởi phát của độc tính muộn thường xảy ra khi liều tích lũy khoảng 550 mg/m2 doxorubicin [48]

1.2.2 Liposom doxorubicin

Nhược điểm của doxorubicin tự do là thể tích phân bố lớn (khoảng 25 L/kg) và bị thải trừ nhanh chóng khỏi vòng tuần hoàn dẫn đến nồng độ thuốc ở khối u thấp mà lại gây độc tính ở các mô bình thường Sử dụng liposom làm hệ mang thuốc doxorubicin sẽ làm thay đổi cả sự phân bố mô, đặc biệt là giảm tích lũy ở tim và tốc độ thải trừ của doxorubicin, từ đó làm tăng tác dụng và giảm độc tính của thuốc [20]

Doxorubicin có thể được liposom hóa với hiệu suất cao nhờ sử dụng kỹ thuật chênh lệch pH hoặc chênh lệch nồng độ amoni sulfat Nguyên tắc chung là pH ở bên trong màng liposom là pH acid (4 – 5,5), pH bên ngoài được điều chỉnh về khoảng 7,4, khi đó doxorubicin ở dạng phân tử ở môi trường bên ngoài sẽ khuếch tán vào bên trong sau một thời gian ủ thích hợp [38]

Hiện nay trên thị trường đã có nhiều chế phẩm liposom doxorubicin, trong đó 2 chế phẩm nổi bật là Myocet® và Doxil® Myocet® là chế phẩm liposom truyền thống được chế tạo từ phosphatidyl cholin trứng và cholesterol (55: 45) [18] và sử dụng kỹ thuật chênh lệch pH để tải thuốc [16] Chế phẩm được đóng làm 3 lọ riêng biệt: 1 lọ chứa doxorubicin dạng bột khô, 1 lọ chứa hỗn dịch liposom chưa tải thuốc trong đệm citric và lọ thứ 3 chứa dung dịch natri carbonat Thuốc sẽ được tải vào liposom ngay trước khi sử dụng [30] Thử nghiệm lâm sàng pha III của Myocet® cho thấy tác dụng chống ung thư tương tự nhưng giảm đáng kể độc tính trên tim so với doxorubicin tự do [18]

Doxil® là chế phẩm liposom doxorubicin tuần hoàn kéo dài, với các thành phần phosphatidyl cholin đậu nành hydro hóa (56,2%), cholesterol (38,3%), DSPE-PEG2000

(5,3%) và α-tocoferol (0,2%) Sự có mặt của PEG làm tăng đáng kể thời gian tuần hoàn trong máu của liposom (2,5 giờ với Myocet® và 55 giờ với Doxil®) và tương tự Myocet®,

đặc tính an toàn của Doxil® cũng được cải thiện hơn hẳn so với doxorubicin dạng thuốc tự do[18]

1.3 Số phận của liposom sau khi tiêm tĩnh mạch

Sau khi tiêm tĩnh mạch, liposom tiếp xúc với các protein huyết tương và các tế bào máu Rất nhiều trong số đó tương tác và có thể làm mất ổn định lớp lipid kép của liposom hoặc khởi phát các quá trình sinh học dẫn tới gia tăng giải phóng thuốc và/hoặc dẫn tới thải trừ liposom bởi hệ thực bào đơn nhân (MPS) (hình 1.2)

Hình 1.2 Các giai đoạn sinh lý trong sự thải trừ của liposom [46]

Đầu tiên, liposom có thể tương tác với các lipoprotein trong máu Tùy thuộc vào thành phần của liposom, lipoprotein có thể tấn cống và thoái hóa liposom thông qua loại bỏ

các phân tử phospholipid từ cấu trúc màng lipid kép Tương tác này dẫn đến sự mất ổn định của lớp màng kép và giải phóng các phân tử thuốc bên trong liposom vào máu (hình 1.2, A) [17],[30],[31],[46].

Liposom cũng có thể tương tác với các protein huyết tương Các protein khi hấp phụ lên bề mặt của liposom có thể làm tăng tính thấm của màng, ảnh hưởng đến sự lưu giữ thuốc bên trong liposom; hoặc tạo điều kiện để MPS nhận biết và thực bào liposom (hình 1.2, B) Các protein này được gọi là các opsonin, và quá trình hấp phụ đặc hiệu hoặc không đặc hiệu của chúng lên bề mặt liposom được gọi là opsonin hóa [31] Một số các protein có khả năng opsonin hóa đã được xác định là các globulin miễn dịch, fibronectin, β2- glycoprotein, protein C phản ứng và β2-macroglobulin, các thành phần của bổ thể (C3b, iC3b) [30],[41]

Bên cạnh các opsonin, trong huyết tương cũng tồn tại đồng thời các thành phần ức chế sự thực bào các liposom như albumin và IgA, chúng được gọi là các dysopsonin Sự cân bằng giữa opsonin hóa và dyopsonin hóa quyết định sự thải trừ của liposom [30]

Hệ thực bào đơn nhân (MPS) đóng vai trò quan trọng trong sự thải trừ của liposom khỏi vòng tuần hoàn MPS bao gồm các đại thực bào trong gan (tế bào Kupffer), lách, phổi, ruột, da, tủy xương và các bạch cầu mono trong máu Các tế bào này có chứa một loạt các receptor, đặc hiệu cho các glycoprotein, lipid và các đoạn Fc của globulin miễn dịch Các opsonin sau khi hấp phụ lên bề mặt liposom có thể gắn với các receptor trên màng các tế bào của MPS và dẫn đến sự thực bào liposom [52]

Liposom cũng có thể bị thải trừ khỏi máu thông qua sự tương tác trực tiếp với các tế

bào thực bào Các nghiên cứu in vitro đã cho thấy sự tóm bắt liposom bởi các đại thực bào

có thể xảy ra khi không có protein huyết tương [29] Tuy nhiên, sự gắn của protein lên bề mặt liposom vẫn đóng một vai trò quan trọng trong sự tương tác của liposom với hệ thực bào đơn nhân [46]

Vượt qua các hàng rào trên, các liposom tuần hoàn trong máu sẽ được tích lũy ở đích theo cơ chế thụ động hoặc chủ động [10] Với cơ chế chủ động, liposom được gắn thêm các yếu tố hướng đích và được tích lũy ở đích nhờ ái lực của các yếu tố này với đích tác dụng Liposom cũng có thể tích lũy thụ động tại khối u rắn hoặc các vị trí viêm nhờ khả

năng thoát mạch qua các kẽ hở của thành mạch ở các vị trí này và được lưu giữ lại do giảm

sự dẫn lưu của hệ bạch huyết tại khối u Hiện tượng này được gọi là hiệu ứng tăng tính thấm và khả năng lưu giữ [49] Tuy nhiên, sự tích lũy của liposom tại khối u là một quá trình diễn ra tương đối chậm [24], trong khi đó sự thải trừ của các liposom truyền thống khỏi vòng tuần hoàn lại quá nhanh để có thể đạt được điều này Vì vậy, tăng thời gian tuần hoàn là một yêu cầu đặt ra để có thể tiếp tục phát triển liposom như một hệ mang thuốc hiệu quả

1.4 Những nỗ lực cải thiện thời gian tuần hoàn trong máu của liposom

Sau khi nhận ra được sự tóm bắt của MPS là nguyên nhân chính dẫn đến sự thanh thải nhanh chóng của liposom ra khỏi máu tuần hoàn, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành

để cải thiện thời gian tuần hoàn của liposom

Một trong số những nỗ lực đầu tiên để tăng thời gian tuần hoàn của liposom là thay đổi độ lỏng của lớp kép bằng cách sử dụng các phospholipid có nhiệt độ chuyển pha cao

và cholesterol để tạo liposom Các liposom được tạo từ phospholipid bão hòa như DSPC

có ái lực thấp hơn với các opsonin, ổn định trong máu hơn và thời gian tuần hoàn kéo dài hơn so với liposom chế tạo từ các phospholipid chưa bão hòa như phosphatidyl cholin trứng [6],[20],[46]

Việc điều chỉnh kích thước tiểu phân và điện tích của liposom cũng làm giảm sự tóm bắt bởi MPS Nhìn chung, các liposom có kích thước lớn hơn sẽ bị thải trừ khỏi máu nhanh hơn các liposom có kích thước nhỏ [42] Các liposom không tích điện sẽ có thời gian tuần hoàn dài hơn so với liposom tích điện âm hoặc dương [30]

Một bước ngoặt quan trọng diễn ra vào những năm 1987-1988 đó là phát hiện sự có mặt của các lipid tự nhiên (như gangliosid GM1 [12] và phosphatidylinositol [25]) trên bề mặt liposom có thể làm tăng đáng kể thời gian tuần hoàn trong máu của liposom Tuy nhiên, khó khăn về khả năng thương mại hóa của các liposom chứa gangliosid GM1 đã dẫn đến nhu cầu tìm kiếm nguyên liệu thay thế rẻ hơn, an toàn và được chấp nhận trên lâm sàng Cùng với sự ứng dụng làm tăng thời gian tuần hoàn của các protein, peptid, các dẫn chất polyme đã được chứng minh là có hiệu quả kéo dài thời gian tuần hoàn của liposom vượt trội so với gangliosid và phosphatidyl inositol [13],[16] Cho đến nay, các dẫn chất

polyme đã được ứng dụng rộng rãi để chế tạo các liposom tuần hoàn kéo dài, liposom miễn dịch Trong đó, dẫn chất polyethylen glycol (PEG) được nghiên cứu nhiều và sử dụng phổ biến nhất.

1.5 PEG và một số dẫn chất PEG-lipid ứng dụng trong chế tạo liposom

PEG là một polyme có khối lượng phân tử từ 500 – 30000 Da, có cấu trúc thẳng hoặc phân nhánh được tạo thành do sự liên kết của các phân tử ethylen oxid với nhau bằng các liên kết hóa học (hình 1.3)

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của polyethylen glycol [44]

PEG có những đặc tính có thể nói là có một không hai, cho phép nó được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực dược phẩm:

(1) Không có độc tính, không sinh miễn dịch, không có tính kháng nguyên [30],[44],[52],[56]

(2) Tan tốt trong nước và nhiều dung môi hữu cơ [30],[44],[56]

(4) Chuỗi có tỷ lệ hydrat hóa cao và linh hoạt [9],[50]

(5) Có sẵn trên thị trường với các mức giá tương đối thấp với nhiều loại khối lượng phân tử và cấu trúc khác nhau

(6) Có thể gắn hoặc hấp phụ dễ dàng lên các hệ mang thuốc

(7) Được US-FDA chấp thuận cho sử dụng trên người

Để có khả năng gắn vào màng liposom, PEG hoặc các dẫn chất thân nước của nó được liên kết với một phần thân dầu, phổ biến nhất là phosphatidylethanolamine (DSPE) tạo thành phức hợp PEG-DSPE (hình 1.4) Khối lượng phân tử của PEG trong phức hợp

có thể từ 750 đến 20000 Da Tuy nhiên, các nghiên cứu cho thấy khả năng kéo dài thời gian tuần hoàn là tốt nhất khi khối lượng phân tử của PEG từ 1000 đến 5000 Da [11],[13],[33] Một số các dẫn chất lipid khác của PEG cũng cho thấy tăng thời gian tuần hoàn là

PEG-Cholesterol, PEG-distearoylglycerol, PEG-oxycarbonyl-3-amino-1,2-propanediol distearoyleste … [11].

Hình 1.4 Một số dẫn chất lipid của polyethylen glycol [21],[36]

1.6 Cơ chế PEG làm tăng thời gian tuần hoàn của liposom trong máu

Gắn PEG lên bề mặt liposom đã được chứng minh là có nhiều ưu điểm, trong đó quan trọng nhất là kéo dài thời gian tuần hoàn trong máu của liposom, tạo điều kiện để đạt được nồng độ thuốc cao tại vị trí khối u, cải thiện hoạt tính chống ung thư Tuy nhiên, cơ chế làm bền vững và tăng thời gian tuần hoàn liposom của PEG vẫn còn nhiều điểm chưa

rõ ràng Cơ chế được đề cập nhiều và chấp nhận rộng rãi đó là PEG làm giảm sự tương tác của liposom với các protein, giảm sự tóm bắt liposom của MPS

Lực hút thân dầu giữa bề mặt lipid của liposom và protein tạo điều kiện để protein hấp phụ lên bề mặt tiểu phân [52] Khi gắn PEG lên bề mặt liposom, lớp áo nước được hình thành do ái lực cao của PEG với các phân tử nước sẽ làm cho bề mặt liposom trở nên thân nước, làm giảm lực hút thân dầu, do đó, làm sự tương tác của liposom với protein

huyết tương (hình 1.5 A) Đồng thời, sự có mặt của PEG trên bề mặt liposom còn tạo ra một lực đẩy không gian Lực đẩy này tăng lên khi các tiểu phân khác lại gần liposom do lớp polyme bị nén lại (hình 1.5 B) Lực đẩy không gian đã góp một phần quan trọng làm hạn chế sự tương tác giữa các liposom với nhau cũng như giữa liposom với các phân tử protein và các tế bào khác [37].

Sự tăng thời gian tuần hoàn của liposom gắn PEG còn có thể được giải thích dựa trên ảnh hưởng của PEG tới sự kết tụ của các tiểu phân liposom Lực đẩy không gian giữa các liposom gắn PEG làm giảm sự kết tụ của chúng, giúp duy trì các liposom ở trạng thái riêng rẽ với đường kính nhỏ (khoảng 100 nm)- kích thước tối ưu để kéo dài thời gian tuần hoàn [9],[19] Ahl và cộng sự (1997) đã nghiên cứu mối quan hệ giữa sự kết tụ của

liposom in vitro với thời gian tuần hoàn in vivo của chúng [7] Kết quả cho thấy có mối

liên quan mật thiết giữa giữa xu hướng kết tụ của liposom và thời gian tuần hoàn Sự kết tụ của các liposom trong huyết tương/ huyết thanh được quan sát trên kính hiển vi và độ đục tương đối định lượng được là 275, 185 và 15 tương ứng với các chế phẩm liposom chỉ chứa DSPC, chứa DSPC/Chol (2:1) và DSPC/DSPE-PEG 2000 (9:1) Thời gian tuần hoàn, được phản ánh qua AUC trung bình cho thấy liposom gắn PEG có thời gian tuần hoàn kéo dài hơn hẳn (AUC là 1,16 ± 0,05) so với hai chế phẩm liposom không gắn PEG (AUC là 0,04 ± 0,02, 0,[35]34 ± 0,04 lần lượt với liposom DSPC và DSPC/Chol)

A B

Hình 1.5 Cơ chế PEG kéo dài thời gian tuần hoàn của liposom trong máu

(A): Giảm hiện tượng opsonin hóa [16]

(B): Tương tác đẩy không gian làm giảm kết tụ tiểu phân

Một điều thú vị là mặc dù tính thân nước và lực đẩy không gian được tạo ra bởi PEG chính là cơ chế để kéo dài thời gian tuần hoàn của liposom nhưng khi gắn dextran, một polyme tan tốt trong nước và có tính thân nước cao lên bề mặt liposom lại không chứng minh được khả năng kéo dài thời gian tuần hoàn Điều này có thể liên quan đến đặc tính linh động (flexibility) (sự quay tự do của các đơn vị polyme xung quanh các liên kết của chúng) của PEG Sự linh động này khiến lớp polyme khó thấm và tạo thành một lớp áo bao bọc và bảo vệ toàn bộ liposom, trong khi các polyme kém linh động như dextran không tạo ra được sự bảo vệ toàn diện trên bề mặt liposom [50]

1.7 Các phương pháp tạo liposom gắn PEG

PEG có thể được gắn vào liposom trong hoặc sau quá trình tạo liposom

1.7.1 Gắn PEG trong quá trình tạo liposom (phương pháp truyền thống, modification)

pre-Với phương pháp này, dẫn chất lipid của PEG, ví dụ mPEG-DSPE, cùng các lipid khác được hòa tan trong một pha dung môi hữu cơ và tiến hành hydrat hóa tạo liposom theo các phương pháp trình bày ở mục 1.4 PEG sẽ phân bố ở cả 2 bên màng lipid kép của liposom tạo thành (hình 1.6A)

Hình 1.6 Các phương pháp tạo liposom gắn PEG [35]

1.7.2 Gắn PEG sau quá trình tạo liposom (phương pháp post-modification)

Có 2 kỹ thuật chính để gắn PEG lên bề mặt các liposom tạo thành từ trước formed liposomes)

(pre-Kỹ thuật thứ nhất dựa trên cơ sở tạo liên kết đồng hóa trị của PEG đã hoạt hóa với nhóm phản ứng trên bề mặt của liposom (hình 1.6C) Kỹ thuật này được đề xuất bởi Senior

và cộng sự (1991) [47] Monomethoxy-poly (ethylene glycol) (M-PEG) được hoạt hóa tại nhóm hydroxyl tự do với tresyl clorid 0,5 ml liposom đơn lớp (chứa 20% phosphatidylethanolamin) được trộn với đồng thể tích tresylat monomethoxy polyethylen glycol (TMPEG) trong dung dịch đệm phosphat (pH 8,5) Sau khi ủ 2 giờ ở 22oC, TMPEG không phản ứng (không gắn lên liposom) được loại đi bằng sắc ký lọc gel (Sepharose 4B) Các liposom gắn PEG tạo thành có thời gian thời gian bán thải dài hơn liposom không gắn PEG (thời gian bán thải của liposom gắn PEG là 10 giờ, liposom không gắn PEG là 7 giờ)

Một kỹ thuật khác có thể sử dụng để gắn PEG lên bề mặt các liposom là kỹ thuật

“post-insertion” (hình 1.6B) Cơ sở của kỹ thuật này là khả năng di chuyển của phân tử lipid từ pha lipid này sang pha lipid khác trong môi trường nước Ở nồng độ trên nồng độ micell tới hạn, mPEG-DSPE cũng như một số dẫn chất lipid khác của PEG hình thành các micell Khi ủ hỗn dịch micell mPEG-DSPE với hỗn dịch liposom ở điều kiện nhiệt độ và thời gian thích hợp, mPEG-DSPE sẽ được chuyển từ micell sang các liposom Kỹ thuật đã được thực hiện đầu tiên trong nghiên cứu của Uster và cộng sự (1996) [51] Điều đáng ngạc nhiên là sự chuyển pha này diễn ra ngay khi ủ đồng thời liposom và micell ở nhiệt độ thấp hơn nhiều so với nhiệt độ chuyển pha (20oC so với 58oC) và trong thời gian rất ngắn (5 phút) Sau khi quá trình gắn hoàn tất, mPEG-DSPE tồn tại ở dạng monome và được loại bằng cách sử dụng sắc ký lọc gel

1.8 Ứng dụng của liposom gắn PEG

1.8.1 Ứng dụng trong điều trị ung thư:

Doxil® là chế phẩm liposom gắn PEG đầu tiên được US-FDA phê duyệt cho điều trị lâm sàng Một chế phẩm khác của liposom doxorubicin gắn PEG có mặt trên thị trường hiện nay là Lipo-Dox® (TTY Biopharm Company Ltd, Taipei Taiwan) Chế phẩm này sử dụng DSPC, một phospholipid bão hòa có nhiệt độ chuyển pha cao (55oC) thay vì sử dụng phosphatidylcholin đậu nành đã hydro hóa như trường hợp của Doxil® Trong thử nghiệm

lâm sàng pha I, Lipo-Dox® đã đạt được thời gian tuần hoàn kéo dài lên tới 65 giờ [18] Như vậy, cả Doxil® và Lipo-Dox®, những chế phẩm liposom gắn PEG đều cho thấy thời gian tuần hoàn vượt trội so với liposom truyền thống như Myocet®

Liposom gắn PEG cũng đang được nghiên cứu ứng dụng với các hoạt chất chống ung thư khác như cisplatin, camptothecin…[18],[53]

1.8.2 Ứng dụng trong điều trị một số bệnh lý khác

Do hiệu ứng tăng tính thấm và khả năng lưu giữ, các liposom tuần hoàn kéo dài sẽ

có khả năng tích lũy thụ động không chỉ ở vị trí các khối u mà còn ở các vị trí viêm, nhiễm khuẩn Chính vì lý do này mà liposom gắn PEG cũng được ứng dụng trong điều trị các bệnh lý viêm hoặc nhiễm khuẩn

Bakker và cộng sự (1993) đã nghiên cứu tác dụng của liposom gắn PEG (với tỷ lệ mol PEG-DSPE:PHEPC:Chol = 0,15:1,85:1) chứa gentamicin và ceftazidim trên 2 mô

hình chuột cống viêm phổi trái do Klebsiella pneumonia nhạy cảm cao và kháng

gentamicin/ceftazidim Với phác đồ liều đơn bắt đầu lúc 24 giờ sau khi cấy vi khuẩn cho thấy hiệu quả điều trị vượt trội của dạng thuốc kháng sinh trong liposom gắn PEG so với kháng sinh tự do: tăng tỷ lệ sống sót của chuột nhiễm khuẩn cũng như tăng tác dụng diệt khuẩn ở các mô phổi nhiễm khuẩn [14]

1.8.3 Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh

Liposom gắn PEG cũng được sử dụng làm hệ vận chuyển các chất đánh dấu phóng

xạ, ứng dụng trong chẩn đoán bệnh với mục đích khu trú vị trí của các chất phóng xạ và làm giảm độc tính của chúng Một số chất phóng xạ đã được sử dụng như 67Ga, 111In,

99mTc [49].Trong nghiên cứu lâm sàng, kỹ thuật chụp sciti sử dụng liposom gắn PEG mang

99mTc đã cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu cao (94% và 89%) ở 35 bệnh nhân nghi ngờ là

có bệnh lý viêm hoặc nhiễm khuẩn [32] Nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy sử dụng các liposom gắn PEG mang chất phóng xạ là một phương pháp hiệu quả và thuận tiện để chụp sciti, góp phần chẩn đoán tình trạng viêm hoặc nhiễm khuẩn Tuy nhiên, những phản ứng không mong muốn đã ngăn cản việc sử dụng các chế phẩm này trên người và cần có thêm các nghiên cứu khác để ứng dụng vào thực tiễn

1.8.4 Kết hợp để tối ưu hóa hệ mang thuốc liposom

Kết hợp các nguyên liệu khác nhau trong chế tạo liposom để đạt được thời gian tuần hoàn kéo dài, khả năng hướng đích và giải phóng thuốc hợp lý tại đích là một xu hướng trong nghiên cứu, phát triển liposom hiện nay Kazuo Maruyama (2011) đã gắn trasferrin lên bề mặt PEG-liposom chứa oxaliplatin Các transferrin-PEG-liposom vừa có khả năng tuần hoàn kéo dài, duy trì thuốc trong khoang gian bào, vừa có khả năng phân phối chúng vào bào tương của tế bào ung thư thông qua trung gian receptor transferrin Do vậy, transferrin-PEG-liposom cải thiện tính an toàn và hiệu quả của thuốc [40]

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị và động vật thí nghiệm

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất:

Nguyên liệu:

- Phospholipid lòng đỏ trứng đã hydro hóa được tiêu chuẩn hóa theo nghiên cứu trước đó [4]

- Cholesterol (Merck, Đức), DSPE-PEG2000-NH2 (Laysanbio, Mỹ)

- Doxorubicin hydroclorid (Merck, Đức)

Hóa chất:

- Cloroform (Trung Quốc), isopropanol, amonisulfat (Merck, Đức)

- Triton X-100 (MP Biomedicals, Mỹ)

- NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4, BaCl2, HCl (Trung Quốc)

Và một số hóa chất khác đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích

2.1.2 Thiết bị

- Máy cất quay BUCHI R-210, Thụy Sỹ

- Máy khuấy từ IKA C-MAG HS4, Đức

- Máy đo quang phổ UV-VIS U1900 HITACHI, Nhật Bản

- Túi thẩm tách, MWCO: 12000 – 14000 Da, Spectrum Labs – Mỹ

- Máy Emulsiflex –C5, Canada (Viện Công nghệ sinh học)

- Máy huỳnh quang Shimadzu RF1501, Nhật Bản (Bộ môn Hóa phân tích, Khoa Hóa học – Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội)

- Máy ly tâm lạnh Hermle Z326K, Đức

- Máy đo kích thước tiểu phân và đo thế zeta Zetasizer ZS90 (Anh)

- Ống heparin hóa, bơm kim tiêm 1ml (Việt Nam)

- Cân phân tích, cân kỹ thuật, máy đo pH, tủ sấy, nồi hấp tiệt trùng, tủ lạnh, màng lọc PTFE 0,2µm, màng polycarbonat kích thước lỗ 0,4; 0,08 µm…

2.1.3 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng dòng Swiss, BALC 57/6, giống đực do Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Chế tạo liposom doxorubicin gắn PEG và so sánh với liposom doxorubicin không gắn PEG về một số chỉ tiêu:

+ Kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân

+ Thế zeta

+ Hiệu suất tải thuốc

- Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của gắn PEG lên bề mặt liposom tới thời gian tuần hoàn của liposom doxorubicin trong máu thông qua việc khảo sát nồng độ doxorubicin tại một

số thời điểm sau khi tiêm các dạng thuốc khác nhau của doxorubicin: dạng thuốc tự do, dạng liposom không gắn PEG và liposom gắn PEG

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tạo liposom doxorubicin gắn PEG và liposom doxorubicin không gắn PEG

Bảng 2.1 Nguyên liệu tạo liposom gắn và liposom không gắn PEG

STT Tên nguyên liệu Liposom gắn PEG Liposom không gắn

PEG

2 Cholesterol 62,82 mg 62,82 mg

Hai mẫu liposom doxorubicin không gắn PEG (liposom doxorubicin) và liposom doxorubicin gắn PEG (PEG-liposom doxorubicin) với các thành phần nguyên liệu ban đầu như trong bảng 2.1 được chế tạo với cùng một quy trình Quy trình chế tạo được xây dựng dựa trên sự tham khảo các nghiên cứu trước đó [1],[2],[15] và có một vài thay đổi để phù hợp với điều kiện thực tế, cụ thể gồm các bước như sau:

Bước 1: Hydrat hóa màng lipid trong dung dịch amoni sulfat tạo liposom nhiều lớp

Tạo lớp lipid mỏng: Hòa tan phospholipid trứng đã hydro hóa, cholesterol và PEG2000-NH2 (nếu có) vào 15 ml cloroform Toàn bộ dung dịch được cho vào bình cầu dung tích 1000 ml, tiến hành cất quay chân không ở 50oC, tốc độ quay đặt ở mức 5 Sau khi lớp màng mỏng lipid được tạo thành, tiếp tục cất quay thêm 3 giờ để làm bay hơi hết dung môi hữu cơ

DSPE-Hydrat hóa màng mỏng lipid bằng 25 ml dung dịch amoni sulfat nồng độ 250 mM, ở

50oC, tốc độ quay ở mức 5 Quá trình hydrat hóa được thực hiện 2 giờ để đảm bảo lớp màng lipid phân tán hoàn toàn vào dung môi phân cực và tạo thành các liposom nhiều lớp

Bước 2: Làm nhỏ và đồng nhất hóa kích thước tiểu phân bằng phương pháp đẩy qua

Bước 3: Hình thành chênh lệch nồng độ amoni sulfat

Chênh lệch nồng độ amoni sulfat được tạo thành bằng cách sử dụng phương pháp thẩm tách trong môi trường đệm PBS pH 7,4 (NaCl 8,0g; KCl 0,2g; Na2HPO4.12H2O 2,9g; KH2PO4 0,2g pha trong 1 L nước cất) để loại muối amoni sulfat ở môi trường bên